1
pH, Sıcaklık ve Salinitenin Suda Kuş Gribi Virüslerinin Kalıcılığı Üzerindeki Etkileri
Kuş Gribi Virüsü (AIV), deneysel koşullar altında, damıtılmış suda 28°C’de 100 günden fazla ve 17°C’de 200 günden fazla kalabilmektedir (14). Yabani kuş popülasyonları içinde Kuş Gribi Virüsü (AIV) bulaşının, kontamine yüzey-suyu üzerinden fekal-oral yolla gerçekleştiği düşünülmektedir (6,10,13). Bununla birlikte, hem fiziksel hem de kimyasal farklılıklardan kaynaklanan yüzey-suyundaki AIV kalıcılığı ve iletimi üzerindeki potansiyel etkiler incelenmemiştir. Doğal-yaşamdaki kuş türleri, tatlı iç sulardan açık okyanusa kadar çok çeşitli sulak alanlardan ve sucul habitatlardan yararlanmaktadır. AIV için önemli rezervuarlar olarak kabul edilen Anseriformlarda (kazgiller, ördekgiller), habitat kullanımında hem topluluk hem de tür düzeyinde farklılıklar meydana gelmektedir.
(1). Habitat kullanımı da tür içinde yaşa, mevsime, coğrafi konuma ve üreme ve göç durumuna göre değişmektedir. Su kuşlarının habitatlarında AIV’nin kalıcılığına ilişkin bilgiler, bu virüslerin vahşi kuş popülasyonlarındaki epizootiyolojisinin anlaşılması ve dolayısıyla kümes hayvanlarında hastalıklarını önleme çalışmalarında doğrudan uygulamaya tabidir
Bu çalışmanın hedefleri şunlardır: pH, sıcaklık ve salinitenin sudaki AIV’nin kalıcılığı üzerindeki potansiyel etkilerinin test edilmesi ve gerçek yüzey-suyu örneklerindeki AIV kalıcılığının damıtılmış su modeli ile karşılaştırılmasıdır.
MALZEMELER VE YÖNTEMLER
AIV’ler ve Enfektivite assay Testleri.
Bu testlerde kullanılan kuş gribi virüsleri, Cameron Parish, Louisiana’da avcılar tarafından öldürülen av ördeklerinden ve ilave olarak A/benekli-ördek /LA/38M/87 (H6N2), A/mavi- kanatlı bataklık ördeği /LA/44B/87 (H4N6), A/yeşil-kanatlı bataklık ördeği /LA/169GW/88 (H10N7) gibi ördeklerden izole edilmiştir. Tüm virüsler, 9 günlük spesifik patojen içermeyen tavuk yumurtaları embriyolarında çoğaltılmıştır. AIV’lerde üçüncü yumurta geçişini temsil eden İnfektif amniyo-alantoik sıvılar (AAF), 48 saat kültürlenmiş ve test edilene kadar - 70°C’de dondurulmuştur.
Su numunelerindeki AIV’lerin enfektivitesi, bir mikrotitre uç-nokta titrasyonu (14) kullanılarak ölçülmüştür ve sonuçlar, ortalama doku-kültürü enfektif doz (TCID50)/ml su birimi cinsinden ifade edilmiştir. Deneylerde tavuk embriyo fibroblastlarının birincil kültürleri kullanılmıştır.
pH, Sıcaklık ve Salinitenin İnteraktif Etkileri.
A/benekli-ördek/LA/38M/87(H6N2) için enfektif AAF çözülmüş ve önceden ayarlanmış damıtılmış su içinde aşağıdaki uygulamaların tüm kombinasyonlarını kapsayacak şekilde 1:50 oranında seyreltilmiştir.
Amerika Birleşik Devletleri (2) için normal yüzey-suyu değerlerini temsil eden üç pH uygulaması (6,2, 7,2, 8,2) değerlendirilmiştir. pH’daki ayarlamalar, bu ve daha sonraki tüm deneylerde steril 1 N NaOH çözeltisi ile gerçekleştirilmiştir. pH’ı stabilize etmek için, tüm
2 muamele solüsyonlarına 2 mM HEPES tamponu ilave edilmiştir. 19 günlük test süresinden önce ve sonra tedavi pH’ı 0,1 den fazla değişmemiştir.
Tatlı ve acı yüzey-suyundaki (9) tuz konsantrasyonlarına karşılık gelen iki salinite uygulaması (0 ve 20 ppt) olarak test edilmiştir. Salinite, işlenmemiş ticari deniz tuzu ile ayarlanmıştır.
Altı pH/salinite uygulama kombinasyonunu içeren enfekte su numuneleri, inokulumun eşit şekilde dağıtılması için vorteks karıştırıcıda 1,5 ml’lik alikotlarda, karıştırıldıktan sonra 2,5 ml’lik cam şişelere aktarılmıştır. Her pH ve salinite kombinasyonu için şişeler eşit olarak bölünmüştür ve test edilene kadar 17°C ve 28°C’deki sabit sıcaklık çevre odalarına yerleştirilmiştir. Bu değerler Louisiana kıyılarındaki bataklık habitatları için ortalama kış ve yaz sıcaklıklarını temsil etmektedir (8). Enfektivite, tedavi kombinasyonu başına üç ila altı deneyle 19 günlük bir süre boyunca izlenmiştir. 0. gündeki ilk deney, numuneler belirlenen sıcaklıkta 30 dakika inkübe edildikten sonra gerçekleştirilmiştir.
pH’ın Etkileri.
Üç AIV’nin her birisi, virüsler arasında pH yanıtında farklılık olup olmadığını belirlemek için yedi pH uygulamasına tabi tutulmuştur. Her virüs için Enfektif AAF, yukarıda tarif edildiği gibi pH 5,8, 6,2, 6,6, 7,0, 7,4, 7,8 ve 8,2 ye ayarlanmış olarak damıtılmış suda (2 mM HEPES tamponu ile) 1:50 oranında seyreltilmiştir. Her AIV/pH işlemi, tatlı su ve okyanus suyu için normal değerleri temsil eden iki salinite seviyesinde (0 ve 30 ppt) ve iki sıcaklık seviyesinde (17°C ve 28°C) test edilmiştir. Her AIV/pH uygulaması için enfektivite 28°C ve 17°C de, sırasıyla 5. ve 10. günlerde test edilmiştir.
Salinitenin Etkileri.
Enfektivite ve salinite arasındaki ilişkinin belirlenmesi için A/benekli- ördek/LA/38M/87(H6N2) kullanılmıştır ve sonuçların tek başına NaCl ile tekrarlanıp tekrarlanamayacağı değerlendirilmiştir. Eşleştirilmiş salinite uygulamaları (0, 5, 10, 15, 20, 25 ve 30 ppt), işlenmemiş deniz tuzu ve biyolojik dereceli NaCl ile damıtılmış suda (pH 7,2) hazırlanmıştır. Salinite uygulamaları enfektif AAF (1:50) ile inoküle edilmiş ve 28°C de saklanmıştır. Enfektivite tüm salinite uygulamaları için, 6. günde test edilmiştir.
Yüzey-suyunda AIV’nin Kalıcılığı.
Louisiana'daki Vermilion ve Cameron mahallerindeki tipik su kuşu habitatlarından yüzey- suyu örnekleri toplanmıştır (Tablo 1). Su örnekleri, test edilene kadar 4°C de kapalı cam şişelerde saklanmıştır. Tüm numuneler, test edilmeden önce 0,2 μm şırınga filtresiyle sterilize edilmiştir.
A/benekli-ördek/LA/38M/87(H6N2) için enfektif AAF, her yüzey-suyu örneğinde ve kontrol görevi gören damıtılmış suda 1:50 oranında seyreltilmiştir. Enfekte su numuneleri vortekslenmiş ve 1.5 ml lik alikotlar, 2.5 ml lik cam şişelere aktarılmıştır. Her su numunesi için şişeler eşit olarak bölünmüştür ve test edilene kadar 17°C ve 28°C’deki sabit sıcaklık çevre odalarında saklanmıştır. Örnekler, su/sıcaklık uygulaması başına 7-12 assay ile 15 günlük bir süre boyunca tahlil edilmiştir.
3 İstatistiksel analiz.
Sıralı deneylerden elde edilen veriler, log10 ile dönüştürülmüş ve doğrusal regresyon yoluyla analiz edilmiştir. Doğrusal modeller arasındaki eğim farklılıkları, eğimin heterojenliği için bir test kullanılarak test edilmiştir. Tüm analizler, İstatistiksel Analiz Sistemi (SAS) Genel Doğrusal Modeller prosedürü (11) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Tuz uygulamaları arasındaki enfeksiyon farklılıkları (deniz tuzu vs NaCl), eşleştirilmiş t-test kullanılarak test edilmiştir.
BULGULAR
A/benekli-ördek/LA/38M/87(H6N2)’nin kalıcılığı, sıcaklık, salinite ve pH’a göre önemli ölçüde değişmiştir. Veriler için doğrusal regresyon modelleri (Tablo-2, Şekil-1) ve bu modellerdeki tüm parametreler anlamlıdır (P <0,05). Belirleme katsayıları (R2) 0,86 ile 0,99 arasında değişmiştir.
Bu virüsün modifiye edilmiş damıtılmış suda 1 x 106 TCID50 için tahmini kalıcılık süresi 9 ila 100 gün arasında değişmiştir (Tablo-2). Kalıcılık en yüksek 17°C/ 0 ppt /pH 8,2 su numunesinde ve en düşük 28°C / 20 ppt / pH 8,2 uygulamasında olmuştur. Her iki sıcaklıkta da salinite ve pH arasında güçlü bir interaktif etki belirgindir. Virüsün kalıcılığı en uzun pH 6,2 de (20 ppt) salinitede ve tuzsuz olarak pH 8,2 de olmuştur.
Eğimdeki farklılıklar (P <0,05), pH uygulamalarında arasında (6,2 vs 7,2 vs 8,2) tüm sıcaklık ve salinitede tespit edilmiştir. Saliniteye atfedilebilen eğim farklılıkları (0 ppt vs 20 ppt) 28°C de pH 7,2 ve pH 8,2 de ve 17°C de pH 6,2 ve pH 8,2 de kaydedilmiştir. Sıcaklıktan kaynaklanan farklılıklar (17°C vs 28°C), 20 ppt / pH 6,2 ve 20 ppt / pH 7,2 hariç tüm salinite ve pH kombinasyonları için belirgindir.
Şekil-2, A/benekli-ördek /LA/38M/87 (H6N2), A/mavi-kanatlı bataklık ördeği /LA/44B/87 (H4N6), A/yeşil-kanatlı bataklık ördeği /LA/169GW/88 (H10N7) için pH değerlendirmelerinin sonuçlarını göstermektedir. Tüm durumlarda, tuz içermeyen su numunelerinde en yüksek viral enfektivite, pH 7,4-7,8 aralığında tespit edilmiştir. pH etkisinin derecesi virüsler arasında değişmekle birlikte, enfektivite pH ile artmaktadır.
Bununla birlikte, tuzla negatif bir ilişki gözlenmiştir, suyun pH seviyesi arttıkça enfektivite azalmıştır. Bu ilişkiler özellikle A/benekli-ördek /LA/38M/87 (H6N2), A/yeşil-kanatlı bataklık ördeği /LA/169GW/88 (H10N7) için 28°C uygulamalarında belirgin olmuştur, burada 0 ppt ve 30 ppt salinite seviyesindeki çizgiler, pH 6,2 ve 6,8 arasında kesişmiştir. Hem pH hem de salinite etkileri 17°C de azalmıştır.
Şekil-3, Salinite denemelerinin sonuçlarını göstermektedir. Doğrusal modeller hem işlenmemiş deniz tuzu (y = 4,75 – 0,043x, R2 = 0,69) hem de NaCl (y = 4,75 – 0,056x, R2 = 0,69) uygulamaları için uygundur. Bu uygulamalar arasında önemli bir farklılık tespit edilmemiştir (P = 0,2061).
Tablo-3, Yüzey-suyu denemeleri için doğrusal regresyon modellerini göstermektedir. Bu modellerdeki tüm doğrusal modeller ve tüm parametreler anlamlıdır (P <0,05), ve R2 değerleri 0,85 ile 0,99 arasında değişmektedir.
Bu yüzey-suyu örneklerinde 1 x 106 TCID50 A/benekli ördek/LA/38M/87 (H6N2) için tahmini kalıcılık süreleri 9 ila 55 gün arasında değişmektedir. Enfektivite, en hızlı şekilde, her iki sıcaklıkta da, acı-su (brackish-water) numunesinde azalmıştır 28°C de, yüzey-suyu
4 numuneleri için eğim ve damıtılmış-su kontrol numuneleri arasındaki farklılıklar 3(acı su- bataklığı) (P <0,0001) ve 4(tatlı su-bataklığı) (P = 0,0012) için tespit edilmiştir. 17°C de su numuneleri 3(P <0,0001) ve 4(P = 0,0031) ile benzer sonuçlar göstermiştir.
TARTIŞMA
Normal yüzey-suyunu temsil eden seviyelerde sıcaklık, pH ve salinite, AIV’nin kalıcılığını büyük ölçüde etkileyebilir. Doğrusal regresyon modellerinden türetilen 1 x 106 TCID50 / ml A/benekli ördek/LA/38M/87 (H6N2) için enfeksiyon süresi tahminleri, çeşitli uygulama koşulları altında, 9 ila 100 gün arasında değişen kalıcılıkla bu etkilerin büyüklüğünü göstermektedir. Bu değişkenlere yanıt olarak AIV’ler arasındaki varyasyonun boyutu bilinmemektedir, ancak virüsler arasında farklılıklar mevcuttur.
AIV’ler için kısa-süreli pH tolerans testleri, bu virüslerin nötrden pH 8,5 e kadar bir pH aralığında stabil olduğunu ve pH 6,0 ın altında enfektivitenin hızla düştüğünü göstermiştir (5,7). Bununla birlikte, pH 6.0 nın altında, AIV ler insan influenza virüslerinden daha fazla stabilite sergilerler (5,17). Mevcut çalışmadan elde edilen sonuçlar, düşük tuz konsantrasyonunda pH 7,2 ila 8,2 aralığında AIV stabilitesi raporlarını desteklemektedir.
Tuzlu su koşulları altında enfektivite, tuz içeriği ile ters orantılıdır ve optimum pH toleransı daha asidik koşullara kaymaktadır. 30 ppt deniz tuzunda, A/benekli ördek/LA/38M/87 (H6N2) için enfektivite pH 6,6 ile 7,4 arasında zirve yapmıştır ve pH 8,2'de ise en düşük enfektivite görülmüştür. Optimum pH seviyeleri biraz farklı olsa da, benzer sonuçlar A/yeşil- kanatlı bataklık ördeği/LA/169GW/88 (H10N7) ve A/mavi-kanatlı bataklık ördeği/LA/44B/87 (H4N6) ile belirgin olmuştur. Her iki virüsle de, en yüksek enfeksiyon oranı daha asidik bir aralığa kaymıştır ve en düşük enfeksiyon oranı pH 8,2 de gözlenmiştir.
Bu değişkenlerin AIV kalıcılığını tek başlarına veya kombinasyonlar halinde etkilediği mekanizmalar bilinmemektedir; bununla birlikte, pH için viral deaktivasyon için potansiyel bir mekanizma tarif edilmiştir. Düşük değerlerde (<5.0), hemaglutinin (HA) glikoproteininde konformasyonel ve antijenik bir değişiklik meydana gelmektedir, bu durum da konakçı hücrelerin endozomal membranı ile etkileşimine ve füzyonuna izin vermektedir (3,16).
Optimum füzyon ve müteakip enfeksiyon için virion, düşük pH değerlerine maruz kalmadan önce hedef membrana bağlanmalıdır (15). Sato ve ark., (12), bu konformasyonel değişikliğin pH 6,4 ila nötr aralığında geri döndürülebilir olduğunu ancak pH 6,0 nın altında geri döndürülemez olduğunu bildirmişlerdir. İnfluenza virüsleri pH 5,0 de 37°C'de ön-inkübe edildiğinde füzyon aktivitesi geri döndürülemez bir şekilde kaybolmaktadır, ancak virüsler 0°C de ön-inkübe edildiğinde aktivite bu pH ta değişmemektedir (15). Aynı araştırmacılar, inaktivasyonun, proteinde hidrofobik özelliklerin kaybına ve viral glikoproteinde konformasyonel değişikliklere neden olan ikincil bir değişiklik gerektirdiğini öne sürmüşlerdir. Bu değişiklikler düşük sıcaklıkta engellenebilir veya HA’daki yapısal değişikliklerin yalnızca daha yüksek sıcaklıklarda meydana gelmesi mümkündür. Bu pH ilişkisi, A/benekli ördek/LA/38M/87 (H6N2) ve A/yeşil-kanatlı bataklık ördeği /LA/169GW/88 (H10N7) ile gözlemlenen sonuçları açıklayabilir. Her iki durumda da, düşük pH ve yüksek sıcaklık uygulamasıyla İnfektivitede de aşırı azalma meydana getirmiştir.
A / mavi-kanatlı bataklık ördeği/LA/44B/87 (H4N6)’ de gözlemlenen pH'a karşı daha fazla tolerans, suş varyasyonuna atfedilebilir. İnfluenza virüsü suşları arasında optimum
5 füzyon aralığına göre pH yanıtında farklılıklar gözlemlenmiştir ve virüs popülasyonları içinde füzyon varyantları meydana gelmektedir (4).
Tuzun AIV’nin kalıcılığı üzerindeki etkisi ile ilgili herhangi bir rapor bulunmamaktadır.
pH 7,2 de salinite ve enfektivite, negatif bir doğrusal ilişki sergilemektedir. Kalıcılık denemelerinde salinite ayarı, normalde %77 NaCl içeren deniz tuzu ile gerçekleştirilmiştir (9). Deniz tuzunun diğer temel bileşenleri arasında magnezyum, kalsiyum, potasyum, sülfat, bikarbonat, karbonat ve bromür bulunmaktadır. Bu çalışmanın sonuçları, saliniteye atfedilen etkilerin tek başına NaCl ile yeterli şekilde yeniden üretilebileceğini göstermektedir. Bu durum, gelecekteki deneylerde daha hassas kontrol sağlayacaktır. Suyun diğer bileşenlerinin olası etkileri, özellikle tuz bileşiminin büyük ölçüde değişebileceği iç alanlar saline suyu düşünüldüğünde göz ardı edilmemelidir.
Yüzey-suyunda A/benekli ördek/LA/38M/87 (H6N2) için kalıcılık denemelerinin sonuçları, damıtılmış su modelinde gözlemlen aralığına düşmüştür. Kalıcılık, her iki sıcaklıkta da acı-suda (salinite = 19,9 ppt) en düşük olmuştur. Üç tatlı-su örneğiyle, AIV'nin kalıcılığı pH ile biraz artmıştır. Tatlı-su numunelerine ilişkin sonuçlar, damıtılmış su kontrollerinde gözlemlenenlere benzer olmuştur ve bu da sonuçların saha koşulları ile ilgili olabileceğini göstermektedir.
Yabani kuş popülasyonlarında kuş gribinin epizootiyolojisine ilişkin mevcut çevresel konular, viral bulaşma için potansiyel alanlar olarak sucul habitatların tanımlanmasıyla sınırlıdır. Bu çalışmanın sonuçları, sucul habitatların AIV’ nin kalıcılığı açısından büyük farklılıklar gösterdiğini göstermektedir. Kalıcılık ve bunu takip eden bulaşma, pH 7,4 ila pH 7,8 arasında değişen değerleri ile daha soğuk tatlı-su habitatlarında en yüksek seviyede olacaktır. Bununla birlikte, bu sonuçların, normal olarak tatlı-su habitatlarıyla ilişkili ördekgillerden türetilen yumurtalarda çoğalan virüslere dayandığının belirtilmesi önemlidir (1).AIV’ler arasındaki çevresel tolerans çeşitliliğinin boyutu ve bu virüslerin belirli çevresel koşullara adapte olma potansiyeli bilinmemektedir. Aynı şekilde, bu sonuçların ördek bağırsaklarında doğal olarak çoğalan AIV'ler ile dublikasyonunun olabileceği bilinmemektedir.
Tablo-1. A/benekli ördek/LA/38M/87 (H6N2) üzerinde Kalıcılık Denemeleri için Louisiana kıyısı su kuşları habitatlarından toplanan su örnekleri.
Örnek Lokasyon Habitat Türü pH Salinite (ppt)
1 KaplanA Pirinç Tarlası 8,2 0,5
2 Pecan AdasıA Tatlı su bataklığı 7,7 2,2
3 Rockefeller RefugeA Acı su bataklığı 8,2 0,5
4 CreoleB Tatlı su bataklığı 8,2 0,5
Damıtılmış Su
- -
7,1 0,0
A Vermilion Topluluğu, La
B Cameron Topluluğu, La
6 Tablo-2. A/benekli ördek/LA/38M/87 (H6N2) üzerinde Suda Kalıcılık Denemeleri için 12 Sıcaklık / Salinite / pH uygulaması kombinasyonunun doğrusal regresyon modelleri.
UygulamaA Örnek sayısı Doğrusal Regresyon
Modeli R2
Tahmini Kalıcılık (gün)B
28 C/20 ppt/6,2 6 y = 4,79 – 0,23xc 0,90 26
28 C/20 ppt/7,2 5 y = 5,06 – 0,29x 0,93 21
28 C/20 ppt/8,2 3 y = 5,31 – 0,67x 0,99 9
28 C/0 ppt/6,2 3 y = 3,62 – 0,50x 0,86 12
28 C/0 ppt/7,2 6 y = 4,75 – 0,13x 0,98 46
28 C/0 ppt/8,2 6 y = 5,09 – 0,12x 0,99 50
17 C/20 ppt/6,2 6 y = 5,37 – 0,08x 0,90 72
17 C/20 ppt/7,2 6 y = 5,48 – 0,11x 0,96 54
17 C/20 ppt/8,2 6 y = 5,48– 0,19x 0,98 31
17 C/0 ppt/6,2 5 y = 4,41 – 0,26x 0,97 23
17 C/0 ppt/7,2 6 y = 5,48 – 0,11x 0,96 54
17 C/0 ppt/8,2 6 y = 5,03 – 0,06x 0,90 100
A Sıcaklık / Salinite / pH.
B Tahmini Kalıcılık (gün) 1 x 106 TCID50/ml su.
C y= log10 TCID50/ml; x = gün kalıcılık.
Şekil-1. A/benekli ördek/LA/38M/87 (H6N2) üzerinde Suda Kalıcılık Denemeleri için 12 Sıcaklık / Salinite / pH uygulaması kombinasyonunun doğrusal regresyon modelleri.
7 Şekil-2 Enfektivite Üzerinde pH Etkisi
ÜST - A/benekli-ördek /LA/38M/87 (H6N2),
ORTA - A/yeşil-kanatlı bataklık ördeği /LA/169GW/88 (H10N7) ALT - A/mavi-kanatlı bataklık ördeği /LA/44B/87 (H4N6)
8 Şekil-3. A/benekli ördek/LA/38M/87 (H6N2) Enfektivitesi üzerinde Salinite Etkisi
Tablo-3. A/benekli ördek/LA/38M/87 (H6N2) nin Yüzey-Suyu ve Damıtılmış Suda Kalıcılığı için doğrusal regresyon modelleri.
Sıcaklık Örnek
numarası
Doğrusal Regresyon
Modeli R2
Tahmini Kalıcılık (gün)A 17 C
1 y = 5,07 – 0,11xB 0,85 55
2 y = 5,09 – 0,11x 0,88 55
3 y = 5,35 – 0,40x 0,97 15
4 y = 5,19 – 0,17x 0,97 35
Damıtılmış Su y = 3,62 – 0,12x 0,91 55
28 C
1 y = 5,23 – 0,32x 0,93 19
2 y = 4,92 – 0,34x 0,94 18
3 y = 5,06 – 0,63x 0,99 9
4 y = 5,09 – 0,38x 0,98 16
Damıtılmış Su y = 4,96– 0,28x 0,96 21
A Tahmini Kalıcılık (gün) 1 x 106 TCID50/ml su.
B y= log10 TCID50/ml; x = gün kalıcılık.
