• Sonuç bulunamadı

Her hücrenin yüzeyinde kendine özgü antijenler bulunur

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2021

Share "Her hücrenin yüzeyinde kendine özgü antijenler bulunur"

Copied!
41
0
0

Yükleniyor.... (view fulltext now)

Tam metin

(1)

Her hücrenin yüzeyinde kendine özgü

antijenler bulunur

(2)

Hücre yüzey proteinleri farklı yapısal özellikler gösterir

Tip I Tip II Hücre zarını birkaç kez geçenler Bazıları su kanalları oluşturur

Hücre zarını boylu boyunca geçmeyen yüzeydekiler

Lipidlerle tutunanlar GPI ile tutunanlar

(3)

Şekil 1 Beş tip membran proteininin şematik görünümü:

(I) Tip-I membran protein, (II) Tip-II membran protein,

(III) çok geçişli transmembran protein,

(IV) lipid bağı ile tutunan membran proteini, ve (V) GPI-aracılığı ile tutunan membran proteini.

Xiao-Guang Yang , Rui-Yan Luo , Zhi-Ping Feng http://dx.doi.org/10.1016/j.bbrc.2006.12.004

Hücre dışı

Hücre içi

Hücre mebranı

(4)

Hücre Membranı

(5)
(6)
(7)

Tip I Transmembran Proteinler

• Sitoplazmada COOH(karboksil) kısmı

• Hücre dışında NH2(amino) kısmı bulunur.

• Fonksiyonları

– Hücre yüzey reseptörleri

– Ligandlar (hücre hücre etkileşiminde, sinyallerin iletiminde önemli)

• Pek çoğu immunglobulin ailesinden

• Örn: T-hücre reseptörü (TCRalfa/beta)

NH2

COOH

(8)

Tip II Transmembran proteinler

• NH2 (amino) kısmı hücre içinde, COOH(karboksil) ucu hücre dışında

• Hücre içindeki bölümleri kısadır

• Hücre yüzeyinden

salınabilirler(serbestleşebilir).

COOH

NH2

(9)

Tip III Transmembran proteinler

• Plazma membranını birden fazla kez geçebilir (çaprazlayabilir).

• Örn:

– Çoklu ilaç direnci proteinleri

– B hücrelerdeki CD20 kasiyum kanalı

oluşturur.

(10)

Tip IV ve Tip V

• Hücre zarını geçmezler

• COOH uçları ile Plazma membranına tutunurlar. ( lipidler veya Glikozil-

fosfoinozitol(GPI) çapasını kullanırlar)

GPI

(11)

Hücre yüzey proteinleri Fonksiyonları

• Hücre hücre ilişkisi

• Sinyal iletimi

• Moleküllerin, iyonların, suyun taşınması

• Hücre yüzey bütünlüğünü sağlamak ve hücreyi dış etkilerden korumak

• Hücrelerin kimlikleri olarak da rol alırlar

• Fonksiyonları taşıdıkları üniteler, yapıları ile

yakından ilişkilidir

(12)

Hücre membranındaki proteinle

(13)
(14)

• Her hücre tipinin yüzeyinde kendine özgü proteinler (Hücre yüzey antijenleri) bulunur.

• Monoklonal antikorlar kullanılarak hücrelerin yüzeyindeki bu antijenler belirlenebilir.

• Bu antijenleri tanımlamak için Cluster of

differantiation (CD) ifadesini takip eden

rakamlar kullanılır

(15)

CD Moleküller

CD (cluster of differentiation) molecules are cell surface markers useful for the identification and characterization of leukocytes.

The CDnomenclature was developed and is maintained through the HLDA (Human Leukocyte Differentiation Antigens) workshop started in 1982.

The goal is to provide standardization of monoclonal antibodies to

human antigens across laboratories. To characterize or “workshop” the antibodies, multiple laboratories carry out blind analyses of antibodies.

These results independently validate antibody specificity.

While the CD nomenclature has been developed for use with human antigens, it is applied to corresponding mouse antigens as well as antigens from other species. However, the mouse and other species antibodies are not tested by HLDA.

Human CD markers were reviewed by the HLDA. New CD markers

were established at the HLDA9 meeting held in Barcelona in 2010. For

additional information and CD markers please visit www.hcdm.org.

(16)

• Aynı antijenle reaksiyona giren antikorları gruplamak bunu farklı laboratuvarlarda test ederek doğrulamak

Kullanılan istatistiksel yöntem: ‘Cluster’ Analysis)

• Antikorları ‘Cluster of Differentiation (CD) olarak numalandırıp sınıflamak

• Dahil etme kriterleri

– Başlangıçta sadece löksit antijenleri

– Daha sonra endotelial hücre proteinleri, sitokin resptörleri, diğer hücre içi proteinler dahil oldu – Hücre içi molekülleri dahil etme şartı ; Farklılaşmada rol alıyor olması

– Sinyal iletiminde rol alanlar ve HLA molekülleri CD sınıflaması dışında tutuluyor

HLDA * : Temel prensipler

•HLDA adı 2004 yılında HCDM (Human Cell Differentiation Molecules) olarak değşmiştir

(17)
(18)
(19)
(20)

Normal B Hücre Gelişimi

Wood and Borowitz (2006) Henry’s Laboratory Medicine

XVI Uygulamalı FCM Eğitimi, Haziran 2010

(21)

B Hücre farklılaşmasının şematik görünümü En sık görülen B-hücreli lenfomalar ile ilişkisi

Elaine S. Jaffe et al. Blood 2008;112:4384-4399

©2008 by American Society of Hematology

:IgH rearanjmanı :IgL rearanjmanı : Somatik

hipermutasyon

Proliferasyon,SHM, CSR Artmış affinite

Affinite Maturasyonu ile GC Hücreler de 10, 38, 95 DR up regüle olur CD44 ve bcl2 azalır

(22)
(23)

Normal T Hücre Gelişimi

Wood and Borowitz (2006) Henry’s Laboratory Medicine

XVI Uygulamalı FCM Eğitimi, Haziran 2010

(24)

T Hücre farklılaşmasının ve Fonksiyonlarının şematik Görünümü.

Elaine S. Jaffe et al. Blood 2008;112:4384-4399

©2008 by American Society of Hematology

Genelde Ekstranodal

Genelde Nodal

TFH:Folliküler Helper T hücre

(25)

Normal Granulosit Gelişimi

Wood and Borowitz (2006) Henry’s Laboratory Methods

XVI Uygulamalı FCM Eğitimi, Haziran 2010

(26)

Normal Monosit Gelişimi

Wood and Borowitz (2006) Henry’s Laboratory Methods

XVI Uygulamalı FCM Eğitimi, Haziran 2010

(27)

Normal Eritrosit Gelişimi

Wood and Borowitz (2006) Henry’s Laboratory Medicine

XVI Uygulamalı FCM Eğitimi, Haziran 2010

(28)

• Antijenlerin fosforile

olması onları aktif ya da inaktif hale getirebilir

• Amaca göre fosforile olan ve olmayan

molekülleri farklı

monoklonal antikorlar

ile tanımak mümkün

olur

(29)

Antikorlar

• Poliklonal

• Monoklonal

(30)

Monoclonal(Moab) Antibody Production

HGPRT: hipoksantin fosforibozil transferaz, HAT: Hipoksantin Aminopterin Timidin

HAT medium

(31)

Moab kullanırken bilinmesi gerekenler

• Poliklonal antikorlara avantajları Daha homojen

• Daha spesifik (tek bir epitopu tanımlar)

• Tanımlanmaları daha kolay

• Üretimde farklı seriler arasında fark olma riski

yok

(32)

Affinite

– Ag-Ab arasında kovalan bir bağ yok

– İyonik güçler, hidrojen bağları, van der Waals güçleri ile bir aradalar (afiniteyi etkileyen güçler bunlar)

– Antikorun hücresel bir ag ile sature olması için gerekli

sürenin bilinmesi önem taşır fonksiyonel affinite olarak da tanımlanır

– Ab-Ag kompleksleri , tuz konsantrasyonu, pH ve ısıdan etkilenir

– Çalışırken affinitesi en yüksek olan ab seçilmelidir

(33)

Affinite

• Poliklonal ab ile çalışırken boyanma sonrası yıkamalarla kayıplar daha fazla

• Monoklonal ab kullanıldığında affinite aynı olduğundan kayıp riski daha az

• FCM uygulamalarında yüksek tuz, yüksek ısı ve yüksek ve düşük pH değerlerinden

kaçınılmalıdır.

(34)

Çapraz Reaksiyonlar:

– Ortak epitopları taşıyan antijenlerde görülen bağlanmalar nedeni ile söz konusu olur

Ör CEA ile kan grubu ag arasında ortak epitoplar var

(35)

Antikorların Saturasyonu

• Hücre yüzeyinde veya içindeki bir antijen ile çalışılmasına göre farklılıklar görülebilir

• Hücrenin tespiti, ab konsantrasyonu, ısı, zaman gibi değişkenler doygunluğa gelme süresini etkiler

• Zamanı kısaltmak için daha yüksek konsantrasyonda ab kullanılır, bu da NS bağlanmayı arttırabilir, bunu aşmak için fazla yıkama gerekebilir

• Yıkama gerektirmeyen çalışmalarda daha dilue ab

kullanılır

(36)

Antikorların stabilitesi

(Hazırlama ve kullanımda farklı noktalar önemli)

Kullanımda

– Isı travmasından kaçınmalı

– Konsantre stoklar olarak gerekirse porsyonlayarak saklanması tercih edilmeli

– Protein adsorbe etmeyen materyallerde saklanmalı

• Polipropilen, polikarbonat, borosilikat cam

• Protein içeriği düşükse ortama taşıyıcı olarak BSA (%0,1- %1) eklenebilir

– Koyu renkli ambalajlar tercih edilmeli

(37)

• İşeretli oldukları

Florokramların yarılanma ömrü iyi bilinmeli

• Primer Antikorlar

(konjuge olmamış) ile çalışırken seçilecek

sekonder antikorun da doğru seçilmesi önemli

(38)

• Sometimes typical secondary antibodies are either too specific (e.g., recognize only one host species of primary antibody) or too general (e.g., recognize whole IgG and any fragments thereof). In most cases, these limitations can be

overcome by carefully designing the experimental system and choosing the appropriate secondary probe.

The following considerations are useful to consider when choosing a secondary antibody:

• Determine the host species of the primary antibody (mouse anti-tubulin,rabbit anti-CD4, etc.)

• Select an appropriate host species for the secondary antibody (goat anti-mouse IgG, donkey anti-rabbit IgG)

• Consider cross-reactivity or specificity issues of the secondary:

– Cross-adsorbed - for multiple-labeling applications or when using samples with endogenous antibodies

– Specificity - binds to correct fragments, classes or chains of the primary antibody

(39)
(40)

Soru:

• Elimizde miyadı geçmiş bir ilaç var

Anti Human CD38 (IgG1kappa) pure

Bu ilacın halen hücreye bağlanıp bağlanmadığını kontrol etmem istendi

Nasıl bir yöntem izlemeliyim? Reaktif seçimim

nasıl olmalı?

(41)

https://www.thermofisher.com/tr/en/home/life-science/antibodies/secondary-antibodies/second

ary-antibody-selection-guide.html

Referanslar

Benzer Belgeler

İnterfaz evresi sonunda, hücre hacmi iki katına çıkar, DNA replikasyonu gerçekleşmiştir ve mitoz bölünme başlamıştır..

Hücre yüzeyi reseptörleri ligand bağlanması ve sinyal indüksiyonundan sonra membran boyunca hareket etme yeteneğine sahiptir.. Yani

Tiroid hormonları da steroid hormonları gibi benzer şekilde hücreye difüzyon yoluyla giren küçük moleküllerdir. Hedef hücreler üzerine tiroid hormonunun etkisindeki

 Bilinen en küçük hücre bakteri , en büyük hücre deve kuşu yumurtası sarısı ve en uzun hücre ise yaklaşık 1 m olan sinir hücresi dir.... Hücre Yapısı –

Genetik veya akkiz metabolizma defekti sonucu endojen veya eksojen bir maddeden anormal bir ürün

sitoplazmayı hücre dışındaki ortamdan ve diğer hücrelerden ayırır.  Hücrenin sınırlarını belirler, bütünlüğünü sağlar.  Kompleks seçici geçirgen bir tabakaya

Hidrofobik kuvvetler (mavi) ve bir dizi hidrojen bağının (sarı bölge) birleşimi ile baştan başa düzeni ile birbirine bağlanır.. Protein yapılanmaları: tek bağlanma

Yapılan çalışmada lipoaspirasyon sonrası elde edilen dokudan izole edilen hücrelerin in vitro da ektodermal, endodermal ve mezodermal tabakaya ait hücre tiplerine