Her hücrenin yüzeyinde kendine özgü
antijenler bulunur
Hücre yüzey proteinleri farklı yapısal özellikler gösterir
Tip I Tip II Hücre zarını birkaç kez geçenler Bazıları su kanalları oluşturur
Hücre zarını boylu boyunca geçmeyen yüzeydekiler
Lipidlerle tutunanlar GPI ile tutunanlar
Şekil 1 Beş tip membran proteininin şematik görünümü:
(I) Tip-I membran protein, (II) Tip-II membran protein,
(III) çok geçişli transmembran protein,
(IV) lipid bağı ile tutunan membran proteini, ve (V) GPI-aracılığı ile tutunan membran proteini.
Xiao-Guang Yang , Rui-Yan Luo , Zhi-Ping Feng http://dx.doi.org/10.1016/j.bbrc.2006.12.004
Hücre dışı
Hücre içi
Hücre mebranı
Hücre Membranı
Tip I Transmembran Proteinler
• Sitoplazmada COOH(karboksil) kısmı
• Hücre dışında NH2(amino) kısmı bulunur.
• Fonksiyonları
– Hücre yüzey reseptörleri
– Ligandlar (hücre hücre etkileşiminde, sinyallerin iletiminde önemli)
• Pek çoğu immunglobulin ailesinden
• Örn: T-hücre reseptörü (TCRalfa/beta)
NH2
COOH
Tip II Transmembran proteinler
• NH2 (amino) kısmı hücre içinde, COOH(karboksil) ucu hücre dışında
• Hücre içindeki bölümleri kısadır
• Hücre yüzeyinden
salınabilirler(serbestleşebilir).
COOH
NH2
Tip III Transmembran proteinler
• Plazma membranını birden fazla kez geçebilir (çaprazlayabilir).
• Örn:
– Çoklu ilaç direnci proteinleri
– B hücrelerdeki CD20 kasiyum kanalı
oluşturur.
Tip IV ve Tip V
• Hücre zarını geçmezler
• COOH uçları ile Plazma membranına tutunurlar. ( lipidler veya Glikozil-
fosfoinozitol(GPI) çapasını kullanırlar)
GPI
Hücre yüzey proteinleri Fonksiyonları
• Hücre hücre ilişkisi
• Sinyal iletimi
• Moleküllerin, iyonların, suyun taşınması
• Hücre yüzey bütünlüğünü sağlamak ve hücreyi dış etkilerden korumak
• Hücrelerin kimlikleri olarak da rol alırlar
• Fonksiyonları taşıdıkları üniteler, yapıları ile
yakından ilişkilidir
Hücre membranındaki proteinle
• Her hücre tipinin yüzeyinde kendine özgü proteinler (Hücre yüzey antijenleri) bulunur.
• Monoklonal antikorlar kullanılarak hücrelerin yüzeyindeki bu antijenler belirlenebilir.
• Bu antijenleri tanımlamak için Cluster of
differantiation (CD) ifadesini takip eden
rakamlar kullanılır
CD Moleküller
CD (cluster of differentiation) molecules are cell surface markers useful for the identification and characterization of leukocytes.
The CDnomenclature was developed and is maintained through the HLDA (Human Leukocyte Differentiation Antigens) workshop started in 1982.
The goal is to provide standardization of monoclonal antibodies to
human antigens across laboratories. To characterize or “workshop” the antibodies, multiple laboratories carry out blind analyses of antibodies.
These results independently validate antibody specificity.
While the CD nomenclature has been developed for use with human antigens, it is applied to corresponding mouse antigens as well as antigens from other species. However, the mouse and other species antibodies are not tested by HLDA.
Human CD markers were reviewed by the HLDA. New CD markers
were established at the HLDA9 meeting held in Barcelona in 2010. For
additional information and CD markers please visit www.hcdm.org.
• Aynı antijenle reaksiyona giren antikorları gruplamak bunu farklı laboratuvarlarda test ederek doğrulamak
Kullanılan istatistiksel yöntem: ‘Cluster’ Analysis)
• Antikorları ‘Cluster of Differentiation (CD) olarak numalandırıp sınıflamak
• Dahil etme kriterleri
– Başlangıçta sadece löksit antijenleri
– Daha sonra endotelial hücre proteinleri, sitokin resptörleri, diğer hücre içi proteinler dahil oldu – Hücre içi molekülleri dahil etme şartı ; Farklılaşmada rol alıyor olması
– Sinyal iletiminde rol alanlar ve HLA molekülleri CD sınıflaması dışında tutuluyor
HLDA * : Temel prensipler
•HLDA adı 2004 yılında HCDM (Human Cell Differentiation Molecules) olarak değşmiştir
Normal B Hücre Gelişimi
Wood and Borowitz (2006) Henry’s Laboratory Medicine
XVI Uygulamalı FCM Eğitimi, Haziran 2010
B Hücre farklılaşmasının şematik görünümü En sık görülen B-hücreli lenfomalar ile ilişkisi
Elaine S. Jaffe et al. Blood 2008;112:4384-4399
©2008 by American Society of Hematology
:IgH rearanjmanı :IgL rearanjmanı : Somatik
hipermutasyon
Proliferasyon,SHM, CSR Artmış affinite
Affinite Maturasyonu ile GC Hücreler de 10, 38, 95 DR up regüle olur CD44 ve bcl2 azalır
Normal T Hücre Gelişimi
Wood and Borowitz (2006) Henry’s Laboratory Medicine
XVI Uygulamalı FCM Eğitimi, Haziran 2010
T Hücre farklılaşmasının ve Fonksiyonlarının şematik Görünümü.
Elaine S. Jaffe et al. Blood 2008;112:4384-4399
©2008 by American Society of Hematology
Genelde Ekstranodal
Genelde Nodal
TFH:Folliküler Helper T hücre
Normal Granulosit Gelişimi
Wood and Borowitz (2006) Henry’s Laboratory Methods
XVI Uygulamalı FCM Eğitimi, Haziran 2010
Normal Monosit Gelişimi
Wood and Borowitz (2006) Henry’s Laboratory Methods
XVI Uygulamalı FCM Eğitimi, Haziran 2010
Normal Eritrosit Gelişimi
Wood and Borowitz (2006) Henry’s Laboratory Medicine
XVI Uygulamalı FCM Eğitimi, Haziran 2010
• Antijenlerin fosforile
olması onları aktif ya da inaktif hale getirebilir
• Amaca göre fosforile olan ve olmayan
molekülleri farklı
monoklonal antikorlar
ile tanımak mümkün
olur
Antikorlar
• Poliklonal
• Monoklonal
Monoclonal(Moab) Antibody Production
HGPRT: hipoksantin fosforibozil transferaz, HAT: Hipoksantin Aminopterin Timidin
HAT medium
Moab kullanırken bilinmesi gerekenler
• Poliklonal antikorlara avantajları Daha homojen
• Daha spesifik (tek bir epitopu tanımlar)
• Tanımlanmaları daha kolay
• Üretimde farklı seriler arasında fark olma riski
yok
Affinite
– Ag-Ab arasında kovalan bir bağ yok
– İyonik güçler, hidrojen bağları, van der Waals güçleri ile bir aradalar (afiniteyi etkileyen güçler bunlar)
– Antikorun hücresel bir ag ile sature olması için gerekli
sürenin bilinmesi önem taşır fonksiyonel affinite olarak da tanımlanır
– Ab-Ag kompleksleri , tuz konsantrasyonu, pH ve ısıdan etkilenir
– Çalışırken affinitesi en yüksek olan ab seçilmelidir
Affinite
• Poliklonal ab ile çalışırken boyanma sonrası yıkamalarla kayıplar daha fazla
• Monoklonal ab kullanıldığında affinite aynı olduğundan kayıp riski daha az
• FCM uygulamalarında yüksek tuz, yüksek ısı ve yüksek ve düşük pH değerlerinden
kaçınılmalıdır.
Çapraz Reaksiyonlar:
– Ortak epitopları taşıyan antijenlerde görülen bağlanmalar nedeni ile söz konusu olur
Ör CEA ile kan grubu ag arasında ortak epitoplar var
Antikorların Saturasyonu
• Hücre yüzeyinde veya içindeki bir antijen ile çalışılmasına göre farklılıklar görülebilir
• Hücrenin tespiti, ab konsantrasyonu, ısı, zaman gibi değişkenler doygunluğa gelme süresini etkiler
• Zamanı kısaltmak için daha yüksek konsantrasyonda ab kullanılır, bu da NS bağlanmayı arttırabilir, bunu aşmak için fazla yıkama gerekebilir
• Yıkama gerektirmeyen çalışmalarda daha dilue ab
kullanılır
Antikorların stabilitesi
(Hazırlama ve kullanımda farklı noktalar önemli)
Kullanımda
– Isı travmasından kaçınmalı
– Konsantre stoklar olarak gerekirse porsyonlayarak saklanması tercih edilmeli
– Protein adsorbe etmeyen materyallerde saklanmalı
• Polipropilen, polikarbonat, borosilikat cam
• Protein içeriği düşükse ortama taşıyıcı olarak BSA (%0,1- %1) eklenebilir
– Koyu renkli ambalajlar tercih edilmeli
• İşeretli oldukları
Florokramların yarılanma ömrü iyi bilinmeli
• Primer Antikorlar
(konjuge olmamış) ile çalışırken seçilecek
sekonder antikorun da doğru seçilmesi önemli
•
• Sometimes typical secondary antibodies are either too specific (e.g., recognize only one host species of primary antibody) or too general (e.g., recognize whole IgG and any fragments thereof). In most cases, these limitations can be
overcome by carefully designing the experimental system and choosing the appropriate secondary probe.
The following considerations are useful to consider when choosing a secondary antibody:
• Determine the host species of the primary antibody (mouse anti-tubulin,rabbit anti-CD4, etc.)
• Select an appropriate host species for the secondary antibody (goat anti-mouse IgG, donkey anti-rabbit IgG)
• Consider cross-reactivity or specificity issues of the secondary:
– Cross-adsorbed - for multiple-labeling applications or when using samples with endogenous antibodies
– Specificity - binds to correct fragments, classes or chains of the primary antibody
