SIĞIR, KOYUN, KEÇĠ, MANDADAN ELDE EDĠLEN FARKLI TĠPTEKĠ HÜCRELERĠN SĠNKRONĠZASYONUNDA SERUM
AÇLIĞI VE KONTAK ĠNHĠBĠSYONUN ETKĠLERĠNĠN ARAġTIRILMASI
Proje No:NKUBAP.00.24.AR.12.10
Proje Yürütücüsü:
Prof.Dr. Sezen ARAT
AraĢtırmacı:
Prof.Dr.Metin TUNA
HAZĠRAN 2014 TEKĠRDAĞ
i ÖNSÖZ
Gelecekte daha tehlikeli boyutlara ulaĢacak olan ve günümüzün en önemli sorunlarından biri olan küresel ısınma dünya iklimini ve coğrafyasını değiĢtirmekte bunun sonucu olarak ortaya çıkacak kuraklık ve yaĢam alanlarının daralması önümüzdeki yıllarda canlı hayatını ve buna bağlı olarak insan hayatını tehlike altına sokmaktadır. Bu sorunların çözümü için diğer birçok araĢtırma alanında olduğu gibi hayvancılık alanında da yeni ve ileri modern üretim teknolojileri geliĢtirilmektedir. Bunlardan biri son yıllarda hızlı bir tırmanıĢa geçen nükleer transfer teknolojisi ile genetik yapısı aynı olan hayvanlar oluĢturmaktır.
TÜBĠTAK Gen Mühendisliği ve Biyoteknoloji AraĢtırma Enstitüsü (GMBAE), 1999 yılında ülke için öncelikli araĢtırma alanları ve buna bağlı teknolojileri belirlemek üzere bir çalıĢma yapmıĢ ve bunun sonucunda nükleer transfer teknolojisinin transfer edilmesinin ülke çıkarına olacağına karar vermiĢtir. Bu bağlamda bu projenin yürütücüsü Prof.Dr.Sezen Arat, Amerika BirleĢik Devletleri, Georgia Üniversitersi, Hayvan Bilimleri Bölümü’nde iki yıl süreyle çalıĢmak üzere görevlendirilmiĢtir. Projenin yürütücüsü bu süre zarfında sığır ve domuzların klonlanması üzerine çalıĢmıĢtır. Yürütücü teknolojiyi ülkeye tranfer etmek üzere 2003 yılından bu yana ülkesinde klonlama çalıĢmalarına baĢlamıĢ ve 2009 yılında bir erkek ve 2010 yılında 4 diĢi boz klon buzağı üretmiĢtir. Dünya’nın ilk boz klonları olan bu buzağılar halen sağlıklı olarak yaĢamlarını sürdürmektedir. Ayrıca üç diĢi ve bir erkek klonun sağlılık yavruları da teknolojinin baĢarı ile uygulandığı göstermiĢtir.
Bu stratejik teknolojinin sürdürülebilir hayvansal üretim için geleceğin sigortaları olarak görülen yerli hayvanların koruma programlarında önemli bir yer tutacağı öngörülmektedir. Bu bağlamda teknolojinin geliĢtirilmesi için bu teknolojiye sahip ülkeler çalıĢmalarına devam etmektedirler. Bu proje teknolojinin temel materyallerinden biri olan vücut hücrenin doğru olarak geriye programlanmasında önemli bir basamak olan hücre sinkronizasyonu için uygun yöntemi belirlemek ve böylece teknolojinin geliĢimine katkı sağlamak üzere planlanmıĢtır. Proje Namık Kemal Üniversitesi’nin değiĢik birimlerinden özellikle hücre kültürleri ve hücre analizleri konusunda uzman araĢtırmacılar tarafından yürütülmüĢ ve Namık Kemal Üniversitesi AraĢtırma Projeleri Destekleme Programı NKUBAP.00.24.AR.12.10 proje numarı ile desteklenmiĢtir.
Prof.Dr.Sezen ARAT Proje Yürütücüsü Haziran 2014 (Bu proje raporu Proje Yürütücüsü Prof.Dr. Sezen Arat tarafından yazılmıĢtır)
ii ÖZET
Nükleer transfer (NT) sonucu bir canlının klonlanması yani genetik kopyasının oluĢturulması modern biyoteknolojinin günümüzdeki en ileri noktası ve yardımcı üreme tekniklerinin en geliĢmiĢidir. Bu teknoloji üstün genetik yapıya sahip veya hastalıklara dirençli bireylerin sayısını artırmak için kullanılabileceği gibi aynı zamanda sayıları gittikçe azalan lokal ırkların yok olma sınırından kurtarılması içinde kullanılabilecektir. Ancak ilk klonun üretilmesinden bu yana birçok çalıĢma yapılarak teknoloji iyileĢtirilmeye çalıĢılmıĢ olsa da baĢarı yüzdesi halen istenilen seviyede değildir. Klon embriyosu ölümlerinin vücut hücrelerinin yetersiz geri proglamlanmasının sonucu olan dengesiz gen ekspresyonlari sebebiyle meydana geldiği yaygın bir kanıdır. Donör nükleusun yeniden programlanmasında gerçekleĢen bazı hataların klonlamadaki baĢarısızlıkların temel sebebi olduğu düĢünülür.
Hücre programlamasının ve dolayısıyla klonlama baĢarısının anahtar faktörlerinden biri hücre ile oositin arasındaki uyumdur. Bu nedenle NT’de en önemli basamak klonlanması istenen canlının hücresinin istenilen siklus dönemine getirilmesidir. Projenin amacı farklı tür (sığır, koyun, keçi, manda) çiftlik hayvanından elde edilen farklı tipteki hücrelerin (deri fibroblastı, kas hücresi, kıkırdak hücresi, granulosa hücresi) değiĢik yöntemler kullanılarak (farklı sürelerde serum açlığı ve kontak inhibisyon) hücre siklusunun istenilen dönemine getirilmesini sağlamak, yöntemlerin hücre üzerinde meydana getirebileceği muhtemel zararlı etkileri belirlemek, en iyi sonuç veren ve en zararsız yöntemi tespit etmektir. Sinkronizasyon deneyleri sonucunda hücreler flow sitometre ile canlılık, apoptozis, nekrozis ve hücre siklusu için analiz edilmiĢtir. Bu çalıĢma sonucunda dört hayvan türünde klonlama çalıĢmalarında en az bir kez kullanılmıĢ ve canlı doğum ile sonuçlanmıĢ dört farklı hücre tipi için en yüksek G1/G0 oranı veren ve hücrelere en az zararlı olan bir veya birkaç hücre sinkronizasyon seçeneği belirlenmiĢtir. Bu çalıĢma Ģimdiye kadar bu kadar farklı hücre tipinde farklı sinkronizasyon yöntemlerinin denendiği ve aynı zamanda bu yöntemlerin hücre üzerindeki zararının analiz edildiği ilk çalıĢmadır. Ayrıca genetik kaynakların koruma programları kapsamına alınan dondurulmuĢ hücre bankalarında saklanacak hücrelerde düĢünülerek tüm uygulamalar hem taze hemde donmuĢ hücre kültürlerinde karĢılaĢtırmalı olarak yapılmıĢtır.
Anahtar Kelimeler: Hücre kültürü, hücre siklusu, hücre sinkronizasyonu, geri programlama, nukleer transfer, flow sitometri
iii ABSTRACT
Cloning of organisms with nuclear transfer (NT), namely production of genetic copy of organisms, is the most advanced point of today’s modern biotechnology and assisted reproductive technique. This technology can be used to increase the number of organisms with high genetic structure or disease-resistant individuals as well as to save dwindling number of local breeds from the border of extinction. Although many studies have been done since the first production of the clone to improve this technology, success rate is still not at the desired level. The common belief for clone embryo deaths is the inadequate reprogramming of somatic cells which causes unbalanced gene expression. Some failures that occur during reprogramming of the donor nucleus are considered as the main reason for unsuccessful cloning. The one of the key factors for cell programming, and thus success of cloning, is harmony between the cell and the oocyte. Therefore, the most important step of NT is to synchronize the cells of desired animal at desired cell cycle stage for cloning. The aim of the project is to synchronize different type of cells (such as; skin fibroblast, muscle cells, cartilage cells and granulosa cells) obtained from various species (such as; cattle, sheep, goat and buffalo) at a particular cell cycle stage using a variety of methods (serum starvation, contact inhibition for different duration), to determine the potential harmful effects of methods on these cells, and to determine the less hazardous and the best method. After synchronization experiments, cells were analysed by flow cytometry for cell viability, apoptosis, necrosis and cell cycle stage. As a result of this study, one or a few cell synchronization options giving highest rate of G1/G0 and having lowest harmful effect on cells were identified for four different cell types used at least on time for nuclear transfer studies and resulted live birth. This is the first study in which several synchronization methods were tested on different cell types and harmful effect of those methods on cell were analysed. In addition, thinking of cells stored in frozen cell banks in the scope of genetic resouces conservation program, all methods were applied on both fresh and frozen cells in comparison.
Keywords: cell culture, cell cycle, cell synchronization, reprogramming, nuclear transfer, flow cytometry
iv ĠÇĠNDEKĠLER
ÖNSÖZ ... i
ÖZET ... ii
ABSTRACT ... iii
ĠÇĠNDEKĠLER ... iv, v ġEKĠLLER DĠZĠNĠ ... vi
RESĠMLER DĠZĠNĠ ... vi
TABLOLAR DĠZĠNĠ ... vii, viii,ix,x 1. GĠRĠġ...1
2.GENEL BĠLGĠLER ... 2
3.GEREÇ ve YÖNTEM...…… 6
3.1. Dokuların Alınması...6
3.2. Primer Kültür...6
3.3. Hücre Kültürü...7
3.4. Hücrelerin dondurulması...7
3.5. Sinkronizasyon Deney Grupları...7
3.6. Analiz Yöntemleri...8
3.6.1. Hücre Siklusu Analizi...8
3.6.2. Hücrede Apoptozis ve Nekrozis Analizi...9
4.BULGULAR...11
4.1. Primer kültür...11
4.2.Hücre siklus analizi ...13
4.2.1. Hücre sayısı optimizasyonu...13
4.2.2. PI Boyama optimizasyonu...14
v
4.2.3.Analiz sonuçları ...17
4.3.Hücrede Apoptozis ve Nekrozis Analizi...51
4.3.1. RNase optimizasyon ………..51
4.3.2.Analiz sonuçları ...53
5. TARTIġMA VE SONUÇ...91
6. KAYNAKLAR...104
vi
ġEKĠLLER DĠZĠNĠ Sayfa No
ġekil 3.1. Flow sitometri FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit analiz sonucu örneği...10
ġekil 4.1. 50µg/ml PI ile boyanan kıkırdak hücrelerine ait analiz sonucu...14
ġekil 4.2. 30µg/ml PI ile boyanan kıkırdak hücrelerine ait analiz sonucu...15
ġekil 4.3. 20µg/ml PI ile boyanan kıkırdak hücrelerine ait analiz sonucu...16
ġekil 4.4. Hücre siklus analizi programı kullanılarak fazların yüzdelerinin belirlenmesi...17
ġekil 4.5. Bölünen normal fibroblast hücre grubu...18
ġekil 4.6. Fibroblast hücrelerinde geç konfluent grubu...18
ġekil 4.7. RNase eklenmeyen boyama sonucu ………..51
ġekil 4.8. RNase eklenen boyama sonucu………..52
ġekil 4.9. Canlılık analiz sonuçlarının değerlendirilmesinin gösterimi...53
ġekil 4.10. Bölünen normal fibroblast hücre grubu...54
ġekil 4.11. Fibroblast hücrelerinde erken konfluent grubu...54
RESĠMLER DĠZĠNĠ Resim 4.1. Primer kültürde üreme gösteren kıkırdak hücreleri...11
Resim 4.2. Primer kültürde üreme gösteren kas hücreleri...11
Resim 4.3. Ovaryumdan elde edilen granüloza hücreleri...11
Resim 4.4. Primer kültürde üreme gösteren fibroblast hücreleri...11
Resim 4.5. Primer kültürdeki kas hücrelerinin üremesi. (yaklaĢık 30 günlük kültür)...12
Resim 4.6. Primer kültürdeki kıkırdak hücrelerinin üremesi. (yaklaĢık 10 günlük kültür)...12
Resim 4.7. Primer kültürdeki fibroblast hücrelerinin üremesi. (yaklaĢık 10 günlük kültür)...12
Resim 4.8. Ekimden 1 gün sonra hücrelerin mikroskoptaki görüntüsü. (4×105 hücre)...13
Resim 4.9. Ekimden 3 gün sonra hücrelerin mikroskoptaki görüntüsü. (%50 konfluent)...13
Resim 4.10. Ekimin 6-7. günü hücrelerin mikroskoptaki görüntüsü. (%100 konfluent)...13
vii TABLO DĠZĠNĠ
Tablo 4.1. Erkek sığır taze fibroblast hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları…………...19
Tablo 4.2. Erkek sığır donmuĢ fibroblast hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları……. ..19
Tablo 4.3. Erkek sığır taze kas hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ……….20
Tablo 4.4. Erkek sığır donmuĢ kas hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ………..20
Tablo 4.5. Erkek sığır taze kıkırdak hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ……….21
Tablo 4.6. Erkek sığır donmuĢ kas hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ………..21
Tablo 4.7. DiĢi sığır taze fibroblast hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ………...22
Tablo 4.8. DiĢi sığır donmuĢ fibroblast hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları …………22
Tablo 4.9. DiĢi sığır taze kas hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ……….23
Tablo 4.10. DiĢi sığır donmuĢ kas hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ………...23
Tablo 4.11. DiĢi sığır taze kıkırdak hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ………..24
Tablo 4.12. DiĢi sığır donmuĢ kıkırdak hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları …………25
Tablo 4.13. DiĢi sığır taze granulosa hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları …………...25
Tablo 4.14. DiĢi sığır donmuĢ granulosa hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ……….26
Tablo 4.15. Erkek koyun taze fibroblast hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları………...26
Tablo 4.16. Erkek koyun donmuĢ fibroblast hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları …………...27
Tablo 4.17. Erkek koyun taze kas hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları………...28
Tablo 4.18. Erkek koyun donmuĢ fibroblast hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları…….28
Tablo 4.19. Erkek koyun taze kıkırdak hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ………….29
Tablo 4.20. Erkek koyun donmuĢ kıkırdak hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları……...30
Tablo 4.21. DiĢi koyun taze fibroblast hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları …………..30
Tablo 4.22. DiĢi koyun donmuĢ fibroblast hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ………31
Tablo 4.23. DiĢi koyun taze kas hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ………....32
Tablo 4.24. DiĢi koyun donmuĢ kas hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları………..32
Tablo 4.25. DiĢi koyun taze kıkırdak hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları…………...33
Tablo 4.26. DiĢi koyun donmuĢ kıkırdak hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ………..33
Tablo 4.27. DiĢi koyun taze granulosa hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ………….34
viii
Tablo 4.28. DiĢi koyun donmuĢ granulosa hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ……..34 Tablo 4.29. Erkek keçi taze fibroblast hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ………...35 Tablo 4.30. Erkek keçi donmuĢ fibroblast hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları……....35 Tablo 4.31. Erkek keçi taze kas hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ………....36 Tablo 4.32. Erkek keçi donmuĢ kas hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ……….36 Tablo 4.33. Erkek keçi taze kıkırdak hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ………37 Tablo 4.34. Erkek keçi donmuĢ kıkırdak hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ……….38 Tablo 4.35. DiĢi keçi taze fibroblast hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ……….38 Tablo 4.36. DiĢi keçi donmuĢ fibroblast hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ………...39 Tablo 4.37. DiĢi keçi taze kas hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ………40 Tablo 4.38. DiĢi keçi donmuĢ kas hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ……….40 Tablo 4.39. DiĢi keçi taze kıkırdak hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ………41 Tablo 4.40. DiĢi keçi donmuĢ kıkırdak hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ………….41 Tablo 4.41. DiĢi keçi taze granulosa hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ………42 Tablo 4.42. DiĢi keçi donmuĢ granulosa hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ……….42 Tablo 4.43. Erkek manda taze fibroblast hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ……....43 Tablo 4.44. Erkek manda donmuĢ fibroblast hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları …..44 Tablo 4.45. Erkek manda taze kas hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ………...44 Tablo 4.46. Erkek manda donmuĢ kas hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları …………45 Tablo 4.47. Erkek manda taze kıkırdak hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ………...45 Tablo 4.48. Erkek manda donmuĢ kıkırdak hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları……..46 Tablo 4.49. DiĢi manda taze fibroblast hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları…………..47 Tablo 4.50. DiĢi manda donmuĢ fibroblast hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ……..47 Tablo 4.51. DiĢi manda taze kıkırdak hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları………48 Tablo 4.52. DiĢi manda donmuĢ kıkırdak hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ………49 Tablo 4.53. DiĢi manda taze granulosa hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları…………49 Tablo 4.54. DiĢi manda donmuĢ granulosa hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ……50 Tablo 4.55. AnexinV boyama protokolünde RNase kullanımının etkisi……….52
ix
Tablo 4.56. Erkek sığır taze fibroblast hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları ………..55 Tablo 4.57. Erkek sığır donmuĢ fibroblast hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları ……55 Tablo 4.58. Erkek sığır taze kas hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları ………56 Tablo 4.59. Erkek sığır donmuĢ kas hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları …………..57 Tablo 4.60. Erkek sığır taze kıkırdak hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları…………..57 Tablo 4.61. Erkek sığır donmuĢ kıkırdak hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları………58 Tablo 4.62. DiĢi sığır taze fibroblast hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları ………59 Tablo 4.63. DiĢi sığır donmuĢ fibroblast hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları……….59 Tablo 4.64. DiĢi sığır taze kas hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları………...60 Tablo 4.65. DiĢi sığır donmuĢ kas hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları………..61 Tablo 4.66. DiĢi sığır taze kıkırdak hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları……….61
Tablo 4.67. DiĢi sığır donmuĢ kıkırdak hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları……….62 Tablo 4.68. DiĢi sığır taze granulosa hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları………….63 Tablo 4.69. DiĢi sığır donmuĢ granulosa hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları……..63 Tablo 4.70. Erkek koyun taze fibroblast hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları………64 Tablo 4.71. Erkek koyun donmuĢ fibroblast hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları….65 Tablo 4.72. Erkek koyun taze kas hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları………..65 Tablo 4.73. Erkek koyun donmuĢ kas hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları ………..66 Tablo 4.74. Erkek koyun taze kıkırdak hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları………..67 Tablo 4.75. Erkek koyun donmuĢ kıkırdak hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları……67 Tablo 4.76. DiĢi koyun taze fibroblast hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları…………68 Tablo 4.77. DiĢi koyun donmuĢ fibroblast hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları…….69 Tablo 4.78. DiĢi koyun taze kas hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları……….69 Tablo 4.79. DiĢi koyun donmuĢ kas hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları…………..70 Tablo 4.80. DiĢi koyun taze kıkırdak hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları………….71 Tablo 4.81. DiĢi koyun donmuĢ kıkırdak hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları……...71 Tablo 4.82. DiĢi koyun taze granulosa hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları…..……72 Tablo 4.83. DiĢi koyun donmuĢ granulosa hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları...73
x
Tablo 4.84. Erkek keçi taze fibroblast hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları……….73 Tablo 4.85. Erkek keçi donmuĢ fibroblast hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları……74 Tablo 4.86. Erkek keçi taze kas hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları………75 Tablo 4.87. Erkek keçi donmuĢ kas hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları………..…75 Tablo 4.88. Erkek keçi taze kıkırdak hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları………….76 Tablo 4.89. Erkek keçi donmuĢ kıkırdak hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları……..77 Tablo 4.90. DiĢi keçi taze fibroblast hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları…………..77 Tablo 4.91. DiĢi keçi donmuĢ fibroblast hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları……...78 Tablo 4.92. DiĢi keçi taze kas hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları………79 Tablo 4.93. DiĢi keçi donmuĢ kas hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları……….79 Tablo 4.94. DiĢi keçi taze kıkırdak hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları………80 Tablo 4.95. DiĢi keçi donmuĢ kıkırdak hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları……….81 Tablo 4.96. DiĢi keçi taze granulosa hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları…………81 Tablo 4.97. DiĢi keçi donmuĢ granulosa hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları……..82 Tablo 4.98. Erkek manda taze fibroblast hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları……..83 Tablo 4.99. Erkek manda donmuĢ fibroblast hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları…84 Tablo 4.100. Erkek manda taze kas hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları………….84 Tablo 4.101. Erkek manda taze kas hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları………….85 Tablo 4.102. Erkek manda taze kıkırdak hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları…….85 Tablo 4.103. Erkek manda donmuĢ kıkırdak hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları...86 Tablo 4.104. DiĢi manda taze fibroblast hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları………87 Tablo 4.105. DiĢi manda donmuĢ fibroblast hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları…..88 Tablo 4.106. DiĢi manda taze kıkırdak hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları………...88 Tablo 4.107. DiĢi manda donmuĢ kıkırdak hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları……89 Tablo 4.108. DiĢi manda taze granulosa hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları………90 Tablo 4.109. DiĢi manda donmuĢ granulosa hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları….90
1 1.GĠRĠġ
Nükleer transfer (NT) sonucu bir canlının klonlanması yani genetik kopyasının oluĢturulması modern biyoteknolojinin günümüzdeki en uç noktası ve yardımcı üreme tekniklerinin en geliĢmiĢidir. Bu teknoloji üstün genetik yapıya sahip veya hastalıklara dirençli bireylerin sayısını artırmak için kullanılabileceği gibi aynı zamanda sayıları gittikçe azalan lokal ırkların yok olma sınırından kurtarılması içinde kullanılabilecektir. Bu yüzden Dünya Gıda ve Tarım Organizasyonu (FAO) gen kaynaklarının korunması için ülkeleri belli zamanlarda bir araya getirmekte ve bu toplantılarda gelecekte yok olacak türleri geriye getirmek için hücre bankalarının kurulmasının gerekliliğini tartıĢmaktadır. Kurulacak hücre bankalarının etkin bir Ģekilde kullanılabilmesi, teknolojinin sorunlarının çözülmesine bağlıdır.
Bu nedenle hala bu teknolojiyi kullanabilen ülkeler yoğun olarak araĢtırmalarına devam etmektedirler. Bu projenin de amacı teknolojideki en önemli ve temel basamaklardan biri olan hücre programlamasına katkı sağlıyacak çalıĢmaları içermektedir. Klonlanması istenen canlının hücresi geriye programlanması için çekirdeği alınan oosit (yumurta hücresi) içine bırakılır. Oositin farklılaĢmıĢ bir hücreyi nasıl geriye programlayabildiği hala tartıĢma konusudur ve tam olarak anlaĢılamamıĢtır. Ancak yapılan çalıĢmalar bu bu mekanizmanın düzgün iĢleyebilmesi için oosit içine nakledilen hücrenin G1-G0 fazında olması gerektiğini göstermektedir. Ġn vitro kültür ortamında hücrelerin her biri farklı siklus fazındadır ve bunları aynı faza getirmek için birtakım uygulamalar yapılması gerekir. Ancak bu uygulamalar her tür için ve her hücre tipi için aynı etkiye sahip olmayabilir. Sınırlı sayıda çalıĢma yapılarak belirlenmiĢ ancak her tür ve hücre tipinde birbirinden farklı baĢarı yüzdesi ile rapor edilen en yaygın iki sinkronizasyon yönteminin farklı türlerin farklı hücre tiplerinde daha ayrıntılı ve eĢ zamanlı analizinin yapılması gereklidir. Sunulan projede sığır, koyun, keçi, mandadan elde edilen primer deri, kas, kıkırdak ve granusa hücre hatlarında hücrelerin G1-G0 fazına getirilmesi için değiĢik sürelerde serum açlığı ve kontak inhibisyon uygulanması olarak bilinen sinkronizasyon yöntemleri incelenecek, bu yöntemlerin farklı türlere ait farklı tipteki hücreler üzerindeki etkileri analiz edilecektir. Bu çalıĢma sonucunda hangi türün hangi hücre tipinde hangi yöntemin en yüksek oranda sinkronizasyonu sağladığı tespit edilmeye aynı zamanda uygulamanın sınırları hücre canlılığının ve apotozisin analizi ile belirlenmeye çalıĢılmıĢ, böylece hücreye en az zarar veren yöntemin belirlenmesi hedeflenmiĢtir.
2 2. GENEL BĠLGĠLER
Nükleer transfer (NT) sonucu bir canlının klonlanması yani genetik kopyasının oluĢturulması modern biyoteknolojinin günümüzdeki en uç noktası ve yardımcı üreme tekniklerinin en geliĢmiĢidir. Bu teknoloji üstün genetik yapıya sahip veya hastalıklara dirençli bireylerin sayısını artırmak için kullanılabileceği gibi aynı zamanda sayıları gittikçe azalan lokal ırkların yok olma sınırından kurtarılması içinde kullanılabilecektir. Bu yüzden Dünya Gıda ve Tarım Organizasyonu (FAO) gen kaynaklarının korunması için ülkeleri belli zamanlarda bir araya getirmekte ve bu toplantılarda gelecekte yok olacak türleri geriye getirmek için hücre bankalarının kurulmasının gerekliliğini tartıĢmaktadır. Kurulacak hücre bankalarının etkin bir Ģekilde kullanılabilmesĠ, teknolojinin sorunlarının çözülmesine bağlıdır.
Bu nedenle hala bu teknolojiyi kullanabilen ülkeler yoğun olarak araĢtırmalarına devam etmektedirler.
EriĢkin bir canlının baĢarı ile klonlanması sonucu doğan ilk klon koyun “Dolly” nin (Wilmut ve ark 1997) ardından sığır, keçi, at, domuz, tavĢan, manda, katır, fare tavĢan ve deve gibi birçok memeli türü aynı yöntem ile klonlanmıĢtır (Arat ve ark 2011). Ġlk klonun üretilmesinden bu yana birçok çalıĢma yapılarak teknoloji iyileĢtirilmeye çalıĢılmıĢ olsa da baĢarı yüzdesi halen istenilen seviyede değildir. Bazı çalıĢmalarda %12.5 gibi daha yüksek sonuçlar alınmasına karĢın (Arat ve ark 2011) sığır da dahil olmak üzere çoğu türde NT’in baĢarı ortalaması %0.5 ila 5 arasında değiĢmektedir (Smith ve ark 2000, Solter ve ark 2000, Shi ve ark 2007, Wani ve ark 2010).In vitro fertilizasyon (IVF) ile karĢılaĢtırıldığında embriyonal kayıplar çok fazladır ve embriyoların çoğu hamileliğin 35 ila 60. günleri arasında
%50-100 kayıpla sonuçlanmaktadır (Edwards ve ark 2003). Bu kayıplar tek bir anomaliden çok, geliĢim bozukluğu ve geriliğinden, muhtemel kromozom anomalilerinden, yenidoğanın artan ağırlığından, akciğerdeki anormalliklere, solunum problemlerinden metabolik hasarlara kadar değiĢen komplikasyonlara bağlıdır. NT plasentaları genelde büyük ama az sayıda plasentom, edema ve hidroallantois içerir (Bertolini ve ark 2007, Constant ve ark 2006, Farin ve ark 2006, Hill ve ark 1999). Yavrunun normalden büyük olması ile karakterize büyük yavru sendromu sık görülen bir geliĢme bozukluğudur (Cibelli ve ark 1998,Constant ve ark 2006).
NT etkinliğini arttırmak için birçok çalıĢma yapılmıĢ, genotip (Heyman ve ark 2002), donör hücre çeĢidi (Kato ve ark 2000) ve evresine (Renard ve ark 2002) bağlı olarak küçük değiĢiklikler gözlemlenmiĢ ancak çok büyük bir baĢarı elde edilememiĢtir.
DöllenmemiĢ yumurta hücresi yetiĢkin vücut hücresine özgü gen ekspresyon motiflerinin silinip embriyonal geliĢimin yeniden baĢlatılması için gerekli gen ekspresyonu
3
motiflerini oluĢturabilme potansiyeline sahiptir. Bu olgu yeniden programlama olarak adlandırılır. Yeniden programlanma vücut hücresi çekirdeğinin epigenetik olarak tekrar ayarlanması ile oluĢturulur ancak yeniden programlama mekanizması tam olarak bilinmemektedir. Birçok klon embriyo anormal büyük plasentaya sahiptir ve embriyogenesisin değiĢik geliĢim evresinde veya doğum öncesi dönemde ölürler (Ogura ve ark 2002). Klon embriyosu ölümlerinin vücut hücrelerinin yetersiz yeniden proglamlanmasinin sonucu olan dengesiz gen ekspresyonlari sebebiyle meydana geldiği yaygın bir kanıdır. NT iĢlemi esnasında oosit (yumurta hücresi), donör (vücut hücresi) nukleusu orijinal halinden zigotik nukleusa dönüĢtürür. Donör nükleusun yeniden programlanmasında gerçekleĢen bazı hataların klonlamadaki baĢarısızlıkların temel sebebi olduğu düĢünülür. Hücre programlamasının ve dolayısıyla klonlama baĢarısının anahtar fakörlerinden biri hücre ile oositin arasındaki uyumdur (Campbell ve ark 1996). Bu nedenle NT’de en önemli basamak hücrenin istenilen siklus dönemine getirilmesidir.
Hücre siklusu dört fazdan oluĢur. Mitozu takiben iki kardeĢ hücre G1 fazına girer. Bu dönemdeki hücre büyür ve hücre dıĢı büyüme faktörlerine cevap verir. Yine bu dönemde kromozom yoğunlaĢması kaybolur ve tekrar çekirdek zarfı oluĢur. Bunu takip eden S fazında ise DNA replikasyonu meydana gelir. G2 fazında ise yeniden kromozomlar yoğunlaĢır ve hücre mitoza girer. Mitoz esnasında kromozomlar yoğunlaĢmıĢ olarak kalır. Nükleer transfer çalıĢmalarında çoğunlukla G1/GO fazındaki hücreler seçilir. Bu dönemdeki hücrelerin geriye programlanmaya daha uygun ve daha yüksek oranda normal embriyo geliĢimi ile sonuçlandığı bildirilmiĢtir (Wilmut ve ark 1997, Baguisi ve ark 1999, Kubota ve ark 2000, Polejaeva ve ark 2000, Arat ve ark 2001a, Gibbons ve ark 2002). Buna karĢın diğer hücre siklus dönemlerindeki hücrelerin örneğin S fazında olanların kullanıldığı durumda erken kromozom yoğunlaĢması sonucu kromozomal anomali, G2/M fazında olanların kullanıldığı durumda ise aneploidi sonucu düĢük embryo geliĢimi görüldüğü bildirilmiĢtir(Campbell ve ark 1996).
Hücreler G1/GO fazına değiĢik Ģekillede getirilebilirler. Kumulus hücreleri elde edildikleri anda bu dönemdedirler ve hemen NT için kullanılabilirler. Eğer hücreler kültüre ediliyorsa bölünen hücre populasyonunda çok değiĢik dönemlerde hücre vardır. Bu hücreleri istenen döneme getirmek için serum starvasyonu (düĢük serum varlığında kültür) uygulanabilir ve böylece hücreler yeteri kadar beslenemedikleri için dinlenme fazına yani G0 fazına geçerler. Ġlk baĢarılı NT çalıĢmasında bu yöntem kullanılmıĢtır (Wilmut ve 1997). Diğer yöntemde hücreler kültür kaplarını kapladıklarında birbirleri ile temas ettikleri için (kontak inhibisyon) S fazına geçemezler ve G1’de kalırlar. Bazı NT çalıĢmalarında bu yöntem
4
kullanılmıĢtır (Cibelli ve ark 1998, Arat ve ark 2001b, Arat ve ark 2002, Gerger ve ark 2010, Arat ve ark 2011). Bir baĢka yöntem ise siklin kinaz inhibitörü gibi (roskovitin, dimetil sulfoksit, siklohekzimid) bazı kimyasallar kullanılarak hücrelerin G1 fazında bloklanmasıdır ve bazı NT çalıĢmalarında da bu yöntem kullanılmıĢtır (Arat ve ark 2001b, Gibbons ve ark 2002, Goissis ve ark 2007, Hashem ve ark 2006). Bu sinkronizasyon ajanlarının kullanımı hücre siklusunu düzenlemede etkili olmakla birlikte DNA hasarına sebep olarak hücre hasarı veya ölümü ile sonuçlanabilen toksik etkileri beraberinde getirebilir (Koo ve ark, 2009). Benzer bir durumunda serum starvasyonu sonucu görüldüğüne dikkat çeken ve gerek embriyonal dönemde gerekse doğum sonrası ölümlerin bu yöntemin sebep olduğu DNA hasarlarına veya apostozise bağlı olabileceğini iddia eden çalıĢmalar da vardır (Kato ve ark 1998, Wells ve ark 1998a, Hill ve ark 1999, Gibbons ve ark 2002). Ancak hücre kültüründe serum starvasyonunun apoptozise sebep olduğunu gösteren çalıĢmalar oldukça sınırlıdır ve eriĢkin hücre (Peng ve ark 1998, Dalman ve ark 2010) ile yapılmıĢ birkaç çalıĢma dıĢında çoğu fetal hücrelerde yapılmıĢtır (Peura ve ark 2001, Kues ve ark 2002, Cho ve ark 2005). Buna karĢın serum strarvasyonunun herhangi bir olumsuz etkisine rastlanmadığını rapor eden bir çalıĢmada mevcuttur (Lima-Neto ve ark 2010). Bunun yanı sıra sinkronizasyonda kullanılan kimyasal ajanlar farklı tip hücrelerde farklı reaksiyonlara sebep olabilir. Bununla ilgili ise ayrıntılı bir çalıĢmaya rastlanmamıĢtır. Bugüne kadar; fibroblastlar, meme bezi hücresi, kumulus hücresi, ovidukt hücresi, lokositler, granulosa hücresi, üreme hücresi, kas hücresi, karaciger hücresi gibi çok değiĢik eriĢkin hücre tipleri klonlama çalıĢmalarında kullanılmıĢ farklı baĢarı oranları ile sonuçlanmıĢtır (Brem ve ark 2002). Daha sonra klonlamada kullanılabileceği gösterilen hücre tiplerine böbrek hücresi (Adams ve ark 2004) ve kıkırdak hücresi (Arat ve ark 2011) gibi yenileri eklenmiĢtir. Ancak bu çalıĢmaların hiçbirinde uygulanan sinkronizasyon yöntemlerinin hücre üzerinde nasıl etki yaptığı incelenmemiĢtir.
Birçok türün klonlanmasından sonra nükleer transfer teknolojisi özellikle nesli tehlike altındaki türlerin korunma programlarında ele alınmaya baĢlanmıĢtır. Yıllar önce teknolojinin nesli tehlike altındaki türlerin korunmasına nasıl fayda sağlıyacağı ile ilgili bir rapor yayınlanmıĢtır (Wells ve ark 1998b). Bu nedenle gen bankalarında artık sadece dondurulmuĢ sperma ve embriyo saklamak yerine aynı zamanda dondurulmuĢ hücrelerin saklanması da önerilmektedir (Ryder ve ark 2002, Andrabi ve ark 2007, Leon-Quinto ve ark 2009).
Ülkemizde ve dünyada ilk kez gen bankasında saklanan hücreler ile sayıları azalan bir yerli ırkımız klonlanmıĢ ve yukarıda bahsedilen varsayım ve öneriler somut veriler ile kanıtlanmıĢtır (Arat ve ark 2011).
Literatür bilgilerinden anlaĢıldığı üzere çoğunlukla tek, bazen iki hücre tipi kullanılarak
5
sınırlı sayıda yapılan denemelerle geliĢtirilen hücre sinkronizasyon yöntemlerinin farklı türlerde ve farklı tipteki hücrelerde uygulandığı çeĢitli NT çalıĢmalarında standart sonuçların alınamaması ve baĢarı oranlarının çok değiĢken seyretmesi bu yöntemlerin farklı türlerde ve farklı tip hücrelerde daha ayrıntılı incelenmesi gerektiğini ortaya koymaktadır. Ayrıca yöntemlerin hücre üzerindeki toksik etkilerinin de varsayımdan öte in vitro çalıĢmalar ile ortaya çıkarılmaya ihtiyacı vardır. Yöntemlerin hücreye zararı ile ilgili çeliĢkili raporlarda konunun yeterince aydınlatılmadığını göstermekte, daha fazla türde ve çeĢitli hücre tiplerinde aynı anda yapılacak çalıĢmalara ihtiyaç olduğunu iĢaret etmektedir. Ayrıca gelecekte kaybolan tür veya ırkların geriye getirilmesinde kullanılacak hücrelerin hücre bankalarında dondurulmuĢ olarak saklanmıĢ olacağı düĢünülürse bu donmuĢ hücrelere uygulanacak her türlü sinkronizasyon yönteminin de verimliliğini ve hücreye verebileceği zararı belirlemek önemlidir.
Sunulan projede sığır, koyun, keçi, mandadan elde edilen primer deri, kas, kıkırdak ve granulosa hücre hatlarında hücrelerin G1-G0 fazına getirilmesi için değiĢik sürelerde serum açlığı ve kontak inhibisyon uygulanması olarak bilinen sinkronizasyon yöntemleri incelenerek, bu yöntemlerin farklı türlere ait farklı tipteki taze ve dondurulmuĢ hücreler üzerindeki etkileri analiz edilmiĢtir. Bu çalıĢma sonucunda hangi türün hangi hücre tipinde hangi yöntemin en yüksek oranda sinkronizasyonu sağladığı tespit edilmeye çalıĢılmıĢ, aynı zamanda uygulamanın hücre canlılığı üzerindeki etkileri de incelenerek hücreye en az zarar veren yöntem belirlenmeye çalıĢılmıĢtır. Tüm calıĢma hem taze hem dondurulmuĢ hücrelerde karĢılaĢtırmalı yapılarak özellikle dondurulmuĢ hücrelerde sonuçlarda fark olup olmadığı incelenmiĢtir. DondurulmuĢ hücrelerin sonuçları özellikle hücre bankalarında saklanan hücrelerle yapılacak çalıĢmalar için ayrı bir önem taĢımaktadır.
6 3.GEREÇ ve YÖNTEM
3.1. Dokuların Alınması
ÇalıĢma materyalini mezbada kesinlen sığır, koyun, keçi, manda gibi hayvanlardan elde edilen farklı dokular oluĢturmuĢtur. Her bir türden bir erkek bir diĢi hayvana (toplam 8 hayvan) ait doku parçaları alınmıĢtır. Bu dokular erkek için kas, kulaktan alınan kıkırdak ve deri fibroblast dokusu iken, diĢi için bu dokuların yanında ovaryumdan elde edilen granülosa hücreleridir.
Dokular temiz bistüri uçları ile alındıktan sonra % 5 Antibiyotik-antimikotik (Gibco-15240-062) içeren tuzlu fosfat tampon (PBS) çözeltisi içerisinde ve soğuk ortamda muhafaza edilerek en geç 2 saat içerisinde laboratuvara getirilmiĢtir. Ekim iĢlemine kadar +4 °C’de saklanmıĢtır.
3.2. Primer Kültür
Henüz kesilmiĢ hayvanın (tek hayvan) kulak dokusu, bacak kası doku parçası, ve ovaryumları %5 Antibiyotik-antimikotik (Gibco-15240-062) içeren DPBS (Sigma- D5652) içerisinde laboratuara getirilmiĢtir. Hücre izolasyonu ve kültürü daha önce açıklandığı gibi yapılmıĢtır (Arat 2011). Özetle; laboratuvara getirilen ve +4 °C’de saklanan dokular %5 antibiyotik-antimikotik içeren DPBS (Sigma- D5652) ile yıkandıktan sonra steril bistüri ucu ile küçük parçalara (1mm3) ayrılarak 35mm kültür petrilerine ekilmiĢtir. Doku parçalarının yapıĢmasının ardından tüm dokuların yüzeyini kaplayacak Ģekilde % 15 fetal buzağı serumu (FBS), %1 antibiyotik (Biochrom-A2213) içeren hücre kültür medyumu (DMEM/F12) (Gibco- 32500-035) ile kaplanmıĢtır. Ekim yapılan doku petrileri 37°C ve %5 CO2 içeren inkübatöre yerleĢtirilmiĢtir. Kültür baĢlangıcından 10-12 gün sonra doku parçalarından hücre üremeleri incelenerek kültür ortamının medyumu değiĢtirilmiĢtir. Kültür kabını kaplayan hücreler büyük doku parçaları uzaklaĢtırıldıktan sonra %0.25 tripsin-EDTA (Gibco-25200-056) solusyonu ile kaldırılıp 60 mm'lik kültür petrilerine transfer edilmiĢtir(Arat ve ark 2011).
Ovaryumların follikülerinden aspire edilen garanulosa hücreleri de 35 mm’lik kültür kaplarına ekildikten sonra aynı kültür ortamında kültür kaplarını kaplayana kadar kültüre edilmiĢ, ardından tripsinlerenek kaldırılmıĢ ve 60 mm 'lik kültür petrilerine transfer edilmiĢtir(Arat ve ark 2011).
7 3.3. Hücre Kültürü
Primer kültür sonrası konfluent olan petrilerden doku parçaları aspirasyon yöntemi ile alınmıĢtır. Petrilerdeki besiyeri çekildikten sonra DPBS (Sigma- D5652) ile yıkanmıĢ, %0.25 tripsin-EDTA (Gibco-25200-056) solusyonu eklenerek 5 dakika boyunca 37°C ve %5 CO2 içeren inkübatöre kaldırılmıĢtır. Ardından konulan tripsinin inaktive olması için tripsin miktarının 2 katı kadar %10 FBS (Sigma- F9665),, %1 antibiyotik (Biochrom-A2213) içeren DMEM F12 (Gibco- 32500-035) eklenerek hücreler pipetlenerek tek hücre süspansiyonu haline getirilmiĢtir. Hücreler 15 ml’lik santrifüj tüplerine aktarılarak 6 dk 1000 rpmde santrifüj edilmiĢ, ardından hücreler %10 FBS (Sigma- F9665), %1 antibiyotik (Biochrom-A2213) içeren DMEM/F12 (Gibco- 32500-035) ile sulandırılarak 60 mm’lik kültür petrilerine ekilmiĢtir.
Aynı zamanda bir kısım hücreler dondurularak saklanmıĢtır (Arat ve ark 2011).
3.4. Hücrelerin dondurulması
Doku eksplantlarından üreyen hücreler tripsinlenerek (Gibco-25200-056) 60 mm'lik kültür petrilerine transfer edilmiĢtir. Kültür kaplarını kaplayan hücreler tekrar tripsinlenmiĢ bir kısmı sinkronizasyon çalıĢması yapmak için tekrar ekilirken bir kısmı ise dondurulmuĢtur.
Dondurma sıvısı olarak %80 FBS(Sigma- F9665) ve %20 DMSO ( Sigma-Aldrich-D5879) içeren ve +4 °C’de saklanan dondurma medyumu ve DMEM/F12 (Gibco- 32500-035) içinde süspanse olarak bulunan hücreler 1:1 oranın karıĢtırılarak dondurma tüplerine konmuĢtur.
Hücreleri içeren dondurma tüplerdeki final konsantrasyon %40 FBS (Sigma- F9665), , %10 DMSO (Sigma- D5879) ve %50 DMEM/F12 olmuĢtur (Gibco- 32500-035) . Tüpler ısıyı 1
oC/dk düĢüren dondurma kaplarındaki gözlere yerleĢtilmiĢ ve dondurma kabı -80 °C derin dondurucuya konmuĢtur (Arat ve ark 2011).
Yapılan tüm analizlerde kullanılan hücrelerin pasaj sayısı 2 ile 6 arasındadır.
3.5. Sinkronizasyon Deney Grupları
1. Hücreler kültür kabına ekilerek %10 FBS içeren DMEM/F12 medyumunda kültüre edilmiĢ, konfluent olmadan yani kültür kabını kaplamadan tripsin ile kaldırılmıĢ ve analiz için hazırlanmıĢtır (bölünen normal hücre grubu).
2. Hücreler kültür kabına ekilerek %10 FBS içeren DMEM/F12 medyumunda kültüre edilerek konfluent olmaları yani kültür kabını tamamen kaplaması sağlanmıĢtır (Kontak Ġnhibisyon). Ertesi gün hücreler tripsin ile kaldırılarak analiz için hazırlanmıĢtır (erken konfluent grubu).
3. Hücreler konfluent olmasının ardından 72 saat boyunca %10 FBS içeren medyumda
8
kültüre edilmeye devam edilmiĢ, sürenin sonunda hücreler tripsin ile kaldırılarak analiz için hazırlanmıĢtır (geç konfluent grubu).
4. Hücreler konfluent olmasının ardından 72 saat boyunca %5 FBS içeren medyumda kültüre edilmeye devam edilmiĢ, sürenin sonunda hücreler tripsin ile kaldırılarak analiz için hazırlanmıĢtır (geç konfluent ve serum oranı düĢük grup).
5. Hücreler kültür kabına ekilerek %10 FBS içeren DMEM/F12 medyumunda 24 saat kültüre edilmiĢ, ve konfluent olmadan medyum % 0.5 FBS içeren DMEM/F12 medyumuyla değiĢtirilmiĢtir. Bu düĢük serumlu ortamda hücreler 72 saat kültüre edilmiĢ, sürenin sonunda hücreler tripsin ile kaldırılarak analiz için hazırlanmıĢtır (72 saat serum açlığı grubu).
6. Hücreler kültür kabına ekilerek %10 FBS içeren DMEM/F12 medyumunda 24 saat kültüre edilmiĢ, ve konfluent olmadan medyum % 0.5 FBS içeren DMEM/F12 medyumuyla değiĢtirilmiĢtir. Bu düĢük serumlu ortamda hücreler 120 saat kültüre edilmiĢ, sürenin sonunda hücreler tripsin ile kaldırılarak analiz için hazırlanmıĢtır(120 saat serum açlığı grubu).
Bu deney grupları 4 farklı türden (sığır, koyun, keçi, manda) elde edilen tüm hücre tiplerine (fibroblast, kas, kıkırdak, granüloza) ve aynı dokulardan elde edilen dondurulup çözülen hücrelere uygulanmıĢtır.
3.6. Analiz Yöntemleri 3.6.1. Hücre Siklusu Analizi
Analiz edilecek hücreler %0.25 Tripsin-EDTA (Gibco-25200-056) solusyonu ile kültür kabından kaldırılmıĢ ve, santrifüj edilmiĢtir. Hücreler DPBS (Sigma- D5652) ile yıkandıktan sonra tekrar santrifüj edilmiĢ ve 1 ml DPBS (Sigma- D5652) ile sulandırılmıĢ, ardından 3 ml soğuk etanol (%70) ilavesi ile 4oC de 20 dk bekletilerek fiske edilmiĢtir. Fikse edilen hücreler DPBS (Sigma- D5652) ile tekrar yıkandıktan sonra hücre peleti 500 µl DPBS içerisinde 20 µg/ml propidium iodide (PI) (Sigma-P4864), 100 µg/ml RNase A ( AppliChem A3832,0050),
%0,1 Triton X 100 (CAS 9002-93-1) içeren boyama solüsyonu ile 37º C yarım saat bekletildikten sonra flow sitometri cihazı (Partec-CyFlow Space) ile analizler yapılmıĢtır.
G0/G1, S, G2/M fazlarındaki hücrelerin oranı hesaplanmıĢtır (Gibbons ve 2002, Dalman ve 2010).
9 3.6.2. Hücrede Apoptozis ve Nekrozis Analizi
Analiz edilecek hücreler %0.25 Tripsin-EDTA (Gibco-25200-056) solusyonu ile kültür kabından kaldırılmiĢ, santrifüj tüplerine aktarılarak santrifüj edilmiĢtir. Santrifuj sonrası sulandırılan hücreler hemostometre kullanılarak sayılmıĢtır. Hücre peleti soğuk PBS ile iki kez yıkandıktan sonra kit içerisinde bulunan Binding Buffer (1Х)’ dan 200 µl eklenerek hücreler (hücre yoğunluğu 2-5 Х 105/ml olacak Ģekilde) süspansiyon haline getirilmiĢtir. Bu hücre süspansiyonunun 195 µl’sine 5 µl Annexin V FITC (eBioscience- BMS500FI/300CE) eklenmiĢ ve 10 dk oda sıcaklığında, karanlık ortamda inkübe edilmiĢtir. Hücreler 200µl Binding Buffer (1Х) ile yıkanmıĢ ve 190 µl Binding Buffer (1Х) ile tekrar süspansiyon haline getirilmiĢtir. Bu süspansiyona 10 µl Propidium Iodide (20µg/ml) ve 100 µg/ml RNaseA eklenmiĢ ve 10 dk oda sıcaklığında, karanlık ortamda inkübe edilmiĢtir. Hücreler soğuk DPBS (Sigma- D5652) ile yıkandıktan sonra her tüpe 500 µl DPBS (Sigma- D5652) eklenerek BD FACS Calibur Flow Cytometer cihazında analizi yapılmıĢtır.
Analiz sonucu aĢağıdaki Ģekilde değerlendirilmiĢtir:
Nekrotik Hücreler: PI pozitif, Annexin V negatif Canlı Hücreler: PI negatif, Annexin V negatif
Geç Apoptotik Hücreler: PI pozitif Annexin V pozitif Erken Apoptotik Hücreler: PI negatif Annexin V pozitif
10
ġekil 3.1. Flow sitometri FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit analiz sonucu örneği
Ġstatistiksel Analizler
ÇalıĢmada her grup üç kez tekrar edilmiĢ hem siklus hemde hücre canlılık analizlerinin üçer tekrarı istatistiksel analizde kullanılmıĢtır. Hücrelerin canlılık ve siklus analizleri yapıldıktan sonra SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) programı kullanılarak istatistiksel analiz yapılmıĢtır. SPSS programında One-Way ANOVA (tek yönlü varyans analizi) testi kullanılarak deney grupları arasındaki fark Duncan önemlilik testine göre değerlendirilmiĢtir.
(P<0.05)
11 4.BULGULAR
4.1. Primer kültür
Her bir türden (sığır, koyun, keçi, manda) alınan çeĢitli dokulardan (kulak, kas, ovaryum) primer kültür yapılarak hücreler elde edilmiĢtir. Alınan kulak dokusundan deri fibroblastı ve kulak kıkırdak hücreleri, kas dokusundan kas hücreleri elde edilirken ovaryum foliküllerinin aspirasyonu ile granüloza hücreleri elde edilmiĢtir. Primer kültür oluĢturulduktan sonra her gün periyodik olarak kontaminasyon olup olmadığı kontrol edilmiĢtir.
Sığırdan ve koyundan alınan dokularla oluĢturulan primer kültürlerde ekimin 7. günü fibroblast, kıkırdak ve kas hücrelerinde üreme olduğu gözlemlenmiĢtir. (Resim 4.1,Resim 4.2, Resim 4.4) Hücre tiplerinin üremeleri karĢılaĢtırıldığında her iki tür için de fibroblast hücrelerinin üremesinin kıkırdak ve kas hücrelerine oranla daha hızlı olduğu, en yavaĢ üreyen hücre tipinin ise kas hücreleri olduğu görülmüĢtür. Granulosa hücrelerinin ise ekimin ertesi günü üremeye baĢladığı tespit edilmiĢtir. (Resim 4.3)
12
Keçiden alınan dokularla oluĢturulan primer kültürlerde ekimin 20. günü fibroblast ve kıkırdak hücrelerinde üreme gözlenirken, 22.günü kas hücrelerinde üreme olduğu gözlemlenmiĢtir. Hücre tiplerinin üremeleri karĢılaĢtırıldığında her iki tür için de fibroblast hücrelerinin üremesinin kıkırdak ve kas hücrelerine oranla daha hızlı olduğu, en yavaĢ üreyen hücre tipinin ise kas hücreleri olduğu görülmüĢtür. Granulosa hücrelerinin ise ekimin ertesi günü üremeye baĢladığı tespit edilmiĢtir.
Mandadan alınan dokularla oluĢturulan primer kültürlerde ekimin 10. günü üreme olup olmadığı kontrol edilmiĢ, üreme gözlenememiĢtir. Ekimin 20. günü tekrar kontrol edilen kültürlerde üremenin olmadığı gözlemlenmiĢ, ardından yapılan araĢtırmalar sonucu manda türü ile yapılan bazı çalıĢmalarda yüksek glikoz içeren besiyerinin kullanıldığı görülmüĢ, bunun üzerine kültüre yüksek glikozlu besiyeri (12800-017) ile devam edilmiĢtir. Besiyerinin değiĢtilmesinin ardından ekimin 27. günü erkek mandanın fibroblast ve kıkırdak hücrelerinde, 35. günü diĢi mandanın fibroblast ve kıkırdak hücrelerinde, 45. gün erkek mandanın kas hücrelerinde üreme olduğu gözlemlenmiĢtir. DiĢi mandanın kas dokusundan oluĢturulan primer kültürde ise 50 gün geçmesine rağmen üreme gözlenememiĢtir. Manda ırkının soyunun tükeniyor olması ve kesiminin belirli illerde, belirli sayıda yapılması nedeniyle diĢi mandanın kas dokusu tekrar alınamamıĢ, deneyden çıkartılmasına karar verilmiĢtir.
Granulosa hücrelerinin ise ekimin ertesi günü üremeye baĢladığı tespit edilmiĢtir.
13 4.2.Hücre siklus analizi
4.2.1. Hücre sayısı optimizasyonu
Analiz gruplarını oluĢturmadan önce bir optimizasyon çalıĢması yapılmıĢtır. Hücreler 60 mm kültür kabına 4×105 olarak ekilmiĢ (Resim 4.8), kültür kabını tamamen kapladıkları yani %100 konfluent olduklarında hücreler sayılmıĢ ve sayının 35-36 ×105 olduğu bulunmuĢtur. (Resim 4.10) Aynı sayıda ekilen hücreler 3. gün sonra 16×105 hücreye ulaĢmıĢ ve %50 konfluent kabul edilmiĢtir. (Resim 4.9).
14 4.2.2. PI Boyama optimizasyonu
Literatür taraması sonucu bulunan protokellerde boya solüsyonunda PI (Sigma- P4864) konsantrasyonunun 20µg/ml ile 50µg/ml arasında değiĢtiği görülmüĢtür. Miktarın sonuçları ne ölçüde etkilediği üzerinde bir çalıĢma yapılarak uygulanacak PI (Sigma-P4864) konsantrasyonu belirlenmiĢtir. Fibroblast ve kıkırdak hücreleri konfluent olduktan sonra fikse edilip aĢağıda belirtildiği Ģekilde protokole uygun olarak boyama iĢlemi gerçekleĢtirilmiĢtir.
Fibroblast hücreleri (1 milyon hc/500µl) 50µg/ml PI ile boyandı.
Fibroblast hücreleri (1 milyon hc/500µl) 30µg/ml PI ile boyandı.
Fibroblast hücreleri (1 milyon hc/500µl) 20 µg/ml PI ile boyandı.
Kıkırdak hücreleri (1 milyon hc/500µl) 50µg/ml PI ile boyandı.
Kıkırdak hücreleri (1 milyon hc/500µl) 30µg/ml PI ile boyandı.
Kıkırdak hücreleri (1 milyon hc/500µl) 20 µg/ml PI ile boyandı.
ġekil 4.1. 50µg/ml PI ile boyanan kıkırdak hücrelerine ait analiz sonucu.
15
ġekil 4.2. 30µg/ml PI ile boyanan kıkırdak hücrelerine ait analiz sonucu.
16
ġekil 4.3. 20µg/ml PI ile boyanan kıkırdak hücrelerine ait analiz sonucu.
Grafiklerde: M1 G0/G1 fazını M2 S fazını
M3 G2/M fazını göstermektedir.
Yapılan optimizasyon çalıĢmaları sonucunda denenen boya miktarlarının sonucu etkilemediği 20µg/ml PI’ın (Sigma-P4864) yeterli olduğu tespit edilmiĢtir.
17 4.2.2.Analiz sonuçları
PI (Sigma-P4864) boya ile boyanan hücreler Partec Flow Sitometri cihazında okutularak hücre siklus analizleri yapılmıĢtır. Partec Flow Sitometri cihazının hücre siklusu analizi için oluĢturulan program kullanılarak piklerin hangi fazda olduğu ve bu fazların yüzdeleri hesaplanmıĢtır.
ġekil 4.4. Hücre siklus analizi programı kullanılarak fazların yüzdelerinin belirlenmesi G0/ G1 fazındaki
hücreler
S fazındaki hücreler
G2/ M fazındaki hücreler Fazlara göre
hücrelerin yüzdeleri
18
Yapılan hücre siklus analizlerinden iki tanesi örnek olarak aĢağıda verilmiĢtir.
ġekil 4.5. Bölünen normal fibroblast hücre grubu
ġekil 4.6. Fibroblast hücrelerinde geç konfluent grubu
19 Sığır hücrelerinde siklus analiz sonuçları
HAYVAN GRUP HÜCRE % G0/G1 % S % G2/M SIĞIR
ERKEK
1 FĠB 54,32±3,54e 23,13±4,34a 23,65±3,64a SIĞIR
ERKEK
2 FIB 78,10±0,10b 7,15±0,17c 7,15±0,17c SIĞIR
ERKEK
3 FĠB 80,77±1,41a 4,98±0,87c,d 4,98±0,87d SIĞIR
ERKEK
4 FĠB 79,75±0,47b 7,26±0,36c 7,26±0,36b SIĞIR
ERKEK
5 FĠB 69,53±0,24d 14,79±0,45a 14,79±0,45b,c SIĞIR
ERKEK
6 FĠB 81,37±1,01a 4,30±0,43d 4,30±0,43b,c,d Tablo 4.1. Erkek sığır taze fibroblast hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
HAYVAN GRUP HÜCRE %G0/G1 % S % G2/M SIĞIR
ERKEK
1 FĠB 51,56±0,86f 31,42±0,69a 28,32±0,14b SIĞIR
ERKEK
2 FIB 69,67±0,29e 11,58±0,31b 18,76±0,35b SIĞIR
ERKEK
3 FĠB 82,30±0,24b 7,49±0,22e 10,29±0,08e SIĞIR
ERKEK
4 FĠB 77,31±0,09d 10,23±0,94c 12,31±0,38c SIĞIR
ERKEK
5 FĠB 79,54±0,31c 8,47±0,11d 11,56±0,32d SIĞIR
ERKEK
6 FĠB 87,55±0,27a 2,12±0,05f 10,44±0,41e
Tablo 4.2. Erkek sığır donmuĢ fibroblast hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
Erkek sığır taze fibroblast hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon uygulamaları kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢtir ancak en yüksek G0/G1 oranı (P<0.05) grup 3 (geç konfluent) ve grup 6(120 gün serum açlığı) da elde edilmiĢtir. (Tablo 4.1)
Erkek sığır donmuĢ fibroblast hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon uygulamaları kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢtir ancak en yüksek G0/G1 oranı grup 6(120 gün serum açlığı) da elde edilmiĢtir. (Tablo 4.2)
20
HAYVAN GRUP HÜCRE % G0/G1 % S % G2/M SIĞIR
ERKEK
1 KAS 51,48±0,15g 29,63±0,23a 19,43±0,10c SIĞIR
ERKEK
2 KAS 67,43±0,40d 12,59±0,22c 20,72±0,30b SIĞIR
ERKEK
3 KAS 77,68±0,20a 9,59±0,31e 12,62±0,20e SIĞIR
ERKEK
4 KAS 78,17±0,20a 6,54±0,34e 15,46±0,33c SIĞIR
ERKEK
5 KAS 75,05±0,21c 10,71±0,50c 14,61±0,36d SIĞIR
ERKEK
6 KAS 76,49±0,36b 2,61±0,14f 20,33±0,17a Tablo 4.3. Erkek sığır taze kas hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
HAYVAN GRUP HÜCRE %G0/G1 % S % G2/M SIĞIR
ERKEK
1 KAS 67,47±0,42f 23,48±0,37a 9,48±0,10c SIĞIR
ERKEK
2 KAS 78,78±0,16e 11,10±0,08b 10,22±0,10b SIĞIR
ERKEK
3 KAS 82,46±0,34d 5,69±0,28d 11,84±0,10a SIĞIR
ERKEK
4 KAS 83,41±0,37c 5,77±0,11d 11,52±0,29a SIĞIR
ERKEK
5 KAS 87,22±0,24b 6,32±0,11c 6,55±0,25e SIĞIR
ERKEK
6 KAS 90,26±0,13a 2,52±0,40e 7,18±0,18d Tablo 4.4. Erkek sığır donmuĢ kas hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
Erkek sığır taze kas hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon uygulamaları kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢtir ancak en yüksek G0/G1 oranı (P<0.05) grup 3 ve 4 (geç konfluent ve geç konfluent ve serum oranı düĢük ) de elde edilmiĢtir. (Tablo 4.3.)
Erkek sığır taze kas hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon uygulamaları kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢtir ancak en yüksek G0/G1 oranı (P<0.05) grup 6 (120 saat serum açlığı grubu) da elde edilmiĢtir. (Tablo 4.4.)
21
HAYVAN GRUP HÜCRE % G0/G1 % S % G2/M SIĞIR
ERKEK
1 KIK 51,05±0,41g 22,17±0,15a 27,70±0,21a SIĞIR
ERKEK
2 KIK 67,32±0,11d 9,55±0,33d 25,13±0,59b SIĞIR
ERKEK
3 KIK 77,49±0,39a 9,56±0,33d 12,51±0,33f SIĞIR
ERKEK
4 KIK 72,96±0,13d 13,06±0,13b 15,42±0,31d SIĞIR
ERKEK
5 KIK 74,69±0,46c 11,89±0,37c 13,58±0,43e SIĞIR
ERKEK
6 KIK 76,22±0,19b 7,39±0,40e 16,30±0,07c Tablo 4.5. Erkek sığır taze kıkırdak hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
HAYVAN GRUP HÜCRE % G0/G1 % S %G2/M SIĞIR
ERKEK
1 KIK 53,37±0,24g 23,16±0,66a 21,76±0,31f SIĞIR
ERKEK
2 KIK 79,91±0,04d 7,00±0,20000b 13,03±0,03a SIĞIR
ERKEK
3 KIK 82,85±0,66c 4,66±0,33645d 12,45±0,34b SIĞIR
ERKEK
4 KIK 83,28±0,17c 5,53±0,35791c 13,61±0,37a SIĞIR
ERKEK
5 KIK 86,18±0,18a 1,55±0,21e 13,55±0,34a SIĞIR
ERKEK
6 KIK 85,12±0,01b 1,55±0,22e 13,47±0,31a Tablo 4.6. Erkek sığır donmuĢ kıkırdak hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
Erkek sığır donmuĢ kıkırdak hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon uygulamaları kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢtir ancak en yüksek G0/G1 oranları (P<0.05) grup 3 (geç konfluent ) den elde edilmiĢtir.( (Tablo 4.5.)
Erkek sığır donmuĢ kıkırdak hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon uygulamaları kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢtir ancak en yüksek G0/G1 oranları (P<0.05) 5 (72 saat serum açlığı )den elde edilmiĢtir.(Tablo 4.6.)
22
HAYVAN GRUP HÜCRE %G0/G1 % S % G2/M SIĞIR
DĠġĠ
1 FĠB 65,20±0,17e 23,46±0,35a 11,49±0,19d SIĞIR
DĠġĠ
2 FIB 69,76±0,28d 9,41±0,17c 20,48±0,08a
SIĞIR DĠġĠ
3 FĠB 73,61±0,37c 12,98±0,06b 13,63±0,20c
SIĞIR DĠġĠ
4 FĠB 74,00±0,09c 7,44±0,34e 18,35±0,12b
SIĞIR DĠġĠ
5 FĠB 81,65±0,33b 8,53±0,32d 9,94±0,03e
SIĞIR DĠġĠ
6 FĠB 84,43±0,45a 5,42±0,33f 9,51±0,07f
Tablo 4.7. DiĢi sığır taze fibroblast hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları HAYVAN GRUP HÜCRE %G0/G1 % S % G2/M SIĞIR
DĠġĠ
1 FĠB 62,34±0,15f 21,92±0,07a 15,4667±0,33c SIĞIR
DĠġĠ
2 FIB 69,55±0,27e 14,29±0,24b 16,2167±0,02b
SIĞIR DĠġĠ
3 FĠB 71,19±0,22d 10,69±0,29c 18,03±0,06a
SIĞIR DĠġĠ
4 FĠB 80,92±0,01a 7,65±0,25e 11,53±0,35e
SIĞIR DĠġĠ
5 FĠB 75,57±0,19c 9,91±0,05d 14,50±0,38d
SIĞIR DĠġĠ
6 FĠB 79,38±0,22b 6,53±0,25f 14,48±0,40d
Tablo 4.8. DiĢi sığır donmuĢ fibroblast hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
DiĢi sığır taze fibroblast hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon uygulamaları kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢtir ancak en yüksek G0/G1 oranları (P<0.05) grup 6 (120 saat serum açlığı) dan elde edilmiĢtir. (Tablo 4.7.) DiĢi sığır donmuĢ fibroblast hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon uygulamaları kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢtir ancak en yüksek G0/G1 oranları (P<0.05) grup 4 (geç konfluent ve serum oranı düĢük ) den elde edilmiĢtir.
(Tablo 4.8.)
23
HAYVAN GRUP HÜCRE %G0/G1 % S % G2/M SIĞIR
DĠġĠ
1 KAS 68,42±0,44f 13,70±0,24a 17,53±0,34a SIĞIR
DĠġĠ
2 KAS 83,93±1,25e 5,44±0,38b 11,69±0,31b
SIĞIR DĠġĠ
3 KAS 86,25±0,11d 2,99±0,19d 10,71±0,30c
SIĞIR DĠġĠ
4 KAS 88,56±0,36c 4,33±0,19c 6,83±0,22d
SIĞIR DĠġĠ
5 KAS 92,29±0,30b 1,52±0,27e 6,83±0,09d
SIĞIR DĠġĠ
6 KAS 94,90±0,05a 1,95±0,01e 3,33±0,43e
Tablo 4.9. DiĢi sığır taze kas hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları HAYVAN GRUP HÜCRE % G0/G1 % S % G2/M SIĞIR
DĠġĠ
1 KAS 76,59±0,31d 10,18±0,15a 12,80±0,29b SIĞIR
DĠġĠ
2 KAS 82,47±0,53c 5,65±0,24c 11,81±0,12c
SIĞIR DĠġĠ
3 KAS 84,42±0,37b 8,55±0,36b 15,47±0,17a
SIĞIR DĠġĠ
4 KAS 89,08±0,04a 3,02±0,01c 7,79±0,18f
SIĞIR DĠġĠ
5 KAS 84,15±0,13b 3,12±0,07c 9,76±0,25d
SIĞIR DĠġĠ
6 KAS 89,63±0,31a 2,50±0,33d 8,20±0,31e
Tablo 4.10. DiĢi sığır donmuĢ kas hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
DiĢi sığır taze kas hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon uygulamaları kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢtir ancak en yüksek G0/G1 oranları (P<0.05)grup 6 (120 saat serum açlığı) dan elde edilmiĢtir. (Tablo 4.9.)
DiĢi sığır donmuĢ kas hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon uygulamaları kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢtir ancak en yüksek G0/G1 oranları
24
(P<0.05) grup 4 (geç konfluent ve serum oranı düĢük grup) ve grup 6 (120 saat serum açlığı) den elde edilmiĢtir. (Tablo 4.10.)
HAYVAN GRUP HÜCRE % G0/G1 % S %G2/M SIĞIR
DĠġĠ
1 KIK 52,96±0,12f 23,50±0,34a 23,45±0,27a SIĞIR
DĠġĠ
2 KIK 64,10±0,20e 16,26±0,09b 19,08±0,10b
SIĞIR DĠġĠ
3 KIK 79,22±0,05a 7,61±0,32f 13,04±0,03f
SIĞIR DĠġĠ
4 KIK 71,28±0,09b 13,05±0,23d 15,16±0,11e
SIĞIR DĠġĠ
5 KIK 68,21±0,09d 15,30±0,07c 16,42±0,27d
SIĞIR DĠġĠ
6 KIK 70,35±0,17c 12,47±0,34e 16,95±0,04c
Tablo 4.11. DiĢi sığır taze kıkırdak hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
DiĢi sığır taze kıkırdak hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon uygulamaları kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢtir ancak en yüksek G0/G1 oranları (P<0.05) grup 3 (geç konfluent) den elde edilmiĢtir. (Tablo 4.11.)
DiĢi sığır donmuĢ kıkırdak hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon uygulamaları kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢtir ancak en yüksek G0/G1 oranları (P<0.05) grup 3 (geç konfluent) den elde edilmiĢtir. (Tablo 4.12.)
