Genequality AZF MX EKSTANSİYON

(1)

KULLANICI KILAVUZU

Genequality

AZF MX EKSTANSİYON

Kod

Kod. 04-24A Kod. 04-24R

AZF lokus da mikrodelesyonların ekstansiyon tespiti için kit

Compliant to the European Guidelines

“EAA/EQMN best practice guidelines for molecular diagnosis of Y-chromosomal microdeletions. State of the art 2004”

Simoni M., Bakker E., Krausz C. Int. J. Andrology, 2004, 27: 240-249.

(2)

1 ÜRÜN BİLGİSİ 1 1.1 Kullanım Amacı

2 KİT İÇERİĞİ 2

3 REAKTİFLERİN SAKLANMASI VE STABİLİTES 4

4 KULLANIM İÇİN ÖNLEMLER 4

5 GÜVENLİK KURALLARI 5

5.1 Genel Güvenlik Kuralları

5.2. Kit Hakkında Güvenlik Kuralları

6 GEREKLİ OLAN, KİT İÇERİĞİNDE BULUNMAYAN MALZEMELER 6 6.1 Reaktifler

6.2 Cihazlar 6.3. Materyaller

7 REAKTİF HAZIRLAMA 7

8 GİRİŞ 7

9 TEST PRENSİBİ 8

10 ÜRÜN TANIMI 8

11 ÖRNEK TOPLAMA, MANİPULASYON VE ÖN-MUAMELESİ 10

12 PROSEDÜR 10

12.1. DNA Ekstraksiyon 12.2 DNA Amplifikasyon

12.3 Amplifikasyon Ürünlerinin Görüntülenmesi

12.3.1Yüksek Resolüsyon agaroze jel elektroforezi

(3)

12.3.2 Örnek yükleme

13 SONUÇLARIN YORUMLANMASI 13

14 SORUN GİDERME 15

15 CİHAZ LİMİTLERİ 16

16 CİHAZ PERFORMANSLARI 16

16.1 Analitik Özgünlük 16.2 Diagnostik Özgünlük 16.3 Diagnostik duyarlılık 16.4 Doğruluk

17 REFERANSLAR 17

(4)

(5)

1 ÜRÜN BİLGİSİ

1.1 Kullanım Amacı

AZF EXTENSION kit, erkek infertilitesine neden olan AZF lokusta mikrodelesyonların ekstansiyon tespiti için bir IVD dir.

Aşağıdaki ürünler için mevcut olan manuele bakın:

AZF-MX EKSTANSİYON

Agaroz jel elektroforezi ile görüntüleme ve amplifikasyon için gerekli tüm reaktifleri içerir.

Kod Ürün Format

04-24A-12 AZF-MX EXTANSİYON 12 test

04-24A-24 AZF-MX EXTANSİYON 24 test

AZF-MX EXTENSION- amplifikasyon reaktifleri Amplifikasyon için gerekli tüm reaktifleri içerir.

Kod Ürün Format

04-24R-12 AZF-MX EXTANSİYON 12 test

04-24R-24 AZF-MX EXTANSİYON 24 test

(6)

2 KİT İÇERİĞİ

Dikkat: Kit içeriğinde farklı kodlarda farklı komponentler bulunur.

(kısaltma: X= kit içeriğinde bulunan komponent; 0= kit içeriğinde bulunmayan komponent)

KUTU P

– 30°/– 20°C DE SAKLANIR

kod. 04-24A kod. 04-24R AÇIKLAMA ETİKET TÜP (T)

YADA KAPAK

RENGİ 12 test 24 test X X AZFa-MIX1 için

tek-doz premikslenmiş tüpler. Renksiz

(T) 2 4

X X AZFa-MIX2 için

tek-doz premikslenmiş tüpler. Mavi (T) 2 4

tek-doz premikslenmiş tüpler. Sarı (T) 3 6

tek-doz premikslenmiş tüpler. Turuncu

(T) 3 6

tek-doz premikslenmiş tüpler. Yeşil (T) 7 14 X X AZFa-MIX6 için

tek-doz premikslenmiş tüpler. Kırmızı (T) 7 14 X X

Termostable Hot start

Taq DNA polimeraz Süper AB Taq

5 U/μL Kırmızı 25 μL 50 μL

KÜÇÜK ÇANTA

-30^oC/– 20°C DE SAKLANIR

YADA KAPAK

RENGİ 12 test 24 test X X Referans DNA

(delesyon olmayan bir erkekten alınan)

Referans DNA (delesyon

olmayan erkek) Mavi 1X 20 μL 1X 40 μL

(7)

KUTU F

+2°/ +8°C DE SAKLANIR

YADA KAPAK

RENGİ 12 test 24 test X 0 Elektroforez yükleme buffer

(6X solüsyon) Bromofenol

mavi Mavi 200 μL 350μL

X 0 Etidyum Bromür solüsyonu (2,5 mg/mL)

Etidyum Bromür

TOXIC R 23 68 S 36/37 45

Kırmızı 100 μL 200 μL

X 0 DNA Moleküler Ağırlık Marker MW Marker Sarı 100 μL 200 μL

KUTU A

+15°/ +25°C DE SAKLANIR

YADA KAPAK

RENGİ 12 test 24 test X 0 Yüksek resolüsyon agaroz

moleküler biyoloji aşaması

HR AGAROZ

1X10 g 1X20 g X 0

Elektroforez buffer

TRIS-Asetat -EDTA pH 8.0 50 X TAE 1X40 mL 1X70 mL

(8)

3 REAKTİFLERİN SAKLANMASI VE STABİLİTESİ

Kitin her bir komponenti, tekli kutuların etiketlerinde belirtilen talimatlara göre saklanmalıdır.

Özellikle:

P kutusu -30°/-20°C de saklanır Küçük Paket -30°/-20°C de saklanır F kutusu +2/+8°C de saklanır A kutusu +15/+25°C de saklanır

Önerilen sıcaklıkta saklandığında, tüm test reaktifleri son kullanım tarihine kadar stabil kalır.

4 KULLANIM İÇİN ÖNLEMLER

• Kit; moleküler biyoloji tekniklerini diagnostikte uygulama eğitimi almış ve deneyimli araştırmacı tarafından ve sadece IVD olarak kullanılmalıdır;

• Kit prosedürüne başlamadan önce kullanım kılavuzunu dikkatlice ve tamamen okuyun;

• Ürünleri ısı kaynağından uzakta tutun;

• Son kullanım tarihi geçmiş kit parçalarını kullanmayın;

• Saklama koşulları, kutu bütünlüğü ya da yöntem uygulaması ile ilgili her hangi bir şüpheniz olduğunda, kit kullanmadan önce AB ANALITICA teknik destek ile bağlantı kurun: laboratorio@abanalitica.it ;

Nükleik asitlerin amlifikasyonunda, araştırmacı aşağıdaki özel önlemleri almalıdır:

•

Filtreli-uç kullanın;

•

Biyolojik örnekler, saflaştırılmış DNA, kit içeriğindeki referans DNA ve tüm amplifikasyon ürünleri, amplifikasyon reaktiflerinden farklı bir yerde saklanmalıdır.

•

PCR öncesi ve sonrası için farklı alanlar hazırlayın ve iki alan arasında materyal (pipetler, uçlar, tüpler, vs.) paylaşımı yapmayın.

• Sık sık eldiven değiştirin.

• Benç yüzeyini %5 sodyum hipoklorit ile temizleyin.

• Ekstrakte edilmiş DNA kısa bir zaman için +2° / +8°C de saklanmalı veya uzun bir zaman için -30°/ -20°Cde dondurulmalıdır.

• Kullanmadan önce PCR premiksi oda ısısında eritin; Taq DNA polymerase ekleyin ve oda ısısında ya da buz kabında oldukça hızlı DNA purifiye edin.

(9)

5 GÜVENLİK KURALLARI

5.1 Genel Güvenlik Kuralları

• Reaktifler ve klinik örnekler ile çalışırken tek kullanımlık eldiven kullanın ve çalışma bitiminde ellerinizi yıkayın.

• Ağızla pipetleme yapmayın.

• Bilinen hiçbir diagnostik yöntem enfektif faktörlerin yok olduğunu garanti etmez.

Tüm klinik örnekleri potansiyel enfeksiyonu ajanı olarak kabul edip o şekilde kullanmak gerekir;

• Klinik örnekler ile direk temasta olan cihazların kontaminasyonlu olduğu ve bu şekilde kullanılması gerektiği göz önüne alınmalıdır. Örneklerin kazara etrafa dökülmesi durumunda, %10 Sodyum Hipoklorit ile temizleyin. Temizlenmiş materyaller, kontamine ürünler için olan özel konteynerlere atılmalıdır.

• Klinik örnekler, materyaller ve kontamine ürünler aşağıdaki dekontaminasyondan sonra atılmalıdır:

30 dakika %5 Sodyum Hipoklorit (1 hacim %5 Sodyum Hipoklorit solüsyonu her bir 10 hacim kontaminasyonlu sıvı için) solüsyonuna batırılmalı

YA DA

en az 2 saat 121°C de otoklavlanmalı (NOT: Sodyum Hipoklorit içeren solüsyonları otoklavlamayın !!)

5.2. Kit Hakkında Güvenlik Kuralları

Bu kit kullanımı için riskler tekli komponentler ile ilişkilidir:

Tehlikeli Komponentler:

ETİDYUM BROMÜR (04-24A içerir)

3,8-diamin-1-etil-6-fenilfenantridyumbromür (Etidyum Bromür) <2%

Risk tanımı: T (Toksik)

RİSK İBARESİ VE S İBARESİ

R 23 ve R 68 İnhalasyon için toksik.

Geri dönülmez etkiler riski.

S 36/37 45 Laboratuar giysisi ve tek kullanımlık eldiven kullanın.

Kaza veya rahatsızlık durumlarında, doktora başvurun ve paket etiketini gösterin.

(10)

R ve S ibareleri kit ile sağlanan konsantre ürünlere işaret etmektedir. Özellikle Etidyum Bromür için, agaroz jelde dilüsyona kadar.

Konsantre Etidyum Bromür uygulamasında kimyasal dağıtıcı buharlı kabin kullanın.

Seyreltilmiş Etidyum solüsyonu ile çalışırken daima laboratuar giysisi ve tek kullanımlık eldiven giyin.

Bu ürünler genel çöplere atılamaz. Kurutucu sistem kullanılmamalıdır. Atılım için yasal kuralları takip edin.

Etidyum Bromür kaza ile dökülmesi durumunda Sodyum Hipoklorit ve su ile temizleyin.

Kitin materyal güvenlik bilgi formu (MSDS) istendiğinde elde edilebilir.

6 KİT İÇERİĞİNDE BULUNMAYAN GEREKLİ MATERYALLER

6.1 Reaktifler

• DNA ekstraksiyonu için reaktifler;

• Steril DNase ve RNase serbest su;

• Distile su;

• Agaroz jel elektroforezi için reaktifler (Kod. 04-24R için gerekli).

6.2 Cihazlar

• Laminar flow kabini (kontaminasyondan korunmak için amplifikasyon premikse TAQ polymerase eklenirken kullanılması önerilir; ekstrakte DNA eklenirken başka bir laminar flow kabini kullanılması önerilebilir);

• Mikropipetler (aralık: 0,2-2 μL; 0,5-10 μL; 2-20 μL; 20-100 μL; 100-1000 μL);

• Thermalcycler;

• Termoblok veya termal banyo;

• Mikrosantrifüj (max 12-14.000 rpm);

• Tartı;

• Vorteks;

• Manyetik ısıtıcı ya da mikrodalga;

• Kimyasal kabin (Etidyum Bromide uygulamasında kullanılması önerilir);

• Agaroz minijel için yatay elektroforez haznesi;

• Güç kaynağı (50-150 V);

• UV Transilluminator;

• Foto kamera ya da imaj analizör . 6.3 Materyaller

• Tek kullanımlık eldivenler;

• Tek kullanımlık filtreli uçlar (aralık: 0,2-2 μL; 0,5-10 μL; 2-20 μL; 20-100 μL; 100-1000 μL);

• TAE dilusyonu için dereceli silindirler (1L);

• Agaroz jel hazırlamak için pireks şişe ya da Beher;

• Parafilm.

(11)

• Mikrotüpler (1,5 – 2,0 mL).

7 REAKTİFLERİ HAZIRLAMA

1 L 1XTAE Buffer hazırlamak için:

20 mL 50X TAE ile 980 mL distile suyu karıştırın.

8 GİRİŞ

Y kromozomunun uzun kolunda mikodelesyonların analizi infertil bireyler için önemli bir teşhis aracı haline gelmiştir: halen, Y kromozomunun mikrodelesyon taraması tıp merkezlerinde androloji ve üreme birimleri tarafından yapılır. Ayrıca, ICSI’in hızlı büyümesi kişinin çocuğuna geçecek olası genetik nedenlerin araştırılmasına katkıda bulunmuştur.

Aslında, Y kromozom mikrodelesyonlu hastalar ICSI için en önemli adaylardandır, çünkü TESE (TEstiküler sperm ekstraksiyon) tarafından kullanılabilen testislerin içindeki spermatoz varlığı ile şiddetli oligozoospermi veya azoospermiye sahiptir.

Bu hastalarda mikrodelesyon sıklığı % 10-15 civarında olduğu tahmin ediliyor (Foresta et al., 2000a; Hargreave, 1999; Ma et al., 2000).

Mikrodelesyonlar bir veya birden fazla AZF adlandırılmış bölgeleri kapsar: mikrodelesyon vakalarının %14 daha büyük ve fazla AZF bölgeleri içeriyorken AZFc bölgesinde % 60, AZFb bölgesinde % 16 ve AZFa bölgede % 5 dir. Mikrodelesyon vakalarının % 5’i AZF bölgeleri dışında yer alır.

Delesyonun ektensiyon tespiti klinik olarak önemli görünür.

Tüm AZFa lokusun delesyonlu hastaları her zaman Sertoli-cell-only (SCO) sendromlu azospermiktir, sonuç olarak ICSI için hastadan testiküler sperm toplamak imkansızdır.

(Vogt et al., 1996; Krausz et al., 2000; Kamp et al., 2000; Hopps et al., 2003).

Bunun yerine, gen-spesifik AFZa delesyonları ile ilişkili fenotip değiştirilebilir. DBY yokluğunu hem hipospermatogenez (Sun et al., 1999; Foresta et al., 2000b), hem de Sertoli-cell-only (SCO) sendromuna neden oluyorken, delesyonlar ve USP9Y nokta mutasyonları şiddetli hipospermatogenez gene neden olur (Foresta et al., 2000b).

AZFb ve AZFb+c lokusun komplet delesyonları histolojik SCO ve azoospermide sonuçlanan arest spermatogenetik tarafından karakterizedir. Çeşitli çalışmalar AZFa komple delesyonlu hastalarda olan benzerlikleri göstermiştir, ICSI tekniği için bu hastadan alınan testiküler spermi elde etmek mümkün değildir (Krausz et al., 2000; Hopps et al., 2003). AZFb de kısmi delesyonlar yerine ,ancak nadiren orta oligozoospermia ile ilişkilendirilebilir (Pryor et al., 1997; van der Ven et al., 1998; Krausz et al., 1999a).

AZFc bölgenin delesyonları değişken histolojik ve klinik fenotip ile ilişkilidir (Reijo et al., 1996; Oates et al., 2002). Genel olarak, AZFc lokus delesyonları azoospermia veya şiddetli oligospermi sahip erkeklerde bulunmuştur ve nadir durumlarda bile iletilebilir (Kühnert et al., 2004). AZFc delesyonlu azoospermik hastalarda, ICSI için testikular sperm elde etmenin makul bir olasılığı vardır. (Kent-First et al., 1996; Mulhall et al., 1997;

Kamischke et al., 1999; Cram et al., 2000; van Golde et al., 2001; Oates et al., 2002;

Peterlin et al., 2002). Bu hastaların çocukları doğal olarak aynı delesyonları alacaktır.

(12)

9 TEST PRENSİBİ

PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) literatürlerde ilk DNA amplifikasyonu metodudur (Saiki RK ve arkadaşları, 1985). Termo-stable DNA polymerase ile DNA’nın spesifik bir parçasının (hedef dizi) in vitro amplifikasyon reaksiyonu olarak tanımlanabilir.

Reaksiyonda nükleik asitin üç segmenti yer alır: Amplifiye olması için çift iplikli DNA kalıbı (hedef DNA) ve iki tek iplikli oligonükleotid “primerler” kalıp DNA’ya spesifik olarak dizayn edilmiştir.

DNA polimeraz primerler tarafından işaretlenen bölgeden sentez işlemine başlar ve solüsyonda serbest olarak bulunan tamamlayıcı nükleotidlerin (dNTPler) eklenmesi ve bağlanması ile orjinal çift iplikli hedef DNA bölgesi ile aynı olan yeni çift iplikli DNA molekülünü sentezler. Çeşitli döngülerden sonra, hedef diziye uygun olan milyonlarca DNA molekülü oluşturabilir.

Bu testin duyarlılığı, laboratuvar tanısında uygulamaya olanak sağlar.

Multipleks amplifikasyon seçilen bir primer karışımı olan aynı reaksiyonda farklı DNA dizilerinin eş zamanlı amplifikasyonunu sağlar.

10 ÜRÜN TANIMI

AZF lokusta (AZF-MX kod 04-23) delesyonların yokluğu veya varlığını tespit etmek için kullanılan ilk seviye analizi sonrası, Avrupa Kılavuzu tarafından gösterilen her AZF lokusun proksimal veya distal bölgesi yanında lokalize olmuş STS amplifikasyonu tarafından önceden belirlenen ekstansiyonu tespit etmek mümükündür (Simoni et al., 1999; Simoni et al., 2004).

Özellikle, uygulanan strateji gözlenen bölge için bazı spesifik markörların amplifikasyonunu önceden görmektedir.

Amplifiye bölgeler şunlardır:

AZFa: sY82 (+), sY83 (-/+), (proximal) // (distal) sY87 (-),12f2(-/+),sY88(+) AZFb: sY105 (+), Y6BaH34 (-)(proximal) // (distal) sY143 (-), sY152 (+) AZFc: sY1197 (+), sY1192 (-)(proximal) // (distal) sY1206 (-), sY1125 (+) Yq12 (heterokromatik bölge, AZFc’a distal): sY160 (+)

(13)

Amplifiye edilmiş markörler 1999 ve 2004 yıllarında Simoni ve arkadaşları tarafından yapılan çalışmada açıklananlar ile örtüşür.

AZFa bölgesi ile ilgili olarak, 12f2 işaretleyici ID1 konformasyonuna sahip markördan gelen ID2 konformasyonuna sahip bir delesyonu ayırt etmeyi sağlamak için eklendi (Kamp et al, 2001).

AZFb bölgesi ile ilgili olarak sY114, amplifikasyon ürünün farklı boyutlarından yararlanarak aynı gen lokusun (DYS206) bir parçasını oluşturan Y6BaH34 markırı ile yer değiştirir.

Tüm AZFc bölgesinin yokluğu, AZF-MX (04-23) tarafından STS sY254 ve sY255 amplifikasyon ürünlerinin eksikliğini tespit eder (Simoni et al., 2004). AZF EXTENSION kiti, en çok bu bölgede bulunan b2/b4 tipi delesyonun tespitini sağlar (Ferlin et al, 2005).

Bu delesyon b2 ve b4 olarak adlandırılan iki benzer dizi arasında rekombinasyon ile oluşur ve bu iki dizisi arasındaki tüm bölgenin kaybını tespit eder.

İnternal kontrol (ZFX / ZFY gen) amplifikasyonu ekstra edilmiş DNA’nın miktarını sağlar, aynı zamanda, amplifikasyon inhibitörlerinin yokluğu doğrular ve bu doğrulama yanlış pozitif sonuçları önler.

Kit, delesyon olmayan erkekten alınan referans DNA içerir. Referans DNA amplifikasyonu (tüm beklenen bantların varlığı ile) reaksiyonun doğru çalıştığını gösterir.

Referans DNA insan kaynaklıdır ama operatör için tehlikeli değildir.

Kiti premiks formatında: amplifikasyon için tüm reaktifleri önceden karıştırılmıştır ve tek doz tüplerde eşit miktarda bulunan örnek Taq polimeraz ve ekstrate DNA’ya eklenir.

Bu premiks format pre-amplifikasyon adımlarında manipülasyon azaltmayı verir, reaktiflerin (bu ürünlerin performansını değiştirebilir) tekrarlanan donma/çözdürmesinden

(14)

kaçınılır ve her şeyden önce, bu form örnek kontaminasyon riskini aza indirir ve yanlış pozitif sonuçlar elde etmek için bir risk oluşturur.

Yine de, her zaman uygun amplifikasyon kontrol kullanmanız önerilir.

Üç AZF lokusda delesyon frekansı farklı olduğu için (AZFc bölgesinde 60%, AZFb bölgesinde %16 ve AZFa bölgede% 5) kit premikslerin aşağıdaki sayılarını içerir:

04-24-12 (12 TEST)

04-24-24 (24 TEST)

AZFa Premix 2 4

AZFb Premix 3 6

AZFc Premix 7 14

AZF-MX (04-23) testi ile örneğin analizden elde edilen sonuçlara dayalı olan araştırmanın doğru lokusunu belirlemek kullanıcının sorumluluğundadır.

11 ÖRNEKLERİN TOPLANMASI, MANİPULASYON VE ÖN HAZIRLIKLARI

Y kromozom mikrodelesyonların analizi için prosedür tam kan numunelerinin toplanması ile başlar.

Numune toplamak için tüm steril önlemler takip etmelidir.

Kan EDTA ile işlenmelidir. Diğer pıhtılaştırma ajanları, heparin gibi Taq polimeraz’ın güçlü inhibitörleridir ve bundan dolayı amplifikasyon reaksiyonunun verimliliğini değiştirebilir.

Taze kan kısa bir zaman için +2 / +8°C’de saklanmalıdır; eğer DNA ekstraksiyonu kısa bir zamanda yapılamazsa, numunenin dondurulması gereklidir.

AZF-MX EXTENSION (04-24) ile analiz olan örnek AZF-MX (04-23) test ile zaten silinmiş sonuçlara ulaşır.

12 PROSEDÜR

12.1 DNA ekstraksiyonu

Herhangi bir DNA ekstraksiyon yöntemi kullanılabilir ve ayrıca saf ve integral DNA’nın ekstraksiyonunu sağlar.

Ekstre edilmiş DNA’nın spektrofotometrik ölçümü ile miktarı belirlenmelidir. Her multipleks amplifikasyonda kullanmak için DNA’nın miktarı 100 ng eşittir, bu nedenle, saflaştırılmış DNA solüsyonu 10 μL’ye eşit her primeks tüpünde saflaştırılmış DNA için mevcut olan hacim ile dilüe edilmelidir.

Bu ard arda bir analiz olduğu için, kullanılan DNA genellikle zaten önceki test için ekstre edilmiş olmalıdır. Ekstrate nükleik asit eğer maksimum 1 yılda −20°C’de saklanırsa, integral olarak kalır.

Yöntemin uygulanmasında oluşacak herhangi bir sorun için, AB ANALITICA teknik destek ile irtibata geçebilirsiniz: laboratorio@abanalitica.it .

(15)

12.2 DNA AMPLİFİKASYONU Kullanıcı kullanım için seçebilir:

Eğer AZFa bölgesinde bir delesyon bulunursa, miks 1 ve 2;

Eğer AZFb bölgesinde bir delesyon bulunursa, miks 3 ve 4;

Eğer AZFc bölgesinde bir delesyon bulunursa, miks 5 ve 6;

Her numune için, iki premiks edilmiş tüpüne her birini ekleyin:

Süper AB Taq 0,2 µL

DNA 100ng H2O 10 µL getir

VFİNAL 50 µL

DİKKAT: Eğer termocycler gerekli ise, her premikse 2 damla minarel yağ (dahil değildir) ekleyin.

Farklı işaretlerin tüm bantlarını gösterecek olan referans DNA’yı (delesyon olmayan bir erkeğin DNA’sı) ve kontaminasyonu (ekstrakte DNA yerine karışıma distile su ekleyin) izlemek için her deneyde bir negatif kontrolün dahil edilmesi önemlidir.

Mikrotüpleri aşağıdaki programda termalcyclera koyun:

1 döngü 94°C 5 dk

35 döngü 94°C 58°C 72°C

1 dk 1 dk 1 dk

1 döngü 72°C 7 dk

Depolama 4°C

Tablo 1: Multipleks Amplifikasyondan amplifikasyon ürünlerinin uzunluğu

(16)

12.3 AMPLİFİKASYON ÜRÜNLERİNİN GÖRÜNTÜLENMESİ

12.3.1 HR agaroz jel elektroforezi

Restriksiyondan elde edilen bantları görüntülemek için, %3 yüksek resolüsyon agaroz jel hazırlamak gereklidir. Büyük kuyuları oluşturabilen dişli bir tarak kullanılması önerilir (40- 50 μL).

1,5 g HR agaroz tartın ve 50 mL 1X TAE içine ekleyin.

Agaroz jelin bu türü hazırlandığında özellikle dikkat edilmelidir: HR agaroz toz tartın ve soğuk TAE (not prewarmed!) içinde çözün, sonra her pıhtı çözünene kadar karıştırın.

Solüsyonu sadece bu noktada magnetik karıştırıcı üzerine ya da mikrodalga içine koyun.

Isınma adımda kısa süre sonra solüsyonu alarak solüsyonu kaynatmaktan kaçının, sonra solüsyon berraklaşana kadar tekrar ısıtıcı üzerine koyun. Agoraz solüsyonu bir kaç dakika boyunca soğuyana kadar bekletin ve sonra 2.5 mg/mL Etidyum Bromür solüsyonundan 10 μL ekleyin.

DİKKAT! Etidyum Bromür güçlü bir mutajenik ajandır: Daima eldiven kullanın ve bu reaktifle ya da içeren jel ile çalışırken tercihen kimyasal güvenlik kabini altında çalışın.

Jeli tarakları ile birlikte uygun bir dökme tankına koyun ve oda ısısında soğuyana kadar bekleyin ya da jeli katı hale gelene kadar buzdolabına koyun.

(17)

Jel katılaştığında tarakları dikkatlice alın (jel kuyucuklarına zarar vermemeye dikkat edin) ve trayi elektroforez tankına geçirin. Jeli tamamen kaplayacak şekilde (jel yüzeyinin 1-2 mm üzerinde) uygun miktarda 1X TAE buffer dökün.

12. 3.2 Örnek yükleme

Amplifikasyon ürünlerin görüntülenmesi için, test tüpünde ya da direk parafilmde aşağıdakileri karıştırın:

2 µL 6X Mavi*

10 µL Her multipleks PCR’ın Ampifikasyon ürünü ve

2 µL 6X Mavi*

10 µL DNA Moleküler Ağırlık Markır *

Jel kuyularına karışımı yükleyin: güç kaynağını açın ve 80-90 V arasında voltajı ayarlayın.

Yaklaşık 2 saat boyunca jeli çalışın, sonra jeli UV transilluminatör üzerine koyun ve referans Moleküler Ağırlık Markır lı amplifikasyon ürünlerinin boyutlarını karşılaştırarak sonuçları analiz edin.

*= 6X Blue ve DNA Moleküler Ağırlık Markör kod. 04-24A içinde bulunur; Başka bir yükleme buffer ya da Moleküler Ağırlık Markör kullanıldığında üretici bilgilerini takip edin.

* DNA Moleküler Ağırlık Markır (MW Markör, 04-24A içerir):

501- 489, 404, 331, 242, 190, 147, 111, 110, 67, 34x2, 26 bp.

(NOT: 3% agaroz jelde 501-489 bp bantlar genellikle tam olarak çözülmez ve tek bir bant olarak görülür; 26 ve 34 bp bantları 3% agaroz jelde bazen görünmek için çok küçük olur (düşük moleküler ağırlıklarından dolayı).

NOT: UV ışınları deri ve en önemlisi gözler için tehlikelidir: daima eldiven ve koruyucu gözlük kullanın ya da UV transilluminatorün koruyucu ekranını kullanın.

13 SONUÇLARIN YORUMLANMASI

Kontroller aşağıdaki sonuçları göstermelidir:

KONTROL SONUÇ YORUM

referans DNA Beklenen tüm bantların varlığı

Multipleks PCR amplifikasyon doğru çalışır.

Negatif kontrol Bantların yokluğu Kontaminasyon yokluğu

(18)

Sonra, agaroz jelde bantların yorumlanması için aşağıdaki tabloya bakın (Tablo 1, sayfa 19 bakın):

SONUÇ YORUM

ZFX/ZFY bandın yokluğu

Biraz veya bütün markörlerin yokluğu

Örnek amplifikasyon için uygun değildir

AZFa

ZFX/ZFY bandın varlığı

SY82, SY 88, ve 12f2 bantlarının varlığı SY83 ve SY87 bantlarının varlığı

Bir ID1 konformasyonunda tüm AZFa bölge ile amplifibe

olabilen örnek delesyonu ZFX/ZFY bandın varlığı

SY82, SY 88, ve SY83 bantlarının varlığı

12f2 ve SY87 bantlarının varlığı

Bir ID2 konformasyonunda tüm AZFa bölge ile amplifibe

olabilen örnek delesyonu

AZFb

SY105 ve SY152 bantlarının varlığı SY143 ve Y6BaH34 bantlarının varlığı

Tüm AZFb bölge ile amplifibe olabilen örnek delesyonu

AZFc

SY1125, sY 1197, ve SY160 bantlarının varlığı

SY1192 ve SY1106 bantlarının varlığı

Tüm AZFc bölge ile amplifibe olabilen örnek delesyonu (tip b2/b4)

Araştırılan tüm markörlerin varlığı

İnceleme bölgesinde kısmi delesyon ile Amplifibe olabilen örnek

Eğer örnek sonuçları amplifiye değilse (ZFX/ZFY gen ile ilgili bandın yokluğu bildirildi), analiz tekrar edilmelidir.

(19)

Şekil 2. Altı Multiplex Amplifikasyonun 3% Nusieve agaroz jel elektroforezi

14 SORUN GİDERME

Amplifikasyon ürünü ya da pozitif kontrol DNA bandı yoksa

• TAQ polymerase premikse doğru eklenememiştir

- Uygun hacimde pipet ve uçlar kullanın (pipet aralığı 0,2-2 μL);

-Görsel olarak TAQ polimerazın premiksi difüze olduğunu gözleyin: Bu basittir, çünkü enzim, yüksek bir yoğunluğa sahip olan gliserolde çözülür;

- Alternatif olarak, tüp duvarına konulmuş olan TAQ polimerazı görsel olarak teyit edin, sonra kısa bir süre santrifüj edin.

• Thermalcycler doğru olarak programlanmamıştır.

- Thermalcycler programının uygunluğunu ve kullanıcı kılavuzundaki sıcaklık profilini kontrol edin ve doğru program ile amplifikasyon adımlarını tekrar edin.

• Kit uygun şekilde çalışmaz.

- Premiks, enzim ve referans DNAyı – 30°/ –20°C de saklayın;

- Premiks ve reaktifleri tekrar dondurup/çözdürmekten kaçının.

Amplifikasyon bandı (ya da sadece bazı markırlar için) ZFX/ZFY bandın yokluğunda yoktur fakat referans DNA için iyi bir bant vardır.

• Ekstraksiyon adımı sırasında olası problemler:

-Ekstraksiyon kitinin yeterli olup olmadığından emin olun ve bütün kılavuzu doğru şekilde takip edin.

-Ekstraksiyon kitinin kullanıcı kılavuzu bölümünde ‘’giderme’’ bakın.

-Yeni bir örnekten alınan DNA ekstaraksiyonu tekrar edin.

(20)

• Amplifikasyon inhibe oldu.

-Elde edilen DNA solüsyonu saf değildir (Ekstrate DNA için A260/A 280 oranı düşüktür).

İzlenen ekstraksiyon protokolünü doğru şekilde yapılıp yapılmadığını kontrol edin ve yeni bir örnekten başlayarak ekstraksiyonu tekrar edin;

-Elde edilen DNA solüsyonunda kalan RNA bulunur(Ekstrate DNA için A260/A 280 oranı çok yüksektir). RNAase ile sindirim adımında elimine edilir.

Her hangi bir sorun için, AB ANALITICA teknik destek ile temasa geçebilirsiniz: e-mail:

laboratorio@abanalitica.it, fax (+39) 049-8709510, ya da tel. (+39) 049-761698.

15 CİHAZ SINIRLARI

Eğer klinik örnek bu analiz için uygun değilse, kit performansını azalabilir (kan örneği doğru şekilde saklanmamış veya anti-koagülant olarak heparin ile işlenmemiş ya da tekrar dondurulup/çözündürülmüş).

16 TEST PERFORMANSI

16.1 Analitik Özgünlük

AZF-MX Extension kitin analitik özgünlüğü primerlerin doğru seçimi ile garanti altındadır.

İnsan genomik DNA’nın diğer bölgeleri ile çapraz reaktivite belirginliği yoktur. Analitik özgüllüğü, aspecific amplifikasyonun olasılığını azaltan bir Hot start enzimi ile ve bağlayıcı amplifikasyon koşullarının kullanımı ile de garanti altına alınmıştır.

16.2 Diagnostik Özgünlük

Diagnostik özgünlük, daha önce AZF-MX (04-23) kitte delesyon bulunmayan seçilmiş örneklerin bir setinin analizi tarafından AZF-MX Extension kitle hesaplandı. Elde edilen sonuçlar % 100 diagnostik özgünlüğü göstermiştir.

16.3 Diagnostik Duyarlılık

Diagnostik duyarlılığı, araştırma altında AZF lokusa referansla silinmiş örnekleri doğru şekilde tanımlamak için cihazın kapasitesi olarak kabul edilir. Deneysel bir araştırmadan elde edilen sonuçlar gösteriyor ki sistemin diagnostik duyarlılığı %100'dür.

16.4 Doğruluk

Doğruluk, yapılmış amplifikasyon toplam sayısı üzerinden doğru amplifikasyon sayısı olarak hesaplanır. Cihaz GENEQUALITY AZF-MX Extension % 100 doğruluk gösterdi.

(21)

17 REFERANSLAR

Simoni M., Bakker E., Eurlings M. C. M., Matthijs G., Moro E., Muller C. R. Et Vogt P. H., Intern, Journal. of Andrology, 22:292-299, 1999.

Simoni M., Bakker E., Krausz C., International Journal of Andrology, 27: 240- 249, 2004.

Vogt P.H., Edelmann A., Kirsch S.; Hum. Mol. Genet., 5:933-943, 1996

Cram, Ma, Bhasin, Ariasc, Pandjaitanc, Chu, Audrins, Saunders, Quinn et al. Fertil steril;

Vol 74, pp. 909-915; 2000;

Foresta, Ferlin, Moro, et al. Y chromosome. Lancet, 355, pp. 234-235; 2000.

Foresta, Ferlin, Moro; Hum. Mol. Genet., 9, pp.1161-1169; 2000b.

Hargreave; Understanding the Y chromosome; Lancet, Vol. 354; pp.: 1746- 1747; 1999.

Hopps , A Mielnik, M. Goldstein, G.D. Palermo, Z. Rosenwaks, P.N. Schlegel; Human Reproduction, Vol.18; No.8; pp.1660-1665, 2003;

Kamischke, Gromoll, Simoni, Behre, Nieschlag; Hum Reprod.; Vol. 14; pp.2320-2322;

1999;

Kamp et al., Human Mol Genet 9, 2563-2572, 2000 Kamp et al., Human Hum Reprod 7(10), 987-984,2001

Kent-First, Kol, Muallem, Ofir, Manor, Blazer, First et al.; Mol Hum Reprod; Vol. 2,pp.943- 950, 1996;

Krausz ; K. McElreavey, Bishop CE; The genetic basis of male infertilità; Berlin:

Sprinter.Verlag;pp.211-232; 1999.

Krausz, L. Quintana-Murci, K. McElreavey; Human Reproduction, vol. 15, No 7, pp. 1431- 1434, 2000;

Kühnert, KuÈhnert, Gromoll, Kostova, Tschanter, Luetjens, Simoni and E.Nieschlag*; Hum Reprod; Vol.19, No.4 pp. 886-888, 2004

Ma, Mallidis, Bhasin; Eur. J. Endocrinol, Vol.142, pp:418-430; 2000.

Mulhall, Reijo, Alagappan, et al.; Hum. Reprod., Vol 12, pp.503–508; 1997; Oates, Silber, Brown, Page; Hum. Reprod; Vol 17, pp. 2813-2824, 2002;

Peterlin, Kunej, Sinkovec, Gligorievska, Zorn; Hum. Reprod., Vol. 17, No. 1, 17-24; 2002.

Pryor; Kent First M.,; Muallem A. et Al.; N Engl J Med.;pp.336:534-539; 1997;

(22)

Reijo, Alagappan, Patrizio et al.; Lancet 347, pp.:1290-1293; 1996;

Repping Am.J.Hum.Genet.,71; 906-922,2002

Simoni M., Bakker E., Krausz C. “EAA/EQMN best practice guidelines for molecular diagnosis of Y-chromosomal microdeletions. State of the art 2004” Int. J. Andrology, 2004, 27: 240-249

Simoni, M., Bakker, E., Eurlings, M.C.M. et al. “Laboratory guidelines for molecular diagnosis of Y-chromosomal microdeletions”,. Int. J. Andrology. 1999, 22:292-299.

Sun, Skaletsky, Birren, et al. Nature Genet., Vol.23, pp.429-432; 1999 .

Van der Ven, Montag, Peschka, et al.; Mol. Hum. Reprod., vol.3; pp. 699-704;

1997.

Van Golde Wetzels, de Graaf,Tuerlings, Braat, Kremer; Hum. Reprod, 16,pp.289-292;

2001;

Vogt P.H., et al. Hum. Mol. Genet.; Vol.5, No7, 1996;

(23)

AB ANALITICA srl Via Svizzera 16 - 35127 PADOVA, (ITALY) Tel +39 049 761698 - Fax +39 049 8709510 e-mail: info@abanalitica.it