T.C.
GAZİ ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ
PLASTİK REKONSTRÜKTİF VE ESTETİK CERRAHİ ANABİLİM DALI
KEMODENERVASYON İLE CERRAHİ DENERVASYONUN HİYALÜRONİK ASİT YIKILIMINA ETKİLERİNİN
KARŞILAŞTIRILMASI
UZMANLIK TEZİ Dr. ÖMER POLAT
TEZ DANIŞMANI
Prof. Dr. OSMAN LATİFOĞLU
T.C.
GAZİ ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ
PLASTİK REKONSTRÜKTİF VE ESTETİK CERRAHİ ANABİLİM DALI
KEMODENERVASYON İLE CERRAHİ DENERVASYONUN HİYALÜRONİK ASİT YIKILIMINA ETKİLERİNİN
KARŞILAŞTIRILMASI
UZMANLIK TEZİ Dr. ÖMER POLAT
TEZ DANIŞMANI
Prof. Dr. OSMAN LATİFOĞLU
KABUL VE ONAY
ÖNSÖZ
Bilim dünyası süratli bir devinim içinde. Her geçen gün bilgilerimize yenileri ekleniyor. Yayınlanan bütün araştırmalar farklı zihinlerin olayları anlaması ve açıklamasının ürünleri. Edindiğimiz ham bilgileri olduğu gibi kabul etmeden sorgulayıp, yorumlamamız gerekiyor. Bu düşünce tarzını bana aşılayan saygı değer hocam Prof. Dr. Seyhan Çenetoğlu’na teşekkür ederim.
Çalışmamız bilimsel gelişmenin ve teknolojik ilerlemenin geldiği konuma göre önemsiz ve basit görünse de mevcut bilgileri sorgulayıcı yönü ve farklı bir açıdan bakması nedeniyle kıymetli olduğunu düşünüyorum.
Tez sürecinde bana rahat bir çalışma ortamı sağlayan ve her türlü desteğini sunan danışmanım Prof. Dr. Osman Latifoğlu’na; değerlendirme yöntemlerinde yardımlarını esirgemeyen Radyoloji ABD’dan Doç. Dr. Murat Uçar’a ve FTR ABD’dan Doç. Dr. Murat Zinnuroğlu’na, tez konusu fikrinin sahibi çalışma arkadaşım Dr. Giray Genç’e, deney sürecinde yardımları için Dr. Ahsen Öncü ve Dr. Erkan Deniz’e, istatistiksel değerlendirmelerde yardımcı olan Dr. Ertuğrul Şentürk’e, Gazi Üniversitesi Deney Hayvanları Laboratuvarı’nın bütün veteriner hekim ve çalışanlarına teşekkür ederim.
Sorgulamayı ve mantıklı düşünmeyi bana öğreten, beni daima destekleyen anne ve babama en derin şükranlarımı sunarım.
Daima bilimin ışığında kalmak dileğiyle…
İÇİNDEKİLER
Sayfa No:
KABUL VE ONAY ... i
ÖNSÖZ ... ii
İÇİNDEKİLER ... iii
TABLOLAR DİZİNİ ... v
ŞEKİLLER DİZİNİ ... vi
1. GİRİŞ ve AMAÇ ... 1
2. GENEL BİLGİLER... 4
2.1. Hiyalüronik Asit ve Hiyalüronik Asit Dolgular ... 4
2.1.1. Hiyalüronik asit ... 4
2.1.2. Hiyaluronik asit dolgular ... 8
2.2. Botulinum Toksini ... 22
2.3. Tavşan Auriküler Bölge Anatomisi ... 30
2.4. Denervasyon ... 33
2.4.1. Periferik sinir aksotomisi ile çizgili kas denervasyonu... 33
2.4.2. Botulinum toksini ile çizgili kas denervasyonu ... 34
3. GEREÇ VE YÖNTEM ... 36
3.1. Deney Hazırlıkları ... 36
3.2. Çalışma Grupları ... 37
3.3. Botulinum Toksininin Hazırlanması ... 38
3.4. Cerrahi Denervayson ... 38
3.5. Hiyalüronik Asit Jel ... 40
3.6. Deney İçin Gerekli Araç ve Gereçler ... 42
3.7. Değerlendirme Yöntemleri ... 45
3.7.1. Görsel değerlendirme ve fotoğrafik kayıt ... 45
3.7.2. Elektronöromiyografi (ENMG) ... 46
3.7.3. Manyetik rezonans görüntüleme (MRG) ... 46
3.8. Verilerin İstatistiksel Analiz Yöntemleri ... 47
4. BULGULAR ... 48
4.1. Genel Değerlendirme Bulguları ... 48
4.2. Görsel Değerlendirme Bulguları ... 48
4.3. ENMG Bulguları ... 49
4.4. Manyetik Rezonans Görüntüleme Bulguları ... 50
5. TARTIŞMA ... 61
6. ÖZET ... 72
7. SUMMARY ... 74
8. KAYNAKLAR ... 76
9. ÖZGEÇMİŞ ... 85
TABLOLAR DİZİNİ
Sayfa No:
Tablo 1: Hiyalüronidaz enzimleri ... 7 Tablo 2: Bifazik (Restylane ) ve monofazik (Juvederm Ultra 4) iki
dolgunun reolojik özellikleri. ... 18 Tablo 3: Çalışma gruplarındaki ilk ve son hacimsel ölçümler ve değişim
yüzdeleri. ... 52 Tablo 4: Çalışma gruplarındaki ilk ve son maksimum yükseklik
ölçümleri ve değişim yüzdeleri ... 56 Tablo 5: Çalışma gruplarının kendi içlerinde minimum maksimum ve
ortalama değişim yüzdeleri. ... 58 Tablo 6: Hacimsel yıkılım değişim yüzdesi, yükseklik değişim yüzdesi
ve yıkılım hacminin tanımlayıcı verileri ve p değeri sonucu. ... 58
ŞEKİLLER DİZİNİ
Sayfa No:
Şekil 1: Hiyalüronik asit monomer yapısı. ... 5
Şekil 2: HA zincileri su ile etkileşime geçince visköz bir sıvı oluşturu ... 10
Şekil 3: Çapraz bağlanma ile HA solüsyonu jel haline gelir. ... 11
Şekil 4: Çapraz bağlayıcı olarak BDDE’nin kullanıldığı bir HA jel. ... 11
Şekil 5: 2.4x büyütmede bifazik Restylane (A) ve monofazik Juvederm Ultra (B) dolgularının görüntüsü ... 13
Şekil 6: 51x büyütmede bifazik (solda) ve monofazik (sağda) dolguların görüntüsü ... 14
Şekil 7: Monofazik (soldaki görüntü) ve bifazik (sağdaki görüntü) histolojik görüntüleri... 14
Şekil 8: Dokuda dolgu maddesine etki eden güçler ... 15
Şekil 9: Kompresyon gücü karşısında kohezivitelere göre dolgu davranışları. ... 19
Şekil 10: Partikül büyüklüğü enzim yüzey alanı temas ilişkisi ... 20
Şekil 11: HA dolguların (Alcian mavisi) enjeksiyonunun hemen sonrasında histolojik görüntüsü ... 22
Şekil 12: Botulinum toksinin yapısı ... 25
Şekil 13: Botulinum nörotoksinin SNARE kompleksindeki hedef molekülleri ... 25
Şekil 14: BT ilacının içeriği ... 26
Şek l 15: Botulinum toksininin etki mekanizması ... 28
Şek l 16: Tavşan yüz ve boyun kaslarının anatom s ... 31
Şek l 17: Fasiyal sinir ve dalları ... 32
Şekil 18: Anterior auriküler kasın disseksiyonu ... 33
Şekil 19: Anestezik ilaçlar. Ketalar 500mg Pfizer, Alfazyne %2 Atafen ... 37
Şekil 21: Siyah ile işaretli bölgeler enjeksiyon alanlarını göstermektedir ... 41
Şekil 22: Deney basamakları ... 43
Şekil 23: Cerrahi işlemin basamakları ... 44
Şek l 24: Kulak poz syonlarının görsel derecelend rme s stem le değerlend r lmes ... 45
Şekil 25: Cerrahi denervasyon sonrası sağ grade 1 sol grade 3. ... 48
Şekil 26: Botulinum toksini sonrası 14.gün. Her iki kulak grade 3. ... 49
Şekil 27: Grupların yıkılım miktarlarının ortalamaları ... 51
Şekil 28: Grupların hacimsel yıkılım değişim yüzdelerinin ortalamaları ... 52
Şekil 29: 1.ölçüm hacim ... 53
Şekil 30: 2. Ölçüm hacim ... 53
Şekil 31: Kontrol grubundan hayvan no 7 nin ilk (soldaki resim) ve ikinci (sağdaki resim) ölçümleri ... 54
Şekil 32: Deney grubundan hayvan no 2 nin ilk (Soldaki resim) ve ikinci (sağdaki resim) ölçümleri ... 54
Şekil 33: Kontrol grubundan hayvan no 8’in ilk (soldaki resim) ve ikinci (sağdaki resim) ölçümleri ... 55
Şekil 34: Deney grubundan hayvan no 3’ün ilk (soldaki resim) ve ikinci (sağdaki resim) ölçümleri ... 55
Şekil 35: Gruplar arası yükseklik değişim yüzdelerinin ortalamaları ... 56
Şekil 36: 1. Ölçüm vertikal yükseklik ... 57
Şekil 37: 2. Ölçüm vertikal yükseklik ... 57
Şekil 38: BT-A ile denerve kulaklarda dolgu ilk ve son hacim grafiği ... 59
Şekil 39: Cerrahi denerve kulaklarda dolgu ilk ve son hacim grafiği ... 59
Şekil 40: Kontrol grubunda kulaklarda dolgu ilk ve son hacim grafiği ... 60
Şekil 41: Sağ ve sol anterior auriküler kası denerve tavşanda HA dolgunun yayılımı ... 66
Şekil 42: HA dolgunun orta hattan geçişi ... 70
1. GİRİŞ ve AMAÇ
Güzellik ve zarif bir yaşlanma bireylerin mutluluğu, özgüvenleri ve sağlığı için vazgeçilmez ihtiyaçlarıdır.
Güzellik algısı etnik, dönemsel ve kişisel farklılıklar göstermekle beraber, bu algıda ilk olarak Yunan düşünür Pisagor tarafından tanımlanan daha sonra pek çok kez farklı yayınlarda konu edilen oranların belirleyici olduğu biliniyor.
Yaşlanma ise hacim kaybının, hacimsel yer değişikliklerinin, sürekli kas hareketlerinin ve yer çekiminin sebep olduğu dinamik ve statik çizgilenmelerin yer aldığı kompleks bir süreç. Güzellik ve zarif yaşlanma ihtiyaçlarının karşılanmasında plastik cerrahların elinde cerrahi ve cerrahi olmayan tedavi seçenekleri vardır.
Cerrahi olmayan tedavi yöntemleri uygulama kolaylığı, kişiyi işinden alıkoymaması gibi nedenlerle giderek yaygınlaşıyor. 2016 yılında Amerika’da uygulanan botulinum toksin A (BT-A) uygulaması sayısı toplam cerrahi işlem sayısından daha fazladır (1).
Özellikle yaşlanma sürecindeki mekanizmaların daha iyi anlaşılması tedavi de bir paradigma değişikliğini beraberinde getirdi. Hacim kaybının rolünün belirginleşmesi cerrahi ve cerrahi olmayan tedavilere hacim düzeltmelerinin artan oranlarda eklenmesini sağladı (2). Bu hacim uygulamalarında kullanılacak ideal maddenin doku uyumlu, güvenli, kalıcı değil ama uzun etkili, etkileri geri döndürülebilir, maliyeti düşük, etkinliği yüksek, doğal, kolay uygulanabilir olması
2016 yılında Amerika’da en sık estetik girişim 4,597,886 botulinum toksin uygulamaları olup bunu 2,494,814 ile hiyaluronik asit (HA) uygulamaları takip etmektedir (1). Hacim uygulamalarında en sık kullanılan madde hiyalüronik asit (HA) dolgulardır. Bu veriler ışığında uygulayıcıların ideale yakın olarak gördüğü yumuşak doku dolgu materyalinin günümüzde hiyaluronik asit dolgular olduğunu söyleyebilir.
HA dolgular ideal dolgu materyali özelliklerinin pek çoğunu karşılasa da hastaların talebi, plastik cerrahlarında arayışı bütün vertebralılar da ve bazı bakterilerde aynı molekül yapısında bulunan bu immünojen olmayan maddenin dokuda kalış süresini uzatma yönündedir (8).
Kozmetik problemlerin mekanizmalarında ki algımızın iki boyuttan üç boyuta yönelmesi kombine uygulamaları da beraberinde getirdi. Dinamik çizgilenmelerin tedavisinde kullanılan BT-A’nın statik çizgilenmelerin tedavisinde de kullanılan HA dolgular ile beraber kullanımı bu duruma güzel bir örnektir.
Tekrarlayan kas aktivitesi zamanla subdermal fibrotik birleşimlere ve bunun neticesinde kalıcı yüz çizgilerine sebep olur (4). Özellikle glabella bölgesinde kas aktivitesini zayıflatan botulinum toksini ile statik çizgileri düzelten HA in beraber kullanımı bu mekanizma nedeniyledir. HA dolgu BT-A kombinasyon tedavisini orta ve ağır glabellar çizgilenmeler için kullanan araştırmacılar, gözlemlerinde tedavinin etki süresinin uzadığını farketmiştir (4). Bu durumu aydınlatmaya yönelik planladıkları prospektif klinik çalışmalarda glabella da tedavinin etki süresinin uzadığını sübjektif veriler ışığında göstermişlerdir (5) (6). Aynı araştırmacıların alt yüz bölgesi ve dudak için planladığı benzer başka bir çalışma da dudak
bölgesindeki hacim kazandırıcı etki süresinde BT-A ile kombine edilen HA dolguların tek başına kullanılanlarla arasında istatistiksel olarak bir farkının olmadığı görülmüştür. Bu çalışma ile glabella da yapılan çalışma da kullanılan HA dolgunun reolojik özellikleri farklıdır. Glabella da kullanılan dolgu bifazik non kohezivken (Restylane), alt yüz ve dudak bölgesinde kullanılan monofazik koheziv (Juvederm) bir dolgudur (7). 2016 yılında İsmail Küçüker ve arkadaşlarının yaptığı deneysel çalışmada HA in BT-A ile kimyasal olarak denerve edilmiş bölgede denerve edilmemiş bölgeye göre daha fazla hacimde kaldığı manyetik rezonans görüntüleme ile kanıtlanmıştır. Bu çalışmada da kullanılan HA bifazik koheziv olmayan (Restylane) bir HA dolgudur (8). HA dolguların doku sağ kalımlarında BT-A ile kombine kullanımda artışı ortaya koyan çalışmalarda bu durumun mekanizması mekanik etkinin ortadan kalkması hipotezi ile açıklanmıştır (5) (6) (8).
BT-A’nın HA dolguya sağladığı etki süresi uzamasının HA dolgunun tipi ile alakalı olup olmadığını ve olası bir etki süresi uzamasının mekanizmasında BT- A ile HA arasında kimyasal bir etkileşimin var olup olmadığını aydınlatmaya yönelik deneysel bir çalışma planlandı (9). Deneysel tavşan modelinde bir grup hayvanın anterior auriküler kası cerrahi olarak, bir grubunda BT-A ile kimyasal olarak denerve edildi. Bu iki grup kendi içinde ve herhangi bir denervasyon uygulanmayan kontrol grubu ile karşılaştırıldı.
2. GENEL BİLGİLER
2.1. Hiyalüronik Asit ve Hiyalüronik Asit Dolgular 2.1.1. Hiyalüronik asit
a. Tarihçe:
HA ilk olarak 1934 yılında Karl Meyer tarafından inek gözünden izole edildi (10). Daha sonra insan dokusunda ve diğer hayvan türlerinde de varlığı tespit edildi. (Bütün vertebralılar da bulunur ve bazı bakterilerce sentezlenir) Gözden izole edilmesi ve içeriğindeki şekerlerden birinin üronik asit olması nedeniyle hyaloid (vitreus) ve uronik asitin bir kombinasyonu olan hiyalüronik asit ismi verilmiştir.
b. Biyokimyasal yapısı:
HA bir glukozaminoglikan olup birbirine beta-1,3 glikozidik bağı ile bağlanmış D-glukronik asit ve N-asetilglukozamin disakkarit ünitelerinden oluşur.
(Şekil 1) Bu dallanmayan polisakkarit zincirinin büyüklüğü monomeri olan disakkarit unitelerinin tekrar sayısı kadardır. Disakkarit ünitelerinin kompozisyonu bulunduğu bütün canlılarda aynıdır. Bu nedenle farklı canlılardan elde edilen HA molekülleri insanlar için immunojenik değildir (11). Hayvan kaynaklı HA ile bakteri kaynaklı HA’in farkını yaratan monomerlerin tekrar sayısıdır. Hayvan kaynaklı HA lerde 10 000-15 000 monomer bulunurken, bakteri kaynaklı HA lerde 4000-6000 monomer bulunur (12). HA molekülü 5-10 milyon dalton gibi ciddi bir moleküler ağırlığa sahip olabilir. HA in fizyolojik ve biyolojik fonksiyonları bu molar kitlesine bağlıdır (13).
Şekil 1: Hiyalüronik asit monomer yapısı.
Birbirine beta-1,3 glikozidik bağı ile bağlı D-glukronik asit ve N-asetilglukozamin. Bu disakkarit unitleri birbirine beta-1,4 glikozidik bağları ile bağlanır.
Hidrofilik ve higrofilik bir madde olan HA bu özelliğini serbest karboksil (- COOH) ve hidroksil (-OH) grupları ile kazanır. (Karboksil grupları içinde çözündüğü plazmanın serbest sodyum (Na+) iyonuyla birleşirken hidroksil grupları suyun hidrojen iyonuyla birleşmektedirler (H+).)
Higroskopik bir madde olan HAin 1 gramı yaklaşık olarak 6 litre su tutabilir (14). Su ile çözünen HA tuzu berrak, kaygan, viskoelastik bir likit oluşturur.
c. Özellikleri:
Invivo olarak bağ dokusunun hücre dışı ortamında sinoviyal sıvıda, tendonlarda, gözde, akciğerlerde, kıkırdak dokusunda, umblikal kord da temel bir yapıtaşı olarak bulunur.
HA fonksiyonları hacim yaratma, dokuları kayganlaştırma, ekstrasellüler hareketleri düzenleme, sitokinler ve hücre reseptörleri ile bağlantı kurma olarak sayılabilir. Bu özellikleri ile gözde darbe emici, kıkırdakta darbe emici ve
D-Glukronik asit N- Asetilglukozamin
yanı sıra ultraviyole radyasyonun yarattığı serbest radikaller için koruyucu görevi görür. Bunların dışında fetal doku gelişmesinde, inflamatuar süreçlerde, enfeksiyonların dokuda yayılmasını engelleme gibi pek çok alanda rol alır (15) (16) (13).
70 kg bir insanın vücudunda yaklaşık 15gr HA bulunup bunun yaklaşık yarısı deridedir (13).
d. Sentez:
HA diğer glikozaminoglikanların aksine golgi cisimciğinde değil hücre membranın iç yüzünde bulunan hyaluronansentaz (HAS) enzimlerince sentezlenir.
İnsanda en yoğun sentez dermal fibroblastlar ve epidermal keratinositlerdedir.
Enzimlerin vertebralılar ve bakterilerdeki formları birbiri ile benzerlik içindedir (17). Bu benzerlik evrimsel süreçte hayvandan bakteriye lateral gen değişimi ile açıklanabilir. Çok büyük bir molekül olması nedeniyle HA sentez edildikçe eş zamanlı olarak hücre dışı alana verilir.
e. Yıkım:
Doğal olarak bulunan modifiye edilmemiş bu formun insan vücudundaki yarı ömrü yaklaşık 24 saattir (18). HA’in yıkımı bulunduğu doku da, lenf nodlarında ve karaciğerde gerçekleşebilir. Lenf nodlarına hidrodinamik olarak göç edebilir ve bu doku yıkımın önemli bir merkezidir (13). HA nın yıkımı moleküler temelde iki yolla gerçekleşir.
HA temelde iki yolla yıkılır.
1. Enzimatik (Hiyaluronidaz enzimleri)
2. Non Enzimatik (Oksidanlarla, Asit/Alkali hidroliz, Ultrasonik, Termal)
Enzimatik yıkılım ökaryotlar ve prokaryotlarda benzer ancak farklı enzimlerce gerçekleştirilir. Ökaryotik enzimler iki gruba ayrılır. - endoglikozidazlar ve -ekzoglikozidalar. -endoglikozidazlardan endo -n- asetilhekzosaminidazlar (HYAL-1, HYAL-2, PH-20) 1-4 glikozidik bağını yıkarak etki gösterir. HYAL-2 ve PH-20 hücre membranının dış yüzeyinde bulunur.
HYAL-1 lizozmlarda bulunur. İnsanlarda en aktif iki hiyaluronidaz HYAL-1 ve HYAL-2 dir. HYAL 2 hücre dışı ortamdaki HAyı yaklaşık 50 disakkaritlik bölümlere yıkar. HYAL-1 ise lizozomal bir enzimdir ve her boyuttan HAyı tetrasakkaritlere yıkar. -endoglikozidalardan endoglukronidaz 1-3 glikozidik bağını yıkar. ekzoglikozidazlarda iki gruba ayrılır ve lizozmlarda bulunur. Bu enzimler ekzoglukronidaz ve ekzo N asetilglukozaminidazdır. Bu iki enzim tek şeker unitelerini ayırır (9). (Tablo-1)
HYAL enzimlerinin doku ekstraktlarından saflaştırılması sonrasında aktivitelerinde ciddi bir artış görülmüştür. Bu durum henüz net ortaya konulamasa da bazı HYAL inhibitörlerinin varlığının göstergesidir (19).
Tablo 1: Hiyalüronidaz enzimleri
Hiyaluronidazlar
Ökaryotik
B endoglikozidaz B ekzoglikozidaz
Prokaryotik
B endoglikozidaz B ekzoglikozidaz
Non enzimatik yıkılım temelde reaktif oksijen türevleri ile olmakla birlikte ultrasonik, asit/alkali hidroliz, termal yıkımda vardır. Reaktif oksijen türevleri özellikle makrofajlar ve polimorfonükleer lökositlerden inflamatuar durumların tetiklemesi ile sentezlenir (20). Superoksit anyon radikalleri (O2-), süperoksit radikali (HO2-), hidrojen peroksit (H2O2), hidroksil radikalleri (HO-), Hipoklorik asit (HOCl) farklı derecelerde HA yıkımına yol açan reaktif oksijen türevleridir (13).
Bu iki yönteminin hangi oranlarda HA yıkımına katıldığını ortaya koyan bir çalışma mevcut değildir. Bilinen şu ki enzimatik yolla oluşan yıkımın ürünü ana yapı ile aynı iken reaktif oksijen radikalleri ile oluşan yıkımın ürünleri ana yapıdan tamamen farklıdır.
2.1.2. Hiyaluronik asit dolgular
HA otolojide timpan membranının perforasyonu sonrası rejenerasyona destek olmak için, oftalmik cerrahide ve kuru göz sendromunda, ortopedi de eklem rahatsızlıklarında antiinflamatuar ve kayganlaştırıcı olarak kullanılır. Plastik cerrahideki kullanımı daha çok kırışıklıkların, deprese alanların düzeltilmesi ve cildin nemlendirilmesi amacıyladır. Bu amaçla kullanılacak bir maddeden beklentiler şunlardır.
Etkili olması: Uygulama amacına yönelik olarak hastanın şikayetini tam ve doğal bir görünümle düzeltmesidir. Enjekte edildiği bölgeden kalması göç etmemesidir.
Biyouyumlu olması: İnsan da immünolojik bir reaksiyona yol
açmamasıdır. Enjekte edildiği bölgeye entegre olmasıdır.
Zararlı olmaması: Kanserojenik, mutajenik,toksik özelliklerinin olmamasıdır.
Kolay uygulanabilir: Uygulama öncesi bir test gerektirmemesi veya ön hazırlık ihtiyacı olmamasıdır. Uygulama sonrasında hastanın günlük hayatına en hızlı şekilde dönebilmesidir.
Ucuz olması: Maliyet fayda oranının yüksek olmasıdır.
Etkisinin geri döndürülebilir olması: Uygulama sonrasında istenmeyen bir sonuç alındığında etkisinin ortadan kaldırılabilmesidir.
Etki süresinin uzun olması: Etkisinin kalıcı değil ancak uzun olmasıdır.
İdeal dolgu maddesinin bu özelliklerini günümüz teknolojisinde en yüksek oranda karşılayan HA dolgulardır.
1996 yılında piyasaya ilk sürüldüğünden bugüne çok sayıda farklı özellikte HA dolgu üretildi. Hayvansal veya bakteriyel kökenli olma, çapraz bağ sayısı, çapraz bağ için kullanılan madde, çapraz bağlanma için kullanılan yöntem, molekül büyüklüğü, HA konsantrasyonu, higroskopik equilibrium gibi pek çok değişken farklı materyaller elde edilmesine sebep olur.
HAin canlılar arası yapısal farklılık taşımaması nedeniyle ilk piyasaya sürülen HAler çiftliklerde bolca bulunan horoz ibiğinden üretilen avian kaynaklılardır. Bu ürünlerin tabi tutulduğu işlemlere rağmen artık proteinler içerebilmesi, alerjik reaksiyonlara sebep verme ihtimalini ortaya çıkartıyordu.
Teknolojik gelişmelerle birlikte bakterilerin kapsülü için ürettiği HAin izole
üretimin çoğunun bu yönteme kaymasına sebep oldu.
Streptococcus equi bakterisi HA üretiminde yaygın olarak kullanılır.
Kültüre edilip çoğaltılan bu bakterinin konak immun sisteminden korunma, hareketini kolaylaştırma, yapışmasını kolaylaştırma amaçlı ürettiği HA kapsülü bakteriden ayrıştırılır. Çeşitli yöntemlerle saflaştırılan HA liyofilize halde ileri işlemler aşamasına gelir.
Toz haldeki bu modifiye edilmemiş saf HA su ile birleştiğinde yumurta beyazı benzeri visköz bir sıvı oluşur (12). (Şekil 2) Bu aşamadaki HA molekülleri canlı dokuya enjekte edilirse hızlı bir şekilde daha önce bahsettiğimiz enzimatik ve non-enzimatik yollarla elimine edilir. Bu basit yapılı ancak kompleks işlevli molekülün tedavi amaçlı kullanımı için yıkımını yavaşlatacak modifikasyonlara (çapraz bağlanma, stabilizasyon) tabi tutulması gerekir.
Şekil 2: HA zincileri su ile etkileşime geçince visköz bir sıvı oluşturu
a. Çapraz Bağlama (Stabilizasyon):
Kalıcılığı arttırmak için yapılan bu işlemde çapraz bağlanma için kullanılan molekül farklı HA polimer zincirlerini geri dönüşümsüz olarak kovalent bağ ile birbirine bağlar. Oluşan polimer ağı jel halini alır (12). (Şekil 3) Oluşan polimer
ağı sayesinde HYAL enzimleri ve serbest radikallerin molekül ile teması zorlaşır;
her bağ kopartışında daha küçük bir parçayı yıkabilir. Bu durum daha yavaş bir yıkım sürecini sağlar.
Şekil 3: Çapraz bağlanma ile HA solüsyonu jel haline gelir.
Çapraz bağ oluşturmak için en yaygın olarak kullanılan iki molekül 1,4- butanediol digılisidal eter (BDDE) ve di-vinyl sulfondur (DVS). Bu moleküller HA zincirindeki hidroksil kısımları uygun sıcaklık ve basınçta çapraz bağlayıcı enzimlerin yardımı ile reaksiyona girer. Farklı çapraz bağlayıcı moleküllerin degredasyonu yavaşlatmada benzer sonuçları vardır (12) (Şekil 4).
Çapraz bağ yüzdesi her 100 disakkarit unitesi başına düşen çapraz bağ sayısını gösteren bir parametredir. %5 çapraz bağ demek her 100 disakkarit ünitesinde 5 çapraz bağ anlamına gelir. İçerik ve üretim süreçleri ile ilgili bütün parametreler aynı olduğunda çapraz bağ yüzdesinin artması jel sertliğini arttırıp daha zor yıkılan (kalıcı) bir HA elde edilmesini sağlar. Bu nokta da ince bir denge olduğu unutulmamalıdır. Artan çapraz bağ sayısı doğaldan (vücudun tanıdığından) uzaklaşan bir molekül anlamına gelir. Biyouyumluluğu azalan bu jel enjekte edildiği vücutta immünolojik reaksiyon oluşmasına sebep olabilir.
b. Faz Kavramı:
Çapraz bağlama da kullanılan tekniğe göre HA dolgular ikiye ayrılır.
Bifazik (non-koheziv) ve monofazik (koheziv).
Çapraz bağ oluşumu sonrasında HA zincirleri birbirine bağlanarak tek bir kitle haline gelir. Bifazik (non-koheziv) ve monofazik (koheziv) jeller arasında ki fark bu noktada ortaya çıkar.
Yaygın olarak kullanılan adıyla NASHAlar (Non animal stabilized hyaluronic acid, Restylane) bifazik jellerdir. Bu materyalin üretiminde kullanılan çapraz bağlama tekniği nedeniyle elde edilen çapraz bağlı kitlenin enjektörden enjekte edilebilmesi için eşit büyüklükte partiküllere bölünmesi ve bu partiküllerin kayganlaşmasına yardım edecek çapraz bağlanmamış HA süspansiyonunda süspanse edilmesi gerekir. Bifazik tanımı buradan ileri gelmektedir (Çapraz bağlı ve çapraz bağsız HA moleküllerinin bir arada bulunması). Bu modifiye edilmemiş HA partiküllerinin varlığı dolgunun kohezivitesini azaltır. Çünkü bu partiküller dokuda hızlı bir şekilde yıkılır ve geri kalan bölümde boşluklara sebep olur.
Monofazik (Juvéderm®) HA jellerde ise molekül ağırlığı farklı HA molekülleri arasında tek aşamalı olarak çapraz bağ oluşturulur. Bu işlemde kullanılan teknik nedeniyle oluşan pürüzsüz devamlı (homojen) madde de modifiye edilmemiş HA molekülleri bulunmaz, kohezivdir, daha yumuşaktır ve enjektörden ek bir kayganlaştırıcıya ihtiyaç olmaksızın geçebilir. Tek homojen bir parça olması nedeniyle bu teknikle üretilen HA jellere partikülsüz denir. Aslında bu terim tam olarak doğru değildir. Çünkü uygulama esnasında enjektörün pistonu itilirken durulması gerekeceği için molekül parçalanacaktır. Yapılan histolojik incelemelerde bifazik jeller gibi düzenli olmasa da partikül yapıları görülmüştür (21) (22) (Şekil 5) (Şekil 6) (Şekil 7).
Şekil 5: 2.4x büyütmede bifazik Restylane (A) ve monofazik Juvederm Ultra (B) dolgularının görüntüsü
(Beasley KL, Weiss MA, Weiss RA. Hyaluronic acid fillers: a comprehensive review. Facial Plast Surg. 2009;25 (2):86-94.)
Şekil 6: 51x büyütmede bifazik (solda) ve monofazik (sağda) dolguların görüntüsü
(Pierre S, Liew S, Bernardin A. Basics of dermal filler rheology. Dermatol Surg. 2015;41 Suppl 1:S120-6.)
Şekil 7: Monofazik (soldaki görüntü) ve bifazik (sağdaki görüntü) histolojik görüntüleri
(Ohrlund JA, Edsman KL. The Myth of the "Biphasic" Hyaluronic Acid Filler. Dermatol Surg.
2015;41 Suppl 1:S358-64.)
Monofazik dolguların bir alt başlığı da polidensifiye (çoklu çaprazlanmış) dolgulardır. (Belotero) Bu dolgular klasik monofazik dolgulara ek olarak bir aşama daha çaprazlanma işlemine tabi tutulur (22).
Partiküllü HA dolgular doldurucu etki ve kalıcılık için partikül büyüklüğünü kullanırken, partikülsüz HA dolgular doldurucu etki ve kalıcılık için daha fazla çapraz bağ ve koheziviteyi kullanır (23).
c. Reoloji (Akış bilimi):
Akışkan maddelerin fiziksel ve kimyasal özelliklerini gösterir. Dolgu materyalleri reolojik olarak incelendiğinde içeriklerinin ve üretim süreçlerinin yarattığı karakter farklılıkları ortaya konur.
Dolguların reolojik özellikleri reometre ile ölçülür. Bu alet deforme edilemeyen biri sabit birisi hareketli iki plak ve bunlarda ölçüm yapan proplardan oluşur. Dolgu bu iki plak ile tam temas edecek şekilde yerleştirilir. Sabit bir osülasyonda basınç uygulanır ve bu makaslama gücüne dolgunun verdiği yanıta göre visköz ve elastik değerleri hesaplanır (24).
Reometre dolguya uygulanan makaslama güçlerine karşı davranışını gösterse de dolgunun enjeksiyonu ve dokudaki mevcudiyeti sırasında maruz kaldığı güç sadece makaslama değil aynı zamanda kompresyon ve çekme güçleridir. Bu güçlere olan direnci de kohezivite belirler (Şekil 8).
Şekil 8: Dokuda dolgu maddesine etki eden güçler
Şeklini değiştirip boyutlarını değiştirmeyen torsiyon ve makaslama güçleri (Solda). Şeklini değiştirmeyip boyutlarını değiştiren kompresyon ve germe güçleri (Sağda). Pierre S, Liew S, Bernardin A. Basics of dermal filler rheology. Dermatol Surg. 2015;41 Suppl 1:S120-6.
i. Viskoelastisite
HA jeller visköz ve elastik özellikleri bir arada bulunduran yapılardır.
Viskoelastik bir maddeye güç uygulandığında iki şekilde deforme olur. Visköz deformasyon geri dönüşümsüz şekil değişikliğidir, elastik deformasyonsa uygulanan güç ortadan kaldırılınca maddenin eski haline geri döndüğü şekil değişikliğidir (25). Saf visköz bir madde (örn: bal) makaslama gücü devam ettikçe deforme olmaya devam eder ama bu madde üzerindeki güç kaldırıldığında eski haline dönmez. Saf elastik bir madde (örn: silgi) ise makaslama gücü altında belirli bir noktaya kadar deforme olur ancak güç ortadan kalkınca eski haline döner (26).
Madde reometrede değerlendirildiğinde deformasyona karşı rezistansı, sertliği (kompleks modulus) (G*); depolama katsayısı (elastik modulus) (G’); kayıp katsayısı (visköz modulus) (G’’); tan =G’’/G’ ölçülebilir.
HA jellerin ince iğnelerden geçip enjekte edilebilmesi için yeterince düşük visköz modulusları enjekte edilip gittiği bölgede kalabilmeleri içinde yüksek elastik modulusları olması gerekir (27). Başka bir deyişle enjeksiyon esnasında düşük visköz, enjekte edildiği bölgede de yüksek elastik olmalıdır.
tan değeri maddenin elastik ve visköz davranışları arasındaki dengeyi verir. HA jellerdeki tan değeri genellikle 1 den küçüktür. Bu HA jellerin düşük G’’ değerine bağlıdır. Deformasyona cevapları temelde elastiktir. HA dolguların dokudaki davranışları bizim için daha önemli olduğu için enjekte edilebilir olduğu sürece önemli olan elastik modulustur. (G’) Bu nedenle visköz modulus HA dolguların reometrik değerlendirmesinde ön plandaki parametrelerden birisi değildir.
G* değeri ∗ √ ′′ ′ formülü ile hesaplanır. Bu formülden G*
değerinin kabaca G’ ve G’’ değerlerinin toplamı olduğunu söyleyebiliriz. HA dolgularda elastik davranış ön planda olduğu için G* değeri ile G’ değeri genellikle eş anlamlı kullanılır.
G’ değeri jelin sertliğini verir. Yüksek G’ değerli bir jel deforme edilmesi daha zor, daha sert bir jeldir. G’değeri yüksek HA jeller dokuyu kaldırmak (lifting) için gerekli güce karşı koyabileceği için kaldırma kapasitesi daha yüksek jellerdir.
G’ değerini belirleyen HA dolgunun üretim tekniği, HA konsantrasyonu (çapraz bağlı ve çapraz bağsız) ve çapraz bağ sayısıdır. Aynı yöntemle üretilmiş, aynı miktarda HA içeren iki dolgudan çapraz bağ sayısı fazla olanın G’ değeri daha yüksektir (25).
Cmin değeri çeşitli yöntemlerle dolgu içindeki çapraz bağsız HAlerin yarattığı sertliği ekarte ederek, sadece çapraz bağ sayısının sertlik üzerinde yarattığı etkiyi gösteren G’ değerinin bir eşleniğidir.
Üretim sürecinde oluşan farklılıklar şu şekilde açıklanabilir. Oluşan her çapraz bağın etki gücü aynı değildir. Çapraz bağlama işleminde HA zincirleri çapraz bağlayıcı ajan (BDDE,DVS vb.) ile muamele edilince çapraz bağlanmalar oluşabilir veya sadece şeker uniteleri ile tek taraflı bir bağlanma oluşur. Her türlü bağlanmaya MoD (modification degree) denir. MoE (Modification efficency) modifikasyon başına oluşturulan sertliği gösterir (25).
MoE Cmin
MoD
Bifazik dolguların çapraz bağlanma işlemindeki teknik ve kullanılan işlenmemiş molekülden kaynaklı MoE değeri >1 iken Monofazik dolgularda bu rakam <1’dir. Monofazik bir dolgu olan Juvederm Ultra 4’ün daha fazla HA konsantrasyonu, daha fazla çapraz bağ yüzdesi ve MoD’ye rağmen bifazik bir dolgu olan Restylane ’e göre daha düşük G’ değerinin olması bu sebepledir (25) (Tablo 2).
Tablo 2: Bifazik (Restylane ) ve monofazik (Juvederm Ultra 4) iki dolgunun reolojik özellikleri.
ii. Kohezivite:
Kohezivite temelde çapraz bağlı HA moleküllerini bir arada tutan çekim gücü ile ilişkilidir (28). Koheziv jellerde bu çekim gücü yüksek koheziv olmayan jellerde bu çekim gücü düşüktür. Kohezivite HA jellerin vertikal deformasyon (kompresyon) güçlerine olan direncini gösterir. Bu vertikal güçlere maruziyette koheziv jeller projeksiyonlarını korurken koheziv olmayan jeller projeksiyonlarını kaybeder ve yayılır. Yayılmanın derecesi enjekte edildiği bölgeye göre değişir.
Dermal enjeksiyonlarda sıkışık alan nedeniyle az subdermal enjeksiyonlarda gevşek alan nedeniyle çok yayılırlar (26). (Şekil 9)
Ürün Faz Partikül
size (m)
HA konsantrasyonu
(mg/ml)
Çapraz Bağ Yüzdesi
Çapraz bağ molekülü
G’
(Pa) Cmin (mg/ml)
MoE Kompresyon (gmf)
Juvederm Ultra 4®
Monofazik N/A 24 6 BDDE 94 2.1 <1 96
Restylane® Bifazik 400 20 <1 BDDE 565 5 5 29
Şekil 9: Kompresyon gücü karşısında kohezivitelere göre dolgu davranışları.
iii. Su Çekme
HA jellerin hidrofilik karakterlerine bağlı ozmotik güçleri ile şişen HA ağının elastik güçleri belli bir seviyede dengeye gelince higroskopik equilibriuma (denge) erişilir. Yani HA su çekme açısından doygunluğa erişir (12).
HA dolgular hazırlanırken belirli bir su doygunluğunda (higroskopik equilibrium) hazırlanır. Bu doygunluğun artması enjekte edildikten sonra ki su çekme kapasitesini azaltır. HA dolgunun su çekme kapasitesini etkileyen birinci faktör içeriğindeki HA konsantrasyonu ikincisi ise çapraz bağ sayısıdır. Çapraz bağ sayısını arttıran HA küçülür ve su moleküllerinin gireceği alan daralır, su çekme özelliği azalır. Artan HA konsantrasyonu daha çok su çekme kapasitesi demektir (29).
d. HA Jel Kararlılığı
Ekzojen HA molekülü de endojen HA gibi enzimatik ve non-enzimatik olarak yıkılır. Enzimatik yıkım endojen veya ekzojen hiyaluronidazlar ile olurken non enzimatik yıkım ağırlıklı olarak serbest radikaller ile gerçekleşir.
HA dolguların yıkımı bulunduğu bölgede, taşındığı lenf nodlarında ve
HA dolguların yıkıma karşı koyma kapasitesi içeriğindeki HA konsantrasyonuna, çapraz bağ sayısına, partikül büyüklüğüne, uygulama yöntemine göre değişir.
Kararlılıkla ilgili temel mantık şudur. HA molekülü ile etkileşime geçen radikaller ve hiyalüronidaz molekülü 1-4 glikozidik bağını yıkar. Bu işlemin gerçekleşmesi için enzimin ve radikallerin molekülün o bölgesi ile yakınlaşması gerekir. Eğer molekülde çok miktarda çapraz bağ varsa bunun sebep olacağı kapalı şekil enzimin o bölgeye yaklaşmasını önler. Aynı zamanda artan çapraz bağ sayısı enzimin molekülden kopardığı parçaların küçülmesine neden olur. Artan HA konsantrasyonuda yıkılacak molekül miktarı arttığı için yıkım süresini uzatır.
Partikül büyüklüğü ve uygulama yönteminin yarattığı etki ise şu şekilde anlatılabilir. Büyüyen partiküllerin yüzey alanı küçülür (12). (Şekil 10) Aynı şekilde bolus yüksek hacimli enjeksiyon yapılması yüzey alanını azaltacağı için yıkıcıların temas ettiği HA alanı azalır, yıkılım yavaşlar (31).
Şekil 10: Partikül büyüklüğü enzim yüzey alanı temas ilişkisi
Yapılan klinik çalışmalarda etki süresi açısından monofazik ve bifazik dolgular arasında bir fark olmadığını gösterilmiştir (32).
e. Uygulama
Reolojik özellik farklılıkları tedavi seçeneklerimizi genişletir. HA dolgular farklı bölgelerde farklı derinliklerde uygulanır. Temelde uygulama bölgelerine uygunlukta değerlendirilen reolojik parametre G’ değeridir. Sert dolgular daha derin bölgelerde hacim vererek yapısal değişiklikler yaratma (lifting) amaçlı kullanılırken daha yumuşak dolgular daha yüzeysel, kemiğe yakın, yumuşak olması gereken bölgelerde kırışıklıkları açmak veya hacim vermek için kullanılır. Örneğin dudaklarda sert bir dolgunun kullanılması sahip olduğu direnç nedeniyle dokuda yarılma yaratacak bu durum hastada doğal olmayan sert bir hisse sebep olacaktır.
Orta yüz bölgesini hacimlendirmek için yumuşak bir dolgunun kullanılması ihtiyaç duyulan kaldırıcı etkiyi sağlamak için gerekli direnci gösteremeyecektir.
Yüzeysel uygulamalar da bifazik ve monofazik dolgular derideki davranış biçimleri bakımından farklıdır. Bu dolgular ile yapılan histolojik çalışmalarda bifazik dolguların retiküler dermiste ve subkutan dokuda geniş düzensiz kümeleşmeler yaptığı; papiller dermise ulaşamadığı görülmüştür. Monofazik dolgularınsa daha homojen küçük kümeleşmeler yaptığı ve papiller dermise doğru yaklaştığı tespit edilmiştir. Bifazik dolgulardaki bu geniş kümeleşmeler etraf dokuları çarpıtırken monofazik dolgular mevcut doku ile daha uyumlu bir pozisyon alır (33). Bu nedenle farklı faz özelliklerine sahip dolgular farklı endikasyonlarda kullanılır (Şekil 11).
Şekil 11: HA dolguların (Alcian mavisi) enjeksiyonunun hemen sonrasında histolojik görüntüsü
Restylane bifazik (şekil A ve B) ve Juvederm Ultra monofazik dolgular. (Flynn TC, Sarazin D, Bezzola A, Terrani C, Micheels P. Comparative Histology of Intradermal Implantation of Mono and Biphasic Hyaluronic Acid Fillers. Dermatologic Surgery. 2011;37 (5):637-43.)
2.2. Botulinum Toksini a. Tarihçe
Botulinum gram (+) anaerob bir bakteri olan Clostridium Botulinum tarafından üretilen nörotoksin ailesidir. Bu toksin ailesinde 7 serotip bulunur. (A, B, C1, D, E, F, G) İnsanlar bu subtipler arasında A, B, E, F, G’ye duyarlıdır. Farklı subtipler Clostridium Botulinum’un farklı suşlarınca sentezlenir. En uzun etkili subtip BT-A’dır.
Bakteriye bağlı enfeksiyon besin, infantil, yara, inhalasyon kaynaklı oluşabilir. Toksin botulizm olarak bilinen klinik tabloya yol açar. Klinik tablo
olarak kraniyal sinirlerce innerve edilen kaslarda görülür. Semptomlar çift görme, göz kapağında düşüklük, yutma güçlüğü, yüz mimiklerinin kaybı ile başlar.
Otonom sinir sistemini etkilen bulgular eklenebilir. Ağızda kuruluk, kabızlık, postüral hipotansiyon. Klinik tablonun ilerlemesi ile güçsüzlük ekstremitelere doğru ilerler. Ciddi olgularda solunum kaslarının etkilenmesi sonucu solunum depresyonu ve ölüm görülür (34).
Botulizm terimi latince botulus yani sosis kelimesinden gelmektedir. 1802 yılında Almanya’nın Stuttgart şehrinde gelişen epideminin iyi pişirilmemiş sosislerden kaynaklandığının düşünülmesi üzerine bu isim verilmiştir. 1822 yılında Justinus Kerner tarafından yayınlanan hasta serisinde klinik tablo özetlenmiş ve sinir sistemini etkileyen bir entoksikasyon tanımı yapılmıştır. 1895 yılında Belçikalı mikrobiyolog Emile Pierre Marie van Ermengem hastalığa sebep olan bakteriyi tespit etmiştir. 1920 yılında Amerikalı Dr. Herman Sommer tarafından BT-A izole edildi. 1946 yılında Amerikalı Dr. Edward Schantz BT’yi saflaştırıp yüksek miktarlarda üretmeyi başarmıştır. 1950lerde Dr. Vernon Brooks BT-A nın enjekte edildiğinde hiperaktif kasların motor sinir sonlarında asetilkolin salınımını blokladığını ve hedef kasta paraliziye sebep olduğunu tespit edilmiştir. Bu gelişmeden sonra BT’nin tedavi amaçlı kullanılabileceğine yönelik araştırmalar yaygınlaşmıştır. 1970li yıllarda oftalmolog Dr. Alan B. Scott maymunlar üzerinde yaptığı deneylerde BT-A’nın oftalmik distoni tedavisinde kullanılabileceğine yönelik sonuçlar almıştır (35). 1978’de Dr. Scott Oculinum şirketini kurmuş ve insanda strabismus tedavisi için BT-A araştırmalarına başlamıştır. 1981 yılında
göstermiştir (36). Toksinin kozmetik amaçlı kullanımı 1987 yılında Jean Carruthers ve Alistair Carruthers tarafından kaz ayakları için 1992 yılında da glabella için tanımlanmıştır (37) (38). 2000 yılında FDA (Food and Drug Administration tarafından servikal distoni tedavisinde kullanımı 2002 yılındaysa göz etrafı kırışıklıklarının tedavisinde kozmetik amaçlı kullanımı onaylanmıştır.
2016 yılı ASAPS verilerine göre Amerika’da yılda ortalama 4,5 milyon botulinum toksin uygulaması yapılmaktadır. Cerrahi olmayan kozmetik girişimler arasında en sık yapılandır (1).
Botulinum toksininin nörolojik, oftalmolojik, otolaringolojik, ürolojik, proktolojik, algolojik ve jinekolojik pek çok uygulama alanı mevcuttur ve giderek genişlemektedir.
b. Molekül yapısı
Botulinum toksini aksesuar toksik olmayan proteinlerin eşlik ettiği bir komplekstir. (Şekil 14) Botulinum toksini 1296 amino asitten oluşan tek pol pept t z nc r yapısında sentezlend kten sonra ntrasellüler veya ekstrasellüler proteazlar aracılığı le 100 kDa ağırlığındak ağır z nc r ve 50 kDa ağırlığındak haf f z nc rden oluşan d mer yapısına dönüşür. (Şekil 12) Toks n n etk nl ğ n göstereb lmes ç n hem ağır hem de haf f z nc re ht yaç vardır. Bu k z nc r b rb r ne ısıya karşı duyarlı d sülf t bağları ve non-kovalent güçlerle bağlanmıştır. 7 farklı subtipi tanımlanan botulinum toksinin hepsi presinaptik sinir ucunda asetilkolin salınımını engellese de hedef aldıkları proteinler ve etki mekanizmaları farklıdır.
Şekil 12: Botulinum toksinin yapısı
Hafif zincir (Mavi), ağır zincir (Yeşil) ve bağlantı zinciri (Sarı ve kırmızı)
Günümüzde sadece BT-A (Botox, Dysport, Xeomin) ve BT-B (Myobloc) ticari olarak kullanımdadır. Bu ilaçlar koruyucu içerikleri, kompleks içerikleri, biyolojik aktiviteleri açısından farklılıklar gösterir (Şekil 14).
Şekil 14: BT ilacının içeriği
Dressler D. & Benecke, R. (2006). (Xeomin®: Eine neue therapeutische Botulinum Toxin Typ A- Preparation. Akt Neurol, 33, 138–41.)
Botulinum toksin ilaç
Botulinum toksin (BT)
Botulinum nörotoksin
(BNT)
Ağır zincir (HC) Hafif Zincir (LC)
Toksik olmayan proteinler
Hemaglutinin proteinler
Non hemaglutinin
proteinler Koruyucular
Toksik olmayan proteinler Botulinum nörotoksini
c. Etki Mekanizması
Botulinum toksini enjekte edildiği bölgede ağır zinciri ile kolinerjik sinir terminallerindeki glikoprotein yapılara selektif olarak bağlanır. Bu olayda kesin bir nörospesifite söz konusudur (39). Bu bağlanma sıfırıncı derece kinetiğe uyar. Ya hep ya hiç fenomeni değildir. Belirli bir miktarda toksin belirli bir miktarda sinir terminalini bloke eder. Reseptörler doygunluğa erişince dozun arttırılması etkiyi veya etki süresini değiştirmez. Ektoreseptör ile ağır zincirin etkileşimi sonrası vezikül aracılı endosiztoz ile BT’in hafif zinciri hücre içine alınır. Hafif zincirin çinko endopeptidaz özelliği vardır. Bu özelliği ile hücre içi asetilkolin veziküllerini sinaptik aralığa taşıyan SNARE (soluble N-ethylmaleimide sensitive factor attachment protein reseptör) proteinlerini yıkar (40). SNARE proteinleri ökaryotik hücrelerdeki bütün membran füzyon olaylarında önemli rol alır (39). Farklı BT subtipleri farklı SNARE proteinlerini (SNAP-25, Sinaptobrevin, Sintaksin) hedef alır. BT-A, BT-C ve BT-E SNAP 25’i (Synaptosomal-associated protein 25 kD) hedef alırken BT-B, BT-D ve BT-F sinaptobrevini (VAMP vesicle associated membrane protein) hedef alır (41) (42). BT-C aynı zamanda sintaksin molekülünü hedef alır. Bu mekanizmalar ile hem spontan hem istemli asetilkolin salınımı azalır.
(Şekil 13 ve 15)
Kas fiberlerinde (ekstrafüzal) botulinum toksini asetilkolinin nöromuskuler bileşkede salınmasını engelleyerek kas gücünde azalma yaratırken, kas iğciğinde (intrafüzal) yarattığı azalmış aktivasyon kastaki gevşemeyi sağlar.
Hedef organa bağlı olarak BT kolinerjik nöromusküler iletimi etkilemenin yanı sıra ter, tükrük, göz yaşı bezlerinin ve düz kasın kolinerjik otonomik uyarımını da bloklar.
Botulinum toksin ayrıca noradrenalin, dopamin, glisin, peptid metiyonin enkefalin, substance P gibi başka nörotransmitterlerin de salınımını inhibe etmektedir (43).
Şek l 15: Botulinum toksininin etki mekanizması
(Dickerson JT, Janda KD. The use of Small Molecules to Investigate Molecular Mechanisms and Therapeutic Targets for Treatment of Botulinum Neurotoxin A Intoxication. ACS Chem Biol. 2006;
1 (6):359-69.)
Botulinum toksinin oluşturduğu denervasyon sinir terminalindeki rejenerasyon ile geri döner. Erken dönemde inaktive haldeki postsinaptik terminalden salınan büyüme faktörleri presinaptik bölge sinir terminalinden yeni
aksonal tomurcuklanmalara neden olur (44) (45). Ana sinir terminalinin rejenerasyonu ile birlikte bu tomurcuklanmalar geriler.
Botulinum toksini insanda enjeksiyon sonrası maksimum etkisine 2 haftada ulaşırken 2.5 ay sonra etkisinde kademeli bir azalma başlar ve 6-9 ay sonra tamamen ortadan kalkar. İnsan üzerinde bu sürecin moleküler temelini ele alan çalışmalar olmayıp yapılan fare deneylerinde süreç şu şekilde gösterilmiştir.
Farelerde etki yaklaşık 30 gün sürer. Yıkılmış SNAP-25 molekülleri 20-40 gün kadar motor sinir son ucunda görülür. Sinir tomurcuklanması 42 güne kadar devam eder. Bu tomurcuklanmalardan yeni vezikül oluşumları görülür. Erken faz kas seğirmeleri bu yeni oluşan bağlantılardan kaynaklanır. Geç fazda (63.gün) ana sinir terminalinde yeni vezikül oluşumları görülür. Tomurcuklanmalar geriler. 93.gün ana sinir terminali tam olarak iyileşir ve tomurcuklar tamamen yok olur (46).
Botulinum toksin A’nın etki ettiği memeli sinir hücreleri dejenere olmaz.
Yaklaşık 90 günde nöral ekzositozun tam olarak geri döndüğü yeniden şekillenmeye gider (47).
d. Tavşanlarda Botulinum Toksin Deney Modelleri
Tavşanlar üzer nde botul num toks n deney lk olarak 1953 yılında yapılmıştır (48). 1960 ve 1970'lerde toksinin etki mekanizması ve serotiplendirilmesi le lg l çalışmalar devam etm şt r.
2003 yılında Jabor ve ark. Tarafından yapılan ön çalışmada tavşan kulağın da toks n n hazırlanma ve saklanma koşullarına göre etk s değerlend r lm ş, toks n n tavşan kulağın da paral t k etk oluşturacak m n mum etk n dozunun 2.5 U
parametreler kullanılmıştır. 2006 yılında Görgü ve ark. tavşan kulağında botul num toks n n n lokal anestet k ajanlarla olan etk leş m n değerlend rm şt r (50). 2007 yılında Elmas ve ark. y ne tavşan kulağında toks n n sulandırıldıktan sonra bekletilme süresi le etk nl k arasındak l şk y değerlend rm şt r (51). 2013 yılında Bulam ve ark. tavşan kulağında trombos tten zeng n plazma mezoterap s le botul num toks n uygulamasının arasındak l şk y değerlend ren b r araştırma yapmıştır (52). 2016 yılında Şibar ve ark. Botulinum toksinin sulandırmasında albümin veya plateletten fakir plazmanın kullanılmasının biyoyararlanım üzerine etkilerini deneysel bir tavşan modelinde çalışmışlardır (53).
2.3. Tavşan Auriküler Bölge Anatomisi
Tavşan frontal bölgesi cilt kalınlığı, hemen altında bulunan anterior auriküler kas. (M. scutuloauricularis superficialis dorsalis) ve onun altındaki kemik nedeniyle insan glabellasına benzerlik gösterir.
Tavşanlarda botul num toks n etk nl ğ ç n yapılmış olan çalışmalarda, kulak bölgesi hem enjeksiyonun kolay olması, hem de toks n n kulak stat k poz syonunda bel rg n değ ş kl k oluşturab lmes neden yle sık terc h ed len bölgelerden b r s olmuştur.
Tavşan kulağında 3 ana kas grubu bulunur. Anterior, medial ve lateral kas grupları. Bu kaslardan anteriorda olan grup daha belirgin kas kitlesi içerir.
Anteriordaki kas grubu dışarıdan rahatlıkla palpe edilebilmesi nedeniyle enjeksiyonu oldukça rahattır. Anter or aur kuler kas grubu frontal kem kte med al kantusun 2 cm kran al nden or j n alır ve ps lateral kulağın ventromedial sınırına
(kulak baz s nden 3 cm uzağa) yapışır. (Şekil 16: 16. m. scutuloauricularis superficialis dorsalis). Bu kas kulağın erekte pozisyonunu korumada en etkili olandır. Bu kasın paral z s kulakta düşüklük ve kulağı erekte edememe ile sonuçlanmaktadır. Medial ve lateral kas grupları kısmen bir hareket sağlar.
Şek l 16: Tavşan yüz ve boyun kaslarının anatomisi
M. scutuloauricularis superficialis dorsalis (16), m. scutuloauricularis superficialis ventralis (17), m. parotidoauricularis (18), m. zygomaticus portio auricularis (11') kulak hareketlerinden sorumlu kaslardır. (A Colour Atlas of Anatomy of Small Labaratory Animals. Peter Popesko, et al., Wolfe Publishing Ltd. 1990. Sayfa 18)
Anterior auriküler kasın (M. scutuloauricularis superficialis dorsalis) innervasyonu fasiyal sinirin rami auriculares rostrales dalı tarafından sağlanır (54) (Şekil 17).
Şek l 17: Fasiyal sinir ve dalları
N. facialis (1), n. auriculopalpebralis (2), rami auriculares rostrales (4) (A Colour Atlas of Anatomy of Small Labaratory Animals. Peter Popesko, et al., Wolfe Publishing Ltd. 1990. Sayfa 22)
Bu sinir insanda olduğu gibi parotis bezinin yüzeyel lobunun altından dallanarak yüze ve frontal bölgeye dağılır. Frontal dalı bulmak için en uygun yüzey işareti angulus mandibulanın posterosuperiorudur.
Deneyimizin ön çalışmasında yapılan disseksiyonun ve önemli anatomik yapılar gösterilmiştir (Şekil 18).
Şekil 18: Anterior auriküler kasın disseksiyonu
Beyaz oklar kasın origosunu siyah ok kasın insersiyosunu göstermektedir.
2.4. Denervasyon
2.4.1. Periferik sinir aksotomisi ile çizgili kas denervasyonu
Uyarılmanın yokluğunda çizgili kaslar engellenemez bir atrofi sürecine girer. Bu süreç neticede fonksiyonel kasın fibrozis ve yağ dokusu ile yer değiştirmesi ile sonuçlanır (55).
Denervasyon sonrası kas dokusu 3 aşamadan geçer (56). Bu aşamaların
İlk aşama denervasyonun hemen sonrasında başlar yaklaşık 2 ay sürer.
İstemli hareketler kaybolur ve kas kitlesinde hızlı bir kayıp gelişir. Bu dönemde kasın tekrar innerve olması halinde tam olarak iyileşme gerçekleşir (57).
İkinci aşama 2-7 ay arası dönemdir. Atrofi ilerler ve sarkomerik organizasyon bozulur (58). Bu dönemde iyileşme kabiliyeti artarak azalır.
Üçüncü aşama 7. aydan sonrasıdır. Kas fiberleri dejenere olur. Fibröz bağ dokusu ve yağ dokusu ile yer değiştirir. Kas içi sinir kökleri dejenere olur (57).
Yavaş kas gruplarında hızlı kas gruplarına göre atrofi daha hızlı gelişir. Hızlı kas gruplarında tip 1 (ekstrafüzal) kas lifleri daha çabuk atrofiye giderken tip 2 (intrafüzal) kas lifleri daha yavaş atrofiye gider (59).
Paradoksal olarak denervasyonun erken döneminde kas kan akımı artsa da haftalar içinde kapiller sayısında azalma görülür (60, 61). Denervasyonun hemen ardından vazokonstriksiyona uğrayan kas 48 saat sonra vazodilate olur. İkinci hafta da kas kan akımı denerve olmayan haline göre %133 olur (62).
2.4.2. Botulinum toksini ile çizgili kas denervasyonu
Botulinum toksini ile oluşan denervasyon aksotomi benzeri değişiklikler gösterir (63). Yapılan çalışmalarda botulinum toksini ile denerve edilen tavşan kulak kasın da 5.günün sonunda dejeneratif değişiklikler görülmüş olup 12. haftada yapılan incelemede denervasyonun ilerlediği ve cerrahi denervasyonda olduğu gibi sarkomerik organizasyonda değişiklikler görülmüştür. Sinir hücrelerinde aksonal dağılma, schwann hücre sitoplazmasında dejenerasyon, myelinsiz sinirlerin kaybı myelin kılıflarında ayrılma görülmüştür (51).
Botulinum toksinin perivasküler olarak enjeksiyonundan sonra SNARE proteinlerinin engellenmesi ile NA salınımını engeller ve damar duvarında sempatektomi benzeri etki gösterir (64).
3. GEREÇ VE YÖNTEM
3.1. Deney Hazırlıkları
Çalışma T.C Gaz Ün vers tes Rektörlüğü Hayvan Deneyler Yerel Et k Kurul Başkanlığı tarafından 24/12/2016 tarih G.Ü.ET-16.082 sayılı z n le onay ver lm şt r. Çalışma Gaz Ün vers tes Deneysel Araştırmalar Merkez 'nde gerçekleşt r lm şt r. Denekler Gaz Ün vers tes Laboratuar Hayvanları Yet şt rme ve Deneysel Araştırmalar Merkez 'nden (GÜDAM) tem n ed lm şt r.
Çalışmada 2500-3000 gr arasında minimum 4 aylık olan 9 adet dişi Yen Zelanda beyaz tavşanı kullanılmıştır. Denekler 22 ±2°C sıcaklıkta 12 saat aydınlık ve karanlık periyotları olan, hava akımı açısından uygun şartlarda ve uygun kafeslerde serbest yem ve su ile beslenerek barındırılmıştır. Her kafeste 1 hayvan bulunacak şekilde uzman veter nerler kontrolünde zlenm şt r. On gün karant na süres beklenm şt r. Hayvanları şaretlemek ç n her hayvanın kulak ç yüzü şaretleme ç n kullanılmıştır. Karant na süres boyunca herhang b r hayvan kaybı söz konusu olmamıştır.
Anestezi için %10'luk ketamin HCl (45mg/kg-Ketalar®
intramuskuler) ve
%2'lik ksilazin HCl (5mg/kg alfazyne®
intramuskuler) kullanılmıştır (Şekil 19).
Şekil 19: Anestezik ilaçlar. Ketalar 500mg Pfizer, Alfazyne %2 Atafen
3.2. Çalışma Grupları
Çalışmamızda deney grubu ve kontrol grubu olmak üzere iki adet çalışma grubu bulunmaktadır. Deney grubundaki hayvanların sağ ve sol tarafları birbirleri ile karşılaştırılmıştır. Kontrol grubundaki 3 hayvanın 6 kulağı deney grubunun kontrolü olarak kullanılmıştır.
Grup 1 (Deney grubu) (n=6): Sol taraf anterior aurikuler kası cerrahi olarak denerve edilip (-21.gün) sağ taraf anterior aurikuler kası BT-A ile denerve edilen (- 14.gün) tavşanlar. Denervasyon sonrası her iki taraf frontal bölgede anterior aurikuler kas altına 0.5 er cc HA dolgu enjekte edildi. (0.gün)
Grup 2 (Kontrol grubu) (n=3): Anterior aurikuler kaslarına işlem yapılmayıp sadece sol taraflarına cilt insizyonu yapılmıştır. (-21.gün) 21 gün sonra frontal bölgede anterior aurikuler kas altına 0.5 er cc HA dolgu enjekte edildi.
3.3. Botulinum Toksininin Hazırlanması Deney grubundaki hayvanlarda Botox®
100U (Allergan Pharmaceut cals Inc, Irv ne, CA) flakon kullanılmıştır. L teratürde daha önceden yapılmış olan çalışmalarda, 2.5U Botul num A toks n n n tavşan anter or aur kuler kasında tam paral z ye yol açan m n mum güvenl doz olduğu saptanmıştır (49). Çalışmamızda da deney grubundak tavşanların sağ kulaklarının anterior auirikuler kasına 2.5U Botox®
(Allergan Pharmaceuticals Inc, Irvine, CA) intramuskuler olarak enjekte edildi. Enjeksiyonlar 30-gauge enjektörler kullanılarak yapıldı. BT-A enjeksiyonu HA enjeksiyonundan 14 gün önce gerçekleştirildi. Şibar ve arkadaşlarının 2016 yılında yaptığı çalışmada anterior aurikuler kasa uygulanan salin ile sulandırılmış 2.5 unite botulinum toksini sonrası elektrofizyolojik ve görsel değerlendirme yapılan çalışma da anterior aurikuler kas aktivitesinin 6.haftadan sonra tekrar başladığı görülmüştür (53). Kas paralizisini sürdürebilmek için 6. haftada hayvanlara tekrar 2.5 unite BT-A enjeksiyonu gerçekleştirildi.
3.4. Cerrahi Denervayson
Cerrahi denervasyon işlemi hiyaluronik asit enjeksiyonundan 21 gün önce genel anestezi altında gerçekleştirildi. (%10'luk ketam n HCl 45mg/kg ntramuskuler ve %2'l k ks laz n HCl ntramuskuler kullanılmıştır). Bu sürenin beklenmesinin nedeni HA’in akut inflamatuar dönemdeki monosit ve nötrofil baskın ortama maruz kalmasının önlenmesidir. HA yıkımındaki önemli bir mekanizma inflamatuar hücrelerin ürettiği serbest oksijen radikalleridir. Cerrahi
yaratacağı farklılığı önlemek için kontrol gurubuna sadece aynı uzunlukta cilt insizyonu gerçekleştirilmiş ve ardından primer olarak sutüre edilmiştir. Grup 1 deki hayvanlarda mandibula angulus ramus ve corpusu boyunca yapılan yaklaşık 3cmlik kesiyi takiben ön yüz bölgesinin flebi anteriora boyun bölgesinin flebi posteriora doğru ekarte edilmiştir. Mandibula angulusu hizasında parotis bezi görülmüş superfisyel lob kaldırılarak fasiyal sinir dalları ortaya konulmuştur. Frontal bölgeye giden dalın derin seyri ve inceliği nedeniyle yerinin belirlenmesi kendinden enerjili sinir stimulatörü ile gerçekleştirilmiştir. (Bovie Neruo-Pulse Self-Powered Nerve Locator) Stimulatör önce 1 mV ile sinirin stimulasyonunu takiben daha sonra hassas lokalizasyon için 0.1 mV uyarı gönderecek şekilde ayarlanmıştır.
Stimulasyon ile anterior aurikuler kas kasılması ve buna bağlı kas hareketi görülünce eğer sinir loop ile görülebildiyse 0.5cmlik bir kısım eksize edilecek şekilde; eğer tespit edilemediyse stimulatör etrafından çapı 0.5 ve 0.7cm olacak şekilde 2 adet dairesel tam kat kesi yapılmıştır. (Video 1) Ardından kanama kontrolü yapılarak kesi monofilament 5-0 eriyen sutür materyali ile primer olarak onarılmıştır. İşlem sonrasında 2.günde yara bakımı gerçekleştirilmiştir. 3 Numaralı hayvanda yara ayrılması gelişmesi nedeniyle yara dudakları tazelenerek cilt onarımı tekrarlanmıştır. Cerrahi sonrası pansuman dışında bir işlem yapılmamış;
herhangi bir antibiyotik veya ağrı kesici uygulanmamıştır (Şekil 23).
Cerrahi işlemden 1 hafta sonra aksotomi yapılan hayvanlara EMG yapılmış ve sinir iletimi değerlendirilmiştir. Deney grubundaki bütün hayvanlarda cerrahi işlem yapılan tarafta sinir aksiyon potansiyelleri değerlendirildi.
Video 1: Sinir stimülasyonu videosu
3.5. Hiyalüronik Asit Jel
Kullanılan hiyalüronik asit jel bakteriyel kaynaklı çapraz bağlı monofazik ve monodensifiyedir. (Juvederm Ultra 4) (Şekil 20) İçeriğinde 24mg/ml hiyaluronik asit bulunur. Hiyalüronik asit zincileri arasında %6 oranında çapraz bağı bulunur. Çapraz bağ için kullanılan molekül BDDE’dir. G’ değeri 0.1 Hz de 102.2111.46 pa’dır (27). Kutusunda 2x1ml lik iki enjektör çıkan ürünün her 1ml lik enjektörleri bir hayvan için kullanılmıştır. Enjeksiyon için ürünün içinden gelen 27 G 13mm lik iğne kullanılmıştır. Hiyalüronik asit enjeksiyonu sagittal planda iris hizasından çizilen dik çizginin 2 cm kraniyaline kas altı supraperiostal plana her bir tarafa bolus olarak 0.5cc yapıldı (Şekil 21).
Şekil 20: Juvederm Ultra 4. Monofazik monodensifiye çapraz bağlı hiyalüronik asit dolgu
Şekil 21: Siyah ile işaretli bölgeler enjeksiyon alanlarını göstermektedir
Kırmızı çizgiler ile gösterilen anterior aurikuler kasın topografik görüntüsüdür. HA enjeksiyonu korneal apeksin 2 cm kraniyaline yapılmıştır.
3.6. Deney İçin Gerekli Araç ve Gereçler
Kimyasal denervasyon için botulinum A toksini 100 U BOTOX® (
Allergan Pharmaceuticals Inc, Irvine, CA); cerrahi denervasyon için kendinden enerjili sinir stimülatörü (Bovie Neruo-Pulse Self-Powered Nerve Locator), denervasyonun teyidi için EMG çalışmasında VIA SYS - SYNERGY 12.3 MEDELEC® c hazı ve 3 adet ğne uçlu elektrot kullanılmıştır. H yalüron k as t dolgu olarak 9cc Juvederm Ultra 4 kullanılmıştır. Dolgu hacmini belirlemek için Siemens Magnetom Verio syngo MR B17, Erlangen, Germany manyetik rezonans görüntüleme cihazı kullanılmıştır.
Şekil 22: Deney basamakları
Cerrahi denervasyon HA enjeksiyonunun 21 gün öncesinde sol tarafta gerçekleştirilmiştir. BT-A enjeksiyonu HA enjeksiyonunun 14 gün öncesinde sağ tarafa gerçekleştirilmiştir. HA enjeksiyonunu takiben 2. günde ilk MR görüntülemesi yapılmıştır. 6. haftada sağ anterior auriküler kasa BT-A enjeksiyonu tekrarlanmıştır.
Cerrahi denervasyon
‐21.gün
BT‐A enjeksiyonu
‐14.gün
HA enjeksiyonu
0.gün
MR görüntüleme
2.gün
2.BT‐A enjeksiyonu
6.hafta (42.gün)
MR görüntüleme
90.gün
Şekil 23: Cerrahi işlemin basamakları
Angulus mandibula topografisinde yapılan insizyon sonrası cilt flebpleri eleve edildi. Angulus hizasında parotis görüldü. Parotisin yüzeyel lobu kaldırılınca fasiyal sinirin dallanması görüldü. Stimülatör ile naterior auriküler kası innerve eden dal tespit edildi. Makas ile 0.5 cmlik bir segment eksize edilerek aksotomi gerçekleştirildi.
Cilt
insizyonu Parotis ve
sinir dalları
Stimülasyon Sinirin
görülmesi
Aksotomi
3.7. Değerlendirme Yöntemleri
3.7.1. Görsel değerlendirme ve fotoğrafik kayıt
Botulinum toksin A ve cerrahi denervasyonun kaslardaki paralitik etkisi nedeniyle kulaklardaki düşme derecesi değerlendirildi. Tüm hayvanların deneyin başlangıcında kulakları sağlıklı ve dik konumdaydı. Cerrahi işlem sonrası 1.günde işlem yapılan deney grubundaki bütün hayvanların sol kulaklarının pozisyonları Jabor ve arkadaşlarının yayınladığı skorlama sistemine göre değerlendirildi (49).
(Şekil 24) Bu skorlama sistemine göre:
Derece 1: Enjeksiyon öncesi pozisyon (Kulak tamamen d k ve karşı kulakla simetrik pozisyonda)
Derece 2: Minimal/Orta derecede paralizi (Kulak 60°'den fazla kaldırılab l r fakat tam d k poz syon veya karşı kulakla s metr sağlanamaz)
Derece 3: Orta/Ağır derecede paral z (Paralitik kulak 60°'den fazla kaldırılamaz)
Şek l 24: Kulak pozisyonlarının görsel derecelend rme s stem le değerlend r lmes
Cerrahi işlem sonrası 7. günde deney grubundaki hayvanların sağ kulaklarının anterior auriküler kaslarına 2.5 unite BT-A uygulandı. Enjeksiyon sonrası 14.günde sağ kulaklarda yukarıda belirtilen skorlama sistemine göre değerlendirildi. Kulak pozisyonları HA enjeksiyonu ve sonrasındaki 12 hafta boyunca her hafta bir kez değerlendirilmeye devam edildi.
3.7.2. Elektronöromiyografi (ENMG)
Anestez altında tüm tavşanların sol kulaktak anter or aur kuler kas kütleler n n ortası şaretlend . Fas yal s n r trases ve uyarı ver lecek alan şaretlend . Kaydedici aktif kayıt elektrodu anterior aurikuler kas orta noktasına (kas göbeğ ne), referans elektrot anter or aur kuler kasın nsers yosuna batırıldı, toprak ğne elektrot kulağın posterolateral ne yerleşt r ld . VIA SYS- SYNERGY 12.3 MEDELEC® cihazı kullanılarak mandibula angulus hizasında fasiyal sinirin supramaksimal uyarımı yapılarak birleşik kas aksiyon potansiyelleri tespit edilmeye çalışılmıştır.
3.7.3. Manyetik rezonans görüntüleme (MRG)
MR görüntüleri 3 Tesla (T) MR cihazı (Siemens Magnetom Verio syngo MR B17, Erlangen, Germany) ile 8 kanallı kafa sargısı kullanılarak elde edildi.
Tüm baş görüntüye dahil edildi. Aksiyel ve sagittal T2 ağırlıklı MR görüntüleri için kullanılan sekans parametreleri sırasıyla; TR, 4140/3460 milisaniye; TE, 93/97 milisaniye; FOV, 70/80 mm; kesit kalınlığı 2 mm; süre, 4,05/4,06 dakika olarak gerçekleştirildi.
3 ay aralıkla aynı parametreler ile elde edilen görüntüler iş istasyonuna gönderildi. Volümetrik ve projeksiyon hesaplamaları gerçekleştirildi. Hacim hesaplaması için serbest alan çizim yöntemi kullanıldı. Tüm radyolojik ölçümler deneyimli aynı radyolog tarafından gerçekleştirildi.
3.8. Verilerin İstatistiksel Analiz Yöntemleri
Verilerin analizi IBM SPSS Statistics 23.0 (IBM Corporat on, Armonk, NY, USA) paket programında yapıldı. Sürekl değ şkenler n dağılımının normale yakın olup olmadığı Shap ro W lk test ile, varyansların homojenl ğ se Levene test yle araştırıldı. Tanımlayıcı stat st kler ortalama ve ortanca (minimum- maks mum) şekl nde göster ld .
Gruplar arasında ortalama hac msel ve yüksekl k değ ş m yönünden farkın öneml l ğ Kruskal Wall s testler yle araştırıldı. Aks bel rt lmed kçe p<0,05 ç n sonuçlar stat st ksel olarak anlamlı kabul ed lm şt r.
