(MRSA) Prevalansının Farklı
Yöntemlerle Araştırılması
#
Vildan AVKAN OĞUZ*, Senay DODANLI*, İpek YILDIRIM*, Oğuz ÖZTÜRK**, Nevin SARIGÜZEL*, Engin SEBER*
* Şişli Etfal Hastanesi, İnfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji Kliniği,
** İstanbul Üniversitesi, Deneysel Tıp Araştırma Enstitüsü (DETAE) Moleküler Tıp Anabilim Dalı, İSTANBUL
ÖZET
Bu prospektif çal›flmada hastanemizde yatan hastalar›n çeflitli örneklerinden izole edilen metisiline direnç-li Staphylococcus aureus prevalans›n› saptamak ve farkl› yöntemlerle metisidirenç-lin direncini araflt›rmak amaçland›. Toplam 117 S. aureus suflu ile çal›fl›ld›. Agar dilüsyon ile 41(%35), agar tarama ile 39 (%33.3) ve disk difüzyon ile 38 (%32.5) sufl metisiline dirençli bulundu. Dirençli bulunan 41 suflun 27 (%65.8)’si hem beta-laktamaz hem mec A (+), 3 (%7.4)’ü sadece mec A (+), 6 (%14.6)’s› sadece beta-laktamaz (+) bulundu. Befl (%12.2) suflta beta-laktamaz ve mec A saptanmad›. Sonuç olarak, metisilin direncini saptamada agar tarama ve disk difüzyon yöntemlerinin duyarl›l›k ve özgüllükleri aras›nda, istatistiksel olarak anlaml› fark bulunmad› (Mc Nemar testi ve Cohen Kappa istatisti¤i ile uyum ölçümü yap›ld›). Ancak, rutinde kullan›lan disk difüzyonla metisilin diren-ci saptanan sufllar›n direndiren-cinin, agar dilüsyondan daha basit ve ekonomik olan agar tarama yöntemiyle kont-rol edilmesi, sufllar›n minimal inhibitör konsantrasyonu (MIC) de¤erleri hakk›nda bilgi verebilir. Mümkünse bu sufllarda mec A geni bak›lmas› tedavi protokolünün yönlendirilmesinde yard›mc› olabilir.
Anahtar Kelimeler: Staphylococcus aureus, Agar dilüsyon, Agar tarama, Disk difüzyon, Beta-laktamaz, Po-limeraz zincir reaksiyonu, Mec A
SUMMARY
Assessment of The Prevalence of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) with Different Methods
The aim of this prospective study was to determine the prevalence of methicillin resistant Staphylococ-cus aureus that were isolated from various clinical specimens in our hospital and to search for methicillin re-sistance by using different methods. Hundred and seventeen isolates were studied. Of these, 41(35%) were found to be resistant to methicillin with agar dilution; 39 (33.3%) with agar screening and 38 (32.5%) with disk diffusion. Of the resistant strains, 27 (65.8%) were found to be positive both for beta-lactamase and mec A; while 3 (7.4%) only for mec A; 6 (14.6%) only for beta-lactamase. Neither beta-lactamase nor mec A we-re determined in 5 (12.2%) strains. As a conclusion we have found no statistically significant diffewe-rence in sen-sitivity and specificity between agar screening and disk diffusion methods used in the detection of methicillin
Metisiline dirençli Staphylococcus aureus (MRSA) prevalansı hem coğrafik bölgeler arasında hem de aynı bölgede yer alan sağlık kuruluşları ara-sında değişkenlik gösterir[1,2]. Her hastanedeki
MRSA prevalansının bilinmesi, uygun tedavinin seçi-mini sağlayarak hastane içi epidemileri seçi-minimuma indirir. Bu bilgilerin ışığı altında hastanemizdeki S. aureus prevalansını ve metisilin direncini saptamak üzere 6 aylık dönemi içine alan prospektif bir çalış-ma başlatıldı. Çalışçalış-mada, hastanede yatan hasta ör-neklerinden izole edilen S. aureus suşlarının metisi-lin direnci farklı yöntemlerle çalışıldı ve sonuçları su-nuldu.
MATERYAL ve METOD
Servislerden laboratuvarımıza gönderilen kan, yara aspirasyonu, beyin-omurilik sıvısı (BOS), idrar, apse materyali, kateter ucu, trakeal aspirasyon ma-teryali ve burun sürüntüsünden izole edilen 117 suş ile çalışıldı. Yüzde 5 koyun kanlı agar besiyerinde üreyen, gram-pozitif kok, katalaz ve koagülaz pozi-tif, mannitol salt agarda (Oxoid) mannitolü fermente edenler S. aureus olarak isimlendirildi. Suşların, No-vobiyosin (5 µg Difco) ve basitrasin (0.04 U, Oxoid) duyarlılığına da bakıldı. Suşlar çalışılana kadar %10 gliserol içinde -20°C’de saklandı. Aynı anda agar di-lüsyon, agar tarama ve disk difüzyon yöntemleriyle metisilin direnci araştırıldı. Minimal inhibitör kon-santrasyonu (MIC) 2 µg/mL ve üzerinde olan suşla-rın polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile mec A ge-ni taşıyıp taşımadığına, Nitrocephin Dry-Slide Kit (Difco) ile beta-laktamaz yapıp yapmadığına bakıldı. Standart suş olarak S. aureus ATCC 25923 ve mec A geni pozitif olan S. aureus 27R suşu kullanıldı.
Agar Dilüsyon
Bu yöntem için oksasilin konsantrasyonları 0.06-16 µg/mL olan %2 NaCl ilaveli Mueller-Hin-ton agar (Atabay M-173, MHA) besiyeri ve 104
CFU/mL bakteri içerecek şekilde bakteri süspansi-yonları hazırlandı. Ekim yapılan petriler 35°C’de 24 saat inkübe edildi (Resim 1)[3].
Agar Tarama
Besiyeri 2 µg/mL oksasilin içeren %5 NaCl ila-veli MHA ile yapıldı. Mueller-Hinton sıvı besiyerinde üreyen bakteri süspansiyonundan 100 mL (108
CFU/µL) alınarak agar yüzeyine yayıldı[4,5]. Ekim
yapılan petriler 35°C’de 24 saat inkübe edildi. Üre-me olanlar kaydedildi. ÜreÜre-me olmayanlarda inkü-basyona 48 saat devam edildi. İnkübasyon süresi so-nunda tek bir koloninin üremesi bile metisilin direnci-nin göstergesi kabul edildi. Üreyen koloniler Gram boyama, katalaz ve koagülaz yapılarak kontrol edildi.
Disk Difüzyon
Rutinde kullanılan NaCl ilavesiz MHA’da 1 µg'lık oksasilin (Oxoid) diski ile yapıldı. Ekim yapılan petri-ler 35°C’de 24 saat inkübe edildi. İnhibisyon zon çapları “National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS)” önerilerine göre okundu[3].
Polimeraz Zincir Reaksiyonu
DNA izolasyonu için yoğun bakteri süspansiyonu hazırlandı. 12.000 g’da 1 dakika santrifüj sonrası resistance (Mc Nemar and Cohen Kappa statistical tests were used in the study). Yet we recommend to retest the isolates which are found to be methicillin resistant by disk diffusion method used routinely, with agar screening also which is cheaper and more simple. Than dilution tests this test can give additional infor-mation about MIC levels. Furthermore exploring for mec A gene in these isolates contributes more in the-rapeutic approach.
Key Words: Staphylococcus aureus, Agar dilution, Agar plate screening (agar spread method), Disk dif-fusion, Beta-lactamase, Polymerase chain reaction, Mec A
# Bu çalışma, 8. Türk Mikrobiyoloji ve İnfeksiyon Hastalıkları kongresi (6-10 Ekim, Antalya)’nde sunulmuştur.
dipteki çökeltiye 50 µL lizostafin (100 mg/mL Sig-ma) ilave edildi. Onbeş dakika sonra 50 µL prote-inaz K (100 µg/mL Sigma) ve 150 µL TE buffer (0.5 µL Tris 2M pH 7.4 + 20 µL EDTA 0.5 M pH 8.0 + 99.3 mL distile su) eklenerek 37°C’de 30 da-kika bekletildi[6]. Fenol-kloroform ekstraksiyon
uygu-landı. Çökelti TE buffer içinde çözülerek -20°C’de saklandı. Aynı anda, aynı işlemler apirojen su için de uygulandı ve işlemin negatif kontrolü olarak kullanıl-dı. PCR için 5 µL kullanılkullanıl-dı.
PCR’de kullanılan primerler[7];
5’-GACCGAAACAATGTGGAATTGGCC-3’ 5’-CACCTTGTCCGTAACCTGAATCAGC-3’ dNTP (her birinden 0.2 mM), primerler (50 pmol), 1 ünite Tag polimeraz (Boehringer-Mannheim, Al-manya) ve tampon solüsyonu [50 mM KCl, 10 mM Tris HCL (pH 8.3), %0.1 Triton-X 100, 2.5 mM MgCl] ile reaksiyon karışımı 50 µL’ye tamamlandı. Karışımın üzeri 75 µL mineral oil ile kapatıldı. Ther-mal Cycler (Perkin Elmer Cetus)’de 95°C'de 1 daki-ka, 55°C’de 1 dakidaki-ka, 72°C’de 2 dakika olmak üze-re toplam 35 siklus uygulandı. PCR ürününe %2’lik agaroz (Sigma) jel elektroforez yapıldı. Kontrol ola-rak Hae III DNA belirteci kullanıldı. Jel fotoğrafları çekildi (Resim 2a, 2b, 2c, 2d).
Beta-laktamaz
Nitrocephin Dry-Slide Kit (Difco) kullanılarak metisiline dirençli suşların beta-laktamazı araştırıldı.
İstatistiksel Analiz
SPSS for Windows ver 10.0 paket programı kul-lanılarak, eş grup oranlarının karşılaştırılmasında Mc Nemar testi ve Kappa istatistiği ile uyum ölçümü ya-pılmıştır. Kappa değeri “0” ise testler arasında hiç uyum olmadığı, “1” e ne kadar yakınsa testler ara-sındaki uyumun mükemmelliği, “-1” e ne kadar ya-kınsa testlerin birbirlerinden farklı sonuçlar verdiği düşünülmüştür.
Resim 2a. Mec A geni jel fotoğrafları. 1 pozitif kontrol (27 R), 2 negatif kontrol (25923), 3-11 S. aureus suşları, 12 marker (Hae III).
12 2 1
mec A (1.1 kb)
Resim 2b. Mec A geni jel fotoğrafları. 1 pozitif kont-rol (27 R), 2 negatif kontkont-rol (25923), 3-11 S. aureus suşları, 12 marker (Hae III).
12 2 1
mec A (1.1 kb)
Resim 2c. Mec A geni jel fotoğrafları. 1 pozitif kontrol (27 R), 2 negatif kontrol (25923), 3-11 S. aureus suşları, 12 marker (Hae III).
12 2 1
mec A (1.1 kb)
BULGULAR
S. aureus izole edilen kültürlerin %42.7’si kan (bir hasta için en az 2 kan kültüründe üreme kriter alınmıştır), %25.6’sı yara, %13.6’sı burun sürüntü-sü, %6.8’i idrar, %11.3’ü diğer materyallerden oluş-maktadır (Şekil 1).
Toplam 117 suşun 41 (%35)’i metisiline dirençli bulunmuştur. Agar dilüsyon, agar tarama ve disk di-füzyon sonuçları Tablo 1’de verilmiştir. MRSA’ların PCR ve beta-laktamaz sonuçları Tablo 2’de verilmiş-tir. Tablo 3 ve 4’te agar dilüsyon yöntemi temel
alı-narak agar tarama ve disk difüzyon yöntemlerinin duyarlılık ve özgüllükleri değerlendirilmiştir. Agar di-lüsyona göre agar tarama yönteminin duyarlılığı %100, özgüllüğü %95, disk difüzyonun duyarlılığı %100, özgüllüğü ise %92.6 olarak saptanmıştır. Mc Nemar testi ve Cohen Kappa değerleri incelenerek agar dilüsyon/disk difüzyon (p= 0.250, Cohen kap-pa= 0.943) ve agar dilüsyon/agar tarama (p= 0.50, Cohen Kappa= 0.962) testlerinin birbirleriyle sıra-sıyla %94.3 ve %96.2 oranında uyumlu oldukları gösterilmiştir. Agar tarama/disk difüzyon testleri karşılaştırıldığında (p= 1.000, Cohen Kappa= 0.981) uyumluluk %98.1’e kadar çıkmaktadır. Disk difüzyon ve agar tarama yöntemlerinin özgüllükleri arasında saptanan %2.4’lük fark, istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır.
Tablo 1. Suşların yöntemlere göre duyarlılıkları (n= 117)
Agar dilüsyon Agar tarama Disk difüzyon
• Duyarlı 76 (%65) 78 (%66.7) 79 (%67.5)
• Dirençli 41 (%35) 39 (%33.3) 38 (%32.5)
• Toplam 117 (%100) 117 (%100) 117 (%100)
Tablo 2. MRSA’ların mec A ve beta-laktamaz dağılımları (n= 41)
mec A (-) mec A (+) Toplam
• Beta-laktamaz (-) 5 (%12.2) 3 (%7.4) 8 (%19.6)
• Beta-laktamaz (+) 6 (%14.6) 27 (%65.8) 33 (%80.4)
• Toplam 11 (%26.8) 30 (%73.2) 41 (%100)
Şekil 1. Suşların klinik örneklere göre dağılımı. 1: Kan, 2: Yara, 3: Burun sürüntüsü, 4: İdrar, 5: BOS, 6: Apse, 7: Kateter ucu, 8: Trakeal aspirasyon materyali, 9: Fistül ağ-zından alınan materyal.
Resim 2d. Mec A geni jel fotoğrafları. 1 negatif kon-trol (25923), 2 pozitif konkon-trol (27 R), 3-15 S. aureus suşları, 16 marker (Hae III).
16 2 1 mec A (1.1 kb) 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 S. aureus 1 2 3 4 5 6 7 8 9
TARTIŞMA
Dünyada MRSA prevalansı belirgin farklılıklar göstermektedir. Ülkemizde çeşitli hastanelerde yapı-lan çalışmalarda MRSA sıklığı %9-48 arasında değiş-mektedir[1]. Hastanemizde %35 olarak saptanmıştır.
Hemodiyaliz hastaları, insülin kullanan diyabetik hastalar, intravenöz ilaç bağımlılığı olan kişiler, ato-pik dermatit, AIDS ve interlökin-2 tedavisi görenler gibi MRSA taşıma riski yüksek olan grupta ve endo-kardit, osteomiyelit gibi uzun süre tedavi gerektiren durumlarda bu oran çok daha önemlidir
Stafilokok infeksiyonlu hastalarda antimikrobiyal tedavi metisilin duyarlılığına göre belirlenir. MRSA’da mec A geninin kodladığı penisilin bağla-yan protein (PBP) 2a’nın sentezi en sık rastlanan di-renç mekanizmasıdır[8]. Laboratuvarda direncin
fe-notipik görünümünü etkileyen çevresel faktörlerden etkilenmeyen, genotipik metodlardan biri olan PCR; mec A geninin saptanmasında hızlı, duyarlı, güveni-lir bir yöntemdir[6]. Ancak MRSA suşlarının yüksek
oranda (%77.4) beta-laktamaz yaptığı da unutulma-malıdır[9]. Ayrıca son yıllarda metisilin direnci
olma-sına karşın, belaktamaz negatif ve mec A geni ta-şımayan stafilokokların da olduğu bildirilmektedir[10].
Bu stafilokoklardaki PBP’lerin, duyarlı bakterilerdeki PBP’lerden daha az oranlarda beta-laktam antibiyo-tiklere bağlandıkları saptanmış ve bu mekanizmanın da stafilokoklarda metisilin direncine neden olabile-ceği bildirilmiştir[10]. Çalışmamızda, dirençli suşlar
metisilin direncinin heterojenliği nedeniyle beta-lak-tamaz ve mec A geni varlığı açısından araştırıldı. Me-tisilin direnci saptanan ancak mec A ve beta-lakta-maz negatif 5 suşun ya DNA’sını izole
edemediğimi-zi ya da yukarıda sözü edilen direnç mekanizmasına sahip olduğunu düşündük.
Metisilin direncinin tespitinde PCR'den daha ekonomik, kolay ve güvenilir metodlara gereksinim vardır. İnokülum miktarı, inkübasyon zamanı, inkü-basyon ısısı, hazırlanan besiyerinin pH’sı, NaCl kon-santrasyonu direncin ortaya çıkmasını etkileyebi-lir[11]. Rutinde kullanılan disk difüzyon optimum
şart-larda, uygun ısı (35°C) ve oksasilin (1 µg) diski ile ya-pıldığında güvenilir bir yöntemdir[3,12,13]. Fakat disk
difüzyonun da düşük seviyede dirençli S. aureus suş-larını saptamada agar tarama yönteminden daha az duyarlı olduğu ve metisilin direncinin heterojenitesi yüzünden, bazı izolatların disk difüzyonla yanlışlıkla metisiline duyarlı ya da dirençli olarak yorumlanabi-leceği bildirilmektedir[14]. Bu olasılıklar düşünülerek,
laboratuvardaki rutin çalışmalarda MRSA ve “bor-derline” dirence sahip olabilecek S. aureus suşları saptandığında ya da kesin karar verilemediğinde, so-nuçlar bir başka yöntem ile kontrol edilmelidir. Dilüs-yon yöntemleri, agar tarama ve PCR önerilen yön-temlerdendir. Dilüsyon yöntemlerinin rutinde çalışıl-ması güçtür. Daha fazla zaman ve malzeme sarf edil-mektedir. PCR her laboratuvarda uygulanamayan pahalı, teknik olanak ve deneyimli personel gerektir-mektedir. Bu nedenlerle daha basit ve ekonomik, mec A geninin saptanmasında referans gösterilen metodlarla en iyi uyumu sağlayan, rutinde disk difüz-yon kadar kolay uygulayabileceğimiz agar tarama yöntemini, disk difüzyon ile karşılaştırdık[15].
Metisi-lin direncini saptamada agar tarama ile disk difüzyon yöntemleri aynı duyarlılıkta bulunmasına ve 2 yönte-min de özgüllükleri arasında istatistiksel anlamlı bir
Tablo 3. Agar dilüsyona göre agar tarama yönteminin özgüllük ve duyarlılığı
Agar dilüsyon ile duyarlı Agar dilüsyon ile dirençli Toplam
• Agar tarama ile duyarlı 76 2 78
• Agar tarama ile dirençli 0 39 39
• Toplam 76 41 117
Tablo 4. Agar dilüsyona göre disk difüzyonun özgüllük ve duyarlılığı
Agar dilüsyon ile duyarlı Agar dilüsyon ile dirençli Toplam
• Disk difüzyon ile duyarlı 76 3 79
• Disk difüzyon ile dirençli 0 38 38
fark olmamasına rağmen, disk difüzyonla yapılan ru-tin laboratuvar çalışmalarında metisilin direnci sapta-nan suşların kontrolünde, agar tarama yöntemi kul-lanılabilir. Çünkü agar dilüsyondan daha kolay uygu-lanabilir ve disk difüzyondan farklı olarak suşların MIC değerleri hakkında bilgi verebilir.
Sonuç olarak, gereksiz glikopeptid kullanımını önlemek üzere rutinde disk difüzyonla metisilin di-renci saptanan suşların agar dilüsyondan daha basit ve ekonomik olan agar tarama yöntemiyle kontrol edilmesini öneririz. Mümkünse bu suşlarda mec A geni bakılması tedavi protokolünün yönlendirilme-sinde yardımcı olabilir. Zira son yıllarda çeşitli ülke-lerden (Japonya, Fransa, İngiltere, İspanya) bildiril-meye başlanan glikopeptid duyarlılığı azalmış S. au-reus suşları yeni sorunları ortaya çıkaracaktır[16].
Yaptığımız literatür araştırması sonucunda henüz ül-kemizde glikopeptid antibiyotiklere azalmış duyarlılık veya direnç bildirilmemiş olması rahatlatıcıdır. Dün-yada MRSA infeksiyonlarının tedavisinde alternatif yeni seçenekler (Quinupristin/Dalfopristin, Linezo-lid) vardır[16,17]. Ancak bilindiği gibi, ülkemizde
MRSA infeksiyonlarının tedavisinde glikopeptid an-tibiyotikler henüz tek seçenektir.
KAYNAKLAR
1. Çetinkaya Y, Ünal S. Metisilin dirençli S. aureus infeksi-yonları epidemiyoloji ve kontrol. Flora 1996;1:1-16. 2. Boyce JM. Methicillin resistant Staphylococcus aureus;
a continuing infection control challenge. Eur J Clin Mic-robiol Infect Dis 1994;13:45-9.
3. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically-3rd Edition; Approved Standard. M7-A3. Villanova: 1993.
4. Comité de Antbiogramme de la Société Française de Microbiologie. Comuniqué 1992 du Comité de I’ Antibi-ogramme De la Société Française de Microbiologie. Pat-hol Biol 1992;40:741-8.
5. Richard P, Meyran M, Carpenter E, et al. Comparison of phenotypic methods and DNA hybridization for detecti-on of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol 1994;32:613-7.
6. Ünal S, Hoskins JA, Flokowitsch JE, et al. Detection of methicillin-resistant staphylococci by using the polymera-se chain reaction. J Clin Microbiol 1992;30:1685-91. 7. Ünal S, Werner K, Degırolamı P, et al. Comparison of
tests for detection of methicillin-resistant Staphylococ-cus aureus in a clinical microbiology laboratory. Antimic-rob Agents Chemother 1994;38:345-7.
8. Kaye KS, Fraimov HS, Abrutyn E. Pathogens resistant to antimicrobial agents epidemiology, molecular mecha-nisms, and clinical management. Infect Dis Clin North Am 2000;14:300-3.
9. Kawaguchi E, Minamide W, Mori H, et al. The taxonomic distribution and susceptibility against antimicrobial agents of methicillin-resistant staphylococci isolated from blood. Kansenshogaku-Zasshi 1996 Nov.70;11:1147-53. 10. Ünal S, Aşçıoğlu Akhan S. Stafilokok infeksiyonları.
Will-ke Topçu A, Söyletir G, Doğanay M (editörler). İnfeksi-yon Hastalıkları. 1. Baskı, İstanbul: Nobel Kitabevi, 1996:773-80.
11. Chambers HF. Detection of methicillin resistant staphy-lococci. Infect Dis Clin North Am 1993;7:425-31. 12. Chambers HF. Methicillin resistant staphylococci. Clin
Microbiol Rev 1988;1:173-86.
13. Mulligan ME, Murrey-Leisure KA, Rıbner BS, et al. Met-hicillin Resistant Staphylococcus aureus: A consensus review of the microbiology, pathogenesis and epidemi-ology with implications for prevention and management. Am J Med 1993;94:313-25.
14. Mackenzie AMR, Richardson H, Lannıgan R, et al. Evi-dence that the national committee for clinical laboratory standards disk test is less sensitive than the screen plate for detection of low-expression-class methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol 1995;33: 1909-11.
15. Waldvogel FA. Staphylococcus aureus (including staphylococcal toxic shock). In: Mandell GL, Bennett JE, Dolin R (eds). Principles and Practice of Infectious Dise-ases. 5th ed. New York: Churchill Livingstone, 2000: 2069-92.
16. Lundstrom TS, Sobel JD. Antibiotics for gram-positive bacterial infections. Infect Dis Clin North Am 2000;14: 463-75.
17. Plouffe FJ. Emerging therapies for serious gram-positive bacterial infections; a focus on linezolid. Clin Infect Dis 2000;31(Suppl 4):144-9.
Yazışma Adresi: Dr. Vildan AVKAN OĞUZ Dokuz Eylül Üniversitesi
Tıp Fakültesi İnfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı İnciraltı-İZMİR
