GÖKKUŞAĞI ALABALIKLARINDA (Oncorhynchus mykiss-WALBAUM 1792)
BAZI ANTİBİYOTİK KALINTILARININ SAPTANMASI
Evren Özdemir
BESİN HİJYENİ VE TEKNOLOJİSİ ANABİLİM DALI DOKTORA TEZİ
DANIŞMAN
Prof. Dr. Tarık Haluk ÇELİK
2010 - ANKARA
GÖKKUŞAĞI ALABALIKLARINDA (Oncorhyncus mykiss – WALBAUM 1792)
BAZI ANTİBİYOTİK KALINTILARININ SAPTANMASI
Evren ÖZDEMİR
BESİN HİJYENİ VE TEKNOLOJİSİ ANABİLİM DALI DOKTORA TEZİ
DANIŞMAN
Prof. Dr. Tarık Haluk ÇELİK
2010 - ANKARA
İÇİNDEKİLER
Kabul ve Onay ii
İçindekiler iii
Önsöz v
Simgeler ve Kısaltmalar vi
Çizelgeler vii
Şekiller viii
1. GİRİŞ 1
1.1. Balık Etinin Yapısı ve Besin Değeri 2
1.2. Su Ürünleri Üretim ve Tüketimi 4
1.3. Kültür Balıkları Yetiştiriciliğinde Antibiyotik Kullanımı 8 1.3.1. Su Ürünleri Yetiştiriciliğinde Kullanılan Antibiyotikler 9
1.4. Antibiyotik Kullanımının Olumsuz Etkileri 14
1.4.1. Dirençli Bakteri Soylarının Gelişimi 14
1.4.2. Balık Etinde Kalıntı Problemi 16
1.4.2.1. Aşırı Duyarlılık Reaksiyonları (Hipersensitivite) 17 1.4.2.2. İntestinal Mikroflora Üzerine Etkileri 18 1.4.2.3. Teratojenik, Mutajenik, Karsinojenik Etkileri 19
1.4.3. Çevresel Etkiler 20
1.5. Antibiyotik Kalıntısının Aranmasında Kullanılan Yöntemler 24
1.5.1. Mikrobiyolojik Yöntemler 24
1.5.2. İmmunokimyasal Yöntemler 25
1.5.3. Fizikokimyasal Yöntemler 27
1.6. Alabalık Biyolojisi 28
1.7. Yasal Düzenlemeler 30
1.7.1. Ulusal Kalıntı Kontrol Programı 33 1.7.1.2. Yetiştiricilik Yolu İle Elde Edilen Su Ürünleri Numune Alma
Prosedürü 34
2. GEREÇ VE YÖNTEM 37
2.1. Araştırma Yeri ve Süresi 37
2.2. Gereç 38
2.2.1. Balık Materyali 38
2.2.2. Laboratuarda Kullanılan Araçlar, Cihazlar 38
2.2.3. Kullanılan Kimyasallar ve Malzemeler 38
2.2.3.1. Charm II Test 38
2.2.3.2. Ridascreen ELISA Test 39
2.2.3.3. HPLC 40
2.3. Yöntem 40
2.3.1. Balık Örneklerinin Alınması, Taşınması ve Laboratuarda Saklanması 40
2.3.2. Charm II Testi 41
2.3.2.1. Örneklerin Hazırlanması ve Analizi 41
2.3.3. Ridascreen ELISA Test 42
2.3.3.1. Örneklerin Hazırlanması ve Analizi 43
2.3.4. HPLC 43
2.3.4.1. Örneklerin Hazırlanması ve Analizi 44
3. BULGULAR 45
4. TARTIŞMA 51
5. SONUÇ VE ÖNERİLER 56
ÖZET 57
SUMMARY 58
KAYNAKLAR 59
ÖZGEÇMİŞ
ÖNSÖZ
Su ürünleri başta balık olmak üzere insan beslenmesinde önem taşıyan ve ekonomik açıdan da dünyada büyük paydaya sahip bir endüstridir. Bu bağlamda avcılık ve yetiştiricilik ilk planda göz önüne alınan bölümleri olmakla birlikte insanların hobi olarak da kullandığı ve akvaryum balıkçılığı şeklinde ifade edebileceğimiz bir diğer alanı da mevcuttur.
Dünyada artan nüfus ve onun gereksinim duyduğu hayvansal protein ihtiyacının karşılanması bakımından önemli bir potansiyel olan balık eti, yararı yanında çeşitli faktörlere bağlı olarak halk sağlığı açısından risk oluşturabilmektedir.
Özellikle, kalıntı verici maddelere bağlı olarak insanlarda kısa ve uzun dönemde toksikasyon, kanser, enfeksiyonlara karşı direncin azalması gibi riskler önem taşımaktadır. Bu araştırma kapsamında özellikle yetiştiricilikte antibiyotiklerin kullanılabilmesi ve buna bağlı olarak kalıntı riskinin ortaya konabilmesi açısından oksitetrasiklin ve enrofloksasin kalıntılarının varlığı ve miktarı araştırılmıştır.
Tez çalışmam sırasında yardımlarını esirgemeyen sayın danışman hocam Prof. Dr. T. Halûk ÇELİK ve başta bölüm başkanımız Prof. Dr. İrfan EROL olmak üzere, değerli bölüm hocalarıma; sayın Prof. Dr. Serdar DİKER hocama; tez çalışmamı yürütmemde yardımlarını esirgemeyen Bornova Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü’ne, Toksikoloji Laboratuvarı şefi sayın A.Turan ERDOĞDU’ya ve laboratuar çalışanlarına; maddi ve manevi desteklerini hiç esirgemeyen değerli aileme sonsuz teşekkürler ederim.
SİMGELER VE KISALTMALAR EC European Commission (Avrupa Komisyonu)
EEC European Economic Community (Avrupa Ekonomik Topluluğu) ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (Enzim İlintili İmmün Test) EMEA European Medicines Evoluation Agency (Avrupa Tıbbi Gelişim Ajansı) HPLC High Pressure Liquid Chromatography (Yüksek Basınçlı Sıvı Kromotografi) IgE İmmunglobulin E
IgG İmmunglobulin G kob Koloni oluşturan birim
LC Liquid Chromatography (Sıvı Kromotografi)
LC-MS Liquid Chromatography-Mass Spectrometer (Sıvı Kromotografi- Kütle Spektrometre) MRL Maximum Residue Limit (Maksimum Kalıntı Limitleri)
OTC Oksitetrasiklin
ÇİZELGELER
Çizelge 1.1. Bazı hayvansal gıdalarda esansiyel aminoasitlerin oranları (%) 3 Çizelge 1.2. Balık ve sığır etinin temel bileşenlerinin ortalama değerleri (%) 4
Çizelge 1.3. Dünya balık üretimi (1000 ton) 5
Çizelge 1.4. Yıllara göre Türkiye’de su ürünleri üretim ve tüketimleri 6 Çizelge 1.5. 2006 yılı balık ve deniz ürünleri üretim ve tüketim miktarları 8 Çizelge 1.6. Su ürünleri yetiştiriciliğinde kullanılan başlıca antibakteriyaller 13 Çizelge 1.7. Bazı antibakteriyellerin sedimentte kalış süreleri 22 Çizelge 1.8. İmmunolojik kitlerin başlıca avantaj ve dezavantajları 26 Çizelge 1.9. Türkiye’de yıllara göre alabalık üretim miktarları 36
Çizelge 2.1. Numune alma programı 37
Çizelge 3.1. Aralık 2007-Mart 2008 dönemi bulguları 46 Çizelge 3.2. Nisan 2008-Haziran 2008 dönemi bulguları 46 Çizelge 3.3. Eylül 2008 – Aralık 2008 dönemi bulguları 46 Çizelge 3.4. Enrofloksasin kalıntısı tespit edilen numunelere ait değerlendirme 50
ŞEKİLLER
Şekil 1.1. Türkiye’de 1998-2007 yılları arasındaki son 10 yıllık dönemde su
ürünleri yetiştiricilik üretimindeki değişim 7 Şekil 1.2. Gökkuşağı Alabalığı (Oncorhynchus mykiss) 29
Şekil 2.1. Charm II 7600 analiz cihazı 39
Şekil 2.2. ELISA okuyucu (ELISA ELx 808) 39
Şekil 2.3. HPLC cihazı (Shimadzu) 40
Şekil 3.1. Kinolonların kromatografik sistem tipik kromatogramları 47 Şekil 3.2. 278 nm ve 1 ml /dk akış hızında Symmetry C18 kolonu ile
siprofloksasin ve enrofloksasin retensiyon zamanı üzerinde mobil fazda asetonitrilin etkisi
48
Şekil 3.3. Geri kazanım sonucu (100 ppb standard) 48
Şekil 3.4. 100 no’lu numune HPLC sonucu 49
Şekil 3.5. 101 no’lu numune HPLC sonucu 49
1. GİRİŞ
İnsan gıdası olarak değerli bir protein kaynağı olan balık eti ve diğer su ürünleri, tüm esansiyel amino asitleri içermesi ve yüksek biyolojik değere sahip olmalarından dolayı insan beslenmesinde son derece önemlidir (Huss, 1995). Dünya besin gereksiniminin önemli bir kısmını karşılayan ve temel bir endüstri niteliğine sahip olan su ürünleri yetiştiriciliği, 1970’li yıllardan itibaren tüm dünyada hızlı bir gelişim göstererek, Gıda ve Tarım Örgütü-Food and Agriculture Organization (FAO) tarafından dünyada en hızlı büyüyen gıda sektörü olarak belirlenmiştir (FAO, 2006).
Su ürünleri yetiştiriciliğinde antibiyotik kullanımına 50 yılı aşkın süredir başvurulmaktadır. Su ürünleri yetiştiriciliğinde bakteriyel hastalıklardaki artışa paralel olarak antibakteriyel kullanımı da hızla artmıştır. Veteriner antibakteriyellerin tamamına yakını su ürünleri yetiştiriciliğinde kullanım potansiyeli bulmakta ve antibakteriyel kullanımı coğrafya ve ülkelere bağlı olarak önemli farklılıklar göstermektedir (Inglis, 2000).
Veteriner ilaçlarının su ürünleri yetiştiriciliğinde profilaktik ve tedavi amaçlı yaygın kullanımı ve antibiyotik kalıntılarının su ürünleri tüketimi yoluyla insanlar tarafından alınması sağlık yönünden global endişelere yol açmaktadır (WHO, 1999;
Inglis, 2000).
Su ürünlerinin insan gıdası olarak tüketilen dokularında antimikrobiyel ilaç kalıntılarının bulunması ile ilgili potansiyel tehlikeler alerjik ve toksik etkiler ile insan bağırsak florasının kolonizasyonunda değişimler ve insan patojenlerinin bu etken maddelere sahip antibiyotiklere karşı direnç kazanmasıdır. Su ürünleri yetiştiriciliğinde yoğun antibiyotik kullanımı sonucu çevresel akvatik ortamda ilaç ve metabolitlerinin birikimi, akvatik sisteme dağılması ve ortamdaki canlı populasyonu üzerindeki olumsuz etkileri olarak değerlendirilebilen çevresel sorunlar bulunmaktadır (WHO, 1999).
1.1. Balık Etinin Yapısı ve Besin Değeri
İnsan gıdası olarak değerli bir protein kaynağı olan balık eti, tüm esansiyel amino asitleri içerdiğinden yüksek biyolojik değere sahiptir. Balık eti esansiyel yağ asitlerini yüksek oranda içerirken, yağda eriyen vitaminlerden A ve D vitamininlerini gerek etlerinde gerekse yağlarında yüksek miktarda bulundurur. Ayrıca balıklar B grubu vitaminlerinden, B1 (Tiamin), B2 (Riboflavin) ve B6 vitamini (Piridoksin) içeriği yönünden zengin bir besin kaynağıdır. Balıklarda az miktarda da olsa E ve K vitaminine de rastlanır (Huss, 1988). Balık eti, yüksek miktarda kalsiyum, iyot ve fosfor gibi mineralleri de içermektedir. Ayrıca bağ doku miktarı az olduğundan (%2) sindirilme oranı yüksektir. Belirtilen bu yapı ve besin elementleri kompozisyonu nedeniyle balık eti beslenme fizyolojisinde büyük önem taşır (Huss, 1995).
Balık etlerinde protein oranı genel olarak % 16-21 arasında değişir. Bu değer balığın türüne, yaşına, cinsiyetine beslenme ortamına, üreme ve göç mevsimine göre değişiklikler gösterebilir. Balık etleri, histidin, arginin, aspartik asit, serin, prolin, alanin, taurin, glisin, tripsin gibi diğer besinlerde çok rastlanan aminoasitlerin yanı sıra valin, lösin, izolösin, lizin, treonin, sistin, sistein, metionin, fenilalanin gibi, diğer gıdalarda az rastlanan esansiyel aminoasitleri de bulundurur (Çizelge 1.1).
Bunların oranı balık türüne göre farklılık göstermektedir (Belitz ve Grosch, 1999;
Arslan, 2002; Turan ve ark., 2006).
Balıkların yağ dokusu, ortalama % 20 doymuş, % 80 doymamış yağ asitleri içerir. Balık eti, omega-3 ve omega-6 grubundaki yağ asitlerini içerdiğinden insan sağlığı açısından önemlidir. Bu yağ asitleri insan vücudunda sentezlenmediği için dışarıdan alınması zorunludur. Balık yağları yüksek miktarda yağda eriyen özellikle A ve D vitaminlerini içermesi ve tüketilmeleri sonucu kanda yüksek kolesterol seviyelerine neden olmamasından dolayı önem taşır (Huss, 1995).
Çizelge 1.1. Bazı hayvansal gıdalarda esansiyel aminoasitlerin oranları (%) (Belitz ve Grosch, 1999).
Esansiyel
aminoasitler Balık Süt Et Yumurta
Lizin 8,8 8,1 9,3 6,8
Triptofan 1,0 1,6 1,1 1,9
Histidin 2,0 2,6 3,8 2,2
Fenilalanin 3,9 5,3 4,5 5,4
Lösin 8,4 10,2 8,2 8,4
İzolösin 6,0 7,2 5,2 7,1
Treonin 4,6 4,4 4,2 5,5
Metionin-sistin 4,0 4,3 2,9 3,3
Valin 6,0 7,6 5,0 8,1
Balıklarda bulunan karbonhidrat glikojen formundadır ve daha çok karaciğerde bulunur. Glikojen oranı beyaz etli balıklarda daha az, kırmızı etli balıklarda daha çoktur (Belitz ve Grosch, 1999).
Balık etlerinde % l-2 civarında bulunan inorganik madde içerisinde mineral maddeler bulunmaktadır. Bunların en önemlileri, fosfor (P), kalsiyum (Ca), magnezyum (Mg), kükürt (S), potasyum (K), sodyum (Na), iyot (I) ve klordur (Cl).
Bunların dışında mangan (Mn), çinko (Zn), bakır (Cu), silisyum (Si) ve demir (Fe) de bulunur. İçerdiği bu kadar çeşitli inorganik madde yönüyle de balık etleri önemli bir besin kaynağıdır. Özellikle bol miktarda içerdiği fosfor ve kalsiyum yönüyle insanlarda kemik ve diş gelişimine önemli katkı sağlar (Huss, 1995; Arslan, 2002).
Balık etleri ile kasaplık hayvan etleri içerdikleri kimyasal bileşikler ve yapıları bakımından önemli farklılıklar gösterir. Sığır etlerinde, balık etlerine göre yağ oranı yüksek, su oranı daha düşüktür. Sığır eti yağ dokusu stearik asit ve palmitik asit gibi doymuş yağ asitleri yönünden zengin olduğundan katı formda bulunur. Kasaplık hayvan etleri yapısında su ürünleri etlerine göre daha fazla bağ dokusu bulundurur. Bu nedenle etleri daha serttir. Ancak yine bağ dokusunun güçlü olması nedeniyle kasaplık hayvan etlerinin sindirimi ve buna bağlı absorbsiyonu
daha zordur. Sindirimi kolay olduğu için su ürünleri etlerinin besin değeri daha yüksektir (Belitz ve Grosch, 1999). Balık eti ile sığır etinin temel bileşenleri Çizelge 1.2’de belirtilmiştir.
Çizelge 1.2. Balık ve sığır etinin temel bileşenlerinin ortalama değerleri (%) (Belitz ve Grosch, 1999).
Bileşenler Balık eti Sığır eti
Protein 16-21 20
Yağ 0,2-25 3
Karbonhidrat <0,5 1
Su 66-81 75
1.2. Su Ürünleri Üretim ve Tüketimi
Su ürünleri yetiştiriciliği veya akvakültür, su canlılarının (balıklar, çift kabuklu yumuşakçalar, eklem bacaklılar, algler ve diğerleri) en azından hayatlarının belirli bir safhasında, besleme, büyütme, üretme, ıslah ve muhafaza amacıyla kontrollü şartlar altında yetiştirilmesi olarak tanımlanmaktadır (FAO, 2006). Su ürünleri yetiştiriciliği, dünya besin gereksiniminin önemli kısmını karşılayan temel bir endüstridir. Su ürünleri yetiştiriciliği 1970’li yıllardan itibaren tüm dünyada hızlı bir gelişim göstermiş olup, FAO tarafından dünyada en hızlı büyüyen gıda sektörü olarak belirlenmiştir. Dünyada yetiştiricilikle üretilen su ürünleri miktarı 1980’de 7,4 milyon tondan 1990’da 16,8 milyon tona, 2002 yılında 40 milyon tona ve 2006 yılında 51 milyon tona ulaşmıştır. Su ürünleri yetiştiriciliği, dünya balıkçılık üretiminin yaklaşık % 36’sını karşılamakta ve yılda % 10’dan daha fazla artarak büyümektedir (Anon, 2008a; Davenport ve ark., 2003; Seçer, 2008 ). Dünya balık üretimi ile ilgili veriler Çizelge 1.3’de verilmiştir.
Çizelge 1.3. Dünya balık üretimi (1000 ton) (FAO, 2006).
2005 2006 %
Total 142 691 143 648 100
İnsan Tüketimine
taze, donmuş, işlenmiş, konserve 107 057 110 359 76.8
Diğer amaçlarla 35 634 33 288 23.2
Dünya su ürünleri üretimi 2006 yılı verilerine göre yaklaşık 144 milyon tondur.
Bunun % 36’sı, yani 52 milyon tonu yetiştiricilik yolu ile sağlanmaktadır.
• Avrupa Birliği ülkelerinde toplam 1,6 milyon ton su ürünleri yetiştirilmektedir.
• Yalnızca çiftlik ve üretim bazında istihdam edilen personel sayısı 75.000 kişidir.
• 3 milyar EU’dan fazla üretim değeri sağlanmaktadır (FAO,2006).
Dünya’da 2020 yılı için dünya üretim projeksiyonu 60 milyon tona ulaşmaktır.
Ülkemizde DPT çalışmalarına göre ülkemizde 2023 yılında 600 bin tonluk bir kültür üretimi hedeflenmektedir.
Dünyada avcılık ve yetiştiricilik yolu ile elde edilen toplam su ürünleri üretimine bakıldığında; 1988, 1998 ve 2006 yıllarında sırası ile 100 milyon ton/yıl, 117 milyon ton/yıl ve 144 milyon ton/yıl olduğu gözlenmektedir. Türkiye’deki toplam su ürünleri üretimi ise aynı yıllarda sırası ile 676 bin ton/yıl, 544 bin ton/yıl ve 662 bin ton/yıl olarak gerçekleşmiştir. Ülkemizde kişi başına düşen su ürünleri tüketimi miktarı çok düşük seviyededir. Su ürünlerinin tüketimi daha çok kıyı bölgelerinde yoğunlaşmıştır (Dağtekin ve Ak, 2007; Seçer, 2008).
Türkiye’de 1970’li yıllarda sazan ve alabalık yetiştiriciliği ile başlayan su ürünleri yetiştiriciliği, 1980’li yılların ortalarından itibaren Ege ve Akdeniz’de çipura ve levrek, 1990’lı yıllarda Karadeniz’de kafeslerde somon ve alabalık yetiştiriciliği, 2000’li yılların başlarında Ege ve Akdeniz’de orkinos yetiştiriciliğinin başlaması ile
büyük ivme kazanmıştır. Yetiştiricilikten sağlanan üretim yıllık % 20’nin üzerinde artış sağlayarak 2002 yılında 61,165 tona, toplam su ürünleri üretimindeki payı ise
% 10 civarında gerçekleşmiştir Sonraki 5 yılda artan teknik kapasite, sektöre kamu tarafından verilen destekler, kura bağlı olarak düşen yem fiyatları vb. sebebiyle yaklaşık % 130 artarak 2007 yılında 140.000 ton’a ulaşmıştır (Çizelge 1.4) (Anon, 2004; Çavdar, 2009).
Çizelge 1.4. Yıllara göre Türkiye’de su ürünleri üretim ve tüketimleri (Anon, 2004; Çavdar, 2009).
Dönemi Kişi Başına Tüketilen
Su Ürünleri(Kg) Su Ürünleri Üretimi (Ton)
Kültür
Balıkları(Yetiştiricilik) Üretimi(Ton)
2007 8.57 772.323 139.873
2006 8.19 661.991 128.943
2005 7.23 544.773 118.277
2004 7.81 644.492 94.010
2003 6.65 587.715 79.943
2002 6.7 627.847 61.165
2001 7.55 594.977 67.244
2000 7.99 582.376 79.031
1999 7.59 636.824 63.000
1998 8.12 543.900 56.700
1997 7.67 500.260 45.450
1996 8.6 549.646 33.201
1995 9.88 649.200 33.201
İlk alabalık çiftliği 1970’lerde, deniz levreği ve çipura işletmesi ise 1985 yılında kurulmuştur. 2004 yılı verilerine göre içsularda 1301, denizlerde ise 358 adet olmak üzere toplam 1659 işletme bulunmaktadır. İçsularda yetiştiricilik yoluyla toplam üretimi 40217 tondur ve 1215 alabalık, 86 sazan işletmesi bulunmaktadır (Anon, 2004). Özellikle üretilen ürün miktarına göre verilen nakit destekler sayesinde 2006 ve 2007 yıllarında önemli derecede kapasite artırımları gerçekleşmiş ve yeni işletmeler yatırımlara başlamıştır. Türkiye’de su ürünleri yetiştiriciliğindeki değişim Şekil 1.1’de gösterilmektedir (Anon, 2004; Anon, 2007a; Çavdar, 2009).
Şekil 1.1. Türkiye’de 1998–2007 Yılları Arasındaki Son 10 Yıllık dönemde Su Ürünleri Yetiştiricilik Üretimindeki Değişim (Çavdar, 2009)
2008 yılında, yaklaşık 494 bin tonu avcılıkla, 152 bin tonu yetiştiricilikle olmak üzere toplam yaklaşık 646 bin ton su ürünleri üretilmiştir. 2008 yılındaki toplam su ürünleri üretiminin yaklaşık % 61,22’i deniz balıklarından, % 8,89’u diğer deniz ürünlerinden, % 6,35’i içsu ürünlerinden ve % 23,55’i yetiştiricilik yoluyla elde edilmiştir (TÜİK, 2008).
Türkiye su ürünleri yetiştiriciliğinin tipik özelliklerinden biri çoğunlukla karnivor balık türlerinin entansif üretimine dayanmasıdır. Üretimin % 98,5’i karnivor balık türlerinden (gökkuşağı alabalığı, levrek, çipura ve orkinos) sağlanmaktadır.
Yetiştirilen türler arasında alabalık ilk sırayı almakta (% 56,4), bunu sırası ile levrek (% 23,4), çipura (% 19,1), midye ve sazan (% 1,1) izlemektedir. Son yıllarda av sezonunda yakalanan ton balıklarının Ege ve Akdeniz’de kafeslerde besiciliğe dayanan mavi yüzgeçli orkinos semirtmesi yapılmakta olup, 7 adet orkinos çiftliğinde toplam 1600 ton/yıl civarında üretim yapılmaktadır. Üretimde iç su ve deniz balıkları yetiştiriciliği hemen hemen eşit paya sahiptir, ancak deniz balıkları yetiştiriciliği tür yönünden çeşitlilik göstermektedir (Anon, 2004; Anon, 2007a).
Ülkemiz zengin doğal su kaynaklarına sahip olmasına rağmen yıllık su ürünleri üretimi yaklaşık 600-700 bin ton olarak gerçekleşmektedir. Kişi başına
tüketim 8 kg/yıl civarında gerçekleşmektedir. 2006 istatistiklerine göre kişi başına su ürünleri tüketiminde dünya ortalaması 16 kg, Avrupa Birliği ortalaması ise 23.9 kg’dır (Çizelge 1.6). Türkiye’de mali olarak, balıkçılıktan elde edilen üretimin milli ekonomiye katkısı ise yaklaşık 1.763.937 TL’dir. Su ürünlerinin 2007 yılında gayrı safi yurtiçi hasıla içindeki payı % 0.21, tarım içindeki payı % 3.43 olarak gerçekleşmiştir (Anon, 2008b).
Çizelge 1.5. 2006 yılı balık ve deniz ürünleri üretim ve tüketim miktarları (Anon, 2008b;
Seçer, 2008)
Ülke Üretim (bin ton)
Kişi Başına Düşen Tüketim (kg/yıl)
Dünya 143.647 16.3
Avrupa Birliği 11.623 23.9
Türkiye 662 8.57
1.3. Kültür Balıkları Yetiştiriciliğinde Antibiyotik Kullanımı
Su ürünleri yetiştiriciliğinde antibiyotik kullanımına, alabalıklarda frunkulozis tedavisinde sülfonamidlerin kullanımı ve bazı Gram negatif patojenlere karşı tetrasiklinlerin kullanımından bu yana 50 yılı aşkın süredir başvurulmaktadır.
Bununla birlikte, bu yaklaşım 1970’lerde trimetoprim ile etkinliği artırılan sülfonamidlerin kullanımına kadar sınırlı kalmıştır. Bu tarihten günümüze, su ürünleri yetiştiriciliğinde bakteriyel hastalık problemlerindeki artışa paralel olarak antibakteriyel kullanımı da hızla artmıştır. Veteriner antibakteriyellerin tamamına yakını su ürünleri yetiştiriciliğinde kullanım potansiyeli bulmakta ve farklı coğrafya ve ülkelerde önemli farklılıklar göstermektedir (Inglis, 2000).
Su ürünleri yetiştiriciliğinde antibiyotik kullanımı başlıca 3 metotla uygulanmaktadır;
1. Ağız yoluyla uygulama (yemler ile) 2. İmmersiyon terapisi (banyo, daldırma) 3. Enjeksiyon
İlaçlı yemler, genellikle uygulama bölgesinde ilacın peletlenmiş yemlere ve yağ, jelatin, yumurta gibi yüzey kaplayıcılarla karıştırılması ile hazırlanır. Alternatif olarak ilaçlama işlemi yemlerin hazırlanması aşamasında da gerçekleştirilebilir. Ağız yoluyla tedavinin en önemli üstünlüğü balıkları strese sokmamasıdır. Dezavantajları ise anorektik balıklarda yem alımının azalması ve ilacın yemden sindirimden önce ayrılma olasılığıdır. Antibiyotiklerden bir çoğunun profilaktik ve gelişmeyi artırıcı olarak yem maddelerine ilavesi artan dirençlilikten dolayı AB’de yasaklanmıştır (Inglis ve ark., 1996).
İmmersiyon tedavisi daha çok ektoparazitlere karşı uygulanmakla birlikte tank ve kafes sistemlerinde bakteriyel hastalıklara karşı da kullanılmaktadır. Bu yöntemle antibiyotikler genellikle 1-2 saat süreyle uygulanmakta olup daha çok küçük balıklar ve ağız yoluyla tedavinin pratik olmadığı larvalarda kullanılmaktadır.
Antibiyotiklerin intraperitonal veya intramuskuler yollarla enjeksiyonu ise damızlık değeri olan balıkların hastalıklarının tedavisinde uygulanmaktadır (Inglis ve ark., 1996).
1.3.1. Su Ürünleri Yetiştiriciliğinde Kullanılan Antibiyotikler
β- Laktamlar: Su ürünleri yetiştiriciliğinde başlıca; benzil penisilin ve amoksisilin, İngiltere’de 1990’dan beri, Japonya’da uzun yıllardır kullanım alanı bulmuştur. Oral olarak yemlerle beraber ya da daha az olarak enjeksiyon tarzında uygulanmıştır.
Ancak, Vibriosis’e karşı etkili olmamasından ve motil Aeromonas’ların bu ilaca karşı doğal olarak dirençli olması, ayrıca pahalı olmasından dolayı β- laktamların bu alanda geniş kullanım alanı olmadığı bildirilmektedir (Anon., 1997).
Nitrofuranlar: Furazolidon ve nifurpirinolü içeren sentetik antibiyotiklerdir.
Antibakteriyel ve antiprotozaal aktiviteye sahiptirler ve yaygın olarak balık ve karides yetiştiriciliğinde kullanılırlar. Avrupa ve Kuzey Amerika’da, daha aktif bileşiklerin bulunması ve nitrofuranların karsinojen etkilerinin anlaşılması sonucunda kullanımları azalmıştır. Avrupa Birliği’nde hayvansal ürünlerde kullanımı yasaklanmıştır (Samuelsen ve ark., 1991).
Makrolidler: Balık yetiştiriciliğinde kullanılan tek makrolid eritromisindir. Gram pozitif bakterilere, sarı kuyruklarda (Seriola quinqueradiata) streptekok infeksiyonlarına ve bakteriyel böbrek yetmezliğine (Renibacterium salmoninarum) karşı etkilidir (Anon, 1997).
Fenikoller: Kloramfenikol, tiamfenikol ve florfenikolü içeren geniş spektrumlu antibiyotik grubudur. Kloramfenikol’ün insanlarda tifo tedavisinde olduğu gibi önemli kullanım alanları vardır. Birçok ülkede yasaklanmış olmasına rağmen bazı ülkelerde kullanımı endişe yaratmaktadır. Avrupa ve ABD’de bunlara ilişkin kalıntı bulunmamalıdır, bu bölgelere ihraç edilecek ürünlerinde fenikol grubu antibiyotikler yönünden ari olması zorunludur (Anon., 1997).
Kloramfenikol kullanımı sonucu kolayca bakteriyel direnç gelişebilmektedir.
Kloramfenikol insanlarda Salmonella Typhi enfeksiyonlarının tedavisinde kullanılan antibiyotiklerden biri olduğundan direnç gelişimi önemlidir. Tiamfenikol ve florfenikol ise bazı Avrupa ülkelerinde ve Japonya’da su ürünleri yetiştiriciliğinde kullanılmak için geliştirilen türevlerdir. Bunlar kloramfenikol ile aynı grupta olmasına karşın kloramfenikolün yan etkilerine sahip değildir ve direnç gelişimi bildirilmemiştir (Anon, 1997).
Kinolonlar: Sentetik antibakteriyellerdir. Birinci jenerasyon kinolonlar nalidiksik asit, oksolinik asit ve flumekuin; ikinci jenerasyon kinolonlar ise florlu türevleri olan enrofloksasin ve sarafloksasini içermektedir. Bunlardan ilk jenerasyon Gram negatif bakterilere etkili iken florokinolonların daha geniş spektruma sahip olduğu bildirilmektedir. Kinolonlar mikrobiyel parçalanmaya dirençlidirler. Sedimentlerdeki
kalıntılar haricinde, ışık etkisi ile parçalanma olabileceği belirtilmektedir (Björklund ve ark., 1991; Hansen ve ark., 1992; Samuelsen ve ark., 1992). Sülfonamid ve beta laktam grubu antibiyotiklere dirençli gram pozitif ve gram negatif bakterilere karşı etkilidir. Bu sebeple su ürünleri yetiştiriciliğnde sıklıkla tercih edilen antibiyotik grubudur (Ramos ve ark., 2003).
Rifamisin: Bazı güney doğu asya ülkelerinde karides yetiştiriciliğinde Luminöz Vibriosis’in tedavisinde az da olsa kullanıldığı bildirilmektedir (Primavera, 1993).
Sülfonamidler: Tek başlarına kullanılabilmesinin yanında daha çok trimetoprim veya ormetoprim ile beraber kullanıldıkları bildirilmektedir. Furunkulozis, Enterik kızıl ağız hastalığı (Enteric red mouth disease) ve vibriosis gibi hastalıkların kontrolünde genellikle yemlere katılarak kullanılmaktadır. Direnç gelişimi şekillenmesinin bileşenlerin tek başına kullanıldığında daha hızlı, kombinasyon formunda ise daha yavaş olduğu saptanmıştır (Samuelsen ve ark., 1994; Capone ve ark., 1996).
Tetrasiklinler: Bu gurupta en çok kullanılan antibiyotiğin oksitetrasiklin olduğu, bazı bölgelerde klortetrasiklin ve doksisiklin kullanıldığı belirtilmektedir. Su ürünleri yetiştiriciliğinde en geniş kullanım alanı bulan antibiyotik oksitetrasiklindir (OTC).
Ucuz olması bir avantajdır. Oral ya da banyo tarzında uygulanabilmektedir. Gram pozitif ve Gram negatif bakterilerin çoğuna, özellikle balıklarda ve kabuklularda görülen Aeromonas ve Vibrio gibi bakterilere etkilidir. Ancak son zamanlarda artan direnç gelişimi nedeniyle tedavi edici etkinin azaldığı belirtilmektedir (Capone ve ark., 1996; Smith, 1996).
Diğer antimikrobiyaller arasında oksitetrasiklin, düşük toksisitesi ve çok farklı Gram pozitif ve Gram negative bakteriye karşı olan geniş spektrumu sayesinde en çok tercih edilen ajandır. OTC’nin Vibrio’lara karşı profilaktik olarak başarılı olduğu kanıtlanmıştır (Bermudez-Almada ve ark., 1999).
Tetrasiklinlerin yoğun kullanımı akvatik çevrede bu bileşiklerin kalıntılarına yol açmaktadır. Bu antibiyotiklerin balık çiftliklerinde kullanılması yüzey sularına
karışmalarının değişik bir yoludur. Balık çiftliklerinde kullanılan yeme katılan tetrasiklinler yüzey sularında tetrasiklin kalıntılarının nedenlerinden biridir. Son yıllarda akvakültürlerde oksitetrasiklinler tercih edilen tetrasiklin grubu antibiyotiklerdir. Bu nedenle akvatik çevrede bu bileşiğin kalıntısının izlenmesinde güvenilir analitik metodlara gereksinim duyulmaktadır (Himmelsbach ve Buchberger, 2005).
Su ürünleri yetiştiriciliğinde kullanılan başlıca antibiyotikler Çizelge 1.6’de belirtilmiştir (Subasinghe ve ark., 2000). İngiltere’de balıklarda kullanılmak üzere oksitetrasiklin, oksolinik asit, amoksisilin ve ko-trimazin (trimetoprim-sülfodiazine) olacak şekilde 4 antimikrobiyel madde lisanslandırılmıştır. Norveç’te ise benzilpenisilin-dihidrostreptomisin, florfenikol, flumequin, oksolinik asit, oksiterasiklin ve ko-trimazin olmak üzere bu sayı 6’dır. Avrupa ve Kuzey Amerika’da da benzer sayıda bileşik kullanımına izin verilirken dünya çapında daha fazla sayıda antimikrobiyel kullanımına izin verilmektedir. Bunun yanı sıra, bazı ülkelerde mevcut düzenlemelerin uygulanmasında etkinlik sağlanamadığı gibi bazı bölgelerde bu konuda hiçbir düzenleme de bulunmamaktadır (FAO, 2006).
Çizelge 1.6. Su ürünleri yetiştiriciliğinde kullanılan başlıca antibakteriyaller (Subasinghe ve ark., 2000).
İlaç grubu İlaç ismi Uygulama yolu Doz
(kg CA)
Not
Antibiyotikler
β-laktamlar Ampisilin
Amoksisilin
ağız yolu 50-80 mg/kg 10 gün Somonlarda furunkulosis, tedavisinde Aminoglikozidler Neomisin
Kanamisin
ağız yolu/banyo 50-80 mg/kg 10 gün 20 mg/l Tetrasiklinler Tetrasiklin
Oksitetrasiklin Doksisiklin
ağız yolu/banyo 50-80 mg/kg 10 gün 20 mg/l
Somon ve alabalık yetiştiriciliğinde geniş spektrumlu
Makrolidler Eritromisin ağız yolu/banyo 50 mg/kg 10 gün 2 mg/l 1 saat Fenikoller Kloramfenikol ağız yolu/banyo 50-80 mg/kg 10 gün
20 mg/l 1 saat
Gıdalardaki kalıntıları insanlarda aplastik anemiye sebep olur.
Sentetik Bakteriyel İlaçlar
Sülfonamidler Sülfomerazine Sülfodimetoksin
Trimethoprim+
Sülfodiazin
ağız yolu 200 mg/kg 10 gün 50 mg/kg 10 gün
Alabalık ve somonlarda furunkulosise karşı kullanılan geniş spektrumlu
bakteriyostatik maddeler Nitrofuranlar Furazolidon
Furaltadon Nifurpirinol
ağız yolu 50-80 mg/kg 10 gün 10-50 mg/kg 10 gün
Geniş spektrumlu antimikrobiyel madde. Kanserojen Kinolonlar Oxolinik asit
Flumekuin
ağız yolu 12 mg/kg 10 gün Asyada karides çiftliklerinde
1.4. Antibiyotik Kullanımının Olumsuz Etkileri
Balıkların infeksiyöz ve paraziter hastalıklara karşı korunmasında temel yaklaşım kemoterapotik ajanların kullanımı olduğundan bu durum, kemoterapotiklerin özellikle de antibiyotiklerin yanlış, gereksiz ve aşırı dozda kullanılmalarına neden olmaktadır. Antibiyotik kullanımının en önemli yan etkileri aşağıdaki gibidir (Wise ve Johnson, 1998).
1.4.1. Dirençli Bakteri Soylarının Gelişimi
Balıklarda kemoterapotik ajanların aşırı kullanımı ve ilaçlı yemlerin kullanılması dirençli bakterilerin ve çoklu antibiyotik dirençliliğinin gelişmesi ile sonuçlanmaktadır (McPhearson ve ark., 1991; Wise ve Johnson, 1998). Bakterilerin ilaçlara direnç geliştirme özelliği patojen bakterilere geçebilmekte böylelikle dirençli patojenlerin neden olduğu gerek hayvan gerekse insan hastalıklarında, antibiyotik tedavisine yanıt azalmakta veya ortadan kalkmaktadır. Antimikrobiyel ilaçlara karşı bakteriyel direncin 2 temel mekanizması bulunmaktadır. İlk olarak, plazmidler (ekstra-kromozomal DNA) aynı ya da farklı türden bakterilere horizontal yolla aktarılabilir. Bu durum tetrasiklinler, kloramfenikol, sülfonamidler ve penisilin türevleri gibi sıklıkla kullanılan antimikrobiyellerin çoğunun kullanımı için geçerlidir. Bakteriyel direncin ikinci şekli kromozomal geçiş ile oluşur, dolayısıyla oluşan mutasyonlar diğer bakterilere değil yeni şekillenen hücrelere aktarılır. Bu tarz direnç gelişimine özellikle kinolonlarda rastlanır (Stoffregen ve ark., 1996). Kültür sazanlarından izole edilen antibiyotiklere dirençli Aeromonas hydrophila’da soylarında transfer edilebilir R-plazmidlerine sıklıkla rastlanmaktadır (Akashi ve Aoki, 1986). Balık patojenlerinin çoklu dirençli soylarında dirençlilik hali çok farklı tipte antibiyotiklere karşı şekillenir. Örneğin A. hydrophila’nın 2-9 plazmide sahip olduğu belirlenmiştir. A. hydrophila’daki R-plazmidi antibiyotik dirençli markerları yoğun biçimde tetrasiklin ve sülfonamide karşı iken, kloramfenikol, streptomisin ve sülfonamide dirençli markerlar ile kodlanan R-plazmidlerine A. salmonicida’da nadiren rastlanmaktadır. Dolayısıyla Aeromonas türleri arasında antibiyotik direnci
dağılımı ilgi çekmektedir, çünkü çalışmalar bu organizmaların primer insan patojenleri olduğu yönündedir (Chang ve Bolton, 1987; Ansary ve ark., 1992).
Dirençli bakterilerin gelişimi, orijini bilinmeyen hastalıkların sağaltılmaya çalışılması ya da aşırı doz uygulamasında olduğu gibi yanlış antibiyotik kullanımının bir sonucudur. Bakteriyel hastalıkların kontrolünde aynı ilacın sıklıkla uzun süre ve tedavi edici dozun altında kullanımı genellikle bakteriyel balık patojenlerinde direnç gelişimi ile sonuçlanmaktadır. Direnç gelişimi yetiştiricilikte infeksiyöz hastalıkların artışı buna karşın balık patojenlerinin kontrolünde etkili ilaç sayısının azlığından kaynaklanmaktadır. Direnç, gerek yoğun ya da sık antibiyotik kullanımının bir sonucu olsun, gerekse başka bir mekanizma ile şekillensin, antibiyotiklere dirençli bakteri yoğunluğu tüm dünyada halk sağlığını tehdit etmektedir (McPhearson ve ark., 1991). Yapılan bir çalışmada, Aeromonas türlerinin Amerika Birleşik Devletlerinde lisanslandırılmış iki antibiyotik oksitetrasiklin ve sülfometoksin- ormetoprim’e dirençlerinin oldukça yüksek olduğu, izolatların sırasıyla bu antibiyotiklere % 67 ve % 97 oranında dirençli olduğu saptanmıştır (Dixon ve ark., 1990).
Antimikrobiyellere karşı plazmid aracılı rezistans gelişimi Aeromonas salmonicida, A. hydrophila, Vibrio anguillarum, Pseudomonas fluorescens, Pasteurella piscicida, Edwardsiella tarda ve Yersinia ruckeri gibi bazı bakteriyel balık patojenlerinde belirlenmiştir. Aeromonas salmonicida’da kloramfenikol, sülfonamid ve streptomisin (Japonya’da) ile sülfonamid kombinasyonları, streptomisin, trimetoprim ve/veya tetrasikline (İrlanda’da) karşı rezistansı kodlayan transfer edilebilir R-plazmidleri belirlenmiştir (Aoki, 1988; DeGrandis ve Stevenson, 1985). İskoçya’da gerçekleştirilen bir çalışmada ise oksitetrasikline dirençli 40 Aeromonas salmonicida izolatından 11’inde transfer edilebilir R-plazmidleri saptanmıştır (Inglis ve ark., 1993).
Norveç balık çiftliklerinin çevresindeki deniz çökeltilerinden izole edilen bakterilerde transfer edilebilir antibiyotik direnci belirlenmiştir. Bu çalışmada izole edilen farklı bakterilerin plazmid kökenli çoklu antibiyotik direnci gösterdiği ve
dirençli plazmidleri Escherichia coli gibi balıklarda etkisi bulunmayan patojenlere aktarabildiği saptanmıştır. Araştırıcılar akvatik ortamda antibiyotik dirençliliğini kodlayan genlerin, antibiyotik kullanımı ile arttığını ve direncin patojenik bakterilere aktarılabileceği sonucuna varmışlardır (Sandaa ve ark., 1992).
Antibiyotiklerin su ürünleri yetiştiriciliğinde kullanımı dünyanın bazı bölgelerinde ciddi kontrol altında iken bazı bölgelerde hiçbir düzenleme bulunmamaktadır. Çiftlik hayvanlarında antibiyotik kullanımının halk sağlığı açısından önemine ilişkin geniş bilgiler bulunmasına karşın, su ürünleri yetiştiriciliğinde antibiyotik kullanımının insan sağlığı ve çevreye etkileri üzerine bilgilerin kısıtlı olduğu bildirilmektedir. Su ürünleri yetiştiriciliğinde antibiyotik kullanımı sonucu oluşan direncin balık patojenlerinden insan patojenlerine dolayısı ile besin zincirine transferini ortaya koyan yeterli bilginin mevcut olmadığı bildirilmektedir (Reilly ve Kaferstein, 1997).
1.4.2. Balık Etinde Kalıntı Problemi
Antibiyotiklerin balık yemlerine büyümeyi arttırıcı olarak katılması veya bakteriyel, paraziter, fungal infeksiyonlara karşı profilaktik kullanımında bilinçsiz veya yasadışı uygulaması tüm dünyada bir sorun olmaktadır. Bunun sonucu olarak, hem bakteriyel direnç gelişmekte hem de balıklarda kalıntı riski artarak gıda güvenliği ve halk sağlığı yönünden global bir sorun oluşturmaktadır (Martinsen ve ark., 1992).
Balıklarda ilaçların eliminasyonu su sıcaklığı ile yakından ilişkilidir. Bu yüzden ilaç kullanımını takiben arınma süreleri ya da yasal bekletme süreleri su sıcaklığı göz önünde bulundurularak hesaplanmaktadır. 10 gün boyunca 75 mg/kg canlı ağırlık dozunda oksitetrasiklin uygulanan bir balık için 10°C’den yüksek sıcaklıklarda bekletme süresi 60 gün iken 7-10°C’lik sıcaklıkta bu süre 100 gündür.
Balıkların sülfadiazin-trimetoprim kombinasyonu ile tedavisinden sonra 10°C üzerindeki sıcaklıklarda bekleme süresi 60 gün olmasına karşın düşük sıcaklıklarda kalıntıdan arınma süresi uzadığından ilaç 10°C altında kullanılmaz. Antibiyotiklerin
tedavi süreleri ülkelere göre önemli farklılıklar göstermektedir. Kültür balıklarında antibiyotik kullanımı sonucu insan sağlığıda tehlike içine girmektedir. Kalıntıların insanlar tarafından gıdalar ile alınması sonucu;
Deri reaksiyonları ve solunum sistemi semptomları gösteren aşırı duyarlılık,
Özellikle enterik patojen bakterilerde antibakteriyel direnç gelişiminin
Mutajenik-teratojenik ve toksik etkilerin şekillendiği belirtilmektedir (Salte ve Liestol, 1983).
1.4.2.1. Aşırı Duyarlılık Reaksiyonları (Hipersensitivite)
İlaçlara karşı aşırı duyarlılık reaksiyonları, duyarlı bir hastada herhangi bir ilaca karşı immun-aracılı yanıt olarak tanımlanmakta ve ilaç alerjisinin IgE ile ilişkili bir reaksiyon olduğu bildirilmektedir (Riedl ve Casillas, 2003). Esasen ilaçlar vücuda yabancı moleküllerdir ancak çok düşük molekül ağırlıkları sebebiyle ilaçlara karşı immun sistem reaksiyon vermemektedir. İlaçların immunojen olabilmeleri için, taşıyıcı proteinlere bağlanarak immunojen hal alan ve antikor oluşumunu uyaran haptenler gibi davranmaları gerekmektedir (Dewdney ve ark., 1991).
İmmun reaksiyonlar hayati tehlike arz eden anaflaktik şok reaksiyonlardan deri döküntülerine kadar değişen şekillerde ortaya çıkabilmektedir. İlaçların neden olduğu alerjik reaksiyonlar akut (temastan sonra ilk 1 saat içinde), subakut (1-24 saat içinde), veya latent yanıtlar (1 gün-birkaç hafta içinde) şeklinde gelişebilmektedir.
Akut ve bazı subakut immun reaksiyonlar genellikle Tip I IgE aracılı, bazen de Tip II IgG aracılı reaksiyonlar şeklinde olmaktadır. İmmun kompleks hastalıkları (Tip III) ilaçlarla çok nadir şekillenmekte, Tip IV (hücre aracılı) yanıtlar ise çok daha yavaş gerçekleşmektedir. Temel özellikleri ise; TipI: anaflaktik şok, astım ve angionörotik ödem, Tip II: hemolitik anemi ve agranülositozis, Tip III; serum hastalığı ve alerjik vaskulitis ve Tip IV; alerjik dermatitdir. Anaflaktik şokta, ilaca maruz kalınca hızla akut bronkokontrüksiyon, asfeksi, belirgin hipotansiyon ve ödem şekillenmektedir (Dayan, 1993; Riedl ve Casillas, 2003).
Hayvansal gıdalarda ilaç kalıntıları insanlarda aşırı duyarlılık reaksiyonlarına neden olabilmekte ve daha önce duyarlı hale gelmiş bireylerde alerjik reaksiyonları tetikleyebilmektedir (Myllyniemi, 2004).
Toksik olmayan yapılarına karşın, β-laktam grubu antibiyotiklerden, özellikle penisilinler, insanlarda şekillenen alerjik reaksiyonların en önemli kısmından sorumludur (Fein ve ark., 1995). Aminoglikozidler, sülfanamidler ve tetrasiklinler de alerjik reaksiyonlara neden olmaktadır (Paige ve ark., 1997). Yine bazı makrolidlerin hepatik hücreleri etkileyerek özel bir tip alerjik reaksiyona neden olduğu bilinmektedir (Dewdney ve ark., 1991).
1.4.2.2. İntestinal Mikroflora Üzerine Etkileri
İnsanlarda gastrointestinal sistem stabil özellikte ve kompleks bir yapıda ve 400’den fazla bakteri türünü içermektedir (Carman ve ark., 1993). Anaerobik mikroflora konsantrasyonu dışkıda 1011-1012 kob/g iken, aerobik flora yoğunluğu çok daha düşüktür ve tüm floranın % 0,1’inden daha azını oluşturmaktadır. Mevcut anaerobik dominant mikrofloranın yanı sıra, subdominant mikroflora, az sayıda mikroorganizmanın temsil ettiği flora ve geçici süreler için mevcut olan bakterilerden oluşmaktadır (Boisseau, 1993).
Antibakteriyellerin uzun süreli kullanımının intestinal mikroflora üzerine etkileri; mikroflora metabolik aktivitesinin modifikasyonu, bakteriyel populasyonda değişimler, dirençli bakterilerin seleksiyonu ve bariyer etkisinin bozulmasıdır (Boisseau, 1993; Gorbach, 1993; Perrin-Guyomard ve ark., 2001).
Kolonizasyon rezistansı, normal mikrofloranın ekzojen bakterilerin kolonizasyon ve translokasyonu veya endojen oportunistik bakterilerin aşırı üremesine karşı gösterdiği normal savunma mekanizmasıdır (Barza ve ark., 1987;
Corpet, 1993). Antimikrobiyel ajanlar bu fonksiyonları olumsuz etkileyebilmektedir (Nord ve Endlund, 1990). Konak ve mikroorganizmalar arasındaki ekolojik dengenin
ne derece etkileneceği antimikrobiyel ajanın spektrum, doz, farmakokinetik ve farmakodinamik özellikleri ve ajanın in vivo aktivasyonuna bağlıdır (Sullivan ve ark., 2001). Kolonizasyon rezistansının düşmesi halinde patojen ya da dirençli bakterilerin minimal infeksiyon dozlarının düştüğü, bununla beraber etkilenen insanların sağlıklı insanlara kıyasla daha fazla sayıda bakteriyi daha uzun süre dışkı ile çıkardıkları bildirilmektedir (Van Den Bogaard ve Stobberingh, 1999).
Düşük dozlarda bile antimikrobiyeller bağırsak florasını etkileyebilmekte ve dirençli bakterilerin gelişimini uyarabilmektedir. Benzer şekilde düşük dozlarda antimikrobiyel kullanımının Salmonella spp. infeksiyonuna duyarlılığı arttırdığı belirlenmiştir. Tetrasiklinler de nispeten düşük dozlarda insanlarda fekal anaerobik mikroflorayı etkileyebilmektedir. Sığır etlerindeki tetrasiklin, streptomisin, gentamisin ve kloramfenikol kalıntılarının insanlarda bağırsak florasını etkileyebildiği ve kolonizasyonu değiştirdiği bilinmekle birlikte, balıklarda antimikrobiyel kalıntılarının benzer etkilerine ilişkin yeterli veri bulunmamaktadır (WHO, 1991; Waltner-Toews ve McEven, 1994).
1.4.2.3. Teratojenik, Mutajenik, Karsinojenik Etkileri
Karsinojenite ve mutajenite riski olan birçok ilacın hayvansal besinlerdeki kalıntıları insanlarda da aynı etkiyi gösterebileceğinden kullanımları yasaklanmıştır. İnsanlarda kloramfenikol kullanımı, kemik iliği baskılanmasına, 30 günden küçük bebeklerde dolaşım kollapsı şekli olan gri bebek sendromuna ve geri dönüşümsüz aplastik anemiye neden olmaktadır. Hayvansal gıdalarda (et, yenilebilir iç organ) bulunan kloramfenikol kalıntılarının da insanlarda aplastik anemiye sebep olduğu saptanmıştır. Benzer şekilde bazı sülfonamid ve nitrofuranların insanlarda karsinojenik ve mutajenik etkileri bulunmaktadır. Kloramfenikol, bazı sülfanamidler ve nitrofuranlar diğer besin değeri olan hayvan türlerinde olduğu gibi su ürünleri yetiştiriciliğinde de kullanılmamaktadır. Yüksek dozlarda kullanılan tetrasiklinlerin sindirim sistemi, karaciğer, kemik iliği, kemik ve dişlerde olumsuz etkilere yol açtığı belirtilmektedir (Booth, 1988).
1.4.3. Çevresel Etkiler
Su ürünleri yetiştiriciliğinde yoğun antibiyotik kullanımının çevresel sonuçları;
akvatik ortamda ilaç ve metabolitlerin birikimi, oral yolla kullanılan ilaçların kullanıldıkları çevrede sedimentasyonu, banyo tarzında ya da yemlere katılarak kullanılan ilaçların tüm akvatik sisteme dağılması ve ortamda mevcut mikroorganizmalar ile hedef dışı mikroorganizmaları etkilemesi şeklindedir. İlaçların çevresel birikiminin temel nedeni ilaçlı yemlerin aşırı kullanımı ve balıklarda iştah kaybına bağlı ilaçlı yem tüketiminin düşüşüdür. Bununla birlikte kalıntı problemi dolaylı yoldan balık vücudundan atılan ilaçlar ve banyo tarzı uygulamalar sonrasında da gelişebilmektedir. Akvatik ortama bulaşan bazı ilaçlar, diğer balıklar ve kabuklular tarafından alınarak halk sağlığını tehdit edebilirken bazı ilaçlar çökelti halinde ortamda kalabilirler. Akvatik çökeltiler birçok ilaç için uzun süreli rezervuar görevi de görmektedir (Weston, 2000).
Birçok ilacın ışık etkisi ile parçalanması (fotodegredasyon) ve hızlı dilüsyon göz önüne alındığında çevresel sularda antibakteriyel kalıntılar ciddi problem yaratmamaktadır. Ancak, sedimentler birçok ilaç kalıntısı için rezervuar görevi görmektedir. Oksitetrasiklinlerin su ürünleri yetiştiriciliğinde dünya çapında en geniş kullanım alanına sahip olduğu belirtilmekte ve bu sebeple balık etinde kalıntı problemi açısından en önemli grup olduğu açıklanmaktadır. Yemlere ilave olarak kullanılan oksitetrasiklinin önemli bir kısmı çevreye yayılmakta ve konsantrasyonları neredeyse başlangıçta kullanılan ilaç miktarına eşit olmaktadır (Smith ve ark., 1994).
Gökkuşağı alabalığında sindirilen oksitetrasiklinin yalnızca % 7-9’unun barsak pasajında absorbe olduğu belirtilmektedir (Cravedi ve ark., 1987). Çökelti halindeki oksitetrasiklinler genellikle mikrobiyel yıkımlanmaya uğramamakta ve ancak bu çökeltinin hemen üzerindeki su tabakasına difüzyonu ile azalmaktadır.
Oksitetrasiklinlerin kullanımını takiben en az 2 ay süreyle deniz suyunda bulunabildiği bildirilmektedir. Oksitetrasiklin kalıntıları ise çökeltilerde aylarca kalmakta ve ilaç kullanımını takiben 7. aya kadar belirlenebilmektedir. Hatta, su ürünleri yetiştirilen birçok alanda şekillenebileceği gibi, sedimentasyon hızına bağlı
olarak oksitetrasiklin içeren sediment çabucak çökebilmekte ve kalıntı yıllarca varlığını koruyabilmektedir (Samuelsen, 1989).
Kinolon grubuna ait olan oksolinik asit ve flumekuin çökeltilerde uzun süre kalabilmekte ve ilaç uygulamasını takiben 6 ay veya daha uzun süreyle çökeltilerde belirlenebilmektedir. Yapılan çalışmalarda; sülfodiazin ve sülfodimetoksinin laboratuvar şartlarında kapalı şişelerdeki sedimentlerde aylarca kalıcılıklarını koruduğu ancak sediment üzerindeki suyun akışkanlığının sağlandığı açık sistemlerde kalıcılığının kısa süreli olduğu bildirilmektedir (Samuelsen ve ark., 1994;
Capone ve ark., 1996).
Trimetoprim, ormetoprim ve furazolidon kalıntılarının akvatik sedimentlerde nispeten kısa süreli kaldığı ve konsantrasyonlarının 2 aydan daha kısa sürede ölçülebilir seviyelerin altına düştüğü belirtilmektedir. Özellikle furazolidon hızla mikrobiyel parçalanmaya uğramakta ve akvatik sedimentlerde yarı ömrü 1 gün civarında olmaktadır (Samuelsen ve ark., 1991). Bazı antimikrobiyel maddelerin sedimentteki kalıntı süreleri Çizelge 1.7’de belirtilmiştir.
Antibakteriyel ajanların çökeltideki toplam bakteri sayısına olumsuz etkileri olmakla beraber, oksitetrasiklin ve oksolinik asite karşı artan bir direnç şekillenmekte ve bu nedenle balık patojenlerine direnç geçişi için potansiyel risk oluşmaktadır.
Bunlara ilaveten, yüksek oksijen kullanımı ve sülfat redüksiyon oranları ile kanıtlandığı üzere çökeltinin mikrobiyel populasyonunun fonksiyonel özelliklerindeki değişimler ya da toplam mikrobiyel yoğunluktaki azalma antimikrobiyel direncin artışında rol oynayabilmektedir. Antibakteriyellerin neden olduğu mikrobiyel yükteki indirgenme, çökeltideki mikroorganizmaları besin kaynağı olarak kullanan mikro- ve makro-faunal omurgasızları da olumsuz yönde etkilemektedir (Hansen ve ark., 1992).
Çizelge 1.7. Bazı antibakteriyellerin sedimentte kalış süreleri.
Antibakteriyel Yarılanma ömrü (gün)
Kalıcılık1 (gün)
Veri kaynağı Çiftlik- Laboratuvar (Ç) - (L)
Kaynak
Flumekuin 155 >185
>180
L L
Hansen ve ark., 1992 Samuelsen ve ark., 1994
Furazolidon 0,75 9 L Samuelsen ve ark., 1991
Ormetoprim >2-<23
<30
L L
Capone ve ark., 1996 Samuelsen ve ark., 1994 Oksolinik asit
165 48
6
>77
>185
>210
>180
Ç L L L L
Björklund ve ark., 1991 Björklund ve ark., 1991 Hansen ve ark., 1992 Samuelsen 1992
Samuelsen ve ark., 1994 Oksitetrasiklin 9-419
36 125
70 32 30-60
55 87-144
>7->308
>12
>77
>300
>60
>185
>39
>220
>210
>550
>180
Ç Ç L Ç L L Ç L L Ç L
Björklund ve ark., 1991 Björklund ve ark., 1991 Björklund ve ark., 1991 Capone ve ark., 1996 Capone ve ark., 1996 Hansen ve ark., 1992 Samuelsen 1989 Samuelsen 1989 Samuelsen 1992
Samuelsen ve ark., 1992 Samuelsen ve ark., 1994
Sülfodiazin >180 L Samuelsen ve ark., 1994
Sülfodimetoksin >2-<22
>180
L L
Capone ve ark., 1996 Samuelsen ve ark., 1994
Trimetoprim >30-<60 L Samuelsen ve ark., 1994
1 uygulama sonrası sedimentte kalıntının belirlenebildiği süre
Akvakültür ortamlarında şekillenen organik maddeden zengin sedimentlerde, yüksek O2 kullanımı ve sülfat redüksiyonu ile yoğun mikrobiyel aktivite bulunmaktadır. Antibakteriyel kalıntılar bu sedimentlerde uzun süre, hatta bazıları 1 yıldan fazla kalabildiklerinden bu kalıntıların sedimentlerdeki doğal mikrobiyel populasyona etkilerinin neler olabileceği sorusu akla gelmektedir. Bu konudaki en detaylı bilgiler ABD’de ki bir somon çiftliği ve laboratuvar çalışmalarından elde edilmiştir. Çiftlikte 186 kg oksitetrasiklin kullanımının ve sedimentte ki 1-4 mg/kg düzeyinde ilaç kalıntısının, sedimentin toplam mikrobiyel yoğunluğu, sedimentten amonyum akışı, sudaki sülfat konsantrasyonu ve sedimentin O2 kullanımı üzerinde
ölçülebilir bir etkiye yol açmadığı belirlenmiştir. Benzer şekilde laboratuvar şartlarında oksitetrasiklin, sülfodimetoksin ve ormetoprim uygulamalarının aynı parametrelere etkisi olmamıştır. Mikrobiyel yoğunluk ve aktiviteye etkinin şekillenmemesi, antibakteriyel direncin artması sonucu daha duyarlı mikroorganizmaların kaybına, oksitetrasiklinin divalent katyonlarla kompleksler kurmasına ve sulfadimetoksinin ortamdan hızlı bir şekilde parçalanmasına bağlanmıştır (Herwig ve Gray, 1997; Herwig ve ark., 1997).
Konuyla ilgili başka bir çalışmada ise oksiterasiklin, oksolinik asit ve flumekuin uygulamalarının sedimentlerin mikrobiyel yoğunluğunda % 40-50, sedimentin sülfat redüksiyon oranında ise % 90 azalmaya neden olduğu bildirilmiştir.
Çalışma sonuçları arasındaki bu önemli farklılığın kullanılan antibakteriyel konsantrasyonlarındaki farklılıktan kaynaklanabileceği belirtilmiştir (Hansen ve ark.,1992).
Kullanılan 3 ilaçta başta kalsiyum ve magnezyum olmak üzere divalent katyonlarla kompleksler oluşturmaktadır. Çalışılan deniz sistemlerinde ilaçların yaklaşık % 95’i kompleks oluşturmuş formda ve antimikrobiyel aktivitesi azalmış biçimde belirlenmiştir. İç sularda çok daha fazla oranda ilacın serbest formda kalabilmesi mümkündür. Deniz suyunun kalsiyum ve magnezyum içeriği sırasıyla yaklaşık 400 ve 1,272 mg/L iken tatlı sularda bu oranlar suyun sertliğine bağlı olmakla birlikte yaklaşık 2-60 mg/L ve 1-50 mg/L arasında değişmektedir. Tatlı su sistemlerinde, antibiyotiklerin katyonlarla daha düşük oranda kompleks kurması sonucunda, daha fazla aktif serbest form oluşması ve mikrobiyel populasyona etkilerin daha belirgin şekillenmesi olasıdır (Lunestad ve Goksoyr, 1990).
Organik maddelerin aerobik yıkımlanması, CO2 ve nitratlar gibi toksik olmayan ürünlerin oluşmasını sağlarken; anaerobik yıkımlanma, sülfidler ve amonyum gibi toksik ürünlerin oluşmasına neden olduğu belirtilmektedir.
Antibakteriyel kalıntı varlığının organik maddelerin aerobik yıkımlanmasını azalttığı durumlarda, daha fazla labil organik karbon anaerobik yıkımlanmaya girerek toksik son ürünleri şekillendirebilmektedir. Bu durum henüz ispatlanmış olmamakla
birlikte, antibakteriyel kalıntıların sediment biyo-jeokimyasına etkileri üzerine çalışılması gerekliliğini ortaya koymaktadır (Weston., 2000).
1.5. Antibiyotik Kalıntısının Aranmasında Kullanılan Yöntemler
Diğer hayvansal gıdalarda olduğu gibi balıklarda ve diğer su ürünlerinde antibiyotik kalıntılarının saptanmasında mikrobiyolojik, immunokimyasal ve fizikokimyasal teknikler kullanılmaktadır. Mikrobiyolojik veya immunokimyasal tekniklerin uygulanmasında örneklerin önceden hazırlanmasını gerektirmeden kalıntıların aranması bir avantaj olarak bildirilmektedir. Fizikokimyasal teknikler ise kalıntı saptanan örneklerde kalıntı miktarının belirlenmesine olanak sağlamaktadır (Botsoglou ve Fletouris, 2001).
1.5.1. Mikrobiyolojik Yöntemler
Balıklarda ve diğer su ürünlerinde antibiyotik kalıntılarının belirlenmesinde geleneksel olarak, aranılan mikrobiyel ajana duyarlı test organizmalarının kullanıldığı mikrobiyolojik testler kullanılmaktadır. Bu yöntemler çoğunlukla indikatör organizmayı içeren besi yerlerine konulan doku ekstraktları çevresinde belli bir sürede oluşan inhibisyon alanının ölçülmesi esasına dayanmaktadır. Kalibrasyon dalgaları da konsantrasyon seviyeleri hakkında bilgi vermektedir. Ancak bu metodların duyarlılık ve spesifitesi düşük olup bu durum özellikle ana bir bileşiğin metabolitleri ile çalışıldığında sorun yaratmaktadır. Bununla birlikte mikrobiyolojik metotlar antimikrobiyel bileşiklerin aranmasında nispeten hızlı, ucuz ve kolay uygulanabilir metotlardır (Inglis ve ark., 1994).
Balık dokularında bazı antibiyotik kalıntılarının (sülfanamid, tetrasiklin, makrolid ve β-laktam gruplarından) incelenmesi üzerine farklı birçok mikrobiyolojik metot bildirilmiştir. Sülfonamidlerle ilişkili ilk çalışmalar gökkuşağı alabalığı kas ve iç organlarında kalıntı varlığının kalitatif incelenmesi amacıyla Sarcina lutea (ATCC
9341) ve Staphylococcus aureus (ATCC 6538P)’un test organizmaları olarak kullanımı ile sınırlı kalmıştır. Bu metotta balık vücut sıvılarının agar üzerine yerleştirilen disklere veya ham doku örneklerinin agara direk uygulandığı bildirilmiştir. Daha sonraki çalışmalarda balık dokularında hem sülfonamidlerin hem de bunların etkisini arttıran maddelerin belirlenmesi üzerine yoğunlaşılmıştır.
Bacillus subtilis (ATCC 6633) sülfodiazin belirlenmesi için direkt olarak kullanılmıştır. Bacillus subtilis kullanıldığında sülfodiazini belirleme limiti 0.04 ppm olarak gerçekleşmiştir. Trimetoprimin belirlenmesi için test organizması olarak Bacillus pumilus (CN607) kullanılmış ve limit 0.1 ppm altında gerçekleşmiştir (Fletouris ve ark., 1992).
Farklı alabalık türlerinin serum ve doku örneklerinde oksitetrasiklin kalıntılarının belirlenmesi amacıyla Bacillus cereus var. mycoides (ATCC 11778) veya Bacillus subtilis (ATCC 6633)’in test organizması olarak kullanıldığı plak diffüzyon metodları ortaya konulmuştur. Bacillus cereus kullanılarak balık kasında belirleme limiti 0.25 ppm olarak bildirilmiştir (Brandsteterova ve ark., 2000).
Balık dokularında eritromisin belirlenmesi için bildirilmiş olan testler Sarcina lutea (ATCC 9341)’nın ve Bacillus subtilis (ACTC 6633)’in kullanıldığı testtir.
Ancak her iki metodunda spesifite ve duyarlılığının düşük olduğu; farklı antimikrobiyellerin ayrımında başarılı olmadığı belirtilmiştir. Balık dokularında ampisilin kalıntıları Bacillus stearothermophilus (ATCC 10149)’un disk difüzyon tekniği ile kullanılmasıyla 0.025-1.00 µg/g düzeyine kadar başarı ile saptanmıştır (Plakas ve ark., 1991).
1.5.2. İmmunokimyasal Yöntemler
İmmunokimyasal yöntemlerin prensibi, antikorların antijenlere spesifik bağlanma yeteneklerine dayanmaktadır. Antikorların kendilerine karşılık gelen antijenlere bağlanması immunolojik reaksiyon olarak adlandırılmaktadır. Bu yöntemler antikorların numune ile temasının sağlanması ve mevcut bağlanma bölgeleri için
işaretlenmemiş numune ile yarışacak biçimde bir miktar radyo-, enzim- veya floresan-işaretli numune ilave edilmesi esasına dayanmaktadır. İmmunokimyasal metotlar antimikrobiyal kalıntıların aranması ve identifikasyonunda kullanılabilmektedirler. Ancak, bu testlerin pahalı oluşu, raf ömürlerinin kısa olması ve uygulama öncesi hazırlık gerektirmeleri kullanımlarını kısıtlamaktadır.
Radioimmunoassay, enzyme-linked radioimmunoassay, floresan immunoassay, immunobiosensor assay ve biochip assay gibi yöntemler hayvansal gıdalarda antibiyotik kalıntılarının araştırılmasında kullanılmakla birlikte balıklarda kullanımları yaygın değildir. Bununla birlikte güncel olarak, uzun zamandır diğer hayvansal dokularda kullanılan Charm II ve Tetrasensor ticari kitleri balıklarda kullanılmak üzere piyasaya sürülmüştür (Myllyniemi, 2004).
.
İmmunolojik kitlerin başlıca avantaj ve dezavantajları Çizelge 1.8’de derlenmiştir. Bu kitler önemli avantajlar sunmaktadır. Bunlar arasında konvansiyonel yöntemlerle karşılaştırıldığında çok sayıda örneğin bir kitle analiz edilebilmesi, hızlı uygulanabilmesi ve yüksek spesifitesi ile duyarlılığı sayılabilir. Birçok diagnostik firma birçok kalıntı tespiti için ELISA test kitlerini pazarlamaktadır (Toldra ve Reig, 2006).
Çizelge 1.8. İmmunolojik kitlerin başlıca avantaj ve dezavantajları (Toldra ve Reig, 2006)
Avantaj Dezavantaj
Kullanımı kolay Yüksek maliyet
Spesifik bileşenlere karşı uygun Kısa saklama süresi
Çoklu bileşenler için uygun Her kalıntı araştırması için bir kit Her kit için çok sayıda numune analizi
Kısa sürede sonuç alınması
Yüksek duyarlılık Yüksek belirleyicilik
Gıda üretim işletmelerinde kullanımına uygun
1.5.3. Fizikokimyasal Yöntemler
Günümüzde daha çok spesifite, duyarlılık ve tekrar edilebilirlik özelliklerinden dolayı fizikokimyasal metodlar kullanılmaktadır. Ancak metodoloji ve ekstraksiyon prosedürlerinde bir örnekliliğin olmayışı problem yaratmaktadır. En çok kullanılan fizikokimyasal analiz metodu yüksek basınçlı sıvı kromotografi (HPLC, High Pressure Liquid Chromatography) olmakla birlikte bazı analizlerde ince tabaka kromotografi (TLC, Thin Layer Chromatography) ve gaz kromotografiye (GC, Gas Chromatography) başvurulmaktadır (Inglis ve ark., 1994).
Fiziko kimyasal metodlar genellikle numunelerden araştırılan antibiyotiklerin saptanması amacıyla ön ekstraksiyon işlemi ile başlar. Bileşiklerin gıda ve diğer biyolojik matrikslerden ayrılmasının başlıca amaçları, kromotografik sistemi olumsuz etkilemesi muhtemel makromolekül ve diğer matriks bileşenlerinin uzaklaştırılması ile düşük belirleme limitleri için gerekli zenginleştirmenin sağlanmasıdır (Aerts ve ark., 1995). Bazı antimikrobiyellerin organik çözücülerdeki düşük çözünürlükleri, biyolojik matrikslerden ekstraksiyonu ve kalıntıların konsantre hale getirilmesini sağlayacak işlemleri zorlaştırmaktadır. Bazı antimikrobiyeller ise, yeterince uçucu veya sıcaklığa dayanıksız olduklarından gaz kromotografi veya gaz kromotografi kütle spektrometre analizlerine uygun değildir. Sıvı kromotografi polar, uçucu olmayan ve sıcaklığa duyarlı antimikrobiyellerin belirlenmesi için kullanılmaktadır (Kennedy ve ark., 1998).
HPLC yöntemi de aynı temel aşamaları içermektedir. Bunlar özel bir çözücü (spesifik solvent) ile ilacın ekstraksiyonu, ilacın katı fazda HPLC ile seperasyonu, katı faz çıktısının spektrometre ile belirlenmesi ve mevcut antimikrobiyel miktarının tespit edilmesidir. LC analizlerinde kullanılan belirleme metotlarından en sık kullanılanı ve en basiti UV dedektör kullanımıdır. Diğer yöntemler ise floresan dedektörü, elektrokimyasal dedektörler veya kütle spektrometresi (Mass Spectrometer, MS) ile birlikte kullanımdır. LC-MS tekniği yüksek molekül ağırlıklı bileşikler ve polar, uçucu olmayan ve ısıya dayanıklı antibiyotiklerin belirlenmesini sağlayan özelliklerinden dolayı veteriner ilaç kalıntıları için uygun olan bir tekniktir.
Kütle spektrometreler, incelenen örneğin yapısı ve moleküler kütlesi ile ilgili veriler sağlamaktadır. Kütle spektrometreler diğer tüm HPLC dedektörlerine kıyasla daha duyarlı ve çok daha spesifik olup bu metot 657/2002 EC nolu Komisyon kararında kalıntı analizlerinde öncelik verilmesi gereken metot olarak belirtilmiştir (Stolker ve Brinkman, 2005).
HPLC, bileşiklerin tespitini sağlayabilmesi kullanılan dedektör tipine bağlıdır. Tespit sisteminin seçimi selektivite ve spesifite açısından çok önemlidir.
Bazı analitler (örnek içinde aranan madde) abzorbans ile tespit edilemez bu durumda refraktif index veya floresans kimyasal modifikasyonlara ihtiyaç duyabilir.
Genellikle çoklu-kalıntı tespiti katı-faz ekstraksiyon temizliğini takip eden filtrasyon ve UV-diyod array tespiti ile ters-faz HPLC içine enjeksiyona dayalıdır (Toldra ve Reig, 2006).
HPLC kısa sürede örnek içindeki çok sayıdaki kalıntının aynı anda analiz edilmesine olanak verdiği için kontrol laboratuvarlarında yaygın kullanıma sahiptir.
Yüksek hız HPLC’deki son gelişmelere göre analiz süresini ve örnek işlemesini azaltabilmektedir. Ek olarak bu teknoloji tamamen otomatik olup (enjeksiyon, elusyon, kolon yıkaması, tespit) bilgisayar kontrollüdür ve bir tarama testi olarak kullanımına olanak tanımaktadır (Toldra ve Reig, 2006).
1.6. Alabalık Biyolojisi
Balık, suda yaşayan, genellikle yumurta ile üreyen, hareketlerini yüzgeçleri ile sağlayan, solungaçları ile solunum yapan, soğukkanlı (poikilotherm), omurgalı bir hayvan olarak tanımlanmaktadır (Seçer, 2008).
Alabalık türleri sistematikte Salmonidae familyasında yer alırlar. Morfolojik bakımdan yağ yüzgeci ile karakterizedirler. Salmonidae familyasında ekonomik yetiştiricilik ve doğal suların balıklandırılması için önem arz eden çeşitli alabalıklar üç cinsin türleridir (Aydın, 2000).
Bu cinsler a- Salmo b- Salvelinus
c- Oncorhynchus (Şekil 1.2)
Sistematikte,
Alem: Animalia (Hayvanlar) Şube: Chordata (Kordalılar)
Sınıf: Actinopterygii (ışınsal yüzgeçliler) Takım: Salmoniformers
Familya: Salmonidae Cins: Oncorhynchus Tür: O. mykiss
Oncorhynchus mykiss ( Walbaum, 1792) olarak sınıflandırılmıştır.
Şekil 1.2. Gökkuşağı Alabalığı (Oncorhynchus mykis - Walbaum 1792)
Gökkuşağı alabalığının yetiştiriciliğe uygun özellikleri aşağıdaki başlıklar halinde belirtilebilir (Steffens 1981).
- Gökkuşağı alabalığının çevre koşullarına çok iyi uyum göstermesi yanında özellikle yüksek sıcaklıklara oransal olarak dayanıklı olması,
- Aktif yem alması nedeniyle yemlenmesinin kolay olması ve yemi değerlendirmesinin daha iyi olması yönünden iyi bir büyüme göstermesi,
- Daha yüksek ilkbahar sıcaklığında dere alabalığı ve kaynak alabalığı gibi diğer alabalık türlerine göre daha kısa süreli kuluçka dönemine sahip olması.
Ülkemizde de 1967'den beri soğuk su balıkları yetiştiriciliğinde baskın tür olarak gökkuşağı alabalığı yetiştirilmektedir. Nitekim 2002 yılında derlenen bilgilere göre, çoğu 30 ton/yıl kapasitesi olan projeli işletme sayısı 1302 adet, 2001 yılı alabalık üretimi ise 38067 ton/yıl olarak bildirilmiştir (Emre, 2004).
1.7. Yasal Düzenlemeler
Avrupa Birliğine üye ülkeler arasında veteriner ilaçlarının yasal kontrolünün standardizasyonuna yönelik çalışmalar 20 yılı aşkın süredir devam etmektedir. 1993 yılında Avrupa Tıbbi Gelişim Ajansı’nın (EMEA-European Medicinal Evaluation Agency) kurulmasına karar verilmiştir (Anon, 1993). Avrupa Tıbbi Gelişim Ajansı hem insan hem de veteriner ilaçlarından sorumlu olup bünyesinde ayrıca Veteriner Tıbbı Ürünler Komitesini (Committee For Veterinary Medicinal Products) barındırmaktadır. Avrupa Tıbbi Gelişim Ajansı, Avrupa Birliği’nde veteriner ilaçlarıyla ilgili tüm uygulamalardan sorumludur (Woodward, 1996).
Tüketici sağlığının değerlendirilmesinde ilk yaklaşım EEC/2377/90 no’lu AB direktifi ile ortaya konulan Maksimum Kalıntı Limitleridir (Maximum Residue Limits, Kabul Edilebilir En Yüksek Değer, MRL). Maksimum Kalıntı Limiti bir gıda maddesinde istenmeyen bir maddenin bulunmasına sınırlı olarak izin verilen en yüksek miktarı olarak tanımlanmaktadır. Bir ilaç için MRL’nin ortaya konulması yasal bekletme süresinin belirlenmesinde gereklidir. Birçok hayvan türünde bekletme süreleri günlerle belirtilmekte ancak balıklarda bu sürenin belirlenmesi için ilacın muhtemel kullanım koşulları ile ilgili en az iki farklı su sıcaklığında gerçekleştirilen denemelerin sonuçlarına ihtiyaç duyulmaktadır. Kalıntılardan arınma süresi derece- gün şeklinde belirlenmektedir. Sıcaklıktan etkilenmediği takdirde güne dayalı bekletme süresi belirlenmektedir.
