Haploid bitki üretimi ve bitki ıslahında kullanımı
Sebahattin Özcan
Haploid Bitki Nedir?
• Somatik hücrelerindeki kromozom sayısı, ait oldukları bitki türünün gamet hücrelerinde bulunan kromozom sayısı kadar olan bitkilere haploid bitkiler adı verilmektedir.
• Haploidler, her bir lokustaki allelerden sadece bir seriyi içermekte ve bu özellikleri ile ıslah çalışmalarında önemli yer tutmaktadırlar.
• Haploid bitkilerin homolog kromozomlardan sadece bir takımını içermesi, resesif mutasyonların açığa çıkartılmasına olanak
tanımaktadır.
• Bunun yanısıra haploid bitkilerin kromozom sayılarının katlanması sayesinde %100 homozigot saf hatlar elde edilebilmektedir.
• Böylece uzun yıllara gereksinim duyan saflaştırma işlemi, birkaç ay gibi kısa bir sürede yapılabilmekte; kombinasyon ıslahı ve F1 hibrit çeşit ıslahı programlarında zaman yönünden önemli düzeyde
kazanç sağlanabilmektedir.
Haploid Bitkilerin Sağlamış Olduğu Avantajlar
• Haploid bitkilerin; genetik, moleküler biyoloji, fizyoloji gibi temel bilimler veya bitki yetiştirme ve ıslahı gibi uygulamalı bilimlerle ilgili konularda sağlamış oldukları avantajları, aşağıdaki gibi
gruplandırarak sıralamak mümkündür:
• Haploidleri kullanmanın en başta gelen avantajı, tam bir
homozigotiyi çok kısa bir sürede elde etme olanağını sunmasıdır.
Dihaploid hatların kullanılmasıyla genetik ve ıslah çalışmalarını yapmak kolaylaşmakta ve sonuca daha çabuk ulaşılabilmektedir.
• Yabancı döllenen türlerde heterozigoti oranı çok yüksek olduğundan
bunlarda homozigot hatların elde edilmesi için 10-12 generasyon
boyunca kendilemeler yapmak gerekmekte; kendine döllenen
türlerde bile aynı amaçla 5-7 generasyon kendileme işlemine
gereksinim duyulmaktadır. Dihaploidizasyon yöntemi devreye
girdiğinde homozigot hatlara bir generasyonda ulaşmak olasıdır.
Haploid Bitkilerin Sağlamış Olduğu Avantajlar
• Dioik türlerde veya kendileme depresyonu nedeniyle klasik
yöntemlerle homozigotiye ulaşmanın zor olduğu lahana ve çilek gibi türlerde, dihaploidizasyon yöntemi kullanılarak bu sorun bir
generasyonda çözülebilir.
• Çok yıllık meyve ağaçları ve orman bitkileri gibi tohumdan
çiçeklenmeye kadar oldukça uzun bir gençlik kısırlığı olan türlerde de haploidizasyon önem kazanmaktadır. Bu türlerde kendilemeler mümkün olsa bile, homozigotinin elde edilmesi oldukça uzun bir sürede gerçekleşmektedir.
• F1 hibrit çeşitlerin geliştirilmesinde homozigot hatlar arasında üstün kombinasyon yeteneği verenlerinin belirlenmesi yöntemi
kullanıldığından, haploidinin hibrit çeşit ıslahında özel bir önemi bulunmaktadır.
• Dihaploid bitkilerden elde edilen safhatlar F1 hibrit çeşit ıslahında
ebeveyn olarak kullanılabilirler.
Haploid Bitkilerin Sağlamış Olduğu Avantajlar
• Haploidizasyon, resesif mutasyonların açığa çıkartılmasında başvurulan en etkin yöntemdir. Haploid bitkilerde resesif genler, dominant genler tarafından örtülemeyeceğinden, mutlak
homozigotiye sahip olan dihaploid (DH) hatlarda genetik açılımı izlemek basit bir işlem haline gelmektedir.
• Haploid bitkiler, somatik hibridizasyon işleminin diploid protoplastlara göre daha kolay yapılabilmesine olanak
tanımaktadır. Ayrıca iki haploid protoplastın birleşmesinin sonucu
‘diploid’ olacağından; protoplast kültürü kullanılarak yapılan
somatik hibridizasyon tekniğinin bilinen dezavantajlarının büyük bir kısmı böylece ortadan kalkacaktır.
• Haploidler ve bunların katlanması ile geliştirilen dihaploidler sitolojik, fizyolojik ve genetik açıdan önemli deneysel
materyallerdir.
Haploid Bitkilerin Sağlamış Olduğu Avantajlar
• Islah etkinliğinin artırılması,
haploidizasyonun sağladığı en önemli avantajlar arasındadır. Bu etkinlik artışı iki şekilde açıklanmaktadır:
- Dihaploid bitkilerin döllerinde bir açılım olmadığı için genotipler arasında çok iyi bir eliminasyonun yapılması,
- Dominansi etkisinin kalkması ve
eklemeli gen etkisinin ikiye katlanması.
İlk Doğal Haploid Bitkiler
• İlk kez 1922 yılında Blakeslee ve araştırma grubu tarafından
Datura stramonium bitkisinde yapılan bir çalışmada doğal olarak ortaya çıkan ve ‘haploid’ olarak isimlendirilen bir bitkide
kromozom sayısının, gamet hücrelerinde bulunması gereken sayıda olduğu belirlenmiştir.
• Bunun ardından 1929 yılında Kostoff, iki farklı tütün türünün melezlenmesi sonucunda (Nicotiana tabacum x N. langsdorfii) doğal olarak haploidlerin oluştuğunu rapor etmiştir. Bu ilk bilgilerin verilmesinden sonra pek çok sayıdaki bitki türünde doğal
partenogenesis yoluyla veya değişik tekniklerin deneysel olarak uygulanmasıyla haploid bitkilerin oluşumu üzerinde çalışmalar yoğunlaşmıştır.
• Haploid bitkiler, bazı bitki türlerinde çeşitli doğal yollarla
kendiliğinden oluşabilmektedir. Doğada haploidlerin oluşum
yolları beş ana grupta özetlenebilir.
Doğada haploidlerin oluşum yolları
1. Bunlardan ilki ‘ginogenesis’ olarak adlandırılmaktadır. Bu durumda yumurta hücresi döllenme olmaksızın zigot gibi bölünmeye
başlayarak haploid yapıda bir embriyo oluşturur. Dişi eşey hücresi ile erkek eşey hücresi birleşmediği halde; embriyo kesesi sekonder çekirdekleri ile polen generatif çekirdeği birleşerek embriyonun
gelişip çimlenebilmesi için gereksinim duyacağı endospermi oluştururlar.
2. Haploidlerin oluştuğu bir diğer yolda ise yumurta hücresinin
döllenmesinden önce, dişi eşey hücresinin çekirdeği kaybolur veya inaktif hale geçer. Bu yolla oluşan haploidler, hücrelerinde yalnızca erkek gametin kromozom takımını içerdiklerinden bu olaya
‘androgenesis’ adı verilmektedir.
3. Erkek ve dişi eşey hücrelerinin birleşerek embriyo oluşumuna
katılmasının söz konusu olduğu, fakat çekirdeksel erimenin
gerçekleşmediği ‘semigami’ durumunda ise ana ve babaya ait
sektörlerin bulunduğu kimeralı haploid bitkiler oluşmaktadır.
Doğada haploidlerin oluşum yolları
4. Dördüncü yol olan ‘poliembriyoni’ durumunda, normal döllenme sonucu zigot bölünmeye başlar. Ancak döllenmiş yumurta
hücresinin yanındaki sinerjit hücrelerinden biri de bölünerek gelişir ve haploid embriyo haline geçer. Böylece yeni oluşan tohum içinde biri diploid, diğeri haploid olan iki embriyo bulunur. Biberde ve
şeftalide poliembriyoni yolu ile haploid bitkiler oluşabilmektedir.
5. Beşinci haploid oluşum yolunda, yumurta hücresi ile polen generatif çekirdeği birleşirler ve döllenme olur. Ancak embriyo gelişmesinin ilk devrelerinde ebeveynlerden birine, genellikle babaya ait
kromozomlar elimine olur ve gelişen embriyo n sayıda kromozom içerir. Bu şekildeki haploid oluşumuna da ‘kromozom eliminasyonu’
adı verilir.
Yapay Haploid Bitki Üretimi
• Haploid bitkilerin çeşitli yollardan doğada kendiliğinden ortaya çıkma sıklığı türlere ve hatta tür içerisinde genotiplere bağlı olarak
değişmekte, çoğunlukla %0.1 – 0.001 gibi çok düşük seviyelerde kalmakta; birçok türde ise doğal haploid oluşumuna hiç
rastlanmamaktadır.
• Yetersiz ve düzensiz çıkışları nedeniyle doğal haploid oluşumunu esas alarak ıslah programlarını planlamak ve gerçekleştirmek
mümkün görünmemektedir.
• Islah programlarında kullanılabilecek sayıda ve düzenli olarak haploidlerin elde edilmesi, bitki ıslahçılarının özlemi olmuş ve
değişik araştırıcılar tarafından türler arası melezlemeler, tozlamanın geciktirilmesi, sıcaklık şokları, ışınlanmış polenlerle tozlama, X ve UV ışınları uygulaması, çiçek tozlarına veya bitkilere toluidin mavisi, maleik hidrazid, azotoksit, kolhisin, kloramfenikol ve paraflor
fenilalanin gibi kimyasallar veya bazı büyüme düzenleyici
maddelerin (2-kloro etik fosfonik asit, 2,4-D) uygulanması gibi
değişik yollara başvurulmuştur.
Yapay Haploid Bitki Üretimi
• Tüm bu girişimlere karşın, günümüzde haploid bitkilerin elde edilebilmesi için en etkin ve verimli yöntemler; erkek veya dişi gametlerin başlangıç materyali olarak kullanıldığı in vitro tekniklerle sınırlı kalmaktadır.
• Bir türün normal kromozom sayısının yarısına (n) sahip olan eşey hücreleri yani gametlerden yararlanılarak; o türün gametik kromozom
sayısını taşıyan bitkilerin elde edilmesine
‘haploidizasyon’ adı verilmektedir.
Haploid Bitkilerin Yapısı
• Haploid bitkiler, morfolojik görünümleri bakımından diploidlere göre daha küçük yapılıdırlar. Normal bir bitkide bulunan tüm organlara sahip oldukları halde, diploidlere oranla hücreleri daha küçük olan haploid bitkilerin boyları daha kısa, yaprakları dar ve küçüktür. Çiçekleri de diploidlere oranla küçük olan haploidler, hücrelerinde taşıdıkları kromozom sayısı bakımından
indirgenmiş gametlerin yapısını gösteren bitkilerdir. Bu bitkiler gamet oluşturamadıkları için kısırdırlar ve tohum bağlayamazlar.
• Haploid bitkilerin ıslah programlarında kullanılabilmeleri için yeniden verimli diploid bitkilere dönüştürülmesi gerekmektedir. Haploid bir bitkinin
kromozomlarının bazı kimyasal maddeler yardımıyla veya spontan olarak katlanması sonucunda ait olduğu türün kromozom sayısına (2n) yeniden kavuşturulması, böylece mutlak homozigot bitkilerin elde edilmesine yaygın olarak ‘dihaploidizasyon’ adı verilmektedir.
• Dihaploidizasyon yoluyla bir bitki materyalinin kısa bir süre içerisinde
durağan hale getirilerek ıslah programlarında kullanılması günümüzde arpa, buğday, mısır, çeltik, kolza, biber, patlıcan, kavun, hıyar, gerbera gibi birçok bitki türünde başarıyla uygulanan bir olgu haline gelmiştir.
İn Vitro Anter kültürü
• İlk kez 1953 yılında Ginkgo biloba bitkisine ait olgun polenlerin kültür koşullarında haploid kallus oluşturmak üzere uyarılabileceğini
gözlemlemiştir.
• 1964 yılında ilk önemli gelişmeyi Guha ve Maheshwari
gerçekleştirmiş, Datura innoxia bitkisinin kültüre alınan anterlerinde mikrosporlardan haploid embriyo oluşumu sağlanmıştır.
• Sonraki yıllarda Bourgin ve Nitsch (1967), Nicotiana tabacum türünde anter kültürü yoluyla tam bir haploid bitkiyi elde etmeyi başarmışlardır.
• Bu aşamadan sonra birçok bitki türünde erkek gametten haploid
bitki elde etme amacıyla çalışmalar yapılmış, günümüze değin
yaklaşık 250 farklı bitki türünde in vitro androgenesis tekniğinden
başarılı sonuçlar elde edilmiştir.
İn Vitro Anter Kültürü
• Anter kültürü esas olarak; içerisinde olgunlaşmamış polenleri (mikrosporları) bulunduran anterlerin,
tomurcuklardan ayrılarak in vitro koşullarda yapay besin ortamlarına yerleştirilmesi ve burada olgunlaşmamış
polenlerden haploid embriyolar elde edilmesi olayına
verilen isimdir. Anter kültürü yapılarak, normal koşullarda iki çekirdekli yapıya dönüşecek olan polen tanesinin
gametik gelişme yönü; henüz tek çekirdekli dönemdeyken somatik gelişme yönüne doğru
çevrilmekte ve böylece ‘mikrospor androgenesisi’ veya sadece ‘androgenesis’ olarak adlandırılan oluşum
gerçekleşmektedir.
İn Vitro Anter Kültürü
• Anter kültürü, özellikle Solanaceae familyası üyelerinin çoğunda başarılı sonuçlar vermektedir. Cruciferae,
Gramineae ve Ranunculaceae familyalarına ait değişik türlerden haploid bitkiler elde edilebilmektedir. Bunlardan başka çeltik ve mısır türlerinde de başarılı sonuçlar rapor edilmektedir.
• Bugüne dek Angiospermlerde haploid uyartımının 37 familya, 88 cins ve 247 türde gerçekleştirilebildiği
bildirilmektedir.
• Oryza, Lycopersicon, Arabidopsis, Solanum, Triticum ve
Nicotiana cinslerinde, haploid oluşturma özelliği bakımından türler arasında önemli düzeyde farklılıklar bulunmaktadır.
Tek yıllık veya otsu bitkilerde anter kültürü beklentilere az veya çok yanıt verdiği halde, odunsu bitkilerde anter
kültüründen elde edilen başarı çok düşüktür
.Mikrosporların in vivo (A) ve in vitro (B, C1, C2) koşullarda göstermiş oldukları değişik gelişme modellerinin şematik olarak anlatımı (a: nişasta, n: çekirdek (nucleus), nv:
vegetatif çekirdek, nr: generatif çekirdek, v: vakuol).
Bajaj 1983, Ellialtıoğlu vd. 2002 (Ed: Babaoğlu vd.)
Tütün bitkisine ait tek
çekirdekli mikrospor (kültüre başlandığı aşamada), (b) Bir haftalık inkübasyon süresi sonunda mitoz bölünme geçirmiş ve birbirine benzer yapıdaki iki çekirdeğe sahip mikrospor, (c) İki haftalık kültürlerde oluşan çok çekirdekli mikrospor, (d) Embriyo gelişme yönünde bölünen bir mikrospor, (e) Mikrokallus görünümüne dönüşen çok hücreli bir
mikrospor, (f) Çok hücreli bir mikrospor (embriyoid), (g) Küçük ölçekli bir haploid kallus, (h-j) Tütün
anterlerinde polen
embriyogenesisinin değişik aşamaları.
Bajaj 1983, Ellialtıoğlu vd. 2002 (Ed: Babaoğlu vd.)
a
Anterlerin içerisinden çıkıp gözle görülebilir duruma gelmiş biber embriyoları.
Ellialtıoğlu vd. 2002 (Ed: Babaoğlu vd.)
Biber (a), patlıcan (b) ve tütün (c) anterlerinde doğrudan embriyo oluşumu.
Ellialtıoğlu vd. 2002 (Ed: Babaoğlu vd.)
Patlıcanda anter kültürünün aşamaları (a) Anterlerden embriyo çıkışı, (b) Embriyoların hormonsuz ortamlarda bitkiye dönüştürülmeleri, (c) Taze ortama transfer edilmiş iki haftalık tam bir patlıcan bitkiciği, (d) Toprağa aktarma aşamasına ulaşmış in vitro patlıcan fideleri, (e) Serada sisleme sisteminin altında dış koşullara alıştırılan patlıcan fidesi, (f) Sağlıklı yeni yapraklar geliştiren anter kökenli bir patlıcan bitkisi, (g) Anter kültürü yoluyla elde edilmiş patlıcan bitkileri (soldaki diploid, ortadaki ve sağdaki bitkiler haploid yapıdadır), (h) Haploid yapıdaki bir bitkinin kök uçlarında sayılan kromozomlar (n=12).
Ellialtıoğlu vd. 2002 (Ed: Babaoğlu vd.)
In more traditional breeding, it takes seven generations to generate pure inbred lines - and the plants are still not 100%
pure. Doubled haploids generate inbred lines with 100% purity in just two generations.
Doubled
