Prof. Dr. A. Sülün ÜSTÜN
Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü
( Ders Notları)( Ders Notları)
BİY 433 BİTKİ DOKU VE HÜCRE KÜLTÜRÜ
Bitki doku ve hücre kültürü; aseptik şartlarda, yapay bir besin ortamında, bütün bir bitki, hücre (meristematik hücreler, süspansiyon veya kallus hücreleri), doku (çeşitli bitki kısımları =eksplant) veya organ (apikal meristem, kök vb.) gibi
kısımlarından yeni doku, bitki veya bitkisel ürünlerin (metabolitler gibi) üretilmesi temel olarak araştırılmaktadır
Temel sistem Temel sistem BİTKİ REJENERASYONUBİTKİ REJENERASYONU
1)1) organize olmuş meristematik hücreleri organize olmuş meristematik hücreleri ihtiva eden somatik dokulardan
ihtiva eden somatik dokulardan rejenerasyon,
rejenerasyon,
2)2) meristematik olmayan somatik meristematik olmayan somatik hücrelerden rejenerasyon ve
hücrelerden rejenerasyon ve
3)3) mayoz bölünme geçirmiş gametik mayoz bölünme geçirmiş gametik hücrelerden rejenerasyon
hücrelerden rejenerasyon. .
Bitki Doku Kültürlerinin Tarihi Gelişimi Bitki Doku Kültürlerinin Tarihi Gelişimi ve Uygulama Alanları
ve Uygulama Alanları
Bitki Doku kültürlerinin bitki ıslahındaki Bitki Doku kültürlerinin bitki ıslahındaki uygulama alanları
uygulama alanları
Türler arası melezlemelerden sonra embriyo kültürü
Haploid bitki üretiminde anter (polen) ve yumurtalık (ovül) kültürü
Soma klonal varyasyon
İn vitro seleksiyon
İn vitro döllenme
İn vitro germplazm muhafazası
Somatik hücre melezlemesi (protoplast fizyonu)Somatik hücre melezlemesi (protoplast fizyonu)
Gen transferi
Bitki doku kültürünün ticari ve ıslah dışı uygulamaları
Hastalıksız bitki elde edilmesinde meristem kültürü
Mikroçoğaltım
Sentetik tohum üretimi (somatik embriyolar)
Sekonder metabolit üretimi (kallus-hücre süspansiyonları)
Kimeralar
2 2
Temel araştırmalardaki uygulamalarTemel araştırmalardaki uygulamalar
Temel Teknikler
1)Uygun bir laboratuvar düzenini kurulması,
2)Kullanılacak bitki parçalarının (eksplant) ve besin ortamlarının seçimi, hazırlanması ve sterilizasyonu,
3)Kallus ve hücre süspansiyonlarının oluşturulması,
4)Kallus veya hücre süspansiyonlarından veya doğrudan somatik veya gametik hücrelerden bitki rejenerasyonunun uyarılması,
5)Oluşan sürgünlerin çoğaltılması ve boylarının uzatılması, somatik embriyoların olgunlaşması,
6)Uzayan sürgünlerin köklendirilmesi,
7)Köklenen bitkilerin dış ortama alıştırılması (aklimatizasyon).
33
Sterilizasyon teknikleri Sterilizasyon teknikleri
İn vitro (laboratuvarda ve steril şartlarda) doku
kültüründe en önemli nokta sterilizasyon işlemleridir Sterilizasyon, sterilize edilecek yer ve materyale göre 3 kısımda değerlendirilebilir:
1)Çalışma alanının sterilizasyonu,
2)Kullanılacak alet, ekipman, kapların ve besin
ortamlarının sterilizasyonu (ısı ile bozulabilenler, ısı ile bozulmayanlar)
3)Bitki materyalinin sterilizasyonu
Besin Ortamları Besin Ortamları
Tablo 5. Bitki doku kültüründe en çok kullanılan temel besin ortamları
Tablo 6. Stok solüsyonlarla MS besin ortamının hazırlanması-1
Tablo 7. Stok solüsyonlarla MS besin ortamının hazırlanması-2
Tablo 8. Bitkilerce alınabilir şekerler
Stok solüsyonların hazırlanması ve Stok solüsyonların hazırlanması ve
saklanması saklanması
Bitki büyüme düzenleyicileriBitki büyüme düzenleyicileri
Tablo 9. Bitki doku kültüründe en çok kullanılan bitki büyüme düzenleyecileri
Tablo 10. Uygulama alanları ve etki şekillerine göre bitki düzenleyici, engelleyici ve hormon grupları
Kültür ŞartlarıKültür Şartları
4 4
Denemelerin Planlanması ve Data Analizi
Mikroskopi ve GörüntülemeMikroskopi ve Görüntüleme
Laboratuvarda Güvenlik
Tablo 13. Bitki doku kültüründe üzerinde çalışılan bazı konular, uygulanan teknik ve sistemler
5 5
Bitki Doku Teknikleri
Çoğaltma Amacıyla Kullanılan Doku Kültürleri Teknikleri
Meristem kültüründe izole edilen
meristemin büyüklüğü hem kültürün amacını hem de başarı oranını büyük ölçüde
etkilemekte, dokunun büyüklüğü arttıkça başarı yükselmekte buna karşılık alınan
meristtemin büyük olması virüslü bitki elde edilmesi tehlikesini arttırmaktadır
Meristem kültürü 1
Meristem kültürü 1
Virüslerin bitkilerden eliminasyonu için önceleri sadece termoterapi yöntemi
kullanılmaktaydı. Ancak birden fazla virüs tarafından enfekte edilmiş her virüs farklı bir sıcaklıkta inaktive olduğu için tüm
virüslerin termoterapi ile eliminasyonu mümkün olmamaktadır. Bu yüzden son yıllarda tek başına termoterapi
kullanılması yerine, termoterapi ile meristem kültürünün kombinasyonu yoluyla virüssüz bitki elde edilmesine yönelik çalışmalar hız kazanmıştır
1. Meristemlerin izolasyonu ve kültür ortamlarına dikilmesi.
2. Büyümenin başlatılması ve sürgün oluşturma
3. Oluşan sürgünlerin köklendirilmesi
4. Köklü bitkilerin saksılara şaşırtılması ve dış ortama alıştırılması
Meristem kültürü 4 aşamadan oluşur Meristem kültürü 4 aşamadan oluşur
Sürgün ucu kültürü tekniği bitkilerin mikro çoğaltılmasında koltuk sürgünü proliferasyonu amacıyla kullanılmaktadır. Bu teknikte
kullanılan eksplanta, büyüme konisi ile bunun hemen altında bulunan birkaç adet yaprak taslağını içerdiği için “mikro çelik” ya da
“minyatür çelik” ismi verilmektedir.
Sürgün ucu kültüründe kullanılan bitki parçası meristem kültüründe kullanılan parçaya göre daha büyük olduğu için eksplantın gelişmesi çok daha hızlı olmakta ve aynı zamanda bir vegetatif çoğaltma
tekniği olduğu için klonal bir çoğaltma sağlamaktadır
••Bu teknikle, mantari ve bakteriyel hastalık etmenlerinden bir Bu teknikle, mantari ve bakteriyel hastalık etmenlerinden bir ölçüde korunmak mümkündür. Ancak, virüssüz ve hastalık
ölçüde korunmak mümkündür. Ancak, virüssüz ve hastalık etmenleri ile bulaşık olmadığı garanti edilemez
etmenleri ile bulaşık olmadığı garanti edilemez
9 Sürgün ucu kültürü
9 Sürgün ucu kültürü
Mikro Aşılama
Mikro aşılama tekniği, gerek vegetatif gerekse generatif yöntemle çoğaltılan tepesi vurulmuş anaç olarak kullanılan bir bitkicik üzerine, 0.1-0.4 mm uzunluktaki sürgün ucunun in vitro koşullarda
aşılanmasıdır.
Anaç olarak kullanılacak bitkilerin 1.5 cm’lik epikotil kısmı
bırakılarak tepeleri kesilir. Kotiledonlar ve koltuk altı tomurcukları çıkarılır. Kök ise, 2-4 cm’lik uzunlukta kesilir
.
Kalem olarak kullanılacak sürgün ucu parçası “TersT” şeklinde ya da yatay kesilmiş epikotil üzerine yerleştirilir
Mikro aşılama tekniğinin kullanım amaçlarıMikro aşılama tekniğinin kullanım amaçları::
•• Bu teknik, virüssüz bitki elde etmek için kullanılan en uygun Bu teknik, virüssüz bitki elde etmek için kullanılan en uygun tekniktir.
tekniktir.
•• Mikro aşılama tekniği, sürgün ucu kültüre alındığında, tam bir Mikro aşılama tekniği, sürgün ucu kültüre alındığında, tam bir bitki oluşturamayan tür ve çeşitlerde kullanılmaktadır.
bitki oluşturamayan tür ve çeşitlerde kullanılmaktadır.
•• Ayrıca türler arası aşılamada uyuşma mekanizmasını incelemek Ayrıca türler arası aşılamada uyuşma mekanizmasını incelemek amacıyla kullanılan bir tekniktir
amacıyla kullanılan bir tekniktir..
8 Gen kaynaklarının Muhafazası Amacıyla 8 Gen kaynaklarının Muhafazası Amacıyla
Doku Kültürü Tekniklerinin Kullanımı Doku Kültürü Tekniklerinin Kullanımı
Doku kültürü tekniklerinden yararlanarak, bitkisel materyallerin muhafazası başlıca iki yöntemle
yapılmaktadır
a. Kültürün gelişmesinin minimuma indirerek muhafaza
b. Kültürü dondurarak muhafazab. Kültürü dondurarak muhafaza
Islah Amacıyla Kullanılan Doku Kültürü Teknikleri
Embriyo Kültürü
Embriyo Kültürü, gelişmenin belirli bir devrisinde ovaryum
içerisinde bulunan embriyoların steril koşullarda izole edilerek uygun bir besi ortamında çimlendirilerek geliştirilmesidir
Embriyo kültürü iki şekilde gerçekleştirilebilir
a. Henüz tam olarak olgunlaşmamış tohumlardan alınan olgunlaşmamış embriyoların kültüre alınması
b. Olgun tohumlardan izole edilen tam olarak olgunlaşmamış embriyoların kültürüdür
Embriyonun tohumdan çıkarılmasının güç olduğu durumlarda “Ovaryum Kültürü” ya da “Ovul Kültürü” kullanılmaktadır
7 Anter Kültürü 7 Anter Kültürü
Özellikle ıslah çalışmalarında önemli olan bir Özellikle ıslah çalışmalarında önemli olan bir yöntemdir.
yöntemdir.
Anter kültürü ile haploid bitkiler, direkt androgenesis ve indirekt androgenesis yoluyla gerçekleşmektedir
Anter kültürünün yanı sıra haploid bitki elde edilmesi
amacıyla döllenmiş tohum taslaklarında kullanılabilmekte ve bu amaçla somatik embriyogenezsis teşvik edilmektedir.
Döllenmiş tohum taslağının içindeki gametik kromozom
sayısına sahip olan yumurta hücrelerinden embriyo oluşumu ve bitki gelişimi sağlandığında, haploidi ıslahından
yararlanılarak homozigot bireyler elde edilebilir
Protoplast Kültürü Protoplast Kültürü
Protoplast kültürü ise, izole edilen protoplastların katı yada Protoplast kültürü ise, izole edilen protoplastların katı yada sıvı besin ortamları içerisinde hücre modifikasyonu ve somatik sıvı besin ortamları içerisinde hücre modifikasyonu ve somatik hidridizasyon yoluyla bitki tür ve çeşitlerinin geliştirilmesi
hidridizasyon yoluyla bitki tür ve çeşitlerinin geliştirilmesi amacılya in vitro koşullarda geliştirilmesi işlemidir
amacılya in vitro koşullarda geliştirilmesi işlemidir
Protoplast kültürünün aşamaları:
a.Yaprak sterilizasyonu,
b.Epidermisin soyulması,
c.Enzim uygulaması ve inkübasyon,
d. Protoplast izolasyonu ve inkübasyonu ve kültüre
alınmasıdır
Protoplasların kültüre alınması sonucunda uygun şartlarda protoplastlardan meydana gelen kalluslar farklılaşarak
sürgün ve kök oluşturabilmektedir
Kallus Kültürü
Kallus kültüründe kullanılacak bitki dokuları genellikle
gövde ve köklerin iletim alanlarının yanındaki bölünebilme özelliğine sahip dokulardır. Bunun yanında meyve,
endosperm, polen ya da olgun/olgun olmayan embriyo kallus kültüründe başlangıç materyali olarak
kullanılmaktadır.
Kallus Kültürünün Kullanım Amaçları:
Genetik varyasyon yaratmak suretiyle, bunlar içinden ıslah amacına uygun olanların seçilmesi,
Kallus dokularından yararlanılarak aşı uyuşmazlıklarının belirlenmesi amacıyla kullanılır
11 Sekonder Metabolit Üretimi.
11 Sekonder Metabolit Üretimi.
Ekonomik önemleri Ekonomik önemleri
, ,
Bitkilerde bulunan, türlere özgü bir çok sekonder metabolitin Bitkilerde bulunan, türlere özgü bir çok sekonder metabolitin insanların yararlanabilecegi bir çok alanda (tıp, ecza, kozmetik, insanların yararlanabilecegi bir çok alanda (tıp, ecza, kozmetik, ziraat, gıda vb) kullanılması bu grupda yer alan maddelerin daha ziraat, gıda vb) kullanılması bu grupda yer alan maddelerin daha fazla elde edilebilir olmasını sağlayacak bazı teknikler ile elde fazla elde edilebilir olmasını sağlayacak bazı teknikler ile elde edilmesi bir çok çalışmada amaçlanmıştır.
edilmesi bir çok çalışmada amaçlanmıştır.
Bu tekniklerden biriside , bitkinin çeşitli kısımlarını Bu tekniklerden biriside , bitkinin çeşitli kısımlarını doku ya da doku ya da hücre süspansiyon kültürü
hücre süspansiyon kültürü kullanılarak uygun miktarlarda kullanılarak uygun miktarlarda
maddenin elde edilmesi son yıllarda kullanılabilir bir yol olarak maddenin elde edilmesi son yıllarda kullanılabilir bir yol olarak karşımıza çıkmaktadır
karşımıza çıkmaktadır
Genel olarak tüm tekniklerde karşılaşılan Genel olarak tüm tekniklerde karşılaşılan sorun, bazı özgün sekonder metabolitlerin sorun, bazı özgün sekonder metabolitlerin
üretimindeki düşük verimliliktir üretimindeki düşük verimliliktir
Farklılaşmış ve organize olmuş kültürler ile metabolit üretimi çalışılarken bitkinin büyüme peryodunuda göz önüne almak gerekir. Morfolojik olarak farklılaşma
eğilimindeki organ, doku, hücre veya hücre gruplarında potansiyel olarak sekonder metabolit üretim olanağı
daha fazla olmaktadır.
Çeşitli araştırmanın sonuçlarına gör Çeşitli araştırmanın sonuçlarına gör
sekonder metabolitin fazla olduğu kısımların sekonder metabolitin fazla olduğu kısımların
kültüre alınması daha uygundur kültüre alınması daha uygundur
Kök kültürleri
Sürgün kültürleri
Embriyo kültürleri
Farklılaşmamış ve organize olmamış kültürler ile metabolit üretimi
Farklılaşmış ve organize olmuş kültürler ile metabolit üretimi
Farklılaşmamış ve organize olmamış kültürler ile metabolit üretimi
Kallus kültürleriKallus kültürleri
TABLO 14.TABLO 14.
Hücre süspansiyon kültürleriHücre süspansiyon kültürleri
.
Kallus kültürleri de hücre süspansiyon kültürleri için başlangıç materyali olabilir. Bu durum teknik açıdan daha avantajlıdır.
Çünkü in vitro ortama uyum sağlamış, belli bir büyüme oranı sabitesine sahip kallus kültüründen alınan parçalar, ana bitkiden alınan parçalara göre sıvı ortama daha çabuk adapte olmaktadır.
Kallustan alınan parçaların kolayca ayrılıp sıvı ortam boyunca daha homojen dağılım göstermesi ise hücre süspansiyon
kültürüne başlamada avantaj sağlamaktadır.
Sekonder metabolitlerin üretilmesi konusunda hücre
süspansiyon kültürleri diğer tekniklere ve özellikle kallus
kültürlerine göre daha avantajlı sistemlerdir. Bu avantajlardan en önemlisi, bu sistemlerin kallus kültürlerine göre daha
çabuk büyümesidir. Hücre süspansiyonlarında kaynak bitkiden çok daha fazla ürün birikimi olduğuna dair birçok örnek
bulunmaktadır
Süspansiyon Kültürlerinde Sekonder Ürün Veriminin Artırılması
Sekonder ürün miktarını değişen Sekonder ürün miktarını değişen fiziksel ve kimyasal çevre fiziksel ve kimyasal çevre koşulları
koşulları oldukça etkiler (Tablo 17 ) oldukça etkiler (Tablo 17 )
Aynı zamanda Aynı zamanda kültür ortamında bulunan besinlerkültür ortamında bulunan besinler; yani karbon, ; fosfor, azot kaynakları ve diğer makro elementler ile bitki büyüme düzenleyicileri; yani oksinler ve sitokininler hem büyümeye hem de metabolit oluşumuna etki etmektedir
Bunların yanı sıra, bitkisel koşullarda, kültür tipine, hücre hattına ve hatta kültürün yaşına göre etkilidir
Öncüller (Precursors)
Bitki doku ve hücre kültürlerine öncül ve/veya ara
maddeler ekleyerek sekonder metabolit üretiminde artış sağlamaya yönelik araştırmalar son yıllarda oldukça
fazlalaşmıştır
Bitki hücre kültürlerine öncüller ilave ederek sekonder metabolitin üretimini arttırma yönteminde göz önünde bulundurulması gereken bir takım ön koşullar
bulunmaktadır. Öncelikle bu maddelerin toksik olmayan derişimlerinin saptanması, kültür ortamına ilave etmek için en uygun zamanın belirlenmesi, hücre içine alınma ve birikim mekanizmalarının ortaya çıkarılması ve bu maddelerin kullanımını sağlayan enzimlerle ilişkilerinin bilinmesi gerekmektedir
Elisitörler
Sekonder metabolitlerin bir kısmı bitkinin yapısında hazır bulunan Sekonder metabolitlerin bir kısmı bitkinin yapısında hazır bulunan bir kısmı ise ancak bitki- uyarıcı interaksiyonunda yeni
bir kısmı ise ancak bitki- uyarıcı interaksiyonunda yeni
sentezlenebilen maddelerdir. Bu gibi maddeler bitkilere özgü sentezlenebilen maddelerdir. Bu gibi maddeler bitkilere özgü
şekilde bulunurlar.
şekilde bulunurlar.
Abiyotik elisitörler: Abiyotik elisitörler: biyolojik olmayan (UV, ağır metal iyonları, biyolojik olmayan (UV, ağır metal iyonları, deterjanlar vb.)
deterjanlar vb.)
Biyotik elisitörlerBiyotik elisitörler biyolojik kökenli çok çeşitli yapıda maddeler biyolojik kökenli çok çeşitli yapıda maddeler olabilir,(
olabilir,( polisakkaritler, proteinler, glikoproteinler, bakteri, mantar, nematod ve hatta bitkisel kaynaklı hücre çeperi
parçalanma ürünleri vb)
Biyotik elisitörler ise oluşum ve birikim durumlarına göre 4 ana başlıkta toplanabilir
1. Doğrudan mikroorganizmalar tarafından salınan ve bitki hücrelerince tanınanlar
2. Mikroorganizmaların bitki hücre çeperlerindeki işlevi sonucu oluşanlar
3. Mikroorganizma üzerinde bitki enzimlerinin işlev görmesi 3. Mikroorganizma üzerinde bitki enzimlerinin işlev görmesi ile oluşanlar
ile oluşanlar
4. Çeşitli uyarıcı etkenlere yanıt olarak bitki hücreleri 4. Çeşitli uyarıcı etkenlere yanıt olarak bitki hücreleri
tarafından oluşturulan ve ortama salınan endojen ve her zaman tarafından oluşturulan ve ortama salınan endojen ve her zaman doğada mevcut olan bileşikler.
doğada mevcut olan bileşikler.
Bitkilerden ve bitki hücre kültürlerinden çok sayıda
fitoaleksinler izole edilmiştir. Bu bileşiklerin kimyasal yapıları büyük çeşitlilik gösterse de, karbon iskeletlerinin belli bir tür veya familya için karakteristik olması, fitoaleksinlerin
kemotaksonomide kullanışlı işaretler olmasını gündeme getirmektedir
1212 TutuklamaTutuklama( immobilizasyon)( immobilizasyon)
Aslında tutuklanma, mikroorganizmalarda uzun zamandan beri uygulanan bir tekniktir. Acetobacter hücrelerinin tutuklandığı geleneksel sirke üretme yöntemi tipik bir tutuklanma tekniğidir
Hücrelerin bütünüyle tutuklanmasına dair ilk rapor 1960’lı yıllara dayanmaktadır. Bu raporda, bir liken olan Umbilicaria pustulata hücrelerinin poliakrilamid jel içinde tutuklandığı belirtilmiştir (Mosbach ve Mosbach, 1966). Bir sonraki yıl, embriyonik hayvan hücrelerinin tutuklanması da gerçekleştirilmiştir (Wezel,1967)
Sonraki yıllarda, çoğunlukla mikroorganizmaların yer aldığı, çeşitli mikroorganizmaların, bitki ve hayvan hücreleri ile
organellerin değişik matriksler kullanılarak tutuklandığına dair bir çok rapor literatürlerde yerini almıştır
Bitki hücrelerinin tutuklanması Bitki hücrelerinin tutuklanması
nispeten yeni bir düşüncedir nispeten yeni bir düşüncedir
Catharanthus roseus ve Daucus carota
hücrelerinin aljinat yatakta tutuklanması, ilk rapor edilen bitki hücrelerinin tutuklanması tekniğidir (Bordeliue ve ark, 1979).
Ancak tekniğin temeli, enzim ve/veya
mikroorganizmaların tutuklanması temeline dayanmaktadır.
Tutuklanma işlemi, izlenecek tekniğe göre dört ana sınıfa Tutuklanma işlemi, izlenecek tekniğe göre dört ana sınıfa ayrılabilir
ayrılabilir
1. 1. Hücrelerin inert yatağa tutunmaları (adsorbsiyon),Hücrelerin inert yatağa tutunmaları (adsorbsiyon),
2.2. Hücrelerin(enzimlerin veya organellerin); aljinat, agar, Hücrelerin(enzimlerin veya organellerin); aljinat, agar, poliakrilamid, kollajen vb. gibi inert (tepkisiz) bir yatakta poliakrilamid, kollajen vb. gibi inert (tepkisiz) bir yatakta
tutuklanmaları tutuklanmaları,,
3.3. Hücrelerin biyolojik makro moleküllerle (lektinler) yatağa Hücrelerin biyolojik makro moleküllerle (lektinler) yatağa bağlanması,
bağlanması,
4.4. Hücrelerin karboksimetil selüloz gibi inert bir yatağa kovalent Hücrelerin karboksimetil selüloz gibi inert bir yatağa kovalent bağlanması
bağlanması
Tutuklanmış bitki hücre kültürleri ile
sekonder metabolit üretimi başlıca üç ana grupta toplanabilir.
Bunlar;
1. biyotransformasyon,
2. öncüllerden biyosentez ve
3. bileşiklerin de novo sentezi
Bitki hücrelerinin tutuklanması tekniği ile sekonder metabolit üretimi başlıca şu avantajları sağlamaktadır.
Tutuklanmış hücrelerde büyüme doğal olarak sıvı ortamdaki hücrelere göre daha yavaş gerçekleşir. Bu durum biyomasın daha uzun süre alıkonmasını sağlayacak, metabolit hücrelerden salındığı ve ortamdan kazanıldığı sürece sistem sürekli olarak çalışabilecektir
Halbuki sıvı hücre kültürlerinde bir süre sonra alt kültür (pasaj) yapma gereği duyulmaktadır
Daha çok biyomas verimi elde edilebilir. Ayrıca ortama ‘genç’
hücrelerin ekimi ve ‘yaşlı ‘ hücrelerin çıkarılması ile sistemin
‘gençleştirmesi’ sağlanabilir.
Tutuklamada hücreler besin ortamından matriksle ayrıldığı için salınan ürün kolaylıkla kültürden ‘hasat’ edilmektedir.
Sistemin sürekli ve kararlı doğası, oluşabilecek bazı biyokimyasal değişiklikleri ve yan ürün tepkimelerini ortadan kaldırmaktadır
Büyüme ve ürün oluşumu arasında kesin bir ayırım
yapılabilmektedir. Böylelikle ürün optimizasyonu büyümeyi engellememektedir
Agregat oluşumu ve mekanik hasarlara duyarlılık gibi
büyümeye bağlı olarak ortaya çıkan, bazı sorunlar tutuklanmış hücreleri etkilememektedir
Bitki hücrelerinin tutuklanmasında,
1. Tutunma (adsorpsiyon),
2. Kovalent bağlanma ve
3. Tuzaklama yöntemleri daha fazla kullanılmaktadır
Tutunma Tutunma
Bitki hücrelerinin Bitki hücrelerinin jellatin, agar, aljinat, polipropilenjellatin, agar, aljinat, polipropilen, , polistiren
polistiren ve ve camcam gibi katı desteklere tutundurulmasıdır. gibi katı desteklere tutundurulmasıdır.
Katı destek üzerine ince film halinde tutundurulmuş Katı destek üzerine ince film halinde tutundurulmuş
hücrelerin büyüme ortamı ile doğrudan teması, beslenme hücrelerin büyüme ortamı ile doğrudan teması, beslenme
ile ilgili sınırlamaları ortadan kaldırmaktadır. Bu durum ile ilgili sınırlamaları ortadan kaldırmaktadır. Bu durum
tutunma yöntemine avantaj sağlamaktadır.
tutunma yöntemine avantaj sağlamaktadır. Catharantus Catharantus roseus
roseus hücrelerinin kalsiyum aljinatla kolon reaktöre hücrelerinin kalsiyum aljinatla kolon reaktöre tutundurulması örnek olarak verilebilir
tutundurulması örnek olarak verilebilir
Kovalent Bağlanma Kovalent Bağlanma
GlutaraldehitGlutaraldehit ve ve karbodimidkarbodimidler gibi bağlayıcı maddeler ler gibi bağlayıcı maddeler ile mikroorganizmaların cam gibi katı desteklere
ile mikroorganizmaların cam gibi katı desteklere
bağlanması yöntemi uzun zamandan beri uygulanmaktadır.
bağlanması yöntemi uzun zamandan beri uygulanmaktadır.
Ancak, bu maddelerin bitki hücreleri için oldukça reaktif Ancak, bu maddelerin bitki hücreleri için oldukça reaktif
olması bu yöntemin bitki hücrelerine uygulanmasını olması bu yöntemin bitki hücrelerine uygulanmasını
zorlaştırmaktadır.
zorlaştırmaktadır.
Yine de Yine de Solanum aviculareSolanum aviculare’nin glutaraldehit ile polifenilen ’nin glutaraldehit ile polifenilen oksite bağlanarak glikoaldehidlerin üretimi örnek olarak oksite bağlanarak glikoaldehidlerin üretimi örnek olarak
verilebilir verilebilir
Tuzaklama:
Bitki hücrelerinin tutuklanmasında en sık kullanılan yöntemdir. Tuzaklamada çeşitli alt yöntemler
uygulanmaktadır. Bunlar arasında polimer oluşturulması, gözenekli yapıların kullanılması ve kuşatma (confinement) en çok kullanılan yönemleridir.
Polimer oluşturmada aljinat, agar, karrajen gibi doğal polimerlerin yanı sıra poliakrilamid gibi sentetik
polimerler de kullanılabilir. Polimerleşme yanı sıra poliakrilamid gibi sentetik polimerler de kullanılabilir
Bitki hücrelerinin tutuklanmasının nispeten yeni bir yöntem olmasından dolayı sekonder metabolitlerin
üretimi konusunda bazı sorunlar yaşanabilmektedir. Bu sorunların arasında kullanılacak besi ortamının seçimi, ürün oluşumu ve salınımı ile destek maddesinin doğası ve bitki hücrelerine uygun olup olmayışı sayılabilir.
Ancak, bu sorunlar giderilemeyecek kadar büyük değildir.
Sonuç olarak tutuklanma yönteminin, sekonder metabolitlerin bitki hücreleri tarafından üretilmesi
konusunda bazı pratik ve ekonomik yararlar sağladığı açıktır.
Senkronize (eşzamanlı) kültürler
Hücre süspansiyon kültürlerinde karşılaşılan başlıca sorunlardan biri oda hücrelerin eş zamanlı olarak
bölünmemesidir. Bu durum kültürlerde sıklıkla karşılaşılan heterojen hücre populasyonuna neden olmaktadır.
Heterojen yapı da doğrudan veya dolaylı olarak metabolit üretimi konusunda bazı dezavantajları gündeme
getirmektedir. Eşzamanlı büyüme sistemleri gerek hücre bölünmesinde ve gerekse metabolik süreçlerin
aydınlatılmasında da kullanışlı araçlardır
İki aşamalı kültürler İki aşamalı kültürler
Büyüme ve sekonder metabolit üretimi arasındaki zıt ilişki, Büyüme ve sekonder metabolit üretimi arasındaki zıt ilişki, bu kültür sistemini gündeme getirmiştir. Bu yöntemde
bu kültür sistemini gündeme getirmiştir. Bu yöntemde hücreler öncelikle büyüme için uygun ortamda kültüre hücreler öncelikle büyüme için uygun ortamda kültüre
alınmakta ve daha sonra sekonder metabolit üretimi için alınmakta ve daha sonra sekonder metabolit üretimi için
uygun olan ortama aktarılmaktadır uygun olan ortama aktarılmaktadır
Biyodönüşüm (Biyotransformasyon) Biyodönüşüm (Biyotransformasyon)
Bitki biyoteknolojisinin en ilgi çekici konularından birisi de Bitki biyoteknolojisinin en ilgi çekici konularından birisi de biyodönüşümdür. Biyodönüşüm aynı zamanda bitki doku ve biyodönüşümdür. Biyodönüşüm aynı zamanda bitki doku ve
hücre kültürleri ile sekonder metabolitlerin üretiminin önemli bir hücre kültürleri ile sekonder metabolitlerin üretiminin önemli bir öğesidir. Metabolit üretimi konusunda diğer yöntemlerde olduğu öğesidir. Metabolit üretimi konusunda diğer yöntemlerde olduğu gibi, biyodönüşümün temeli de ilk kez mikroorganizmalarda
gibi, biyodönüşümün temeli de ilk kez mikroorganizmalarda yapılan araştırma ve uygulamalara dayanmaktadır.
yapılan araştırma ve uygulamalara dayanmaktadır.
Mikroorganizmaların rol oynadığı fermantasyon olayları da Mikroorganizmaların rol oynadığı fermantasyon olayları da aslında temel olarak biyodönüşüm olayından başka bir şey aslında temel olarak biyodönüşüm olayından başka bir şey değildir. Örneğin, üzüm suyundan şarap veya sirke üretimi değildir. Örneğin, üzüm suyundan şarap veya sirke üretimi
biyodönüşüm ile gerçekleştirilen ve insanlık tarihi kadar eski bir biyodönüşüm ile gerçekleştirilen ve insanlık tarihi kadar eski bir yöntemdir
yöntemdir
Bitki hücre kültürleriyle başarılı ve etkin bir biyodönüşüm için yerine getirilmesi gereken bazı ön koşullar vardır. Bunların başlıcaları;
Dönüşümü sağlanacak substrat ve sonuçta oluşan ürün bitki hücre kültürleri için toksik olmamalıdır.
Substratın hücre içine girebilmesi ve oluşan ürün tercihen kültür ortamına salınabilmelidir.
Kültürdeki hücrelerde substratın ürüne dönüşümü için gerekn enzimler bulunmalıdır.
Ürünün oluşumu, yıkımından (metabolize olmasından) daha hızlı olmalıdır
Metabolit Kültürü yapılan bitki Kullanım Alanı Maliyet($/kg) Aymalisin Catharanthus roseus İlaç sanayi 1500
Kodein Papaver somiferum İlaç sanayi 650 Digoksin Digitalis lanata İlaç sanayi 3000 Yasemin Jasminum türleri Parfümeri 5000 Kinin Cinchona ledgeriana İlaç ve gıda sanayi 100
Gül yağı Rosa spp. Kozmetik 300
Şikonin Lithospermum erythrorhizon
İlaç ve boya sanayileri
4500
Tablo 22. Endüstride kullanılma potansiyeli olan bazı
bitki hücre kültürü ürünleri (Scragg, 1991).
Özetle bitki hücre kültürleri ile biyodönüşüm, tıpkı
mikroorganizmalarda fermentasyon tekniğinde olduğu gibi endüstriyel açıdan yararlı bir sistem olabilir.
Biyodönüşüm sadece bilinen metabolitlerin hızlı ve etkin bir şekilde sentezlenmesi için değil aynı zamanda daha önce
bitkilerde varlığı bilinmeyen yeni kimyasalların ortaya çıkmasında da katkıda bulunabilir.
Yine yukarıda belirtildiği gibi bitki hücre kültürleri ile
biyodönüşüm, bazı çevre kirliliğine yol açan bazı kimyasalların (senobiyotiklerin) parçalanma mekanizmalarının
araştırılmasında kullanışlı deneysel sistemler olabilir.
Biyoreaktörler (fermentörler) Biyoreaktörler (fermentörler)
Hücre süspansiyon kültürleri ile sekonder metabolitlerin
üretimi konusunda şimdiye kadar verilen pek çok örnek en çok 1 litre kapasiteli, kapalı bir sistemden ibaret kültürlere aitti.
Halbuki biyoreaktör veya fermentör adı verilen sistemler ile kapasiteyi birkaç litreden binlerce litreye kadar çıkarmak
mümkün olmaktadır. Böylelikle endüstriyel anlamda bitki
hücre kültürlerinden yararlanma olanağı gündeme gelmektedir.
Bitki hücrelerinin biyoreaktörlerde kültürü yapılmasının iki önemli avantajı vardır.
1. Kültürlerin daha yakın denetimi. Kapalı bir sistemde
kültürü yapılan hücrelerin bulunduğu ortamdaki değişiklikleri denetim altına almak bir hayli zordur. Oysa biyoreaktörlerde gazlar (oksijen ve karbondioksit) pH ve sıcaklık gibi
değişken faktörlerin yakın denetimi mümkün olmaktadır.
Bu yakın denetim olanağı, biyoreaktörlerin iyi karışan bir sistem olmasını sağlamaktadır. Böylece ürün analizi için gerekli miktarda (örneğin 100ml) ve ortamdaki gerçek
durumu temsil edebilen örnekler biyoreaktörden daha kolay alınabilmektedir.
2. Bitki hücre kültürlerinin endüstriyel amaçlı kullanılması için 2. Bitki hücre kültürlerinin endüstriyel amaçlı kullanılması için (özellikle ekonomik açıdan önemli metabolitlerin üretiminde) (özellikle ekonomik açıdan önemli metabolitlerin üretiminde)
büyük ölçekli kültürler gerekmektedir.
büyük ölçekli kültürler gerekmektedir.
Bu kültürler için gerekli ön bilgiler biyoreaktörler ile Bu kültürler için gerekli ön bilgiler biyoreaktörler ile sağlanmaktadır.
sağlanmaktadır.
Gerek büyüme ve gerekse ürün oluşumu bakımından en yüksek Gerek büyüme ve gerekse ürün oluşumu bakımından en yüksek verimin alındığı hücre süspansiyon kültürlerinden büyük ölçekli verimin alındığı hücre süspansiyon kültürlerinden büyük ölçekli kültürlerin başlatılması durumunda, kültüre ait pek çok özelliğin kültürlerin başlatılması durumunda, kültüre ait pek çok özelliğin
değiştiği görülmektedir.
değiştiği görülmektedir.
Örneğin, Örneğin, kültürün kuru ağırlık miktarı kültür hacminin kültürün kuru ağırlık miktarı kültür hacminin
kübüyle orantılı olarak değişirken, ürün verimindeki değişim kübüyle orantılı olarak değişirken, ürün verimindeki değişim
kültür hacminin karesiyle orantılı olmaktadır kültür hacminin karesiyle orantılı olmaktadır. .
Dolayısı ile Dolayısı ile büyük ölçekli kültürler başlatılmadan önce, gerek büyük ölçekli kültürler başlatılmadan önce, gerek büyüme ve gerekse ürün oluşumu için önemli olan parametreler büyüme ve gerekse ürün oluşumu için önemli olan parametreler
uygun biyoreaktörlerde gözden geçirilmelidir.
uygun biyoreaktörlerde gözden geçirilmelidir.
Bitki hücrelerinin biyoreaktörlerde yüksek hacimde kültür, özellikle ekonomik değeri yüksek, ancak bitkiden izole edilen miktarı düşük kimyasallar için tasarlanmıştır. Örneğin, C. roseus bitkisinden elde edilen ve yapıştırıcı olarak kullanılan kodein
ekonomik değeri yüksek maddedir. Ancak bu maddelerin yukarıda adı geçen bitkilerden elde ediliş miktarları çok düşüktür.
Bioreaktörlerin geçen zaman içerinde ihtiyacı karşılayacak şekillde ve kontrollu şartları taşıyabilen örnekleri günümüzde oldukça gelişim göstermiştir. Aşağıda bu özelliklerden bazıları yer almaktadır.
Mikroptan arındırılmış (steril) bir ortam olmalı,
PH, oksijen, karbondioksit ve sıcaklık gibi çevresel etmenlerin denetimi için giriş noktası,
Taze besi ortamı, köpük giderici maddeler, pH’ nın
düzenlenmesi için gereken asit veya baz ilavesi için giriş noktası,
Hava girişi (sterilite için filtre sistemli)
Karıştırma (karıştırıcılı tank sisteminde pervane, hava kaldıraçlı sistemlerde ise doğrudan havanın kendisi).
Sıcaklık denetimi için soğutma-ısıtma devresi (içinden soğutma suyu ve buhar geçen borular).
KAYNAK KİTAPLARKAYNAK KİTAPLAR Street,H.E.Ed(1973)
Street,H.E.Ed(1973) Botanical monograghs.Vol.11 Plant Botanical monograghs.Vol.11 Plant tissue and cell culture, University of California press,
tissue and cell culture, University of California press, Berkeley and Los Ageles
Berkeley and Los Ageles Gönülşen N., (1987 )
Gönülşen N., (1987 ) Bitki Doku Kültürleri Yöntemleri ve Bitki Doku Kültürleri Yöntemleri ve Uygulama Alanları. TC Tarım Orman ve Köyişleri
Uygulama Alanları. TC Tarım Orman ve Köyişleri
Bakanlığı Ege Tarımsal Araştırma Enstitüsü Yayın No: 78, Bakanlığı Ege Tarımsal Araştırma Enstitüsü Yayın No: 78,
Menemen- İzmir Menemen- İzmir
Kyte, L.(1987)
Kyte, L.(1987) Plants from test tubes- An introduction to Plants from test tubes- An introduction to micropropagation Timer Press Oregon
micropropagation Timer Press Oregon Özcan
Özcan S., Gürel E. Ve Babaoğlu S., Gürel E. Ve Babaoğlu M.,(2001). Bitki M.,(2001). Bitki biyoteknolojisi 1 ve 2 S.Ü. Vakfı yayınları Konya biyoteknolojisi 1 ve 2 S.Ü. Vakfı yayınları Konya
Her Konu ile ilgili çok sayıda Uluslararası ve Ulusal Her Konu ile ilgili çok sayıda Uluslararası ve Ulusal
makalelerden örnekler makalelerden örnekler
Dondurarak saklama ve Dondurarak saklama ve germplazma depolanması germplazma depolanması
Kurutma yöntemleri. Çözdürme sonrası Kurutma yöntemleri. Çözdürme sonrası işlemler ve iyileştirme işlemleri
işlemler ve iyileştirme işlemleri
