TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
ANKARA BÖLGESİ KANATLI KARMA YEMLERİNDE FUMONİSİN B1 VARLIĞININ ARAŞTIRILMASI
Alparslan ÇEVİK
FARMAKOLOJİ VE TOKSİKOLOJİ ANABİLİM DALI DOKTORA TEZİ
DANIŞMAN
Doç. Dr. Ender YARSAN
2006-ANKARA
İÇİNDEKİLER Kabul ve Onay Sayfası
İçindekiler
Önsöz
Şekiller Dizini Çizelgeler Dizini 1.GİRİŞ
1.1.Mikotoksinlerin tanımı ve
çeşitleri
1.2. Fumonisinler
1.3. Fumonisinlerin genel formülü, kimyasal yapı ve özellikleri
1.4. Fumonisinlerin toksikokinetiği 1.4.1. Emilim ve dağılım 4 1.4.2. Metabolizma 5 1.5. Etki şekli 1.6.Toksisite 1.6.1.Akut ve subakut toksisite
1.6.2. Subkronik toksisite 1.6.3.Kronik toksisite ve
karsinojeneti
1.6.4.Genotoksisite 1.6.5. Hücre zehiri olarak etkisi
1.6.6.Üreme ve gelişme üzerine olumsuz etkileri
1.6.7.Bağışıklık sistemine yönelik
olumsuz etkiler 1.6.8. Sinir sistemi üzerine etkileri
1.6.9. Kalp damar sistemi üzerine etkiler
1.6.10.Zehirleyici etkilerin etiyolojisi
1.7.İnsanlar üzerine etkileri 1.8.Fumonisin taramasında
kullanılan analitik metodlar 1.8.1.İnce tabaka kromotografisi
(İTK)
1.8.2.Yüksek performanslı sıvı
kromotografisi (HPCL) 1.8.3.Gaz kromotoğrafi/Kütle
spektrofotometri (GC/MS) 1.8.4.Karşılaştırmalı Enzim-
Bağlantısı İmmünosorbent denemeleri
1.8.5.Capillar zone elektroforez 1.9.Fumonisinlerin tolerans
limitleri
ii iii v vi vii 1 1
2 3
4
6 7 7 9 11
11 12 12
13
13 14
15
15 17 17 17 17 17
18
18
2.GEREÇ ve YÖNTEM 20
2.1.Gereç 20
2.1.1.Kanatlı yem numuneleri 20
2.1.2.Araçlar 21
2.1.3.Kimyasal maddeler 2.1.3.Yöntem 21 21 2.1.4.Standart eğri 24 2.2.İstatistiki hesaplamalar 24
3.BULGULAR 4.TARTIŞMA 30 25 5.SONUÇ ve ÖNERİLER 38 ÖZET 39
SUMMARY 40
KAYNAKLAR 41
ÖZGEÇMİŞ 51
ÖNSÖZ
Tarım ürünlerinde bulunan mikotoksinler ciddi ekonomik kayıplara neden olmaktadır. Mikotoksinlerle kirlenmiş olan ürünlerin neden olduğu ekonomik kayıplar yıllık olarak milyon Yeni Türk Liralara varmaktadır.
Yakın bir geçmişte varlığı tespit edilen ve mikotoksinler içerisinde önemli bir grubu oluşturan fumonisinler, Fusarium verticillioides, F. prolifetarum ve F.
nygamai tarafından üretilen, oldukça zehirli metabolitlerdir. Özellikle mısır ve mısır ürünlerinde bulunan fumonisinlerin, pirinç, domates, fasulye ve şeker kamışında da varlığı tespit edilmiştir.
Fumonisinlerin zehirli etki oluşturacak yoğunlukları önemli derecede hayvan türlerine bağlı olarak değişmektedir. Yemdeki ortalama 5-10 mg/kg konsantrasyonu atlarda nöro-toksik etkilere neden olur. Domuzlarda 4–16 mg/kg c.a. fumonisin alımı karaciğer sirozuna neden olabilir ve 16 mg/kg c.a.’dan fazlası akciğer ödemine yol açabilir. Tavuklar yemlerdeki daha yüksek fumonisin miktarını (75 mg/kg’a kadar) tolere edebilirler. Sığırların yüksek fumonisin yoğunluklarına duyarsızdırlar. Ratlarda kanserojen olduğu tespit edilen fumonisinlerin, insanlarda özefagus kanserine neden oldukları düşünülmektedir.
İlk olarak Güney Afrika ve Amerika’da tespit edilen fumonisinler ile ilgili çalışmalar oldukça az sayıdadır. Avrupa Birliği’nde henüz sistematik bir veri toplaması bulunmamaktadır. Ülkemizde de fumonisinler ile ilgili yeterli çalışma yoktur. Yem ve gıdalarda bulunmasına izin verilen alt ve üst limitleri henüz tespit edilmemiştir.
Bu çalışmanın yapılmasında emeği geçen başta danışman hocam Doç.Dr.Ender YARSAN olmak üzere, tez izleme komitemde yer alan Prof.Dr.Emine BAYDAN ve Prof.Dr.İrfan EROL’a, Farmakoloji ve Toksikoloji Anabilim Dalı Başkanı Prof.Dr.Sezai KAYA’ya, Anabilim Dalı öğretim üyelerine ve çalışan personele; tez çalışmamın uygulama aşamasındaki yardımlarından dolayı Dr.Levent ALTINTAŞ, Biyolog Bahtiyar CAN ve Ziraat Yüksek Mühendisi Osman ÖZBEK’e, bu anabilim dalını seçme konusunda bana destek olan ağabeyim Dr.Mahmut Z. ÇEVİK’e ve aileme içtenlikle teşekkür ederim.
Şekiller Dizini
Şekil 1.1. FB1’in kimyasal yapısı 3
Şekil.2.1.Analizlerde kullanılan standartlara ait % absorbans miktarları 24 Şekil.3.1. Fumonisin miktarlarının mevsimsel değişim grafiği 27
Çizelgeler Dizini
Çizelge.1.1. Bazı fumonisin türlerinin kimyasal formülleri ve
molekül ağırlıkları 4
Çizelge.1.2. Çeşitli ülkelerde tespit edilen mısır ve mısır ürünlerindeki 18
Fumonisin düzeyleri
Çizelge.1.3.FDA tarafından belirlenen yemlerde ve gıdalarda 19 bulunmasına izin verilen maksimum fumonisin düzeyleri
Çizelge.3.1.İlk altı ayda toplanan numuneler için 25 Standart çalışması
Çizelge.3.2.İkinci altı ayda toplanan numuneler için 25
standart çalışması
Çizelge.3.3. Yapılan analizler sonucunda numunelerde tespit edilen 26
fumonisin düzeyleri
Çizelge.3.4. Analiz edilen numunelerde fumonisin rastlanma sıklığına 29 bağlı frekans dağılım tablosu
1.GİRİŞ
1.1.Mikotoksinlerin tanımı ve çeşitleri
Mikotoksinler mantarlar (küfler) tarafından meydana getirilen ve bunları içeren yem ve yem hammaddeleri ve besinleri yiyen hayvan ve insanlarda zehirlenmelere ve ölüme yol açabilen maddelerdir.
Mikotoksin terimi mantar anlamına gelen myco ve zehir anlamındaki toxin kelimelerinin birleştirilmesinden türemiştir; insan ve hayvanlarda mikotoksinlerin sebep oldukları olaylar bu sebeple mikotoksin zehirlenmeleri olarak bilinmektedir (Kaya, 2002).
Mikotoksinler, gıda, yem ve ham maddeleri kontamine edebilen lifli mantarlar tarafından üretilen bir grup ikincil metabolitlerdir (Moss, 1994).
Doğal kirletici olarak besin ve yemlerde bulunabilen, insan ve hayvanların sağlığı yönünden önem taşıyan mikotoksinlerin bazıları şunlardır: aflatoksinler, okratoksinler, zearalenon, sitrinin, patulin, kojik asit, sterigmatosistin, trikotesenler, PR toksin, slaframin, penisillik asit, sporidesmin, ergot alkaloidleri, streoviridin, alternariol, tenuazonik asit, rubratoksinler, sikloklorotin, luteosikrin, rugulosin, tremorin A ve okzalik asit (Kaya, 2002).
Yaygın toprak mantarı olan fusariumun bir çok çeşidi trikotesen ve nivalenol sınıfı bazı toksinler [T-2 toksin, HT-2 toksin deoksinivalenol (DON)] ile zearelenon ve fumonosinleri üretir. Bu mantar çeşidi muhtemelen kuzey ılıman bölgelerinin en etkili toksin üreten ve yaygın olarak Amerika, Avrupa ve Asya’nın ılıman bölgelerinde yetiştirilen hububatlarda bulunan mantar türüdür.
Deney hayvanları ve çiftlik hayvanlarında fusarium toksinleri çeşitli zehirleyici etkilere yol açar. Bazı durumlarda fusarium türlerince
üretilen toksinlerin insanlarda da toksisiteye neden olduğu düşünülmektedir (EHC, 2000).
1.2. Fumonisinler
Fumonisinler, fusarium cinsi mantarlar tarafından sentezlenebilen mikotoksinlerdir (Gelderblom ve ark., 1991; Brown ve ark., 1992;
Hussein ve Brasel, 2001).
Fumonisinler, Fusarium verticillioides, F. napiforme, F. annulatum, F.
succaiase, F. beoiforme, F. dlamin, F. anthophilum, F. moniliforme, F.
proliferatum, F. nygamai türlerince üretilen mikotoksin çeşitleridir (Voss ve ark., 1989; Chen ve ark., 1992; Thiel ve ark., 1992; Leeson ve ark., 1995; Doğan ve Tuzcu, 2001).
Fumonisinler, Fumonisin A1, A2, B1, B2, B3, B4 ve C1 olmak üzere yedi çeşittir (Cawood ve ark., 1991; Akar ve ark., 1999). Doğada en fazla bulunan fumonisin çeşidi fumonisin B1 (FB1)’dir; insanlarda yemek borusu kanseri ile ilişkili olabileceği ileri sürülmektedir. Bu toksin çeşidinin karaciğer üzerindeki zehirleyici ve karsinojenik etkileri kanıtlanmıştır. Bunların deney hayvanları için nefrotoksik, immünodepresan ve embriyo toksik oldukları da bilinmektedir (Nair, 1998). Bu mikotoksinler, özellikle insan ve hayvan gıdası olarak kullanılan doğal veya işlenmiş mısır çeşitlerinde bulunmaktadır (Dowbrink-Kurtzman ve ark., 1999). İşlem tiplerinin büyük bir çoğunluğunda FB1 parçalanmamaktadır. Mısırın kuru değirmende öğütülmesi FB1’in kepek, tohum ve una dağılmasına neden olur.
Mısır bulamacında da durum bu şekildedir. Bununla birlikte, ıslak nemli değirmen işlemlerinde ve mısır nişastası üretiminde FB1
konsantrasyonu azalır; çünkü FB1 suda çözünebilir. Bir çok nedenle FB1 gıdalardan uzaklaştırılamamaktadır (Norred ve ark., 1998).
Fumonisin B1 atlarda ve domuzlarda at lökoensefalomalasi (ELEM)(Marasas ve ark., 1988) ve domuz akciğer ödemi (PPE) (Harrison ve ark., 1990; Ross ve ark., 1991) hastalıklarına yol açar.
Aynı zamanda FB1’in ratlarda kanserojen olduğu ve Afrika’nın belirli bölgelerinde insanlarda yemek borusu kanseri ile bağlantılı olduğu bildirilmektedir (Sydenham ve ark., 1990). Fumonisin B1 tüketen buzağılarda performans ve immün tepkime azalması gözlemlenmiştir (Osweiler ve ark., 1993). Kanatlı türlerinde FB1’ in etkileri iyi bir şekilde tanımlanmıştır. Civcivlerde FB1; düşük performans, organ ağırlıklarında artış, immün tepkimenin azalması ve organ lezyonları oluşturmaktadır (Ledoux ve ark., 1992; Qureshi ve ark., 1992; Javed ve ark., 1993; Weibking ve ark., 1993; Li ve ark., 1993). Hindi palazlarında ve ördek yavrularında, civcivlerdeki etkilerine benzer toksik etkilere yol açmaktadır (Weibking ve ark.,1993; Bermudez ve ark., 1995).
1.3. Fumonisinlerin genel formülü, kimyasal yapı ve özellikleri
Fumonisin B1, (Şekil 1.1)propan-1,2,3-trikarboksilik asit ve içinde C- 14 ve C-15 hidroksil grupların propan-1,2,3-trikarboksilik asitin terminal karboksil grubu ile esterleştirdiği 2-S-amino-12S, 16-R- dimetil-3S, 5R, 10R, 14S, 15-R-pentahidroksieicosan diesteridir (Bezuidenhout et al., 1988; Hoye et al., 1994).
Şekil 1.1. FB1’in kimyasal yapısı
Fumonisin B2 de, FB1’e benzer şekilde eicosane streogenetic ünitelerinden oluşan, FB1’in C-10 deoksianalogudur (Bezuidenhout ve ark., 1988; Harmange ve ark., 1994).
Fumonisin B3’ün amino-termal grubu, FB1’deki gibi tamamen aynı konfigürasyona sahip olmasına rağmen FB3’ün stereokimyasal yapısı tam olarak bilinmemektedir (WHO, 2002)
Fumonisinlerin A serisi üyeleri N-asetilat grubu, B serisi üyeleri ise serbest amin grupları içerir. B serisi üyeleri arasındaki farklılıklar, hidroksil gruplarının sayı ve yerlerinin değişikliğinden kaynaklanır (Riley ve ark., 1993; Lesson ve ark., 1995).
Molekül ağırlığı 721.838 olan FB1’in kapalı formülü C34H59NO15’dir (Çizelge1.1). Fumonisinler suda çözünebilen polar bileşiklerdir. Suda en iyi çözünebilen çeşidi ise FB1‘dir (Gelderblom ve ark., 1988; Riley ve ark., 1993; Lesson ve ark., 1995).
Çizelge 1.1. Bazı fumonisin türlerinin kimyasal formülleri ve molekül ağırlıkları
Fumonisin türü R1 R2 FORMÜLÜ Molekül Ağırlığı
FB1 OH OH C34H59NO15 721.838
FB2 OH H C34H59NO14 705.839 FB3 H OH C34H59NO14 705.839
FB4 H H C34H59NO13 689.840
1.4. Fumonisinlerin toksikokinetiği
1.4.1. Emilim ve dağılım
Ağız yoluyla verildiğinde FB1’in emilimi azdır (%6’dan az). Az miktarda ve biyolojik olarak aktif FB1 (14C) veya bunun metabolitleri karaciğer
ve böbreklerde uzun süre kalmaktadır. Dört haftanın üzerinde bir süreyle FB1 ile bulaşık gıdalarla beslenen domuzlarda FB1 ve bunun metabolitlerinin karaciğer ve böbreklerde biriktiği belirlenmiştir. Bazı hayvan türlerinde (yumurta tavuğu, domuz, inek, sıçan, fare ve insan dışı pirimatlar) safra yoluyla hızla atılır. Küçük miktarda (%1’den az) idrarla da atılır. (EHC, 2000; Norred ve ark., 1998;
Eriksen ve Alexandr, 1998).
Sıçanlara periton içi (Pİ) veya damar içi (Dİ) yolla verilmesinden sonra FB1’in atılması hızlı olmaktadır (t1/2 yaklaşık 10-20 dakika).
Damar içi uygulamalarda yarılanma süresinin 40 dakika olduğu tespit edilmiştir (Shephard ve ark., 1994). Domuzlara Dİ yolla 1-24 gün (14C)-FB1 verilmesinden ve bunu takiben 9 günlük aranın ardından yapılan doku analizlerinde sadece karaciğer ve böbreklerde kalıntı bulunmuştur. Domuzlar bulaşık olmayan gıdalarla beslenmeye başladığında ise 3 günden sonra doku seviyelerinin hızla azaldığı tespit edilmiştir (Prelusky ve ark., 1996).
Ağız yoluyla veya Di olarak FB1 verilen ineklerde hızlı bir dağılım görülmüştür (–D.İ.-t1/2= 1,7 dakika, –ağız yolu-t1/2= 15-18 dakika).
Uygulamadan 120 dakika sonra plazmada FB1 varlığına rastlanmadığı ve dokularda FB1 bulunmadığı tespit edilmiştir (Prelusky ve ark., 1996).
Çeşitli hayvan türlerinde yapılan çalışmalarda FB1’in plasentaya veya süte geçmediği gözlenmiştir (Scott ve ark., 1994; Voss ve ark., 1996 Laborde ve ark., 1997; Collins ve ark., 1998).
1.4.2. Metabolizma
Fumonisinlerin metabolizması hakkında fazla bilgi bulunmamaktadır. İnsan dışı pirimatların dışkı ekstratlarında FB1
metabolitlerine rastlanırken, ilaç verme yolundan ayrı olarak ratlarda metabolitlerin bulunmadığı tespit edilmiştir (Eriksen ve Alexander, 1998).
Fumonisin B1 bir çok hayvan türünde (yumurta tavukları, domuz, inek, sıçan, fare ve insan dışı primatlar) çok yavaş emilir, fakat hızlıca dağılır ve atılır (Prelusky ve ark, 1996; Norred ve ark., 1998;
EHC, 2000). Bununla birlikte, az miktarda da olsa FB1 birikintisi veya bunun metabolitleri karaciğer ve böbreklerde görülür (Scott ve ark., 1994; Laborde ve ark., 1997; Collins ve ark., 1998).
1.5. Etki şekli
Etki şekli tam olarak açıklanamamıştır. Bu konuda ileri sürülen farklı görüşler vardır.
Fumonisin B1 ve B2 yapısal olarak sfingozin ve sfinganine benzerlik göstermektedir. Bu benzerlik dolayısıyla sfingolipidlerin sentezinde onların yerine geçerek sentezini engellediği sanılmaktadır. Bu konuda ileri sürülen bir başka görüş de, FB1 sfingolipidlerin yapı taşı olan sfingozinin biyosentezini engeller. Bu durum, hücre büyümesi, hücre değişimi ve hücre morfolojisi, endothelial hücre geçirgenliği ve apoptozis gibi hücresel işlevlerde bozukluklara neden olur (Abel ve ark., 1998).
Sfingolipidlerin biyosentezlerinin durdurulması, bu sürecin çeşitli dönemlerinde görülür (Merill ve ark., 1997; Rileyet ve ark., 1996;
Norried ve ark., 1998; Wang ve ark., 1999); sfinganin/sfingozin (Sa/So) oranında değişiklik meydana gelir. Sa/So oranındaki belirgin etkiler 0,2 mg/kg.c.a. dozundan itibaren görülür. Gliko-
sfingolipidlerin durdurulması FB1’in ağız yoluyla alımından birkaç saat sonra görülür.
Bu görüşten farklı olarak fumonisinler proteinkinaz C, seritreonin fosfataz ve siklin D kinaz 4 enzim aktivitelerini değiştirerek, kalsiyum dengesini bozarak, glutasyonu baskılayıp nitrik oksit üretimini uyararak da etki gösterebilir.
1.6.Toksisite
1.6.1.Akut ve subakut toksisite
Fumonisin B1’in akut toksisitesi hakkında çok az bilgi bulunmaktadır. Fumonisin B1 için ÖD50 değeri tam olarak bilinmemektedir. Solunum veya deri yoluyla verilen tek doz FB1’in toksik etkisi hakkında da bilgi bulunmamaktadır (EHC, 2000).
Buna karşılık; FB1 verilen kemirgenlerde ağız yoluyla maruziyete bağlı toksisite çalışmaları (birkaç günden birkaç haftaya kadar süren) vardır (Gelderblom ve ark., 1988; 1992; 1993; 1994; Bondy ve ark., 1996; Badria ve ark., 1996; Voss ve ark., 1993; Howard ve ark., 1993). Ratlarda yapılan çalışmalarda böbrek ve karaciğere yönelik zehirli etkiler görülmüştür. Karaciğer üzerindeki etkiler, orta derecede yağ değişiklikleri, hidropik dejenerasyon ve hyaline droplet’in eşlik ettiği tek hücreli nekrozların dağınıklığı ile karakterize edilmiştir.
Yüksek dozlarda veya daha uzun süreli uygulamalarda; karaciğerin lobuler yapısını bozan fibriyozisi de (hiperplastik nodüllerin gelişimi karaciğere farklı bir görünüm vermektedir) içeren daha şiddetli etkiler olmuştur. Böbreklere yönelik etkiler ise, yağ değişiklikleri, proksimal hekzoni tüplerde sınırlı nekrozlar, odağımsı proksimal tubüller epitelyumda bazofil hiperplazisi ve tek hücreli nekrozlar ve piknozdan
ibarettir. Böreklerde ve karaciğerde ultra yapısal değişikliklerin şiddeti dokularda serum ve idrarda artan sphinganin konsantrasyonu ile ilişkilidir (Riley ve ark., 1994). Ratların böbrek ve karaciğerlerinde hızlı hücre ölümleri meydana geldiği, farelerde ise karaciğerde aynı olumsuzluklar görülürken, böbreklerde kötü bir etkisinin oluşmadığı tespit edilmiştir (Bondy ve ark., 1997).
Pek çok hayvan türünde belli doz seviyelerinde böbrek ve karaciğere yönelik zehirleyici etkiler göstermelerine rağmen, domuzlarda FB1’le ortaya çıkan en önemli hastalık PPE’dir. Bu durum, dysapnoe, zayıflık, siyanoz ve ölümle karakterizedir (Kriek ve ark., 1981; Diaz ve Boermans., 1994; Fazekas ve ark., 1998; Casteel ve ark., 1993; 1994;
Rotter ve ark., 1996; Gumprecht ve ark., 1998). Bazı PPE vakaları aynı anda meydana gelen karaciğer toksisitesi ile birlikte gözlemlenmiştir (Osweiler ve ark., 1992; Ross ve ark., 1992; Motelin ve ark., 1994; Ross., 1994). Bu etkinin etiyolojisi hakkında farklı görüşler vardır. En fazla kabul gören kalp damar sistemi ile bağlantılı olandır (Haschet ve ark., 1998; Smith ve ark., 1996; 1999). Günlük 4,5-6,3 mg/kg c.a. FB1 alımı PPE’ye neden olur (Motelin ve ark., 1994). Bu nedenle domuzlarda PPE için NOAEL 4,5 mg /kg c.a.’dan daha düşüktür. Atlarda ve ponilerde FB1’in en önemli toksik etkisi ELEM sendromudur. ELEM, serebrumun beyaz maddesinde sıvı halindeki nekrotik lezyonların bulunmasıyla karakterize durumdur (Ross ve ark., 1993; Marasas ve ark., 1988; Kriek ve ark., 1981;
Wilson, 1992). ELEM’in ilk belirtileri uyuşukluk, kafa baskısı ve iştahsızlıktır. Bununla birlikte konvülziyon, ataksi ve birkaç gün içinde ölüm şekillenir (Wilson ve ark., 1992). Karaciğer toksisitesi de tespit edilmiştir (Wilson ve ark., 1992). Atlarda yapılan çalışmalar, toksik etkilerin başlangıçta Sa/So oranının yükselmesiyle oluştuğunu (Riley ve ark., 1994) ve kalp damar sistemine yönelik toksik etkilerin de meydana geldiğini göstermektedir (Constable ve ark., 2000). ELEM’e neden olan minumum doz 10-22 mg FB1/kg
c.a.’ya eşittir (Ross ve ark., 1994; Eriksen ve Alexandr., 1998). Atlar için tahmin edilen 0,2 mg FB1/kg ca’ dır. Meksika’da yapılan bir çalışmada (Rosiles ve ark., 1998); eşeklerde ELEM’e neden olan gıdalardaki FB1 0,67-13,3 mg/kg olarak tespit edilmiştir. Bu miktar 0,01-0,26 mg/kg c.a.’ya eşittir. Bununla birlikte yemde başka mikotoksinlerin bulunabileceği de düşünülmelidir.
Çiftlik hayvanlarındaki hastalıklarda yemlerde F.verticillioides (F.
moniliforme) kontaminasyonunu gösteren bazı raporlar yayınlanmıştır (Brown ve ark., 1992; Javed ve ark., 1993; Ledoux ve ark., 1992, Weibking ve ark., 1995). Karaciğer ve böbrekteki zehirli etkilere ek olarak bağışıklılığı baskılayıcı etkiler de tespit edilmiştir (Marijanos ve ark., 1991). 10 mg/kg saf FB1 içeren yemlerle beslenen broyler civcivlerinde zehirlenme görüldüğü, kontamine olmuş yemlerle beslenen yumurta tavuklarında alınan miktara bağlı olarak artan bir hastalık ortaya çıktığı tespit edilmiştir. Yumurta üretiminde %20 azalma, siyah yapışkan ishal, kilo kaybı ve gıda alımında azalma, topallık ve %10 oranında ölüm meydana gelmiştir. Fumonisinler, kontamine mısır artıkları veya mısır kültür materyali kullanılarak diğer türlerde yapılan çalışmalarda, zehirlenmenin görüldüğü tüm vakalarda karaciğer ve/veya böbreklerde hasar meydana gelmiştir.
Tavşanlarla yapılan bir çalışmada (Bucci ve ark., 1996) 1,75 mg/kg c.a./gün dozunda saf FB1 sonda edilen 5 gebe tavşanın ikisinin 9 ve 13 gün sonra öldüğü tespit edilmiştir.
1.6.2. Subkronik toksisite
Subkronik etkileri gösterecek şekilde yapılan bir çalışmada (Voss ve ark., 1995) 13 hafta boyunca rat ve fareler 0, 1, 3, 9, 27 veya 81 mg FB1/kg içeren yemlerle beslenmişlerdir. Fumonisin B1 9 mg/kg veya daha yüksek miktarda bulunduğu diyetle beslenen erkek ratlarda dış
medullada yerleşmiş proximal tubule lezyonlar tespit edilmiştir. Bu miktar dişilerde 81 mg/kg olarak belirlenmiştir. Bu lezyonların nitelik olarak 4 haftalık bir çalışmada bulunan lezyonlarla aynı tipte olduğu görülmüştür (Voss ve ark., 1993). Dört haftadan sonra incelenen ratlarda böbrek hasarının insidansı veya şiddetinde farklılık tespit edilmemiştir. Dört hafta 27 mg/kg veya daha fazla beslenen erkeklerde ve 13 hafta 9 mg/kg diyetle beslenen her iki cinsiyet grubundaki ratlarda böbrek ağırlığında nisbi azalma görülmüş, 13 haftadan sonra serum kreatin düzeyi artmış, fakat 4 haftadan sonra 27 mg/kg veya daha fazla FB1 içeren yemle beslenen erkeklerde ve 81 mg/kg FB1 alan dişilerde artış görülmemiştir. Bu araştırmada NOAEL FB1 için 0,2 mg/kg c.a./gün olarak belirlenmiştir. Farelerde, 81 mg/kg FB1 verilendişilerde 13 haftadan sonra karaciğer fonksiyon bozukluğu ile ilgili serum kimyasal bulgusu tespit edilmiştir. Dişi farelerde hepatoksisite görülmemiştir. Her iki cinsiyet grubunda FB1
bağlantılı böbrek lezyonlarına rastlanmamış, sadece dişilerde böbrek üstü korteksinde ( 81 mg/kg ile beslenenlerde) sitoplazmik pigment (muhtemelen ceroid) içeren çok az makrofajlar belirlenmiştir (Voss ve ark., 1995). Bu araştırmada NOAEL FB1 için 1.8 mg/kg ca/gün olarak tespit edilmiştir. Dişi farelerin düşük dozlarda erkeklerden daha az zarara uğradığı ortaya çıkmıştır.
Güney Afrika maymunlarında yapılan bir çalışmada (EHC, 2000), fumonisinleri içeren, %0.5 F.verticillioides kültür materyali diyetlere eklenmiş. 4 yıldan fazla bu diyetlerle beslenen hayvanların karaciğerlerinde hafif derecede fibriyositler ve kan parametrelerinde (vasküler hastalık göstergeleri) değişiklikler belirlenmiştir (EHC, 2000).
1.6.3.Kronik toksisite ve karsinojeneti
Ratlarda yapılan çalışmalarda (Marasas ve ark., 1984; Jaskicwicz ve ark., 1987; Eriksen ve Alexandr, 1988) rasyonda %4 ya da %5 F.
verticillioides bulunması durumunda olumsuz etkilerin geliştiği, özellikle 23-27. aydan sonra karaciğere yönelik olumsuz etkilerin arttığı tespit edilmiştir. Bu konuda yapılan bir çalışmada (Gelderblom ve ark., 1991), 26 aylık bir süreç içerisinde 25 rat 50 mg/kg FB1 içeren yarı saflaştırılmış mısıra dayalı diyetle beslenmiş, kontrol grubundaki ratlar ile birlikte, 6, 12, 20 ve 26 hafta sonucunda her iki gruptan 5 rat öldürülmüştür, FB1 uygulanmış tüm ratlar mikro ve makronodüler siroza yakalanmalarından ve karaciğerdeki hilus’da büyük çapta açılıp yayılan cholangiofibrosis oluşmasından dolayı ölmüş veya öldürülmüştür. Siroz ve cholangiofibrosis ile sonuçlanan patolojik değişiklikler 6 aydan sonra öldürülen ratların karaciğerlerinde tespit edilmiştir. Karaciğer lezyonların şiddeti zamanla artmış ve siroza doğru ilerleyen kronik toksik etkiler görülmüştür. FB1 uygulanan 15 ratın 10’u 18 ve 26 ay arasında primer hepatocellular karsinoma nedeniyle ölmüş veya öldürülmüştür. Hepatocellular karsinomalı 4 ratta kalp, karciğer ve böbreklerde metastaz tespit edilmiştir. Hepatocellular karsinoma dışında FB1, 6 aydan itibaren sürekli olarak cholangiofibrosise neden olmuştur. Bu araştırma FB1’in açıkca karsinojenik olduğunu göstermekte ve kronik karaciğer toksisitesinden karaciğer kanserine doğru ilerleyen bir gelişmeye yol açtığını ortaya koymaktadır.
1.6.4.Genotoksisite
Fumonisin B1 ve FB2’nin belirli miktarlarda uygulanmasıyla yapılan çalışmalarda genotoksik etkilerinin olmadığı gösterilmiştir. Her iki maddenin 100 mg/kg miktarında verilmesiyle yapılan in vivo ya da
ayrı ayrı verilmesiyle yapılan in vitro çalışmalarda (0,04-80 µM/plate FB1 0,04-40 µM/plate FB2) ratlarda DNA üzerinde toksik etki olmadığı belirlenmiştir (Gelderblom ve ark., 1989; 1992).
Fumonisin B1’in DNA üzerinde olumsuz etkilere neden olmadığı bulgusu, 0,5-200 µM yoğunluğundaki primer hepatosit in vitro deneyinde teyit edilmiştir (Norred ve ark., 1990;1992).
1.6.5.Hücre zehiri olarak etkisi
In vitro çalışmalarda FB1’in rat hepatosit, rat hepatoma hücreleri ile köpek ve domuz böbrek hücreleri için orta derecede sitotoksik olduğu görülmüş, buna ilave olarak da FB1’in tavuk makrofajları için sitotoksik olduğu tespit edilmiştir (Eriksen ve Alexandr, 1998).
Maymun böbrek hücrelerinde lipid peroksidasyon, protein ve DNA sentezleri üzerinde yapılan bir çalışmada, FB1’in malondialdehit’in oluşmasında potansiyel bir etkisinin olduğu belirlenmiştir (Abado- Becognee ve ark, 1998).
1.6.6.Üreme ve gelişme üzerine olumsuz etkileri
Fumonosinlerle yapılan in vitro çalışmalarda embriyotoksik etkili olduğu gösterilmiş (Bacon ve ark., 1995; Javed ve ark., 1993), embriyolu tavuk yumurtalarına FB1 enjeksiyonunun, zamanla ve doza bağlı olarak gelişmeyi engelleyici ve öldürücü etkilerinin oluştuğu görülmüştür (Javed ve ark., 1993). Embriyonik değişiklikler;
hydrocephalus, geniş ibikler ve uzamış boyunlar olarak belirlenmiştir. Bununla birlikte orgaların çoğunda patolojik değişiklikler tespit edilmiştir. In vitro olarak düşük miktarda FB1 (0,7 µg/ml) uygulamasının embriyo gelişimi üzerinde olumsuz etkili
olduğu belirlenmiştir. Bu durum aynı zamanda 0,5-1,0 µg/ml hidrolize FB1 uygulanan rat embriyolarında da tespit edilmiştir ayrıca bu tip ratların embriyolarında FB1’in belirli miktarlarda ve şekillerde uygulanmasına bağlı olarak büyüme ve gelişmenin engellendiği ortaya çıkmıştır (Flynn ve ark., 1994). Organların oluşumu safhasındaki rat embriyosu (10,5 gün) için FB1’in zararlı etkilerinin daha az olduğu tespit edilmiştir (LOAEL 0,5 µM = 0,4 µg/ml) (Jhonson ve ark., 1994). Fumonisin B1 (0,2 µg/ml veya daha yüksek miktarlarda) tavuklarda embriyo döneminde retina hücrelerinin gelişmesini engellemektedir, bu türden etkiler özellikle erken embriyo döneminde daha fazla görülmektedir (Bradlaw ve ark., 1994).
CD1 faresi, Suriye hamsteri, Sprague-Dawley veya 344 ratları, Yeni Zelanda tavşanı ve minklerde yapılan in vivo çalışmaların çoğunda sadece maternal toksisiteye neden olabilecek dozlarda üreme ve/veya gelişime üzerinde olumsuz etkiler söz konusudur. Suriye hamsterlerinde 12-18 mg/kg c.a./gün doz seviyesinde FB1’in gelişimsel bozukluklara neden olduğu, ancak maternal toksisitenin söz konusu olmadığı belirtilmiştir (Laborde ve ark., 1997; Voss ve ark., 1996; Collins ve ark., 1998).
1.6.7. Bağışıklık sistemine yönelik olumsuz etkiler
Ratlarla yapılan bir çalışmada (Eriksen ve Alexandr, 1998); Dİ 7,5 mg/kg c.a. dozunda FB1 verilmesinden sonra timus ağırlığı ve timus nekrozlarında azalma ve immunglobulin M düzeyinde artış meydana gelmiştir. Sphingomiyelin ürünleri ve FB1, T lenfosit yüzey hareketini etkilemekte, lenfositin değişik alt populasyonları arasındaki dengeyi bozmakta ve in vivo olarak T-bağımlı antijenlere karşı oluşabilecek immun tepkimesiyi bastırmaktadır (Martinova ve ark., 1998).
1.6.8. Sinir sistemi üzerine etkileri
Ratlarla yapılan bir çalışmada (Kwon ve ark., 1997), deri altına enjekte edilen FB1’in beyin dokularında Sa/So oranının yükselmesine ve myelin depolanmasının azalmasına neden olduğu tespit edilmiştir.
Gelişmekte olan ratların merkezi sinir sistemindeki sphingolipid metabolizması FB1’e karşı hassastır. Bu durum ratlarla yapılan bir çalışmada (Kwon ve ark., 1997) daha belirgin bir şekilde ortaya çıkmıştır. 0, 0.4 veya 0,8 mgkg c.a. dozunda FB1 verilen ratların corpus callosumlarında myelin birikmesi ve 2’, 3’-cylic nükleotid 3’- fosfohidrolaz’ın önemli ölçüde azaldığı görülmüştür.
1.6.9. Kalp damar sistemi üzerine etkiler
Fumonisinlerin kalp damar sistemine yönelik toksik etkilerinin varlığı başlangıçta kronik araştırmalarda tespit edilmiştir. Bu araştırmalarda; F.verticilioides ile beslenen baboon’larda akut konjestif kalp yetersizliği ve domuzlarda kalpte sağ hipertrofi ve akciğer arterlerinde orta hipertrofi meydana geldiği belirlenmiştir (Casteel ve ark., 1994; Harvey ve ark., 1996).
Anestezi altında ve anestezi olmaksızın melez domuzlarda (30-36 kg) kısa süreli FB1 uygulamasının kalp damar sistemine yönelik etkilerinin araştırıldığı bir çalışmada (Smith ve ark., 1996), fumonisin (≤20 mg/kg FB1 ve FB2) içeren kültür materyali domuzların yemine 7 gün süreyle ilave edilirken, kontrol grubu fumonisin içermeyen bir diyetle beslenmiş; fumonisin ile beslenen domuzlarda azalan kalp hızı, kardiak output ve miks toplar damar oksijen tansiyonun eşlik ettiği ortalama pulmonar arterial basınçta önemli bir artış görülmüştür. EKG’nin normal olduğu ve PPE’nin görülmediği sonuçlar; damar daralmasının neden olduğu pulmonar hipertansiyon
ve FB1 zehirlenmesi için erken bir olgu olabileceğini göstermektedir.
Uzun bir periyotta F. verticillioides ile kontamine mısır (yaklaşık 0,15 ve 0,30 mg/kg c.a./gün) dozunda FB1 ile beslenen insan dışı primatlar’da; dozla bağlantılı kolesterol seviyeside artış ile karaciğer tahribatının varlığı belirlenmiştir. Bu değişmeler artan Sa/So yoğunluğunun oluşturduğu kalsiyum kanalarının engellenmesi ile uyumludur. Domuzlarda fumonisin nedenli pulmonar ödemlere, değişen sphingolipid sentezlerinin neden olduğu ve bu durumunda sol taraflı akut kalp yetmezliği ile sonuçlandığı görülmektedir (Fincham, 1992; Nair, 1998).
1.6.10.Zehirleyici etkilerin etiyolojisi
Kısmen hepatektomize olmuş erkek fisher ratlarda sonda ile tek doz verilen FB1 (50 ve 100 mg/kg ca) rat karaciğerinde kansere neden olmamıştır (Gelderblom ve ark, 1992). Yine ratlarda yapılan seri doz tepkili bir çalışmada, 21 gün üzerinde kanser etkisi için en düşük seviyesinin 250 mg/kg olduğu belirtilmiştir. Yem alımı hesaplarına dayanarak kanser için etkili doz seviyesinin maruz kalınan zamana bağlı olduğu bildirilmiştir. Bu miktarlar; 21 gün üzerinde 14,2 ve 30,8 mg/kg c.a./gün ve 14 gün üzerinde 333 mg/kg c.a/gün olarak tespit edilmiştir (Gelderblom ve ark., 1994).
1.7.İnsanlar üzerine etkileri
Mısır yetiştiren ülkelerden olan Güney Afrika ve Çin’de çok yüksek fumonisin yoğunluğu (118-155 mg/kg) tespit edilirken, bu bölgelerde yaşayan insanlarda fumonisinlerin akut etkileri hakkında belirgin bir değerlendirme yapılmamıştır. Domuzlar, ratlar ve farelerdeki vakalar
gibi, bu durum insanlarda fumonisinlerin düşük akut toksisiteye sahip olduğunu göstermektedir (EHC, 2000; Norred, 1998).
Bununla birlikte Güney Afrika-Transkei’de insan topluluklarında gözlenen çok yüksek yemek borusu kanser insidansları ile çok yüksek miktarlarda ana besin olan mısır ve bu besinde bulunan özellikle FB1 olmak üzere yüksek konsantrasyonda fumonisin alımı arasında bir korelasyon bulunmuştur (IARC 1993; Marasas ve ark., 1988; Sydenham ve ark., 1990; Rheeder ve ark., 1992; EHC, 2000).
Benzer bir şekilde Çin’in Henan şehrindeki insan populasyonunda fumonisin alımı ile yemek borusu kanseri arasında bir korelasyon görülmüştür (Zhen ve ark., 1984; Chu and Lee, 1994; Yoshizawa ve ark., 1994).
Kuzeybatı İtalya (Pardenone şehri), Avrupa’da farenks ve yemek borusu kanserinden ölüm oranın en yüksek olduğu yerdir (EHC, 2000; Pascale ve ark., 1995). Bu durum ile FB1 alımı arasında açık bir korelasyon gösterilememiştir. Çin’de 16 evde mısır gözlemesi ile yapılan bir çalışmada mide, bağırsak kanserlerinde herhangi bir artış görülmemiştir (Groves ve ark., 1999; Turner ve ark., 1999). İnsanlar ile kanser arasında direk olarak tespit edilmiş nedensel bir ilişki yoktur. F.verticillioides’den elde edilen toksinler olarak FB1, FB2, Fusarin C, uluslararsı kanser araştırma örgütünce 2B grubunda (insanlar için muhtemelen karsinojen) sınıflandırılmaktadır. Ancak yine de insanlardaki karsinojenite hususunda yeterli veri bulunmamaktadır (IARC, 1993).
1.8.Fumonisin taramasında kullanılan analitik metodlar
1.8.1.İnce tabaka kromotografisi (İTK)
Kalitatif açıdan iyi bir yöntemdir. Fakat fumonisin seviyelerini ölçmede, kantitatif olarak belirlemede kesin sonuçlar vermemektedir (Anonim, 2002).
1.8.2.Yüksek performanslı sıvı kromotografisi (HPCL)
Fumonisinlerden türetilen zehirli bileşiklerin analizleri için kullanılan en yaygın metottur. Ancak bu metotla yapılan çalışmalarda bazen örneklerde düşük seviyelerde bulunan n-asil fumonisin analogları tespit edilememektedir. İlave olarak yoğun temizleme aşaması gerekmektedir (Anonim, 2002).
1.8.3.Gaz kromotografi/ Kütle spektrofotometri (GC/MS)
Bu metod, esterli kenar zincirinin hidrolizi esasına dayanmaktadır ve fumonisinin kimyasal yapısı üzerindeki trimethylsily veya trifluoroacetate hedef alınmaktadır. Hassas ve seçici olmasına rağmen bu metod pahalı ekipman içermektedir (Anonim, 2002).
1.8.4.Karşılaştırmalı enzim-bağlantısı immünosorbent denemeleri (ELISA)
Uygulanması kolaydır ve yoğun ekipman gerektirmez, FB1’in kalitatif yönden taranmasında ve aynı zamanda kantitatif olarak miktar belirlenmesinde kullanılır (Anonim, 2002).
1.8.5.Capillar zone elektroforez
Fumonisinlerin nitelendirilmesini gerektirmektedir. Mısırda tarama limitleri 50 ppb’dir. Bununla birlikte çok sayıdaki deneysel değişkenlerin sıkı şekilde kontrolünü gerektirir (Anonim, 2002).
1.9.Fumonisinlerin tolerans düzeyleri
Avrupa Birliği tarafından bugüne kadar FB1 kalıntı düzeyleri ile ilgili sistematik bir düzenleme bulunmamaktadır. Ancak genel anlamda bazı düzeyler bilinmektedir (Çizelge 1.2). Mısır ve mısır ünlerinde rastlanan FB1 ile ilgili, çeşitli bölgelerdeki ortalama kalıntı düzeyleri;
latin Amerika’da 0,07-38,5 mg/kg, kuzey Amerika’da 0,004-330 mg/kg, Avrupa’da mısırda 0,007-250 mg/kg ve mısır ürünlerinde 0,008-16 mg/kg, Afrika’da 0,02-8,85 mg/kg ve Asya’da 0,01-153 mg/kg arasında değişmektedir (EHC, 2000).
Fumonisilerle ilgili çeşitli ülkelerde tespit edilen kalıntı miktarları Çizelge 1.2’de verilmiştir. .
Çizelge 1.2.Çeşitli ülkelerde tespit edilen mısır ve mısır ürünlerindeki fumonisin düzeyleri (EHC, 2000)
Ülke adı Fumonisin miktarı (mg/kg)
Kanada 0,017-0,089 ABD 0,08 İsviçre 0,03 Hollanda 0,006-7,1 Güney Afrika 14-440
Çizelge 1.3.FDA tarafından belirlenen yemlerde ve gıdalarda bulunmasına izin verilen maksimum fumonisin düzeyleri (FDA/CFSAN 2001)
İnsan Yiyecekleri
Ürün Toplam Fumonisin
(FB1+FB2+FB3) Kuru öğütülmüş mısır ürünlerinde 2 ppm Germ tabakası kısmen ya da tamamen
uzaklaştırılmış, Kurutulmuş mısır ürünlerinde 4 ppm Kuru ve öğütülmüş mısır kepeğinde 4 ppm Mısır ürünlerinin üretiminde kullanılacak
temizlenmiş mısırlarda 4 ppm
Patlamış mısırda kulanılacak mısır
hammaddesinde 3 ppm
Mısır ve mısır ürünlerinden üretilen hayvan
yemleri Bu yemlerde bulunabilecek
toplam fumonisin miktarları (FB1+FB2+FB3)
Tek tınaklı ve tavşan yemi 5 ppm
Domuz ve kedibalığı yemi 20 ppm
Besi hayvanları (gevişen, kanatlı ve mink) yemi 30 ppm Kesimlik 3 aylıktan küçük ruminant ve derisi
için yetiştirilen mink yemi 60 ppm
Kesim için yetiştirilen kanatlı yemi 100 ppm Diğer tüm çiftlik ve evcil hayvanlar yemi 10 ppm
Mikotoksinlerle ilgili olarak, başta aflatoksinler olmak üzere, diğer birçok toksinin yem ve yem hammaddelerindeki varlığına ilişkin tarama niteliğinde çok sayıda çalışma yapılmıştır. Bununla birlikte, FB1 ile ilgili ülkemizde yapılan çalışmaların sayısı çok sınırlı kalmış, mevsimlere yönelik bir değerlendirme ise yapılmamıştır. Ankara ve civarında da bu yönde bir tarama yapılmamıştır. Bunlardan hareketle böyle bir çalışmanın yapılması planlanmış ve gerçekleştirilmiştir.
2.GEREÇ ve YÖNTEM
2.1.Gereç
2.1.1.Kanatlı Yem Numuneleri
Çalışmada 80 adet kanatlı yem çeşidi kullanıldı. Bu yemler, dört mevsimi temsil edecek şekilde üçer aylık arayla ve her periyotta 20 adet olmak üzere Ankara ve çevresinde üretim yapan yem fabrikalarından temin edildi. Bu fabrikaların yem üretim miktarları aylık 20-1000 ton arasında değişmekte olup hammaddeleri Ankara dışından temin edilmektedir. Yemlerin içeriği; %50 mısır, %10 buğday, %25 soya fasülyesi küspesi, %5 mısır gluteni ve %4 soya yağından oluşmaktaydı. Numunelerin alındığı dönemler aşağıdaki gibidir.
1.Dönem: Ocak 2004-Mart 2004 2.Dönem: Nisan 2004-Haziran 2004 3.Dönem: Temmuz 2004-Eylül 2004 4.Dönem: Ekim 2004-Aralık 2004
Numuneler bu zaman dilimlerinde 500’er gram olacak şekilde toplandı. Numuneler uygun ortamlarda (buzdolabında) depolandı.
Toplama periyotlarının ardından analizler yapıldı.
2.1.2.Araçlar
1. Terazi 2. Balon joje
3. Süzgeç kağıdı (Whatman No:1) 4. Mezür
5. Cam huni 6. Deney tüpleri
7. Parafilm
8. Otomatik pipet (100-1000 µl’lik-Gilson) 9. Otomatik pipet (10-100 µl’lik-Gilson)
10.Otomatik pipet ucu (1000 µl’lik, mavi renk-Gilson) 11.Otomatik Pipet ucu (100 µl’lik, sarı renk-Gilson)
12.ELISA Reader (Organon Teknika-Microwell System Typ. 12420)
2.1.3.Kimyasal Maddeler
1. Fumonisin kiti (RIDASCREEN®FAST Fumonisin-r-biopharm)
a) 1 adet 48 kuyucuklu mikroplate (Enine 6, boyuna 8 kuyucuk)
b) 5 adet fumonisin standartı (her biri 1,3 ml olmak üzere 0 ppm, 0,222 ppm, 0,666 ppm, 2 ppm ve 6 ppm)
c) 1 adet konjugat (3 ml peroksidaz konjugatlı fumonisin) d) 1 adet fumonisin antikoru (3 ml)
e) 1 adet substrat/kromojen (6 ml)
f) 1 adet stop solüsyon (6 ml 1 N sülfrik asit) 2. Metanol (Merck Art.No: 1.06008)
3. Distile su
2.1.3.Yöntem
Analizler ELISA yöntemiyle ve Rida Screen Fast Fumonisin, r-Biofarm fumonisin kiti kullanılarak yapıldı (Anonim, 2004). Söz konusu kitin FB1 için %100 duyarlılık gösterdiği ifade edilmiştir.
İlk olarak numunelerden 5 g alındı, üzerlerine 25 ml metanol ilave edilerek karıştırıldı, karışım süzgeç kağıdından (Whatman No:1) geçirilerek deney tüplerine aktarıldı, süzülen ekstrakt 1:14
oranındaki distile su ile sulandırıldı (örneğin; 100 µl ekstraksiyona 1,3 ml su ilave edildi). Bu numuneler 50 µl alınarak ELISA Reader’a okutuldu.
Kit içerisinde bulunan fumonisin standartları kullanılarak standart oranları belirlendi. Ölçümler 450 nm’de fotometrik olarak gerçekleştirildi ve sonuçlar absorbans değeri şeklinde alındı.
Yöntemin ortalama en düşük duyarlılık limitinin 0,222 mg/kg (ppm) olduğu tespit edildi.
Bu yöntemin esası antijen-antikor reaksiyonuna dayanmaktadır.
Mikroplate’deki kuyucukların çeperleri doğrudan fumonisinler için özel, tavşan kaynaklı antijen spesifik antikorlarla kaplanmıştır. İlk olarak 5 adet standart numuneden ve ekstrakte örneklerden 50 µl alındı; her biri birer kuyucuğa olmak üzere mikroplate uygulandı.
Her numune ve standartlar için farklı mikropipet ucu kullanıldı.
Üzerlerine 50 µl peroksidazla konjuge edilmiş enzim konjügat ilave edildi; antikorlara bağlanmanın tamamlanabilmesi için kuyucuklara fumonisinlere duyarlı spesifik antikorlardan (anti-fumonisin antibody solüsyonu) 50 µl eklendi. Oda ısısında inkubasyona bırakıldı.
İnkubasyon sırasında, kuyucuktaki antijenler anti-fumonisin antikorlarına spesifik olduğu için bu aşamadan sonra anti-fumonisin antijenleri kuyucuktaki antikorlara bağlandı. Ortamda hazır bulunan konjugat ve varsa fumonisin, kuyucuktaki antikorlara bağlanmış olan anti-fumonisin antikorlarına bağlandı. Konjugatın bağlanma oranı ne kadar yüksekse ortamdaki fumonisin miktarı da o kadar az demektir. Bu etkileşmenin gerçekleşebilmesi için 10 dk beklenildi. Bu süreç sonrasında bağlanmayan analitlerin ortamdan uzaklaştırılması için kuyucuklar distile su ile yıkandı. Yıkanan kuyucuklar 1-2 saniya çalkalandıktan sonra içindeki su kuyucuklar arası bulaşmanın önlenmesi amacıyla 45º açı ile tek hamlede boşaltıldı. Bu işlem 3 kez tekrarlandı.
Sıvının tamamen boşaltıldığından emin olduktan sonra her bir kuyucuğa 100 µl substrat/kromojen (peroksidaz enziminin HRP- Horseradish Peroksidaz-substratı; TMB –Tetrametilbenzidin-) eklendi.
Bu substrat kuyucuklara bağlanan konjugatlara (peroksidazla konjuge fumonisinlere) bağlanır. Substrat kromojenle bağlı olduğu için ne kadar çok bağlanma olursa ortamın rengi o kadar yoğun olur.
Bu renk turkuazdır. Rengin yoğunluğunun fazla olması ortamda fumonisin varlığının az olduğunu gösterir. Fazla miktarda fumonisin bulunması halinde ise kuyucukların rengi berrak beyazdır. Bu ilavenin ardından 5 dk süre ile oda ısısında kuyucuklar inkübasyona bırakılır. Substart/kromojen güneş ışığına duyarlı olduğu için bekleme sırasında kuyucukların bulunduğu ortamın karanlık olması gerekmektedir. Bu beklemenin ardından reksiyonu durdurmak için her bir kuyucuğa 1 N sülfirik asitten oluşan stop solüsyondan 100 µl eklenir. Bu ilavenin ardından kuyucuklardaki renk yeşilden sarıya dönüşürken, berrak renklerde bir değişim olmaz. Reaksiyonların durmasının ardından 10 dk içerisinde numuneler ELISA Reader’e okutularak 450 nm dalga boyunda absorbansları ölçüldü. Her numunenin yüzdelik absorbansı (Şekil 2.1) sıfır (0) standartlı absorbansın oranına göre hesaplandı.
Kuyucuktaki numunenin absorbansı
Her bir numunenin % absorbansı : ____________________________________________ X 100 Sıfır standartın absorbansı
2.1.4.Standart eğri
Standartlardan elde edilen maksimum standart eğrisinde kuyucukların %’lik absorbansları yardımıyla, numunedeki fumonisin miktarı belirlenmektedir.
% maksimum absorbans
Fumonisin miktarı (ppm)
Şekil.2.1. Analizlerde kullanılan standartlara ait % absorbans miktarları
2.2.İstatistiki hesaplamalar
Çalışma sonucunda elde edilen verilerin istatistiki değerlendirilmesi dönemlere göre ve sıklık dağılımı şeklinde yapıldı. Dört döneme ilişkin veriler varyans analizleri ile karşılaştırıldı. Yine dönemlere göre ve toplam olacak şekilde sıklık dağılımı, en alt-en üst değerler ortalama ve standart sapmaları hesaplanarak çalışma sonuçları değerlendirildi.
3.BULGULAR
Analizlerin ilk aşamasında, fumonisin standartları ELISA Reader’e okutularak tutunma oranları belirlendi ve numunelerden elde edilen sonuçlar bu değerlerle karşılaştırıldı. Standartlara ait oranlar Çizelge 3.1 ve Çizelge 3.2 de verildi.
Çizelge 3.1.İlk altı ayda toplanan numuneler için standart çalışması Sıra no Standart
konsantrasyonu (ppm)
Absorbans miktarı
Absorbans yüzdeleri
(%)
Hesaplanan Fumonisin
miktarı (ppm)
Sapma oranı
(%)
1 0.0 1.808 100.0
2 0.222 1.244 68.8 0.176 20.9
3 0.666 0.786 43.5 1.173 76.1
4 2.0 0.616 34.1 2.40 20.0
5 6.0 0.529 29.3 3.59 40.2
Çizelge 3.2.İkinci altı ayda toplanan numuneler için standart çalışması Sıra no Standart
konsantrasyonu (ppm)
Absorbans miktarı
Absorbans yüzdeleri
(%)
Hesaplanan Fumonisin
miktarı (ppm)
Sapma (%)
1 0.0 1.092 100.0
2 0.222 0.648 59.3 0.191 13.8
3 0.666 0.352 32.2 0.819 22.9
4 2.0 0.190 17.4 2.4 17.7
5 6.0 0.119 10.9 4.8 20.6
Üçer aylık periyotlarla toplanılan fumonisin örnekleri dönem sırasına göre ELISA Reader’a okutuldu ve bu dönemlere ait ortalama fumonisin değerleri ile alt ve üst sınırları tespit edildi. Buna göre, I.Döneme (Ocak-Şubat-Mart) ait 20 numune içerisinde varlığı tespit
edilen fumonisin miktarlarının ortalama değerinin 0,945±0,76 ppm, en düşük fumonisin miktarının 0,23 ppm, en yüksek fumonisin miktarının ise 3 ppm, II. Döneme (Nisan-Mayıs-Haziran) ait 20 numune içerisinde varlığı tespit edilen fumonisin miktarlarının ortalama değerinin 1,143±1,91 ppm, en düşük fumonisin miktarının 0,26 ppm, en yüksek fumonisin miktarının ise 6,02 ppm, III. Döneme (Temmuz-Ağustos-Eylül) ait 20 numune içerisinde varlığı tespit edilen fumonisin miktarlarının ortalama değerinin 1,289 ppm, en düşük fumonisin miktarının 0,24 ppm, en yüksek fumonisin miktarının ise 3,60 ppm, IV. Döneme (Ekim-Kasım-Aralık) ait 20 numune içerisinde varlığı tespit edilen fumonisin miktarlarının ortalama değerinin 1,675 ppm, en düşük fumonisin miktarının 0,30 ppm, en yüksek fumonisin miktarının ise 3,00 olduğu tespit edildi. Belirlenen bu sonuçlar Çizelge.3.3 de gösterildi.
Çizelge 3.3. Yapılan analizler sonucunda numunelerde tespit edilen fumonisin düzeyleri
I. Dönem
(Ocak-Şubat- Mart)
II. Dönem (Nisan-Mayıs-
Haziran)
III. Dönem (Temmuz- Ağustos-Eylül)
IV. Dönem (Ekim-Kasım-
Aralık)
Toplam Fumonisin B1
(ppm)
0,945 ± 0,76 0,23 – 3,00
1,143 ± 1,91 0,26 - 6,02
1,289 ± 1,16 0,24 - 3,60
1,675 ± 0,85 0,30 - 3,00
Analiz edilen numunelerde bulunan fumonisin miktarlarının ortalama değerlerinin yıl başından yıl sonuna doğru artan bir seyir izlediği görülmektedir. En düşük fumonisin miktarı 0.23 ppm olarak I. Dönemde; en yüksek fumonisin miktarı ise 6,02 ppm olarak II.
Dönemde tespit edildi. Numunelerde tespit edilen fumonisin
miktarlarının dönemlere ait değişim grafiği Şekil 3.1’de gösterildi.
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8
I.Dönem II.Dönem III.Dönem IV.Dönem
Şekil 3.1. Fumonisin miktarlarının mevsimsel değişim grafiği
Yapılan analiz sonuçlarına göre; I.dönemde 20 numunenin 19’unda (%95) fumonisin bulunduğu tespit edildi; fumonisin miktarının bu numunelerin 13’ünde 0,2-1 ppm, 4’ünde 1-2 ppm ve 2’sinde ise 2-5 ppm arasında olduğu görüldü. II.Döneme ait 20 numunenin 9’unda (%45) fumonisin bulunduğu tespit edildi, fumonisin miktarının bu numunelerin 7’sinde 0,2-1 ppm arasında, 1’inde 1-2 ppm arasında, 1’inde ise 5 ppm’den fazla olduğu görüldü. III.Döneme ait 20 numunenin 7’sinde (%35) fumonisin varlığı tespit edildi, fumonisin miktarının bu numunelerin 3’ünde 0,2-1 ppm, 3’ünde 1-2 ppm, 1’inde ise 2-5 ppm arasında değiştiği görüldü. IV.Döneme ait 20 numunenin 18’sinde (%90) fumonisin bulunduğu tespit edilmiş, fumonisin miktarının bu numunelerin 4’ünde 0,2-1 ppm, 7’sinde 1-2 ppm, 7’sinde ise 2-5 ppm arasında değiştiği görüldü. Toplam olarak
80 numunenin 53’ünde (%66) fumonisin bulunduğu tespit edildi.
Numunelerde fumonisin varlığına rastlanılma sıklığı ile ilgili sonuçlar Çizelge 3.4’de gösterildi.
Çizelge 3.4. Analiz edilen numunelerde fumonisin rastlanma sıklığına bağlı frekans dağılım tablosu
Frekans
ppm fumonisin aralığına göre rastlanma sıklığı Dönem Örnek sayısı Pozitif (%) 0,2-1 1-2 2-5 >5
Aralık (en alt- en üst)
(ppm)
Ortalama ± standart sapma
(ppm)
I.Dönem 20 19 (95) 13 (68) 4 (21) 2 (11) - 0.229-3.0 0.945±0,76
II.Dönem 20 9 (45) 7 (78) 1 (11) - 1 (11) 0.263-6.20 1.143±1.91
III.Dönem 20 7 (35) 3 (43) 3 (43) 1 (14) - 0.236-3.6 1.289±1.16
IV.Dönem 20 18 (90) 4 (22) 7 (39) 7 (39) - 0.295-3.0 1.675±0.85
Toplam 80 53 (66) 27 (51) 15 (28) 10 (19) 1 (2) 0.229-6.20 1.272±1.12
4.TARTIŞMA
Mikotoksinler, çeşitli mantar türleri tarafından sentezlenen, insan ve hayvanlar tarafından alındıkları zaman, latent, akut veya kronik karakterde zehirlenmelere neden olan kimyasal maddeler veya metabolitlerdir. Tahıllar, yağlı tohumlar ve karma yem çeşitlerinin tek hücreli mantarların invazyonuna uğraması sonucunda küflenmeler bütün dünyada sık sık karşılaşılan doğal bir kirlenme olgusudur.
Mikotoksin oluşturan mantarlar dünyanın her tarafında yaygın şekilde bulunurlar. Gerek sahada gerekse harmanlama, depolama, taşıma ve hazırlama sırasında şartlar (özellikle ısı ve rutubet) mantarların gelişmesine uygun olduğu taktirde, tarım ürünleriyle bunlardan hazırlanan yem ve besinler mantarların istilasına uğrayarak mikotoksinlerle kolayca kirlenebilirler. Bu kirlenmelerin doğurduğu olayların hayvanlarda özellikle farkına varılmadan seyretmesi, gerek hayvan sağlığı ve ekonomik işletmecilik yönünden gerekse kalıntıları vasıtasıyla doğuracakları toplum sağlığı riski bakımından günümüzde en çok ilgi doğuran konuyu oluştururlar.
Fumonisinler başta F. verticillioides ve F. proliferatum olmak üzere, çok sayıda Fusarium türü mantar tarafından hazırlanan mikotoksinlerdir; mantarlar özellikle 20ºC ısı ve >%60 nispi nemde toksin üretmeye başlarlar. Fumonisinler genellikle ürün çeşiti olarak mısırda ürer ve mikotoksin hazırlarlar. (Kaya ve ark., 2002, EHC, 2000, NTP, 1999). Doğada en fazla bulunan fumonisin türü 1988 yılında keşfedilen FB1’dir ve dünyanın birçok yerinde (ABD, Kanada, Güney Afrika, Nepal, Avustralya, Tayland, Filipinler, Endonezya, Meksika, Fransa, İtalya, Polonya ve İspanya) mısır ve mısır kökenli gıdalarda doğal bulaşıcı olarak bulunmaktadır. Yapılan çalışmalarda FB1’in tarım ürünlerinde büyük ölçüde kayıplara yol açtığı ayrıca
insanlarda yemek borusu kanseri ile ilişkili olduğu düşünülmektedir.
Fumonisin B1’in karaciğerde zehirli etkili ve karsinojenik etkili özellikleri kanıtlanmıştır. Fumonisin B1’in deney hayvanları için nefrotoksik, immünodepresan ve embriyotoksik olduğu da gösterilmiştir (Voss ve ark., 1990; Nair, 1998; Sweney and Dobson, 1999).
Fusariumlar üründe koloni halinde bulunmasına rağmen, fumonisin üremesi her zaman için söz konusu olmaz. Fumonisin gelişmesini teşvik eden faktörler tam olarak açıklanamamıştır. Bununla birlikte ılık ve yağışlı dönemlerden sonraki kuraklık durumu bu üreme için özellikle önemlidir. Aynı şekilde insektlerin üründe bulunması durumu da yardımcı bir faktör olarak değerlendirilir.
Ülkemizde fumonisin ile ilgili çalışmalar oldukça sınırlı kalmış, kalıntı miktarları ile gıda maddelerinde ve özellikle yemlerde, yem üretiminde kullanılan ham maddelerde bulunan fumonisinin, zararlı bir sonuç doğurmayacak miktarları henüz belirlenmemiştir.
Beyazit (2003) tarafından yapılan bir çalışmada, Konya ilinde yem üretiminde kullanılan mısır hammaddelerinde FB1 varlığı araştırılmıştır. Araştırma sonucunda, analiz edilen numunelerin
%63’ünde ortalama 0,952±0,204 ppm FB1 tespit edilmiş ve belirlenen miktarların hayvan ve insan sağlığı açısından herhangi bir olumsuzluğa yol açmayacağı belirtilmiştir.
Omurtag (2001) tarafından yapılan bir çalışmada ise, İstanbul’da piyasada bulunan mısır ve mısır ürünlerinde fumonisin araştırılmış;
ve analiz edilen numunelerin %25’inde 0,25-2,66 ppm arasında değişen miktarlarda FB1, numunelerin sadece birinde de 0.55 ppm FB2 tespit edilmiştir.
Sonal ve Oruç (2000) tarafından yapılan bir çalışmada, Bursa ve yakın çevresindeki tavuk çiftliklerinden alınan 27 yem örneğinde total fumonisin düzeyleri belirlenmiş ve ortalama fumonisin düzeyinin 188±25.38 µg/kg olduğu saptanmıştır. Fumonisin rastlantı oranının
%100 olduğu çalışmada, yem numunelerindeki fumonisin miktarının bireysel olarak tavukların sağlık ve verimliliklerinde bir risk oluşturmayacak seviyede olduğu belirtilmiştir.
Akar ve ark. (1999) tarafından yapılan çalışmada, Aydın ilinde üretilmiş 100 adet mısırda fumonisin kalıntısı araştırılmış, numunelerin birisinde atlarda ELEM hastalığına yol açabilecek düzeyde (8000 ng/g) FB1’e rastlanılmıştır.
Fumonisinlere yönelik kapsamlı bir risk değerlendirmesinin yapılması insan ve hayvan sağlığı açısından son derece önemlidir. Özellikle mısır ve mısır esaslı ürünlerin fumonisinlerle kontaminasyonu pek çok ülkede görülmektedir. Yüksek oranda kontamine olmuş mısırın tüketilmesi, bu bölgelerdeki insanlarda görülen gırtlak kanseri rastlanma sıklığıyla yakından ilgili olduğu düşünülmektedir.
Fumonisin hazırlayan mantarların üremesini ve gelişmesini sağlayan faktörler tam olarak bilinmemektedir; dolayısıyla, ülkelere ve farklı iklim şartlarına göre bu toksinin bulunma sıklığı da değişkenlik göstermektedir.
İran’da farklı coğrafi alanlardan elde edilen mısırlarda yapılan bir çalışmada fumonisinler yönüyle analiz yapılmıştır. Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi ile yapılan analizlerde FB1 miktarı 197-9661 µg/g olarak bulunmuştur. Bu miktarda fumonisin üretecek şekilde F.verticilloides ve F.proliferatum mantar çeşidi olarak tespit edilmiştir (Ghiasian ve ark., 2005). Yine İran’da yapılan bir çalışmada mısırlarda FB1 taraması yapılmıştır. 1999 senesinde İran’ın iki bölgesinden toplanan mısırlarda analizler yapılmıştır. Analiz edilen
20 mısır örneğinin hepsinin 3.18 mg/kg (0.68-7.66) oranında FB1 ile kontamine olduğu saptanmıştır (Shephard ve ark. 2002).
Bir başka çalışmada Mısır’ın farklı bölgelerinden toplanan 57 mısır ve mısır ürününde Fusarium grubu mantarların mikotoksinleri incelenmiştir. Mısır çeşitlerine göre değişmekle beraber FB1
rastlanma sıklığı %28.57-80, miktarı da 10-780 µg/g arasında tespit edilmiştir (El-Sayed ve ark., 2003).
Trigo-Stockli ve ark. (2002) tarafından yapılan tarama niteliğindeki çalışmada Amerika’da 1995-1996 yıllarında farklı bölgelerden toplanan mısır örneklerinde fumonisin analizleri yapılmıştır. Çalışma sonunda örneklerin %9’unun ≤1 µg/g; %25-30’unun 1–5 µg/g ve
%65’inin de >5 µg/g düzeyinde FB1 içerdiği tespit edilmiştir.
Güney Afrika’da farklı bölgelerde yapılan çalışmada mısırlarda FB1
kirliliği araştırılmıştır. Bölgelere göre değişmekle beraber, kırsal alanlardan toplanan 50 mısır örneğinden % 32’sinde 0.1-22.2 mg/kg arasında FB1; 28 pişirilmiş mısır örneğinin % 29’unda, 0.1-0.4 mg/kg arasında FB1 tespit edilmiştir (Chelule ve ark., 2001).
Mallmann ve ark., (2001) tarafından yapılan bir çalışmada, Güney Brezilya’da tahıl ve besinlerdeki FB1 varlığının tespiti için, ocak 1996 ve temmuz 1998 dönemleri arasında farklı yem fabrikalarından temin edilen toplam 407 yem numunesi üzerinde çalışılmış ve bu numunelerin %32.2’sinde 0,086-78.92 µg/g arasında FB1 bulunduğu tespit edilmiştir. İçerisinde bu miktarlarda FB1 bulunan gıda maddelerinin fazla tüketilmesinin insan ve hayvan sağlığı açısından risk taşıyabileceği bildirilmiştir.
Kim ve ark., (2001) tarafından Güney Kore’nin başkenti Seul’de mısırdan üretilen 76 çeşit besin maddesinde ELISA ve HPCL yöntemi ile FB1 tespit amacıyla yapılan bir çalışmada, konserve mısır
ürünlerinde FB1 bulunmazken, özellikle mısır gevreklerinde FB1
tespit edilmiş, ancak tespit edilen miktarların insan sağlığı açısından risk taşıyacak seviyede olmadığı bildirilmiştir.
Bir başka çalışmada (Scudamore ve Patel, 2000) İngiltere’ye ithal edilen mısırlarda aflatoksin, okratoksin, zearalenon ve fumonisinlere yönelik analizler yapılmıştır. Tarama niteliğindeki bu çalışmada 140 ham mısır örneği ile 12 ön işlemden geçmiş mısır incelenmiştir.
Örneklerin % 48’inde fumonisin tespit edilmiştir. Ham mısırın ön işlemden geçirilmesi toplam fumonisin düzeyinde % 32 oranında azalma sağlamıştır.
Bir başka çalışmada ise (Kedera ve ark., 1999) Batı Kenya’da yetişen mısırlarda FB1 seviyeleri ve Fusarium türlerinin varlığı araştırılmıştır.
1996 yılında, Batı Kenya’nın tropik bölgelerindeki küçük çaplı çiftliklerden mısır koçanı örnekleri toplanmıştır. Koçanların kültürü yoluyla, 197 mısır örneği, fusarium enfeksiyonu açısından değerlendirilmiştir. En sık izole edilen F.moliniforme olmuştur.
Yüksek basınçlı sıvı kramotografisi yöntemi ile 197 mısır koçanı örneğinde yapılan inceleme, örneklerin % 47’sinde FB1 tespit edilmiştir; bunların % 5’inin insan tüketimi için önerilen 1000 µg/kg’nin üzerinde olduğu belirlenmiştir.
Guatemala’da iki farklı bölgede mısırlarda fumonisin yönüyle yapılan çalışmada (Meredith ve ark., 1999) FB1 seviyesi bölgelere göre 0.85 µg/g ve 2.2 µg/g olarak bulunmuştur.
Arjantin’de yapılan bir çalışmada ise (Magnoli ve ar., 1999) kümes hayvanları yemlerinde Fusarium türlerine rastlanma sıklığı ve fumonisin düzeyleri yönüyle analizler yapılmıştır. 1996-1998 yılları arasında yapılan tarama niteliğindeki çalışmada Furarium türlerinden F.moniliforme %60.7, F.nygamia %35.4 oranında
belirlenmiştir. Fumonisinler yönüyle yapılan analizlerde ise FB1
miktarı 3.99-5.40 ppm olarak tespit edilmiştir.
Brezilya’nın farklı iki bölgesinde yapılan bir çalışmada (Hirooka ve ark., 1996) mısır içeren yemlerde fumonisin düzeyleri ve mantar çeşidi yönüyle analizler gerçekleştirilmiştir. Çalışma sonunda fumonisin rastlanma sıklığı farklı iki bölge için %97,4 ve %94,8 olarak bulunmuş; ortalama FB1 seviyesi 4,79 µg/g ve 5,09 µg/g olarak tespit edilmiştir.
Tayland’ta yapılan çalışmada (Yoshizawa ve ark. 1996) mısırlarda fumonisin ve aflatoksin varlığı araştırılmıştır. Çalışmada 18 örnek analiz edilmiş ve FB1 rastlanma sıklığı %89 miktar 0.063-18 µg/g (ortalama 1,79 µg/g) olarak bulunmuştur.
Yapılan bir çalışmada (Sanchis ve ark., 1995) İspanya’da marketlerden alınan mısırlarda fumonisin taraması yapılmıştır. Bu amaçla 50 mısır esaslı örnek incelenmiştir. 44 örneğin fumonisinle kontamine olduğu görülmüştür. Kontaminasyon seviyeleri, örneklerde ortalama 400 ng/g ile oldukça düşük seviyede bulunmuştur.
Avrupa’nın farklı ülkelerinden (İtalya, İspanya, Polanya ve Fransa) toplanan mısır, sorgum, buğday, arpa ve karma yem örneklerinde tarama niteliğinde fumonisinler yönüyle analiz yapılmıştır. Fransa’da 1, İtalya’da 10, Polonya’da 15 ve İspanya’da 17 örnekte F.moniliforme izole edilmiş ve FB1 miktarı da 0.7-4100 µg/g olarak tespit edilmiştir (Visconti ve Doko, 1994).
İtalya’da yapılan bir çalışmada (Doko ve Visconti, 1994) mısır ve mısır esaslı yiyeceklerde FB1 ve FB2 kalıntısı araştırılmıştır. Mısır esaslı gıdalarda, en yüksek fumonisin kontaminasyon seviyesi (6.100 µg/g) kabartılmış mısırda belirlenmiştir. Diğer mısır çeşitlerindeki FB1
seviyeleri 0.042-3.760 µg/g arasında bulunmuştur. Test edilen tüm süt mısırı örneklerinde de, 0.060-0.079 µg/g seviyesinde FB1
belirlenmiştir. Bu bulgular, İtalya’da mısır esaslı gıdaların yenmesiyle insanların fumonisine maruz kalma oranının oldukça yüksek olduğunu göstermiştir.
Yapılan bir çalışmada (Rottinghaus ve ark., 1992) Amerika’da 1990 yılında 193 mısır örneği fumonisinler yönünden ince tabaka kromatografisi ile incelenmiştir. Mısır örneklerinin % 15’inde FB1
belirlenmiştir.
Amerika’nın farklı bölgelerinde ortaya çıkan domuzlardaki PPE ve atlardaki ELEM olayları ile fumonisin arasındaki ilişkinin incelendiği çalışmada (Ross ve ark., 1992) domuz yemlerinde 20-360 ppm ve at yemlerinde 8-117 ppm FB1 belirlenmiştir.
Yapılan çalışmada, Ankara çevresinde kanatlı karma yemi üretimi yapan fabrikalardan 1 yıl içerisinde 3 er aylık periyotlarla 4 dönemde toplam 80 numune alındı ve fumonisin düzeyleri yönünden analizleri yapıldı. Seksen numunenin 53’ünde (%66) FB1 tespit edildi. Ortalama FB1 miktarının 1.272±1.12 ppm seviyesinde olduğu görüldü. FB1
tespit edilen 53 numunenin içerisinde en düşük FB1 miktarının 0,229 ppm, en yüksek FB1 miktarının ise 6,02 ppm olduğu belirlendi.
Elliüç numunenin 28’inde tespit edilen FB1 miktarının 1 ppm’in altında, 20’sinde FB1 miktarının 1-3 ppm arasında değiştiği, 3’ünde 3 ppm, 1’inde 3,6 ppm ve 1’inde de 6,2 ppm seviyesinde olduğu tespit edildi.
Çalışma sonuçları literatür verilerle karşılaştırıldığında, elde edilen veriler Beyazit (2003) tarafından yapılan çalışma ile benzerlik göstermektedir. Söz konusu çalışmada fumonisine rastlanma sıklığı
%63 ve düzey 0.952 ppm olarak bulunmuştur. Yapılan bu çalışmada ise rastlanma sıklığı %66 ve miktar 1.272±1,12 ppm şeklinde tespit
