TÜRKĠYE CUMHURĠYETĠ ANKARA ÜNĠVERSĠTESĠ
TIP FAKÜLTESĠ
SIÇAN MODELĠNDE YORUCU EGZERSĠZĠN KARACĠĞER REJENERASYONUNA ETKĠSĠ
Dr. Elvan Onur KIRIMKER
GENEL CERRAHĠ ANABĠLĠM DALI TIPTA UZMANLIK TEZĠ
DANIġMAN
Prof. Dr. Kaan KARAYALÇIN
TÜRKĠYE CUMHURĠYETĠ ANKARA ÜNĠVERSĠTESĠ
TIP FAKÜLTESĠ
SIÇAN MODELĠNDE YORUCU EGZERSĠZĠN KARACĠĞER REJENERASYONUNA ETKĠSĠ
Dr. Elvan Onur KIRIMKER
GENEL CERRAHĠ ANABĠLĠM DALI TIPTA UZMANLIK TEZĠ
DANIġMAN
Prof. Dr. Kaan KARAYALÇIN
ANKARA
2011
KABUL VE ONAY
ÖNSÖZ
Asistanlık hayatımın her aşamasında deneyimlerinden yararlandığım ve engin bilgilerini benden esirgemeyen hocalarıma teşekkür ederim
Uzmanlık tezimin hazırlanması sırasında değerleri fikirleriyle bana yol gösteren tez danışmanlarım Prof.Dr. Sadık Ersöz’e ve Prof Dr. Kaan Karayalçın’a, deneylerin en uygun şekilde yapılabilmesi için elindeki imkanları seferber eden Vet.
Hek. Atilla İşgören’e, histokimyasal incelemelerde emeği olan Uz. Dr. Ayça Karabörk ve Prof. Dr. Esra Erden’e şükranlarımı sunarım.
Moral ve motivasyonumu yüksek tutan sevgilerini hep yanımda hissettiğim aileme ve çalışma arkadaşlarıma teşekkür ederim
Dr. Elvan Onur KIRIMKER
ĠÇĠNDEKĠLER
Sayfa
KABUL VE ONAY ... i
TEŞEKKÜR ... ii
İÇİNDEKİLER ... iii
KISALTMALAR ... iv
ŞEKİLLER DİZİNİ ... v
1. GİRİŞ ve AMAÇ ... 1
2. GENEL BİLGİLER ... 3
2.1. Karaciğer ... 3
2.2. Karaciğer Rejenerasyonu ... 5
2.3. Egzersiz ... 8
3. GEREÇLER VE YÖNTEM ... 12
3.1. Çalışma Tasarımı ... 12
3.2. Deneklerin Bakımı ... 13
3.3. Analjezi ve Anestezi ... 13
3.4. Cerrahi Teknik ... 13
3.5. Egzersiz Protokolü ... 16
3.6. Sakrifikasyon ... 18
3.7. Ölçümler ... 18
3.8. İstatistiksel İnceleme ... 19
4. SONUÇLAR ... 21
5. TARTIŞMA ... 23
6. ÖZET ... 26
7. ABSTRACT ... 28
8. KAYNAKLAR ... 30
KISALTMALAR
AKT : Spesifik olmayan serin-treonin protein kinaz AP1 : Aktivatör protein 1
C3a : Kompleman 3a C5a : Kompleman 5a
c/EBPβ : CCAAT artırıcı bağlanmma proteini DNA : Deoksiribonükleik asit
EGF : Endotelyal büyüme faktörü HGF : Hepatosit büyüme faktörü
IGFBP1 : İnsülin benzeri büyğme faktörü bağlayan protein IL-1ra : İnterlökin-1 reseptör antagonisti
IL-4 : İnterlökin 4 IL-6 : İnterlökin 6 IL-8 : İnterlökin 8 IL-10 : İnterlökin 10 IL-15 : İnterlökin 15 JNK : Jun-termal kinaz
MAPK : Mitojenle aktive protein kinaz NFκB : Nükleer faktör kappa B
pERK : Ekstrasellüler sinyalle düzenlenen kinaz PI3K : Fosfatidilinozitol 3-kinaz
PDGF : Trombosit kaynaklı büyüme faktörü proHGF : Hepatosit büyüme faktörü öncülü TGFα : Dönüşen büyüme faktörü alfa TGFβ : Dönüşen büyüme faktörü beta TGFβ1 : Dönüşen büyüme faktörü beta 1 TNF : Tümör nekroz faktörü
uPA : Ürokinaz benzeri plazminojen aktivatörü VEGF :Vazoendotelyal büyüme faktörü.
ġEKĠLLER ve RESĠMLER
Sayfa ġekil 1 Karaciğerin segmenter anatomisi. A:in vivo ve B: ex vivo
görünüm ... 3 ġekil 2 Karaciğerdeki histolojik yapı ... 5 ġekil 3 Karaciğer rejenerasyonunda etkin yolaklar ... 7 ġekil 4 Egzersizle birlikte plazmada çeşitli sitokinlerin
konsantrasyonlarındaki değişim. ... 9 ġekil 5 Sıçan karaciğer loblarının şematik gösterimi ... 14
Resim 1 Tespit edilmiş anestezi altında Wistar albino sıçan (A), Steril
örtünme sonrası orta hattan yapılmış deri kesisi (B) ... 15 Resim 2 Median lob ve sol lobu içeren %70 hepatektomi materyali ... 15 Resim 3 Superior ve inferior sağ loblar ile anterior ve posterior kaudat
loblardanoluşan hiperplazik rezidü karaciğer ... 16 Resim 4 Sıçanlar için tasarlanmış dört kulvarlı eğimi ve hızı ayarlanabilen
koşu bandı ve kontrol ünitesi ... 17 Resim 5 Koşu bandında egzersiz sırasında sıçanlar ... 17 Resim 6 Hepatositlerde gözlenen belirgin mitotik aktivite (Hematoksilen
Eozin, X200) ... 20 Resim 7 Hepatositlerde nükleer büyüme ve belirgin nükleol ile karakterli
rejeneratif değişiklikler (Hematoksilen Eozin, X200) ... 20 Resim 8 Ki-67 immünhistokimya boyası ile hepatositlerde yaygın nükleer
boyanma (Ki-67, X200) ... 20
1. GĠRĠġ ve AMAÇ
Karaciğer metabolizmada, dağıtılması, detoksifikasyon, enfeksiyondan korunma, gliseminin regülasyonu, pıhtılaşma faktörleri ve enzimler de dahil olmak üzere birçok proteinin sentezi ve burada sayılmayan binlerce fonksiyona sahip bir organdır. Karaciğerin fonksiyonel hacminin kaybolduğu durumlar mevcuttur. Bu durumlar arasında akut hepatitler, cerrahi rezeksiyonlar, intoksikasyonlar sayılabilir.
Ayrıca canlıdan karaciğer transplantasyonlarında da ameliyat sonrası ne alıcının ne de vericinin tam bir karaciğeri vardır. Yukarıda sayılan durumlarda karaciğer insanda aylar içinde vücut ihtiyaçlarını karşılayacak ölçüde hacmini artırır. Bu artış karaciğerdeki hücerelerin proliferasyonu yoluyla gerçekleşir (1). Günümüzde karaciğer yetmezliğinde karaciğer fonksiyonlarını uzun vadede gerçekleştirecek bir cihaz yoktur ve son dönem karaciğer yetmezliğinin tek kesin tedavisi karaciğer transplantasyonudur. Gelişmiş anestezi imkanları ve cerrahi teknoloji ve karaciğer üzerine artmış bilgi birikimi günümüzde geniş boyutlu karaciğer rezeksiyonlarını yapılır hale getirmiştir. Bu durumda kalan karaciğerin yetersiz fonksiyon gösterebilmesi söz konusu olabilmektedir.
İnsanlarda hacim kaybı sonrası karaciğerin kendini yenileme yeteneği çok eski zamanlardan beri bilinmektedir. Ancak yukarıda bahsi geçen durumlarda zaman zaman karaciğerin yetersiz fonksiyon göstermesi karaciğer rejenerasyonu üzerine olan ilgiyi artırmıştır. Karaciğerde rejenerasyonun çok yoldan tetiklenen çok yolaklı bir süreç olduğu görüşü günümüzde ağırlık kazanmış ve rejenerasyona ilişkin mekanizmalar hücresel düzeyde açıklığa kavuşmuştur. Bu yolaklarda HGF, IL-6, TNF, EGF ve TGF’nin etkisi belirgindir (2). Bir çok hormonun ve ilacın karaciğer rejenerasyonu üzerine etkisi incelenmiştir.
Egzersizin sağlık üzerine birçok olumlu etkisi bilinmektedir. Ancak karaciğer rejenerasyonu üzerine etkisini inceleyen pek az çalışma vardır. Akut ya da sürekli egzersizle serumda ve dokularda miktaları artan maddeler arasında karaciğer rejenerasyonunda da etkisi olduğu bilinen maddeler de mevcuttur. Bu durum
hipotetik olarak egzersizin karaciğerin rejenerasyonu üzerinde olumlu etkisi olabileceğini akla getirir. Ancak belirlenemeyen ve rejenerasyona olumsuz etkisi olabilecek başka faktörlerin aracılığıyla egzersizin toplam etkisinin rejenerasyonu hızını değiştirmemesi ya da yavaşlatması söz konusu olabilir.
Egzersizin rejenerasyona etkisinin olduğunun görülmesi, bu etkinin insanlarda da benzer olduğunu gösterebilecek insan deneylerinin yapılmasına yol açabilir. İnsanlarda egzersizin karaciğer rejenerasyonuna olumlu katkısının görülmesi karaciğer transplantasyonu yapılmış, geniş çaplı karaciğer rezeksiyonu yapılmış veya akut hepatit nedeniyle karaciğer fonksiyonel hacminde kayıp gelişmiş hastaların tedavi ve bakımlarında hastaların morbidite ve mortalitelerinde azalmaya ve yaşam kalitelerinde artışa yol açacak değişikler doğurabilir.
Bu çalışmamızda karaciğer rejenerasyonu üzerinde egzersizin olası etkilerinin neler olabileceğini ortaya koymayı amaçladık. Bu amaçla sıçan modelinde oluşturduğumuz hipotezi test ettik.
2. GENEL BĠLGĠLER
2.1. KARACĠĞER
Karaciğer vücudun en büyük iç organıdır ve yaklaşık beden kütlesinin %2’si kadar bir kütleye sahiptir. Karında sağ üst kadrandadır. Karaciğerin bugün bildiğimiz segmenter anatomisinin anlaşılmasında Claude Coinaud’nun çalışmalarının katkısı büyüktür (3). Safra yolları ve vaskülatüre göre bölümleri mevcuttur. İki lob, dört sektör ve sekiz segmentten oluşur. Sağ lob anterior (5. ve 8. segmentler) ve posterior (6. ve 7. segmentler) sektörlere; sol lob lateral (2. ve 3. segmentler) ve medial (4.
segment) sektörlere ayrılır (Şekil 1).
ġekil 1. Karaciğerin segmenter anatomisi. A:in vivo ve B: ex vivo görünüm
Kubbedeki peritonsuz alanda karaciğer gevşek fibröz doku ile diaphragmaya yapışıktır. Ligamentum coronaria dexter ve sinister karaciğerin kubbesindeki peritonsuz alanın anterior ve posteriorundan her iki yana uzanarak ligamentum triangulare dexter ve sinisteri oluşturur ve karaciğeri retroperitoneal alana tespit eder.
Anterior yüzü craniocaudal olarak kat eden ligamentum falciforme hepatis ve
inferiorundaki ligamentum teres ile karın ön duvarına tutunur. Karaciğeri duodenuma bağlayan ligamentum hepatoduodenale, içinde arteria hepatica propria, ductus choledochus, vena porta ile lenfatik dokular ve sinirleri bulundurur
Kanlanması, vena mezenterica superior ile vena lienalisin birleşmesinden oluşan vena portalis ve truncus coeliacusun dalı olan arteria hepatica communisten ayrılan arteria hepatica propria tarafından sağlanır. Karaciğere gelen kan akımının yaklaşık ¾’ü vena porta tarafından gelir. Venöz dönüş vena hepatica dexter, sinister ve media ile vena cavaya doğrudur.
Karaciğer metabolik homeostasisin sağlanmasında önemli fonksiyonlara sahiptir. Glikojen sentezi, glukoneogenez, bilirubinin ekskresyonu, ilaçların dönüşümü; lipoproteinler, akut faz proteinleri, albumin, enzimler ve bir çok proteinin sentezi; besinlerin ve vitaminlerin depolanması ve dağıtımında karaciğer görev alır.
Karaciğerde çeşitli hücreler bulunmakla bunların %80’i hepatositlerdir.
Kalanı, parankimal olmayan hücreler olarak gruplandırabileceğimiz endotelyal hücreler, Kupffer hücreleri, lenfositler ve yıldızsı hücrelerdir. Hepatositler karaciğerin metabolik işlevlerinde esas yükü taşırlar. Endotel hücreleri sinüzoidler ve damarların iç yüzeyini döşer. Kupffer hücreleri sinüsoidlerde fagositoz yapar ve sitokin salarlar. Lenfositler immun sistemin bir parçasıdır. Yıldızsı hücreler ekstraselüler matriks üretir ve A vitamini depolarlar. Karaciğer lobül olarak adlandırılan fonksiyonel birimlerden oluşur. Santralde venin yer aldığı bu yapılanmada ven çevresinde 5-6 adet portal yol yer alır burada arteria hepatica ve vena porta dallarıyla safra kanalları bulunur. Akım sinusoidler aracılığı ile santral vene doğrudur (Şekil 2) (4).
ġekil 2. Karaciğerdeki histolojik yapı.
2.2. KARACĠĞER REJENERASYONU
Karaciğer insan bedeninde rejenerasyon kapasitesine sahip tek organdır.
Aslında ‘rejenerasyon’ kavramı burada amfibilerde olduğu gibi kopan bir üyenin yeniden oluşmasını ifade eden biyolojik karşılığından farklıdır. Cerrahi olarak çıkarılan çıkarılan bir karaciğer lobu yeniden oluşmaz. Ancak organizmanın ihiyaçlarını karşılayacak fonksiyonel hacmini, kalan lobun hiperplazisi yoluyla yeniden kazanır. Burada rejenerasyon kavramının reperasyon –onarım- kavramından farklılığını belirtmekte fayda vardır. Diğer dokularda gerçekleşen onarımda, kaybolan dokunun yerini orijinal dokudan farklı olarak fibrozis dokusu doldururken rejenerasyonda kaybolan işlevsel hacim orijinal dokuya ait hücre tipiyle ve mikromimari korunarak yerine konur. Karaciğerde fonksiyonel parankimin kaybı birçok şekilde gerçekleşebilir. Bu nedenler cerrahi rezeksiyon, viral enfeksiyon, metabolik hastalık, toksik etkenler, vasküler nedenler olabilir. Karaciğerin kendini yenilemesine ait gözlemler bilgilerimize göre ilk kez Yunan mitolojisindeki Prometheus Efsanesi’nde yer bulmuştur (Resim 3). Efsaneye göre Zeus tarafından cezalandırılıp Caucasus Dağı’na zincirlenen Prometheus’un karaciğeri bir kartalın
onu sürekli yemesine karşın kendini yenilemektedir (5). Karaciğerin rejenerasyon yeteneğini deneysel olarak ise ilk kez 1931’de Higgins ve Anderson göstermiştir.
Günümüzde de sıçanlarda benzer teknikle karaciğerin %70’i güvenli bir şekilde rezeke edilebilmektedir (6).
Rejenerasyon sitokinler, büyüme faktörleri ve metabolik yolakların içiçe geçtiği karmaşık bir süreçtir (Şekil 3) (7). Dolaşımda hepatektomi sonrası rejenerasyonu indükleyen büyüme faktörleri bulunduğunu ilk kez hepatektomili ve normal karaciğerli sıçanların dolaşımlarını birleştiren (parabiosis) ve normal karaciğerde hepatosit replikasyonunu gören Moolten ve Bucher bildirmişlerdir (8).
Bu süreç parankim kaybı sonrası dakikalar içinde başlar ve sıçanlarda günler boyu, insanlarda aylar boyu devam eder. Taub karaciğerin proliferatif yanıtını gösteren NF- κB, STAT3 ve AP1 gibi özel trinskripsiyon faktörlerinin parsiyel hepatektomi sonrası kalan dokuda dakikalar içinde aktive olduğunu bildirmiştir (9). Büyüme faktörlerinden HGF, EGF ve TGF ve sitokinlerden IL-6 ve TNFα bu faktörlerden önde gelenleridir.(1)Bu faktörler reseptörlerine bağlanıp, transkripsiyona giden intraselüler yolakları aktive eder ve mitoz için gereken protein sentezi gerçekleşir.
Büyüme faktörlerini sitokinlerden ayıran en önemli fark sitokinlerin mitozla doğrudan ilişkili olmayan hücre içi yolları aktive etmeleridir. Ayrıca amphiregulin, insülin, glukagon, serotoninin de rejenerasyonda rol oynadığı öne sürülmektedir (10- 12). Onarım hiperplazi ile olacağından hücrelerin mitoz bölünmeye girmeleri gerekmektedir. Normalde hepatositlerin hemen tamamı G0 fazında bulunurlar.
Sıçanlarda, hücre döngüsünün S fazına girmesiyle birlikte DNA sentezi majör rezeksiyondan 12 saat sonra başlar ve 24 saatte zirve yapar. Genetik materyal sentezi önce hepatositlerde başlar. Rejenerasyon karaciğer lobülünde portal ven tarafından başlayıp santral vene doğru ilerler (13). Rejenerasyon sürecinin başlamasında olduğu gibi sonlanması da çeşitli mediyatörlerle düzenlenir. Sıçanlarda rejenerasyon sırasında kütle artışı üçüncü günde en hızlıdır ve yedinci günde tamamlanır (14).
ġekil 3. Karaciğer rejenerasyonunda etkin yolaklar
Rejenerasyonun başlatılmasında sitokin yollu iletim iletişimin bir bacağını oluşturur. Burada başlangıç için kritik hücre Kupffer hücresidir. Kupffer hücresi üzerindeki reseptörlere lipopolisakakrid, C3a ve C5a bağlanması hücreden IL-6 ve ve TNFα salınımına yol açar (15,16). Hücreye bağlanan TNFα, NF-κB aracılı bir iletimle hücrede IL-6 üretimini indükler (17,18). IL-6 hepatositlerdeki reseptörüne bağlanır. Janus-kinaz aktive olur STAT3 molekülünü dimerize ederek ve MAPK(mitogen activated protein kinase) yolunu aktive ederek hepatosit çekirdeğinde rejenerasyon ilişkili genlerin transkripsiyonunu başlatır (19,20).
Akerman ve arkadaşları anti-TNF antikorlarının sıçan karaciğerinde gecikmiş DNA sentezine ve hepatektomi sonrası oluşan IL-6 seviyelerinde azalmaya yol açtığını bildirmiştir (21). TNF-R1 eksikliği olan sıçanlarda rejenerasyonda gecikme olurken bu gecikmenin rekombinant IL-6 uygulamasıyla geri döndürüldüğü gözlenmiştir (22). Ancak TNF-α varlığında da IL-6 eksiklikli farelerde karaciğer rejenerasyonunun bozuk olması TNF-R1 uyarımının IL-6 salınımına yol açtığını düşündürtmektedir (23)
Rejenerasyonun başlamasında ikinci yol olan TGFα ve HGF yolu IL-6’ya göre daha güçlü bir yoldur. HGF karaciğerde yıldızsı hücrelerde sentezlenir ve parakrin etkiyle hepatositleri etkiler. HGF hepatositlerde doğrudan DNA sentezini indükler. HGF reseptörü Met’e bağlanarak PI3K, AKT, S6 kinaz ve TGFα ile devam eden yolağı aktive eder. Yıldızsı hücrelerin salınan pro-HGF uPA ve plazminojen tarafından aktif olan HGF’ye dönüştürülür (24,25). Plazminojen aktivatör inhibitörü bu dönüşümü engeler. Bu şekilde rejenerasyonun sonlandırılmasına katkıda bulunur.
Endotelyal hücrelerden salınan VEGF yıldızsı hücrelerden pro-HGF salınımını artırır (26).
Sitokin ve büyüme faktörleri ortak bir yola çıkar AP1, JNK, pERK, C/EBPβ, IGFBP1 aracılığı ile siklin D1 aktive olarak hücreyi G0 fazından çıkarır.
TGFβ rejenerasyonun sonlandırılmasında etkin olan bir mediatördür.
Karaciğerde fibrosis ve apoptozisi indükleyebilir. Hepatosit mitogenezini durdurucu etkisi vardır. Yıldızsı hücrelerden salınır (27). Rejenerasyon sürecinde hepatositlerin TGFβ’ya duyarlılığı azalmıştır (2).
2.3. EGZERSĠZ
Egzersiz çizgili kas kontraksiyonlarından kaynaklanan, metabolik hızın, vücut sıcaklığının, kalp hızının, solunum sayısının arttığı fizyolojik durumdur.
Düzenli egzersizin kardiyovasküler hastalık, Tip 2 diabetes mellitus, kolon kanseri ve meme kanseri gibi hastalıkla üzerine olumlu etkileri bildirilmiştir (28-31). Enerji ihtiyacı artan vücutta oksijen ve nutrientlere ihtiyaç da artar. Enerji talebi aerobik ve anaerobik yollardan sağlanır. Anaerobik hızla dekompanze olmasıyla karakterize iken aerobik yol düşük yoğunluklu egzersizde besin ve oksijen temini olduğu sürece teorik olarak dekompanze olmaz. Yorucu egzersiz aerobik ve anaerobik kapasitenin aşılması ile yorulma gerçekleşir. Yorucu egzersizle birlikte vücut sıcaklığı da artar.
Nötrofil ve monositlerin mobilizasyonu da indüklenir (32). Egzersizle birlikte
kısmen cerrahi girişim, travma, yanık ve sepsiste oluşan değişikliklere benzerdir (36- 38). Egzersizle birlikte plazmada inflamatuvar belirteçlerin yükselmesi bilinmektedir (39). Taylor ve ark. egzersiz sonrası deneklerde kan C-reaktif protein seviyelerinde artış bildirmişlerdir (40). Bunların bir bölümü proinflamatuvar haberciler iken bir bölümü de inflamasyon karşıtı habercilerdir. Egzersiz sırasında kas hücrelerinden salınan sitokin ve peptidlere Pedersen myokin adını vermiştir (41). TNFα ve IL1β’nın akut inflamatuvar süreçlerde yer almalarına karşın egzersiz sonrası bu sitokinlerin dolaşımdaki konsantrasyonlarının artmadığı gözlenmiştir. Bununla birlikte IL-6, IL10 ve IL1ra seviyelerinin egzersiz sonrası dolaşımda arttığı bildirilmiştir (32).
Kas kontraksiyonları hücresel düzeyde immün değişikliklere yol açmaktadır (42). İskelet kasının çalışması sırasında IL-6 salgıladığı gösterilmiştir (43). Bunun kas glukojen seviyesinde azalmaya bağlı olduğunu iddia eden araştırıcılar mevcuttur (44). İskelet kası IL-6 dışında IL-8 ve IL-15 de salgılamaktadır (41). Makrofaj inflamatuvar protein α (MIP1-α) ve makrofaj inflamatuvar protein beta (MIP1-β) de yorucu egzersiz sonrası kanda artar (45). IL-4 artışı da bildirilmiştir. Bunlar içinde en dikkat çekeni IL-6’dır (Şekil 4).
ġekil 4. Egzersizle birlikte plazmada çeşitli sitokinlerin konsantrasyonlarındaki değişim.
IL-6’nın pirojenik ve inflamatuvar etkisine ilave olarak karaciğerde glukojenolizi ve yağ dokuda lipolizi artıran etkisi de mevcuttur. TNFα akut inflamasyon patogenezinde önemli bir sitokin iken Ancak uzun süreli yorucu egzersizlerde artma eğiliminde olduğu görülmüştür (46,47). Dolayısıyla TNFα’nın egzersizle indüklenen sitokin yanıtının bir parçası olduğunu söylemek zordur.
TNFα’yı erken gelen IL-6 baskılıyor olabilir. IL-6’nın makrofajlar üzerinde LPS’e bağlı TNFα salınımı baskılayıcı özelliği bilinmektedir. Bu konuda yapılan deneylerde rekombinan IL-6 infüzyonunun endotoksinle indüklenen TNFα yanıtını bastırdığı gözlenmiştir (48). IL-6 artışının ise egzersiz yoğunluğu ile ilişkili olduğu bildirilmiştir (49,50). Örneğin sadece üst ekstremitelerle egzersiz yapılması plazma IL-6 seviyesini yükseltmemektedir (51). Tek ekstremite ile yapılan deneylede lokal kan örneklerinde artmış IL-6 egzersizle IL-6 artışının çoğunluğunun sistemik faktörlerden çok kas ve lokal faktörler kaynaklı olduğunu düşündürmektedir (52,43).
Egzersiz sonrası alınan kas biyopsilerinde de IL-6 ve IL-1ra’nin kas dokusunda artmış miktarda olduğunu göstermiştir (53). IL-6’nın başka kaynakları monosite- makrofaj seri hücreleridir. Sterlie ve ark. egzersiz sırasında bu hücrelerin IL-6 ve IL- 1β içeriğinin değişmediğini göstermişlerdir. IL-6 plazma seviyeleri akut egzersizle bazal değerlerin 100 katına kadar yükseltilebilirken, düzenli fiziksel aktivite düzeyinin bazal IL-6 seviyesi ile paralellik göstermediği gözlenmiştir (54,55).
Yorucu egzersizin IL-8 artışına da yol açtığı bildirilmiştir (56,57). IL-8’in anjiyogenetik etkisi bildirilmiştir (58).
Czarkowska-Paczek ve arkadaşları, gönüllü ünsanlar üzerinde yaptıkları ölçümlerde yorucu egzersizin hemen sonrasında plazma TGFβ1, VEGF, PDGF düzeylerinde anlamlı artışlar gözlemlemişlerdir (59). Aynı araştırıcının başka bir çalışmasında sıçan modelinde egzersiz sonrasındaki TGFβ1 artışının kaynağı araştırılmış ve bu artışın kaynağının ne iskelet kesı ne de kalp kası olduğu gösterilmiştir (60).
İn vitro çalışmalar, myoblastların gerildiklerinde parakrin fonksiyon
aracılığıyla olabileceğini öne sürmüş ve yaptıkları insan deneylerinde egzersizle pulmoner arter-aorta HGF konsantrasyon gradyentinin arttığını görmüş, bunun da dolaşıma HGF salınımıyla olduğunu savunmuşlardır (64). O’Reilly ve arkadaşları quadriseps femorisi konsantrik gerime maruz bırakan deneylerinde zorlayıcı egzersizi takip eden dördüncü saatte plazma HGF düzeylerinde anlamlı artış bildirmişlerdir. Kas biyopsilerinde ise kas dokusunda HGF protein artışı görmemişlerdir (65). Rowswyte çalışmasında 8 hafta egzersiz yaptırdığı sıçanların karaciğer ve kalplerinin egzersiz yapmayan sıçanların karaciğer ve kalplerinden daha büyük olduğunu bildirmiştir (66).
3. GEREÇ ve YÖNTEM
3.1. ÇALIġMA TASARIMI
Hipotezin sınanması için bir hayvan deneyi uygun görüldü. Çeşitli boyutlarda güvenli ve standart hepatektominin yapılabilmesi ve bu konuda yeterli birikimin olması, benzer çalışmalarda sıçanların çok kullanılmış olması nedeniyle deneyler için on iki haftalık Wistar albino erkek sıçanlar kullanıldı. Deneyler için Ankara Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu’ndan 2010-99-358 karar numaralı onay alındı
Tez çalışmasının finansmanı araştırıcıların kendi kaynaklarından sağlandı.
Tek kullanımlık olmayan araç gereçler üniversitemizin Fizyoloji Anabilim Dalı Araştırma Laboratuvarı, Genel Cerrahi Anabilim Dalı Araştırma Laboratuvarı ve Tıp Fakültesi Deney Hayvanları Laboratuvarı’ndan sağlandı. Egzersiz protokolleri Fizyoloji Anabilim Dalı Laboratuvarı’nda uygulandı (67). Hayvan ameliyatları Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Deney Hayvanları Laboratuvarı’nda yapıldı.
Tıbbi İstatistik Bilim Dalı’ndan görüş alınarak örneklem büyüklüğü belirlendi ve deney grupları oluşturuldu. Bu doğrultuda 12 haftalık 12 adet Wistar albino erkek sıçan deney grubunda, 12 adet Wistar albino erkek sıçan kontrol gubunda ve 1 adet Wistar albino erkek sıçan pilot deneyde olmak üzere ağırlıkları 225 g ile 275 g arasında değişen 25 adet sıçan kullanıldı. Pilot deneyde bir deneğe %70 hepatektomi sonrasında iki gün yorucu egzersiz ve üçüncü gün tamamlayıcı hepatektomi yapıldı.
Pilot deney ile araştırıcılar %70 ve total hepatektomi deneyimlerini, araç gereç yeterliliğini, sıçanların fiziksel olarak koşu bandına ve deneylere uyumunu değerlendirdiler. Sıçanlar Ankara Üniversitesi Deney Hayvanları Laboratuvarı’ndan temin edildi. Gruplar şu şekilde düzenlendi:
Deney grubundaki 12 sıçana %70 hepatektomi yapıldıktan sonra
Kontrol grubundaki 12 sıçana %70 hepatektomi yapıldıktan sonra postoperatif 72. saatte total hepatektomi yapıldı.
Gruplar arasında rejenerasyon miktarı karşılaştırıldı.
3.2. DENEKLERĠN BAKIMI
Deney hayvanları 12 saat karanlık – 12 saat aydınlıkta, 21ºC’de, 70x40x30 cm’lik kafeslerde bir kafeste 6 hayvan olacak şekilde, Ankara Üniversitesi Deney Hayvanları Laboratuvarı’nda barındırıldı. İştahlarına göre (ad libitum) su ve pellet yem ile beslendiler. Deneklerin %70 hepatektomi ve total hepatektomi ameliyatları öncesinde ağırlıkları tartıldı.
3.3. ANALJEZĠ VE ANESTEZĠ
Deneklere ameliyatların hemen öncesinde peroperatif analjezi için 20 mg/kg petidin hidroklorür (Aldolan ampul, Liba Laboratuvarları, Türkiye) derialtına uygulandı. Ameliyatlar için anestezi 80 mg/kg ketamin (Ketalar Panker Davis, Türkiye) ile 20 mg/kg xylasine (Rompun Bayer, Türkiye) karışımının intraperitoneal uygulanmasıyla sağlandı. Deney grubundaki hayvanların ameliyattan sonra yapacakları egzersizlere uyumları ve ağrısız egzersiz yapabilmeleri için parsiyel hepatektomi ve total hepatektomi arasındaki 72 saatlik dönemde deneklerin içme sularına 7.5 mg/kg/gün ibuprofen (İbufen pediatrik şurup, Abbott İlaç, Türkiye) eklendi.
3.4. CERRAHĠ TEKNĠK
Her iki gruptaki deneklere önce %70 hepatektomi yapıldı. Sıçanlarda karaciğer loblarının adeta bir ağacın yaprakları gibi ayrı pediküllerinin olması nedeniyle standart büyüklükte çeşitli boyutlarda hepatektomi yapmak Higgins’in
tarif ettiği şekilde düşük mortaliteyle kolaylıkla gerçekleştirilebilmektedir (Şekil 5) (6).
ġekil 5. Sıçan karaciğer loblarının şematik gösterimi
Deneklere %70 hepatektomi için anestezi sonrası karın tıraşı yapılıp %10 povidon iyodür (Batticon, Adeka İlaç, Türkiye) ile saha antisepsisi sağlandı.
Deneklere supin pozisyon verilip ameliyat tablasına tespit edildi ve steril örtü ile örtüldü. Altı cm’lik orta hat kesisi ile deri ve linea alba açılarak karna girildi (Resim 1 A ve B). Karaciğer median lobu ve sol lateral lobu diyafragma, kaudat lob ve mideden serbestlendi. Her iki lobun pedikülü tek bir 4/0 ipek bağlama ile bağlandı.
Bağlamanın hemen distalinden kesilerek loblar çıkarıldı ve tartıldı (Resim 2).
Kanamalar kontrol edilip, varsa aktif kanamalar durduruldu. Linea alba 3/0 ipek ile devamlı dikişle, deri ayrı olarak 3/0 ipek devamlı dikişle dikilerek ameliyete son verildi (Resim 3).
Resim 1. Tespit edilmiş anestezi altında Wistar albino sıçan (A), Steril örtünme sonrası orta hattan yapılmış deri kesisi (B)
Resim 2. Median lob ve sol lobu içeren %70 hepatektomi materyali.
Yüzde 70 hepatektomiden 72 saat sonra yapılan total hepatektomiler ya da bir başka deyişle tamamlayıcı hepatektomiler de %70 hepatektomilerdeki ile aynı anestezi, analjezi ve antisepsi şartlarında gerçekleştirildi. Önceki operasyona ait dikişler alınarak aynı kesiden karna girildi. Kalan karaciğer lobları üst ve alt sağ lob ile ön ve arka kaudat loblardı. Kalan loblar makasla diyafragma, mide ve dalaktan serbestlendi. Portal pedikül 4/0 ipek ile bağlanıp karaciğer tarafından kesildi. Loblar öne çekilip vena kava üzerinden kesilerek çıkarıldı ve tartıldı (Resim 3). Bütün ameliyatlar gündüz saat 10:00 ile 14:00 arasında yapıldı
Resim 3. Superior ve inferior sağ loblar ile anterior ve posterior kaudat loblardan oluşan hiperplazik rezidü karaciğer.
3.5. EGZERSĠZ PROTOKOLÜ
Deney grubundaki deneklere %70 hepatektomiden 24 saat sonra ve 48 saat sonra olmak üzere iki kez yorucu egzersiz yaptırıldı. Deneklere egzersizler üniversitemiz Fizyoloji Anabilim Dalı Laboratuvarı’nda yaptırıldı. Uygun deney protokolünü literatürdeki yorucu egzersiz modellerinden belirlendi (67). Denekler
ardışık olarak sırasıyla 5 dakika 5 m/dk hızda, 5 dakika 10 m/dk hızda, 5 dakika 15 m/dk hızda, 35 dakika 20m/dk hızda, sonrasında 1 m/dk2 artan hızda koşturuldular (Resim 4 ve Resim 5).
Resim 4. Sıçanlar için tasarlanmış dört kulvarlı eğimi ve hızı ayarlanabilen koşu bandı ve kontrol ünitesi.
Resim 5. Koşu bandında egzersiz sırasında sıçanlar.
Koşu bandının gerisinde kalan alanın zeminine sıçanların koşmasını teşvik etmek için düşük voltajlı elektrik verildi. Sıçanların bir dakika içinde beş kez koşu bandının hızına yetişemeyip geri alana düşmesi ile yorulma belirlendi. Egzersizler saat 10:00 ile 14:00 arasında yaptırıldı.
3.6. SAKRĠFĠKASYON
Total hepatektomi sonrası anestezi altında iken vena kavası ve aortu kesilerek denekler sakrifiye edildi.
3.7. ÖLÇÜMLER
Denekler ameliyatlar öncesinde tartıldı. %70 hepatektomi materyallerinin kütleleri oranlanarak (2.33’e(70/30’a) bölünerek) aynı karaciğerin ilk kalan (%30) kütlesi tahmin edildi. Vücut kütlesine bölünerek parsiyel hepatektomi sonrası gram vücut kütlesi başına düşen karaciğer kütlesi her denek için hesaplandı (Parsiyel indeksi). Total hepatektomi (tamamlayıcı hepatektomi) sonrasında elde edilen hepatektomi materyalleri deneklerin vücut kütlelerine bölünerek rejenerasyon sonrası gram vücut kütlesi başına düşen karaciğer kütlesi her denek için hesaplandı (Total indeksi). Her denek için total indeksinin parsiyel indeksine bölünmesi ile kütleye göre rejenerasyon indeksi hesaplandı (68).
Yüzde 70 hepatektomi ve total hepatektomi materyalleri ameliyatların hemen sonrasında %10 formol içine alındı. Üniversitemiz Patoloji Anabilim Dalı İmmünpatoloji Laboratuvarı’nda hematoksilen-eozin ve Ki-67 boyamaları yapıldı.
Işık mikroskopunda mitoz sayımı yapıldı. Hepatositlerdeki mitoz sayısı on tane büyük büyütme alanında (x400’lük büyütme) mitoz sayılarak hesaplandı (Resim-6) (69).
arasında puanlar verildi (70). Puanlama (0) Rejeneratif değişiklik yok, (1) Hepatositlerin %25’inden azında rejeneratif değişiklik var (2) Hepatositlerin %25- 50’sinde rejeneratif değişiklik var (3) Hepatositlerin %75’inden azında rejeneratif değişiklik var (4) Hepatositlerin %75’inden fazlasında rejeneratif değişiklik var şeklinde yapıldı (Resim 7).
Rejenerasyonun hücre bölünmesi ile gerçekleşmesi nedeniyle proliferasyon hızlarının immünhistokimyasal belirteçlerle de ölçülmesi planlandı. Ki-67 immünhistokimyasal boyaması proliferasyon ölçümünde belirteç olarak seçildi. Ki- 67 boyaması hücre bölünmesinin G1, S, G2 ve M fazlarını gösterebilmektedir.
İmmünhistokimyasal incelemede hepatektomi materyallerinde mikroskopun 400 kat büyütmesinde rastgele seçilmiş, büyük damar veya kanal yapısı içermeyen 10 alanda Ki-67 ile boyanmış hücreler sayıldı. Her materyalde yüz hepatosit başına düşen Ki- 67 pozitif hücreler hesaplandı (Resim 8) (71).
3.8. ĠSTATĠSTĠKSEL ĠNCELEME
Üniversitemiz Tıbbi İstatistik Anabilim Dalı’nda deney grubu ile kontrol grubunun kütleye göre hesaplanan rejenerasyon indeks ortalamaları karşılaştırıldı.
Deney ve kontrol gruplarının parsiyel hepatektomi materyallerinde rejeneratif değişikliklere göre verilen puanları, mitoz sayıları, Ki-67 boyanma oranları karşılaştırıldı. Deney ve kontrol gruplarının total hepatektomi materyallerinde rejeneratif değişikliklere göre verilen puanları, mitoz sayıları, Ki-67 boyanma oranları karşılaştırıldı. Ortalamalar arasındaki farkların anlamlılığı gruplardaki denek sayısı 30’un altında olduğu için Mann-Whitney Testi ile test edildi.
Deney ve kontrol gruplarının kendi içlerinde parsiyel hepatektomi ve total hepatektomi materyalleri histokimyasal ve immünhistokimyasal parametreler (rejeneratif değişiklikler, mitoz sayısı, Ki-67 boyanması) açısından karşılaştırıldı.
Resim 6. Hepatositlerde gözlenen belirgin mitotik aktivite (Hematoksilen Eozin, X200)
Resim 7. Hepatositlerde nükleer büyüme ve belirgin nükleol ile karakterli rejeneratif değişiklikler (Hematoksilen Eozin, X200)
4. SONUÇLAR
Deney ve kontrol grubundaki sıçanlar deneyler çalışma öncesinde tartıldılar.
Deney grubunda ortalama vücut kütlesi 238.75 g (±18.46 g) olurken kontrol grubunda ortalama vücut kütlesi 245.83 g (±14.44 g) olarak bulundu. T testi ile gruplar arası ortalama vücut kütleleri arasında anlamlı fark olmadığı görüldü (p>0.05).
Deney grubundaki sıçanlar koşu bandında her egzersizde ortalama 54 dakika 22 saniye (24 dakika 54 saniye-62 dakika 21 saniye) koşabildiler.
Yüzde 70 hepatektomi sonrasında deney grubunda gram vücut kütlesi başına düşen karaciğer kütlesi 0.015 g karaciğer/g vücut kütlesi (0.011-0.022) olurken kontrol grubunda ise 0.014 g karaciğer / g vücut kütlesi (0.012-0.017) oldu.
Total hepatektomi yapıldığında deney grubunda gram vücut kütlesi başına düşen karaciğer kütlesi 0.029 g karaciğer / g vücut kütlesi (0.022-0.034) olurken kontrol grubunda ise 0.034 g karaciğer / g vücut kütlesi (0.031-0.038) oldu.
Deney grubunda karaciğer kütlesine göre hesaplanan rejenerasyon indeksi ortalaması 2.02 (±0.40) bulundu. Kontrol grubunda karaciğer kütlesine göre hesaplanan rejenerasyon indeksi 2.42 (±0.21) bulundu. İki ortalama arasındaki farkın istatistiksel anlamlılığı Mann-Whitney testi ile test edildi. İki grubun karaciğer kütlesine göre rejenerasyon indeksi ortalamaları arasında anlamlı fark bulundu.
(p<0.05).
Histokimyasal incelemede hepatositlerdeki rejeneratif değişiklikler değerlendirildiğinde deney ve kontrol gruplarının %70 hepatektomi materyallerinin rejenerasyon puanları ortancaları sırasıyla 0(0-2) ve 0(0-2) olarak hesaplanmış olup aralarında Mann-Whitney testinde istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmamıştır (p=0.11). Aynı inceleme deney ve kontol gruplarının total (tamamlayıcı) hepatektomi materyallerine yapıldığında rejeneratif değişiklik puan ortancaları sırasıyla 2(1-3) ve
2(1-3) olarak hesaplanmış olup aralarında Mann-Whitney testinde istatistiksel olarak anlamlı fark bulunamamıştır (p=0.84).
Hematoksilen ve eozin boyalı preparatlarda ışık mikroskobunda mitoz sayımı yapıldı. Deney ve kontrol gruplarının %70 hepatektomi materyallerinde mitoz sayıları ortancaları 0(0-1) ve 0.5(0-2) olarak gözlendi ve grup ortancaları arasında Mann-Whitney testinde istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmadı (p=0.08). Total hepatektomi materyallerinde yapılan mitoz sayımında deney grubunda mitoz sayısı ortancası 11.5(5-27) iken kontrol grubunda 26(8-42) olup grup arasında Mann- Whitney testinde anlamlı fark bulunmuştur (p=0.01).
İmmünhistokimyasal incelemede Ki-67 ile boyanmaya göre öncelikle parsiyel hepatektomi materyallerinin boyanma oranları ortalamaları karşılaştırıldı.
Deney grubunun parsiyel hepatektomi materyalinde Ki-67 boyanma oranları
%0.5(%0.5-%3) olurken kontrol grubunun parsiyel hepatektomi materyalinde Ki-67 boyanma oranları ortancası %0.5(%0-%1) oldu. Parsiyel hepatektomi materyallerinin Ki-67 boyanma oranları arasında Mann-Whitney testinde istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmadı (p=0.32). Total hepatektomi materyallerinin Ki-67 boyanma oranları karşılaştırıldığında deney grubunun total hepatektomi materyalinde Ki-67 boyanma oranı ortancası %28.5(%0.5-%60) olurken kontrol grubunun parsiyel hepatektomi materyalinde Ki-67 boyanma oranları ortancası %39(%30-%50) oldu ve total hepatektomi materyallerinin boyanma oranları arasında Mann-Whitney testi ile istatistiksel olarak anlamlı fark saptanmadı (p=0.20).
Deney grubunda total hepatektomi materyalleri ile parsiyel hepatektomi materyalleri karşılaştırıldığında Ki-67 boyanma oranları arasında (%28.5’e %0.5, p=0.003), mitoz sayıları arasında (11.5’a 0.0, p=0.002) ve rejeneratif hücresel değişiklik düzeyleri (2.0’a 1.0, p=0.006) Wilcoxon testi ile anlamlı fark bulunmuştur.
Kontrol grubunda total hepatektomi materyalleri ile parsiyel hepatektomi materyalleri karşılaştırıldığında Ki-67 boyanma oranları arasında (%39’a %0.5,
5. TARTIġMA
Karaciğerin, rezeksiyon sonrasında, hatta tekrarlanan rezeksiyonlar sonrasında gösterdiği rejenerasyon büyüleyicidir. Alıcıya yetmeyen greftlerle yapılan transplantasyonlar ve agresif cerrahi rezeksiyonlar sonrası gelişen karaciğer yetmezliği bu sürecin hızlandırılmasından fayda göreceği umulan durumlardır.
Sıçan modeli karaciğer rezeksiyonları için bilinen ve üzerinde yeterli tecrübe oluşmuş bir modeldir. Sıçan modeli çalışmalar için ortak bir platform sağlayarak karaciğer rejenerasyonu çalışmalarının karşılaştırılması veya benzer çalışmaların meta analizlerle birlikte değerlendirilmelerine imkan tanımaktadır.
Bu çalışmada yorucu egzersizin karaciğer rejenerasyonunu etkilediği hipotezi öne sürüldü. Egzersizin yorucu seçilmesinde sıçanlardaki karaciğer rejenerasyonunun insanlardakinden çok daha kısa bir süreç içerisinde gerçekleşmesinden kaynaklanmıştır. Kısa sürede gerçekleşen rejenerasyon sürecinde en yüksek düzeyde sitokin ve büyüme faktörü salınmasının uyarılması hedeflendi.
Rowswyte sekiz hafta aerobik egzersiz yaptırılan sıçanların karaciğer ve kalplerinin daha büyük bulunduğunu bildirmiştir. Bu durum egzersizin sağlık üzerine olan diğer olumlu etkilerinin ve etki habercilerinin düşünüldüğünde potansiyel olarak beklenebilecek bir durumdur.
Çalışmada rejenerasyonun egzersiz sonrasında dört parametre ile ölçülmesi planlanmıştır. Değerlendirilen parametrelerden vücut kütlesi başına düşen karaciğer kütlesi rezeksiyon tekniğinden etkilenebilecek ve ölçüm hatalarına daha açık bir parametredir. Oysa hepatositlerdeki rejeneratif değişikliklerin gözlenmesi, mitoz sayımı ve Ki-67 ile immünhistokimyasal inceleme kör olarak değerlendirme yapmaya imkan tanıyan ve total hepatektominin teknik başarısından etkilenmeyen ve bu nedenle daha objektif olduğunu söyleyebileceğimiz parametrelerdir. Örneğin posterior kaudat lobun total hepatektomilerde midenin arkasında kalması nedeniyle çıkarılmamış olabilmesi mümkündür. Karaciğer yaş ağırlığının tartılması karaciğerin
içerdiği geniş venöz ve sinüzoidal yapılardaki kanın farklı miktarlarda boşalması nedeniyle rejenerasyonu doğru yansıtacak sağlıklılıkta veri sağlayamayabilir.
Akut egzersizle, karaciğer rejenerasyonunu üzerinde olumlu etkili olduğu bilinen sitokinlerin ve büyüme faktörlerinin plazma düzeylerinde artış olduğunu biliyoruz (32,34,36,37). Aynı zamanda egzersizle birlikte plazma düzeylerinde artış olan TGFβ da karaciğer rejenerasyonu için bir inhibitördür. Ancak karaciğer rejenerasyonuna olumsuz etkisi olduğu bilinen başka habercilerin egzersizle ilişkisi konusunda bilgi birikimimiz sınırlıdır.
Sonuçları incelediğimizde rejenerason indeksleri ortalamalarının anlamlı düzeyde egzersiz yapmayan grubun rejenerasyonu lehine farklı olduğunu (2.02’ye 2.42, p=0.007) ve egzersiz yapmayan grupta mitoz sayısının anlamlı ölçüde yüksek olduğunu (26.0'a 11.5, p=0.01) görmekteyiz. Rejeneratif değişiklikler ve Ki-67 boyanma düzeylerinde fark olmaması rejenerasyonun egzersizle inhibisyonunun sınırlı düzeyde gerçekleştiğini düşündürmektedir.
Her iki grupta da %70 ve total hepatektomi materyalleri arasında mitoz sayısı, Ki-67 boyaması ve rejeneratif değişiklikler arasındaki anlamlı fark rejenerasyonu inhibe edecek bilinen ya da bilinmeyen başka etkenlerin kısmen dışlanabildiğini göstermektedir.
Egzersiz sırasında TGFβ gibi karaciğer rejenerasyonunu inhibe eden habercilerin plazma ve doku düzeylerindeki artışın sonuçlarda katkısı olabilir. Ayrıca karaciğer perfüzyonu da egzersiz sırasında azalmaktadır. Radák, çalışmasında yorucu egzersizin böbrek ve karaciğer dokularında oksidatif hasara neden olduğunu ve bu hasarın sıçanlarda süperoksit dismutaz türevlerinin intraperitoneal enjeksiyonu ile engelleyebildiklerini bildirmiştir (72).
Çalışmamızda dört parametre ile yapılmış ölçümlerde sonuçlar yorucu egzersizin karaciğer rejenerasyonu üzerine olumlu nicel etkisinin olmadığı
Çalışmamıza benzer çalışmalarda ileri dönemde kan analizlerinin de yapılması egzersizin karaciğer rejenerasyonuna olan net etkisinin açıklığa kavuşmasını sağlayabilir.
Sonuç olarak egzersiz ve karaciğer rejenerasyonunu irdeleyen bu sığ alanda daha objektif parametrelerle, kan incelemelerinin dahil olduğu ve geniş örneklemli çalışmaların sayısının artmasıyla klinik uygulamalara yansıtılabilecek netlikte sonuçlara ulaşılabilir.
6. ÖZET
Kırımker EO. Sıçan modelinde yorucu egzersizin karaciğer rejenerasyonuna etkisi. Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Genel Cerrahi Uzmanlık Tezi. Ankara 2011
Egzersiz organizmada metabolizma hızının ve enerji tüketiminin arttığı fizyolojik bir durumdur. Egzersizle birlikte birçok sitokin, hormon ve büyüme faktörü sentez ve salınımı artar. Egzersizle arttığı bilinen faktörler arasında HGF ve IL-6’da vardır. Karaciğer rejenerasyonu TNF, HGF, IL-6, TGFα ve TGFβ gibi çok sayıda faktörün yer aldığı ve hepatositlerin proliferasyonuyla karakterize bir süreçtir.
Karaciğer rejenerasyonu, karaciğer transplantasyonu, agresif karaciğer rezeksiyonları ve akut hepatitlerde gerçekleşir. Çalışmada yorucu egzersizin karaciğer rejenerasyonu üzerine etkisi incelendi. Deney grubundaki 12 Wistar albino sıçana
%70 hepatektomiden 24 ve 48 saat sonra iki kez koşu bandında yorucu egzersiz yaptırıldı. Kontrol grubundaki 12 Wistar albino sıçana %70 hepatektomi yapıldıktan sonra egzersiz yaptırılmadı. Tüm deneklere parsiyel hepatektomiden 72 saat sonra tamamlayıcı hepatektomi yapıldı. Her sıçan için total hepatektomi sırasında ve parsiyel hepatektomi yapıldığı sıradaki gram beden kütlesi başına düşen karaciğer kütlesi hesaplanıp oranlanarak rejenerasyon indeksleri hesaplandı. Histokimyasal ve immünhistokimyasal incelemede hepatositlerdeki rejeneratif değişiklikler, mitoz sayıları ve Ki-67 boyanma düzeyleri belirlenip karşılaştırıldı. Grupların rejenerasyon indeksleri ortalamaları deney grubunda 2.02 (1.29-2.68) ve kontrol grubunda 2.42 (2.05-2.75) bulundu (p=0.007). Deney ve kontrol gruplarının parsiyel hepatektomi materyalleri arasında hepatositlerdeki rejeneratif değişiklikler (p=0.11), mitoz sayıları (p=0.08) ve Ki-67 boyanma oranları (p=0.32) bakımından istatistiksel farklılık saptanmadı. Deney ve kontrol gruplarının total hepatektomi materyalleri arasında rejeneratif değişiklik puanları (p=0.84) ve Ki-67 boyanma oranları (p=0.20) bakımından istatistiksel fark saptanmadı. Mitoz sayıları ortancası deney grubunda
Bu bulgular doğrultusunda yorucu egzersizin hayvan modelinde karaciğer rejenerasyonunun hızını mitoz sayısı ve kütle artışı açısından olumsuz etkilediği, rejeneratif değişiklikler ve Ki-67 boyaması açısından da etkilemediği saptandı.
Bakılan dört parametreden hiç biri yorucu egzersizin karaciğer rejenerasyonuna olumlu etkisi yönünde değildir. Konuyla ilgili plazma incelemeleri ve immünhistokimyasal incelemeler de yapılıp daha objektif ve geniş boyutlu veriler sağlandığında, bu alandaki araştırmaların karaciğer cerrahisi geçiren hastaların klinik bakımına katkısı olabilir.
Anahtar kelimeler: Karaciğer, egzersiz, rejenerasyon, HGF, IL-6
7. ABSTRACT
Kırımker EO. Effect of exhaustive exercise on liver regeneration in rat model.
Ankara University Schol of Medicine Thesis in General Surgery. Ankara 2011
Exercise is a physiological action that metabolic rate and energy consumption of the body increase. Exercise induces production and secretion of many cytokines, hormones and growth factors. HGF and IL-6 are the most known products. Liver regeneration is a process that is characterized by hepatocyte proliferation. HGF, IL-6, TGFα and TGFβ take place in this process. Liver regeneration apppearently occurs after lver resections, liver transplantations and acute hepatitis. In this study we analysed the effect of exercise on liver regeneration. In the experimental group 12 Wistar albino rat had run on treadmill 24 hours and 48 hours after %70 hepatectomy until exhaustion occurs. Control group did not take exercise. Total (complementary) hepatectomy was performed 72 hours after %70 hepatectomy. Regenerative index according to the liver mass per gram body mass was calculated for rats after both
%70 and total hepatectomy. Mean regenerative index of experimental group was 2.02 (1.29-2.68) and mean regenerative index of control group was 2.42 (2.05-2.75) (p=0.007). Histolochemical and immunhistochemical examinations of partial hepatectomy specimens showed no statistically significant difference between groups according to regenerative changes (p=0.11), mitosis count (p=0.08) and Ki-67 staining (p=0.32). Histolochemical and immunhistochemical examinations of total hepatectomy specimens showed no statistically difference between groups according to regenerative changes (p=0.84) and Ki-67 staining (p=0.20). While median mitosis count in the total hepatectomy specimens of exercise group was 11.5(5-27), median mitosis count in the total hepatectomy specimens of the control group was 26(8-42) and difference was significant (p=0.01).
In accordance with these results it was concluded that exhaustive exercise had
sampling and immunohistochemical analyses are needed to reveal the positive and negative effects of exercise by different exercise modalities. These can bring changes in patient care in liver surgery units.
Key words: Liver, exercise, regeneration, HGF, IL-6
8. KAYNAKLAR
1. Taub R. Liver Regeneration: From myth to mechanism. Nature 2004;5:836-47 2. Koniaris L.G., McKillop I.H., Schwartz S.I., Zimmers T.A. Liver Regeneration.
J. Am. Coll. Surg. 2003;197:634-59
3. Sutherland F, Harris J. Claude Couinaud: a passion for the liver. Arch Surg 2002; 137(11):1305–10
4. Fausto, N. and Campbell, J. S. 2003, The role of hepatocytes and oval cells in liver regeneration and repopulation, Mechanisms of Development 120, 117-130 5. İnternet kaynağı: Bulfinch’s mythology: http://www.bulfinch.org/
6. Higgins GM, Anderson RM. Experimental pathology of the liver. I. Restoration of the liver of the white rat following partial surgical removal. Arch Pathol Lab Med 1931; 12:186–202.
7. Fausto N, Campbell JS, Riehle KJ. Liver Regeneration Hepatology.
2006:43;2(Suppl. 1) 45-5
8. Moolten F.L., Bucher N.L. Regeneration of rat liver: transfer of humoral agent by cross circulation. Science. 1967;158:272-274
9. Taub R., Geenbaum L.E., Peng Y. Transcriptional regulatory signals define cytokine-dependent and-independent pathways in liver regeneration. Semin.
Liver Dis. 1999;19:117-127.
10. Berasain C, Garcia-Trevijano ER, Castillo J, Erroba E, Lee DC, Prieto J, Avila MA. Amphiregulin: an early trigger of liver regeneration in mice.
Gastroenterology 2005; 128: 424-432
12. Hwang TL, Chen MF, Chen TJ. Augmentation of liver regeneration with glucagon after partial hepatectomy in rats. J Formos Med Assoc 1993; 92: 725- 728
13. Matsuo T. Control mechanism of the circadian clock for timing of cell division in vivo. Science 2003;302:255-259
14. Grisham J.W. A morphologic study of deoxyrybonucleic acid synthesis and cell proliferation in regenerating rat liver: autoradiography with thymidine-H.
Cancer Res. 1962;22:842-849
15. Cornell R.P., Lilijequist B.L., Bartizal K.F. Depressed liver regeneration after partial hepatectomy in germ-free athymicand lipopolysaccharide-resistant mice.
Hepatology 1990;11:916-922
16. Fujita T. Evolution of lectin-complement pathway and its role in innate immunity. Nature Rev. Immunol. 2002;2:346-353
17. Selzner N, Selzner M, Odermatt B, Tian Y, Van Rooijen N, Clavien PA.
ICAM-1 triggers liver regeneration through leukocyte recruitment and Kupffer cell-dependent release of TNF-alpha/IL-6 in mice. Gastroenterology 2003; 124:
692-700
18. FitzGerald MJ, Webber EM, Donovan JR, Fausto N. Rapid DNA binding by nuclear factor kappa B in hepatocytes at the start of liver regeneration. Cell Growth Differ 1995; 6: 417-427
19. Taub R. in Hepatology: A Textbook of Liver Disease.2003. (eds. Zakim D.Z.
and Boyer W.B.) Ch. 2. 31-55 (Saunders, Philedelphia, USA)
20. Talamin H. The mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase cascade activation is a key signaling pathway involved in the regulation of G1 phase progression in proliferating hepatocytes. Mol. Cell. Biol.
1999;19:6003-6011
21. Akerman P, Cote P, Yang SQ, McClain C, Nelson S, Bagby GJ, Diehl AM.
Antibodies to tumor necrosis factor-alpha inhibit liver regeneration after partial hepatectomy. Am J Physiol 1992; 263: G579-G585
22. Yamada Y, Kirillova I, Peschon JJ, Fausto N. Initiation of liver growth by tumor necrosis factor: defi cient liver regeneration in mice lacking type I tumor necrosis factor receptor. Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94: 1441-1446
23. Cressman DE, Greenbaum LE, DeAngelis RA, Ciliberto G, Furth EE, Poli V, Taub R. Liver failure and defective hepatocyte regeneration in interleukin-6- defi cient mice. Science 1996; 274:1379-1383
24. Currier A.R. Plasminogen directs the pleiotropic effects of uPA in liver injury and repair. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2003;284:508-515 25. Shimizu M. Mechanism of retarded liver regeneration in plasminogen activator-
deficient mice: impaired activation of hepatocyte growth factor after Fas- mediated massive hepatic apoptosis. Hepatology 2001;33:569-576
26. LeCouter J. Angiogenesis-independent endothelial protection of liver: role of VEGFR-1. Science 2003;299:890-893
27. Derynck R., Zhang Y.E. Smad-dependent and smad-independent pathways in TGF-β family signaling. Nature 2003;425:577-584
28. Lamonte MJ, Blair SN, Church TS. Physical activity and diabetes prevention. J Appl Physiol 99: 1205–1213, 2005.
29. Lee IM, Paffenbarger RS Jr, Hennekens CH. Physical activity, physical fitness and longevity. Aging 9: 2–11, 1997.
30. Pedersen BK, Saltin B. Evidence for prescribing exercise as therapy in chronic disease. Scand J Med Sci Sports 16 Suppl 1:3–63, 2006.
32. Suzuki K, Nakaji S, Yamada M, Totsuka M, Sato K, Sugawara K. Systemic inflammatory response to exhaustive exercise. Cytokine kinetics. Exerc Immunol Rev. 2002;8:6-48.
33. Helenius I, LummeA and Haahtela T.Asthma, airway inflammation and treatment in elite athletes. Sports Med 35: 565-574, 2005.
34. Nieman DC. Current perspective on exercise immunology. Curr Sports Med Rep 2:239-242, 2003.
35. Rosa J.C., Lira F.S., Eguchi R.Pimentek G.D., Venancio D.P., Cunha C.A., Oyama L.M., DeMello M.T., Seelaender M., DoNascimento C.M.O.
Exhaustive Exercise Increases Inflammatory Response via Toll Like Receptor-4 and NF-kBp65 Pathway in Rat Adipose Tissue. J. Cell. Physiol. 2011; 226:
1604–1607
36. Brines R, Hoffman-Goetz L, Pedersen BK: Can you exercise to make your immune system fitter? Immunol Today 1996, 17:252–254.
37. Pedersen BK, Hoffman-Goetz L: Exercise and The Immune System:
Regulation, Integration and Adaption. Physiol Rev 2000, 80:1055–1081.
38. Hoffman-Goetz L, Pedersen BK: Exercise and the immune system: a model of the stress response? Immunol Today 1994, 15:382–7.
39. Northoff H., Berg A . Immunologic mediators as parameters of the reaction to strenuous exercise. Int J Sports Med 1991;12:S9–S15.
40. Taylor, C., Rogers, G., Goodman, C., Baynes, R. D., Bothwell, T. H., Bezwoda, W. R. Hematologic, iron-related, and acute-phase responses to sustained strenuous exercise. Journal of Applied Physiology, 1987; 2: 464-469.
41. Pedersen BK, Akerstrom TC, Nielsen AR, Fischer CP. Role ofmyokines in exercise and metabolism. J Appl Physiol 2007;103: 1093–1098.
42. Pedersen B.K., Febbraio M.A. Muscle as an Endocrine Organ: Focus on Muscle Derived Interleukin-6. Physiol Rev 88 2008;: 1379–1406
43. Brakenhoff JP, de Groot ER, Evers RF, Pannekoek H, Aarden LA. Molecular cloning and expression of hybridoma growth factor in Escherichia coli. J Immunol 1987;139: 4116–4121
44. Gleeson M. Interleukins and exercise. J Physiol 2000;529: 1
45. Ostrowski K, Rohde T, Asp S, Schjerling P, Pedersen BK. Proand anti- inflammatory cytokine balance in strenuous exercise in humans. J Physiol 1999;515: 287–291.
46. Bruunsgaard H, Hartkopp A, Mohr T, Konradsen H, Heron I, Mordhorst CH, Pedersen BK. In vivo cell mediated immunity and vaccination response following prolonged, intense exercise. Med Sci Sports Exerc 1997;29: 1176–
1181
47. Starkie RL, Rolland J, Angus DJ, Anderson MJ, Febbraio MA. Circulating monocyes are not the source of elevations in plasma IL-6 and TNF-alpha levels after prolonged running. Am J Physiol Cell Physiol 2001;280: C769–C774 48. Starkie R, Ostrowski SR, Jauffred S, Febbraio M, Pedersen BK. Exercise and
IL-6 infusion inhibit endotoxin-induced TNFalpha production in humans.
FASEB J 2003;17: 884–886
49. Ostrowski K, Schjerling P, Pedersen BK. Physical activity and plasma interleukin-6 in humans: effect of intensity of exercise. Eur J Appl Physiol 2000;83: 512–515
50. Ostrowski K, Rohde T, Asp S, Schjerling P, Pedersen BK. Chemokines are elevated in plasma after strenuous exercise in humans. Eur J Appl Physiol 2001;84: 244–245.
51. Bergfors M, Barnekow-Bergkvist M, Kalezic N, Lyskov E, Eriksson JW. Short- term effects of repetitive arm work and dynamic exercise on glucose metabolism and insulin sensitivity. Acta Physiol Scand 2005;183: 345–356 52. Jonsdottir IH, Schjerling P, Ostrowski K, Asp S, Richter EA, Pedersen BK.
Muscle contractions induce interleukin-6 mRNA production in rat skeletal muscles. J Physiol 2000;528: 157–163
53. Ostrowski K, Rohde T, Zacho M, et al. : Evidence that IL-6 is produced in skeletal muscle during intense long-term muscle activity. J Physiol (London) 1998; 508:949–953.
54. Cesari M, Penninx BW, Pahor M, Lauretani F, Corsi AM, Rhys WG, Guralnik JM, Ferrucci L. Inflammatory markers and physical performance in older persons: the InCHIANTI study. J Gerontol A Biol Sci Med Sci 2004;59: 242–
248.
55. Colbert LH, Visser M, Simonsick EM, Tracy RP, Newman AB, Kritchevsky SB, Pahor M, Taaffe DR, Brach J, Rubin S, Harris TB. Physical activity, exercise, inflammatory markers in older adults: findings from the Health, Aging and Body Composition Study. J Am Geriatr Soc 2004;52: 1098–1104.
56. Nieman DC, Davis JM, Henson DA, Walberg-Rankin J, Shute M, Dumke CL, Utter AC, Vinci DM, Carson JA, Brown A, Lee WJ, McAnulty SR, McAnulty LS. Carbohydrate ingestion influences skeletal muscle cytokine mRNA and plasma cytokine levels after a 3-h run. J Appl Physiol 2003;94: 1917–1925.
57. Nieman DC, Henson DA, McAnulty SR, McAnulty L, Swick NS, Utter AC, Vinci DM, Opiela SJ, Morrow JD. Influence of vitamin C supplementation on oxidative and immune changes after an ultramarathon. J Appl Physiol2002; 92:
1970–1977.
58. Bek EL, McMillen MA, Scott P, Angus LD, Shaftan GW. The effect of diabetes on endothelin, interleukin-8 and vascular endothelial growth factor- mediated angiogenesis in rats. Clin Sci 103 Suppl 2002;48: 424S–429S
59. Czarkowska-Paczek B., Bartlomiejczyk I., Przybylski J. The seum levels of growth factors : PDGF, TGF-Beta and VEGF are increased after strenuous physical exercise. Journal of Physiology and Pharmacology 2006, 57, 2, 189.197.
60. Czarkowska-Paczek B, Zendzian-Piotrowska M, Bartlomiejczyk I, Przybylski J,Gorski J. The effect of acute and prolonged endurance exercise on transforming growth factor-b1 generation in rat skeletal and heart muscle .Journal of Physiology and Pharmacology 2009, 60, Suppl 4, 157-162
61. Tatsumi R, Hattori A, Ikeuchi Y, Anderson JE, Allen RE.Release of hepatocyte growth factor from mechanically stretched skeletal muscle satellite cells and role of pH and nitric oxide. Mol Biol Cell 2002;13:2909 –2918.
62. Tatsumi R, Liu X, Pulido A, Morales M, Sakata R, Dial S, et al. Satellite cell activation in stretched skeletal muscle and the role of nitric oxide and hepatocyte growth factor. Am J Physiol Cell Physiol 2006;290:C1487–C1494.
63. Tatsumi R, Sheehan SM, Iwasaki H, Hattori A, Allen RE. Mechanical stretch induces activation of skeletal muscle satellite cells in vitro. Exp Cell Res 2001;267:107–114.
64. Satoshi Yasuda S., Goto Y., Takaki H., Asaumi Y., Baba T., Miyazaki S., Nonogi H. Exercise-Induced Hepatocyte Growth Factor Production in Patients After Acute Myocardial Infarction Its Relationship to Exercise Capacity and Brain Natriuretic Peptide Levels. Circ J 2004; 68: 304 –307
65. O’Reilly C., McKay B., Phillips S., Tarnopolsky M., Parise G. Hepatocyte growth factor (HGF) and the satellite cell response following muscle lengthening contractions in humans. Muscle Nerve 2008;38: 1434–1442.
66. Rowsey P.J., Metzger B.L., Carlson J., Gordon C.J. Long-Term Exercise
67. Gandra P.G., Valente R.H., Perales J., Pacheco A.G., Macedo D.V. Proteomic analysis of rat skeletal muscle submitted to one bout of incremental exercise.
Scand J Med Sci Sports. 2010 Oct 25. doi: 10.1111/j.1600-0838.2010.01235.x. [Epub ahead of print]
68. Sasanuma H., Mortensen F.V., Knudsen A.R., Funch-Jensen P., Okada M., Nagai H., Yasuda Y. Increased liver regeneration rate and decreased liver function after synchronous liver and colon resection in rats. Ann Surg Innov Res. 2009 Dec;24;3:16.
69. Marshak A., Walker A. Effect of liver fractions on mitosis in regenerating liver.
Am J Physiology 1945 Feb;143(2):226-34.
70. Tannuri A.C., Tannuri U., Coelho M.C., Santos N.A., Mello E.S. Experimental models of hepatectomy and liver regeneration wing newborn and weaning rats.
Clinics(Sao Paulo) 2007 Dec;62(6):757-62.
71. Gerlach C, Sakkab DY, Scholzen T, et al. Ki-67 expression during rat liver regeneration after partial hepatectomy. Hepatology. 1997;26:573–578.
72. Radák Z., Asano K., Inoue M., Kizaki T., Oh-Ishi S., Taniguchi N., Ohno H.
Superoxide dismutase derivative prevents oxidative damage in liver and kidney of rats induced by exhausting exercise. Eur J Appl Physiol Occup Physiol.
1996;72(3):189-94.
