GSBL Pozitif Enterobacteriaceae İzolatlarında e Karbapenem Direnci*

(1)

İİnvazif Enfeksiyonlara Neden Olan

GSBL Pozitif Enterobacteriaceae İzolatlarında e Karbapenem Direnci*

Carbapenem Resistance in ESBL Positive Enterobacteriaceae Isolates Causing Invasive Infections

Özgen KÖSEOĞLU ESER¹, Hatice ALTUN ULUDAĞ^1,2, Alper ERGİN³, Barış BORAL¹, Burçin ŞENER¹, Gülşen HASÇELİK¹

1 Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Ankara.

1 Hacettepe University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Ankara, Turkey.

2 Turgut Özal Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Ankara.

2 Turgut Ozal University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Ankara, Turkey.

3 Hacettepe Üniversitesi Sağlık Hizmetleri Meslek Yüksekokulu, Tıbbi Laboratuvar Programı, Ankara.

3 Hacettepe University School of Health Services, Medical Laboratory Programme, Ankara, Turkey.

* Bu çalışma, 1. Ulusal Klinik Mikrobiyoloji Kongresi (KLİMUD) (12-16 Kasım 2011, Antalya)’nde sözlü bildiri olarak sunulmuştur.

ÖZET

Bu çalışmada 2005-2009 yılları arasında Hacettepe Üniversitesi Hastanesinde invazif enfeksiyonlardan izole edilen Enterobacteriaceae türlerinde karbapenem direnç varlığının fenotipik ve genotipik olarak gös-e terilmesi amaçlanmıştır. Çalışmaya, BD Phoenix (Sparks, ABD) sistemiyle geniş spektrumlu beta-laktamaz (GSBL) pozitif olarak tespit edilen 153’ü Escherichia coli, 47’si i Klebsiella pneumoniae, 10’ue Klebsiella oxyto- ca olmak üzere toplam 210 kan izolatı dahil edilmiştir. İzolatların imipenem, meropenem ve ertapeneme a karşı duyarlılıkları, CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute) önerilerine uygun şekilde mikrodilüsyon yöntemiyle, doripenem duyarlılığı ise E-test (bioMerieux, Hazelwood, ABD) yöntemiyle araştırılmıştır.

Çalışmada karbapeneme dirençli olarak tespit edilen izolatlarda fenotipik doğrulama testleri uygulanmış ve polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yöntemiyle blaa_AmpC’bla_CTX-M, bla_KPC, bla_NDM, bla_OXA, bla_IMP ve blaaa_VIM antibiyotik direnç genlerinin varlığı araştırılmıştır. Çalışmamızda, GSBL üreten 210^p^p Enterobacteriaceae kan izolatının 23 (%11)’ünde karbapenem direnci saptanmış; imipenem, meropenem ve ertapenem direnci sırasıyla %5.7 (n= 12), %1.9 (n= 4) ve %2.4 (n= 5) olarak belirlenmiştir. İzolatlara karşı en etkin karbapenem grubu antibiyotiğin doripenem (direnç %1) olduğu gözlenmiştir. Yirmi üç izolatın yedisi sefotaksim/klavulanik asit (CTX/CLA) ve seftazidim/klavulanik asit (CAZ/CLA) kombine disk difüzyon

Geliş Tarihi (Received): 09.10.2013 • Kabul Ediliş Tarihi (Accepted): 23.12.2013

İletişim (Correspondence):

İ : Prof. Dr. Özgen Köseoğlu Eser, Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi, Ö ğ Ü Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, 06100 Ankara, Türkiye. bbi ik bi l ji bili l 06100 k ü ki Tel (Phone):l ( h ) +90 312 305 1560,: 90 312 30 1 60

(2)

yöntemiyle GSBL negatif bulunurken, CTX/CLA diskine boronik asit (BA) ilavesiyle yapılan modifi ye kombine disk difüzyon yönteminde altı izolatın GSBL pozitif olduğu tespit edilmiştir. Modifi ye Hodge testi (MHT) ve/veya ertapenem-BA kombine disk difüzyon testleriyle pozitif olarak saptanan üç izolatın birinde bla_OXA-48, diğerinde blaa_AmpC geni saptanmıştır. Fenotipik olarak pAmpC varlığı tespit edilen üç K.pneumoniae izolatının birinde e blaa_AmpC geni gösterilmiştir. Bütün antibiyotikler için MİK değeri 256 μg/

ml olan ve meropenem-BA, MHT, imipenem-EDTA, seftazidim-CAZ/CLA, sefoksitin-BA pozitif olan bir K.pneumoniae izolatında e bla_OXA-48 gen varlığı saptanmıştır. Beş izolatta bla_OXA-1 ve bir izolatta bla_OXA-10 gen varlığı gösterilmiştir. İki izolat^OX ⁸bla_CTX-M pozitif olarak bulunmuş; izolatların hiçbirinde bla_IMP_P_P, blaaa_VIM ve bla_NDM-1genleri tespit edilmemiştir. Sonuç olarak, dört yıllık sürede izole edilen invazif Enterobacteriaceae türlerinin karbapenemlere olan direnç değerleri düşük düzeyde bulunmuştur. İzolatlardaki direnç, genel- likle bla_OXA_A tipi karbapenemazlara bağlıdır ve bu izolatlarda bla_KPC ve bla_NDM varlığı saptanmamıştır.

Anahtar sözcükler: Enterobacteriaceae; GSBL; karbapenem direnci; karbapenemaz.

ABSTRACT

The aim of this study was to investigate the presence of carbapenem resistance in Enterobacteriaeceae isolates recovered from invasive infections, in Hacettepe University Hospital, Ankara, Turkey, between 2005-2009, by phenotypic and genotypic methods. A total of 210 non-duplicated Escherichia coli (n=

153), Klebsiella pneumoniae (n= 47) and e Klebsiella oxytoca (n= 10) isolates which were all determineda to be extended-spectrum beta-lactamase (ESBL) positive with the BD Phoenix automated identifi cation and antibiotic susceptibility system (Sparks, USA), were included in the study. The isolates were recovered from patients with bloodstream infections. Susceptibility of the isolates to imipenem, meropenem and ertapenem was detected with microdilution method according to the standards of Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) minimal inhibitory concentration (MIC) breakpoints. Doripenem susceptibility was detected by the E-test (bioMerieux, Hazelwood, USA). All isolates which were found to be non-susceptible to any of the carbapenem antibiotics tested, were characterized by the phenotypic confi rmatory tests and the presence of the resistance genes; blaa_AmpC, bla_CTX-M, bla_KPC, bla_NDM, bla_OXA, bla_IMP ve blaaa_VIM were screened by polymerase chain reaction (PCR). Among the 210 ESBL-producing Enterobacteriaceae blood isolates, 23 (11%) were identifi ed as non-susceptible to any of the carbap-e enems tested. Resistance rates for imipenem, meropenem and ertapenem were 5.7% (n= 12), 1.9%

(n= 4) and 2.4% (n= 5), respectively. Doripenem was more active than the other carbapenems, with a resistance rate of 1.0%. Seven of 23 isolates were ESBL negative with cefotaxime/clavulanic acid (CTX/

CLA) and ceftazidime/clavulanic acid (CAZ/CLA) combined disk diffusion test, however, six of them were ESBL positive with the addition of boronic acid (BA) to CTX/CLA. Among the three isolates positive for Modifi ye Hodge test (MHT) and/or ertapenem-BA tests, bla_OXA-48 was detected in one and blaa_AmpC in the other. Phenotypic pAmpC activity was present in three K.pneumoniae isolates of which one was e positive for blaa_AmpC gene. One K.pneumoniae isolate resistant to all carbapenems with MICs > 256 μg/e ml and positive for phenotypic meropenem-BA, MHT, imipenem-EDTA, ceftazidime-CAZ/CLA, cefoxitin- BA production, was found to inhabit bla_OXA-48 gene. Five isolates were positive for bla_OXA-1 and one for bla_OXA-10. Two isolates were positive for bla_CTX-M, however bla_IMP_P_P, blaaa_VIMand bla_NDM-1 genes were not detected among the isolates. In conclusion, carbapenem non-susceptibility which was low among the Enterobacteriaceae strains isolated in our center, was mostly attributed to the presence of e bla_OXA_A type carbapenemases and no accumulation of bla_KPC and bla_NDM were detected.

Key words: Enterobacteriaceae; ESBL; carbapenem resistance; carbapenemase.

(3)

İ İ GİRİŞ

Enterobacteriaceae ailesinde yer alan e Escherichia coli vei Klebsiella pneumoniae, toplum e ve hastane kaynaklı enfeksiyonlara neden olan bakterilerdir. Bu bakterilerde dirençten sorumlu en önemli mekanizma genişlemiş spektrumlu beta-laktamaz (GSBL) yapımıdır.

Karbapenemler, GSBL üreten, özellikle çok ilaca dirençli Enterobacteriaceae türlerinde,e son seçenek olarak kullanılan önemli bir antibiyotik grubudur. Karbapenemaz üreten izolatlar, ciddi enfeksiyonlara neden olarak hastanede yatış süresini uzatmakta ve mor- talite oranlarını artırmaktadır. Dolaısıyla karbapenemlere karşı gelişen direncin izlenmesi önem taşımaktadır¹.

Karbapenem direnci çeşitli mekanizmalarla oluşmaktadır. Karbapenemleri hidroliz eden üç farklı sınıf beta-laktamaz bulunmaktadır. Bunlar Ambler sınıf A, sınıf B (metallo- beta-laktamazlar) ve sınıf D (oksasilinazlar) beta-laktamazlardır. Karbapenem direnci, bakteride plazmid aracılı AmpC (pAmpC) beta-laktamazlarla birlikte, porin mutasyon- larına bağlı dış membran geçirgenliğinin azalması sonucunda da ortaya çıkmaktadır².

Karbapenemaz üreten Enterobacteriaceae türlerinin tanısında, 2010 yılından öncee

“Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)” antibiyotik sınır değerlerine göre imipenem, meropenem ve ertapenem için ≥ 2 μg/ml minimum inhibitör konsantrasyo- nu (MİK) değerlerinin belirlenmesi durumunda, fenotipik ve/veya genotipik ileri testlerin yapılması önerilmiştir³. Bu açıdan modifi ye Hodge testi (MHT), CLSI tarafından karbapenemaz doğrulama testi olarak önerilen tek fenotipik test olmuştur. 2010 yılı öncesi CLSI rehberlerine göre, karbapenem direnci açısından şüpheli Enterobacteriaceae izolatlarında e MHT’nin pozitif bulunması halinde, yapılan mikrodilüsyon testi sonucunda ertapenem MİK değeri 2-4 μg/ml, imipenem 2-8 μg/ml ve meropenem 2-8 μg/ml bulunursa izo- latların tüm karbapenemlere dirençli olarak rapor edilmesi önerilmiştir. Ancak CLSI’nın 2010 yılında mikrodilüsyon duyarlılık sınır değerlerinde yaptığı değişiklik sonucunda, imipenem, meropenem, doripenem için duyarlılık sınır değerleri ≤ 1 μg/ml, ertapenem için ise ≤ 0.5 μg/ml şeklinde belirlenmiştir. CLSI, yeni düşük sınır değerlerinin uygulan- ması durumunda, MHT’nin sadece enfeksiyon kontrol ve epidemiyolojik amaçlı yapılma- sını ve karbapenem duyarlılık test sonuçlarının değiştirilmeden bildirilmesini önermiştir⁴. MHT’nin tek başına karbapenemaz tanımlama testi olarak kullanımı doğru bir yak- laşım değildir. Bu nedenle, karbapenemazları tanımlamada kullanılacak etkin fenotipik testlere gereksinim vardır. MHT dışında, karbapenemazların saptanmasında halen çift disk sinerji ve kombine disk difüzyon testleri kullanılmaktadır. MBL üreten izolatla- rın belirlenmesinde EDTA’nın indirgenmesi temeline dayanan fenotipik testlerin yanı sıra, boronik asit (BA)’in kullanıldığı çift disk veya kombine disk difüzyon testleriyle KPC tipi beta-laktamazların tanımlanmasında kullanılan testler de bulunmaktadır⁵. Karbapenemazlara ait bla genlerinin genotipik olarak polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) a ile gösterilmesi laboratuvar tanısında altın standarttır.

Karbapenemaz üreten Enterobacteriaceae izolatlarının hızlı saptanması veya yayılımı-e nın engellenmesi açısından, karbapenem MİK değerlerinin düşürülmesi anlam ifade etse de, bu yaklaşım yanlış pozitif sonuçların artmasına yol açmaktadır. Bu enfeksiyonların hastane ortamındaki gerçek oranlarının belirlenmesi, uygun antibiyotik kullanımı ve enfeksiyon kontrolü açısından önem taşımaktadır. Bu çalışmada 2005-2009 yılları ara-

(4)

Ü

sında Hacettepe Üniversitesi Erişkin Hastanesinde invazif enfeksiyon tanısıyla takip edilen hastalardan izole edilen Enterobacteriaceae türlerinde karbapenem direnç varlığının feno-e tipik ve genotipik olarak gösterilmesi amaçlanmıştır.

GEREÇ ve YÖNTEM

Bakteriyel İzolatlar ve Antibiyotik Duyarlılık Testleri

Çalışmaya, 2005-2009 yılları arasında BD Phoenix (BD, Sparks, ABD) otomatize bakteri tanımlama ve antibiyotik duyarlılık sistemiyle GSBL pozitif olarak tespit edilen 210 izolat (153 E.coli, 47i K.pneumoniae ve 10e K.oxytoca) dahil edildi. İnvazif enfeksiyon tanısı alan hastaların kan kültürlerinden izole edilen tek bir suş çalışmaya alındı. İzolatlar konvansiyonel yöntemlerle doğrulandı. İzolatların imipenem, meropenem ve ertapenem antibiyotik duyarlılıkları, CLSI önerileri doğrultusunda mikrodilüsyon yöntemiyle, doripenem duyarlılığı ise E-test (bioMerieux, Hazelwood, ABD) yöntemiyle araştırıldı. Duyarlılık sonuçları CLSI, MİK sınır değerlerine göre belirlendi³. Tüm testlerde kontrol amacıyla E.coli ATCC 25922 standart suşu kullanıldı.i

Karbapeneme dirençli izolat tespit edilen hastaların, yaş, cinsiyet, yoğun bakım üni- telerinde yatış durumu, altta yatan hastalıkları, verilen antibiyotik tedavisi ve son sağlık durumları hasta kayıt sisteminden elde edildi.

GSBL Tanısının Doğrulanması

CLSI tarafından önerilen sefotaksi-klavulanik asit (CTX-CLA) (Becton Dickinson, ABD) ve seftazidim-klavulanik asit (CAZ-CLA) (Becton Dickinson, ABD) kombine disk difüzyon doğrulama testinin yanı sıra, klavulanik asidin BA ile birlikte kullanıldığı modifi ye kombine disk difüzyon yöntemi de kullanıldı^4,5.

Karbapenemazların Saptanması

Karbapeneme dirençli olarak tespit edilen izolatlara fenotipik doğrulama testleri uygulandı. Bu amaçla MHT, CLSI kriterlerine göre çalışıldı³. KPC tipi karbapenemazların tespiti için ayrıca, meropenem(MER)/ meropenem-BA (Becton Dickinson, ABD) ve ertapenem (ETP)/ETP-BA (Becton Dickinson, ABD) kombinasyon disk yöntemleri kullanıldı⁴. Metallo-beta-laktamaz tanımlanması için, CLSI kriterlerine uygun olarak imipenem (IMP)/IMP-EDTA (Becton Dickinson, ABD) kombine disk difüzyon yöntemi kullanıldı⁴. AmpC beta-laktamaz üretiminin tespiti için, sefoksitin (FOX) (Becton Dickinson, ABD)- BA (400 μg) kombine disk difüzyon testi uygulandı⁶.

Genotipik Testler

Karbapeneme dirençli olarak tespit edilen izolatlarda, dirençten sorumlu olabi- lecek gen varlığını göstermek amacıyla PCR yöntemi kullanıldı. İzolatların DNA’ları kaynatma yöntemiyle elde edildi. İzolatlarda bla_KPC gen varlığının araştırılması için F (5’-TGTCACTGTATCGCCGTCTTAG-3’) ve R (5’-TTACTGCCCGTTGACGCCCAATCC-3’) primer dizileri¹; bla_OXA_A gen bölgeleri için multipleks PCR yönteminde kullanılan bla_OXA-1-F (5’-CAGATTCAACTTTCA AGATCG-3’) ve R (5’-GTGTTTAGAATGGTGATCG-3’); bla_OXA-2-F (5’-AAGAAACGCTACTCGCCTGC-3’) ve R (5’-CCACTCAACCCATCC TACCC-3’), bla_OXA-

(5)

10-F (5’-GTCTTTCGAGTACGGCATTA-3’) ve R (5’-ATTTTCTTAGCGGCAACTTAC-3’) primerleri⁷; bla_OXA-48 gen bölgesi için F (5’-GCGTGGTTAAGGATGAACAC-3’) ve R (5’-CATCAAGTTCAACCCAACCG-3’) primerleri¹ kullanıldı. MBL genleri için, bla_IMP-F (5’-CTACCGTTTTGCCTTACCAT-3’) ve R (5’-AACCAGTTTTGCCTTACCAT-3’); blaaa_VIM-F (5’-AGTGGTGAGTATCCGACAG-3’) ve R (5’-ATGAAAGTGCCTGGAGAC-3’); bla_NDM-1-F (5’-GGTTTGGCGATCTGGTTTTC-3’) ve R (5’-CGGAATGGCTCATCACGATC-3’); bla_CTX-

M-F (5’-TCTTCCAGAATAAGGAATCCC-3’) ve R (5’-CCGTTTCCGCTATTACAAAC-3’) primerleri kullanıldı¹. pAmpC beta-laktamazların varlığının tespit edilmesi için blaa_AmpC gen ailesinde yer alan altı gen (bla_MOX, bla_CIT_T_T, bla_DHA, blaa_ACC, bla_FOX ve bla_EBC) multipleks PCR^p^p yöntemi ile araştırıldı⁸.

BULGULAR

Çalışmamızda, GSBL üreten 210 Enterobacteriaceae izolatının 23 (%11)’ünde karba-e penem direnci saptanmıştır (Tablo I).

İmipenem MİK değerleri, meropenem, ertapenem ve doripenem MİK değerlerinden daha yüksek olarak saptanmıştır (Şekil 1, Tablo II). Yirmi üç izolatın hepsi imipeneme dirençli iken, 10’u ertapeneme, 9’u meropeneme ve 2’si doripeneme dirençli bulunmuş- tur. Karbapeneme dirençli 23 izolatın antibiyotiklere göre kümülatif MİK dağılımı Şekil 1’de gösterilmiştir. Buna göre doripenem, diğer karbapenemlerden daha etkili olarak gözlenmiştir. Ertapenem ve meropenem benzer etkinliğe sahipken, imipenem en düşük etkinliğe sahip karbapenem olarak belirlenmiştir.

Tablo I. GSBL Üreten İzolatların Karbapenem Duyarlılıkları (n= 210) Antibiyotik

MİK Aralığı (μl/ml)

MİK₅₀ (μl/ml)

MİK₉₀ (μl/ml)

Direnç n (%)

İmipenem 0.25 - > 256 2 8 12 (5.7)

Meropenem < 0.125 - > 256 0.125 1 4 (1.9)

Ertapenem < 0.125 - > 256 < 0.125 0.25 5 (2.4)

Doripenem 0.008 - > 256 0.016 0.032 1 (0.5)

Ş

Şekil 1. Karbapeneme dirençli 23 izolatın kümülatif yüzdeleri (%).p ç y ( )

(6)

Tablo II. Karbapeneme Dirençli 23 Izolatın Türlere Göre MİK, Fenotipik ve Genotipik Test Sonuçları NoBakteri türüIMP (μl/ml)MER (μl/ml)ETP (μl/ml)DOR (μl/ml)Fenotipik testlerDirenç genleriKarbapenem tedavisiPrognoz 1K.pneumoniae32321< 0.016GSBLMERTakip 2K.pneumoniae16< 0.125< 0.125< 0.023GSBLblaCTX-MIMPTakip 3K.pneumoniae8< 0.125< 0.125< 0.032GBBL-Takip 4K.pneumoniae3210.25< 0.032GSBLMEREx 5K.pneumoniae1642< 0.064AmpC; GSBL (BA)blaOXA-1-Ex* 6K.pneumoniae80.1250.125< 0.032GSBLIMPTakip 7K.pneumoniae1611< 0.075GSBL (BA)blaOXA-1-Ex 8K.pneumoniae818< 0.023GSBL-Takip 9K.pneumoniae128128128< 0.038MHT; GSBLMERTakip 10K.pneumoniae256256256256AmpC; MER-BA; MBL; MHT; GSBLblaOXA-48IMPEx* 11K.pneumoniae16864< 0.032GSBLblaCTX-M-Ex* 12K.pneumoniae4864< 0.023AmpC; ETP-BA; GSBLblaAmpCaIMPTakip 13K.pneumoniae1640.5< 0.032GSBL (+BA)blaOXA-10-Takip 14K.oxytoca80.250.25< 0.032GSBL (+BA)blaOXA-1-Takip 15K.oxytoca8< 0.1250.25< 0.047GSBL (+BA)blaOXA-1IMPTakip 16K.oxytoca80.250.25< 0.023GSBL (+BA)MERTakip* 17E.coli8< 0.1250.5< 0.032GSBLIMPTakip 18E.coli8< 0.125< 0.125< 0.023GSBLIMPTakip 19E.coli844< 0.064GSBLblaOXA-1-Ex* 20E.coli8< 0.125< 0.125< 0.016GSBL-Takip 21E.coli160.25< 0.125< 0.016GSBLMEREx 22E.coli16< 0.125< 0.125< 0.023GSBL-Ex* 23E.coli16161282GSBL-Ex* * Yoğun bakım ünitesinde yatan hastalar. BA: Boronik asit; DOR: Doripenem; ETP: Ertapenem; Ex: Eksitus; GSBL: Genişlemiş spektrumlu beta-laktamaz; IMP: İmipenem; MBL: Metallo-beta-laktamaz; MER: Meropenem.ppşşppp

(7)

Yirmi üç izolatın 7’si CTX/CLA ve CAZ/CLA yöntemiyle GSBL negatif olarak bulunurken, CTX/CLA diskine BA eklenmesiyle bu izolatlardan 6’sının GSBL pozitif olduğu tespit edilmiştir. MHT ve/veya ETP-BA kombine disk difüzyon testleriyle pozitif olarak saptanan 3 izolatın birinde bla_OXA-48, diğerinde blaa_AmpC geni saptanmıştır (Tablo II).

Fenotipik olarak AmpC varlığı tespit edilen 3 K.pneumoniae izolatının birindee bla- AmpC geni gösterilmiştir. Bu izolatların ikisinde aynı zamanda fenotipik olarak karbapenemaz varlığı tespit edilmiştir. Bütün antibiyotikler için MİK değeri 256 μg/ml olan ve MER-BA, MHT, IMP-EDTA, CAZ-CAZ/CLA, FOX-BA pozitif olan bir K.pneumoniae izolatında bla_OXA-48 gen varlığı bulunmuştur. Beş izolatta bla_OXA-1 ve bir izolatta bla_OXA-10 gen varlığı gösterilmiştir (Tablo II). İki izolatta ise ^OX ⁸ bla_CTX-M pozitif olarak bulunmuştur.

İzolatların hiçbirinde bla_IMP_P_P,blaaa_VIM ve bla_NDM-1 genleri tespit edilmemiştir.

Karbapeneme dirençli suşların izole edildiği 23 hastanın özellikleri Tablo III’te görül- mektedir. Yoğun bakım ünitelerinde yatan hasta sayısı 7 olarak belirlenmiş, bütün hastalarda altta yatan hastalıkların olduğu saptanmıştır. Hastaların 12’sine enfeksiyon tedavileri sırasında imipenem veya meropenem verilmiştir.

TARTIŞMA

2000’li yıllardan itibaren karbapenemler dışında tüm sefalosporinlere dirençli kabul edilen GSBL üreten E.coli izolatlarının dünyada yaygınlaşması sonucu hayatı tehdit eden i nozokomiyal enfeksiyonlarının tedavisinde son seçenek ilaç olarak karbapenemlerin korunması gerekliliği öne çıkmıştır. Gelecekte dünyada karbapenem üreten mikroorga- nizmalar ile iki büyük epidemi beklenmekte; bunlardan birinin toplum kaynaklı E.coli suşları, diğerinin ise hastane kaynaklı K.pneumoniae suşları ile gerçekleşmesi öngörül-e mektedir¹. Bu nedenle, karbapenem üreten mikroorganizmaların erken tanımlanması hastane salgınlarının önlenmesi açısından zorunludur.

Tablo III. Karbapeneme Dirençli Suşların İzole Edildiği Hastaların Özellikleri (n= 23)

Yaş ortalaması (Yaş aralığı) (Yıl) 50 (0-75)

Kadın/Erkek (n) 13/10

Yoğun bakım/Servis (n) 7/16

IMP & MER tedavisi alan hasta sayısı 12

Altta yatan hastalık varlığı (n)

Kanser* 13

Diğer** 10

Prognoz

Takip 14

Ölüm 9

* Lenfoma, pankreas, prostat, over, mide, böbrek hücre, sarkoma, Hodgkin.

** Kronik hepatit/karaciğer, talamik kanama, tüberküloz menenjiti, Hashimoto tiroidi, Guillain Barre, polihidroamni- yozis, kanamalı üremik sendrom.

(8)

Amerika Birleşik Devletleri (ABD)’nde 2007-2009 yılları arasında SENTRY çalışması kapsamında 42 merkezden toplanan hastane enfeksiyonu etkeni 2049 K.pneumoniae izolatında karbapenem direnci %6.1 olarak tespit edilmiştir⁹. COMPACT çalışması kapsamında Türkiye’den dahil edilen 10 merkezden 2008 yılı içinde toplanan 240 Enterobacteriaceae izolatında doripenem, imipenem ve meropenem direnç oranla-e rı %1.3 olarak saptanırken, doripenem ve meropenem 0.12 μg/ml MİK₉₀ değeri ile imipenemden (MİK₉₀= 0.5 μg/ml) dört kat daha aktif bulunmuştur¹⁰. Çalışmamızda Enterobacteriaceae türlerinde imipenem, meropenem ve ertapeneme düşük düzeyde e direnç (sırasıyla; %5.7, %1.9 ve %2.4) saptanmıştır. Doripenem ise en etkili karbapenem olarak belirlenmiştir. Doripenemin, Enterobacteriaceae türlerinde daha duyarlı olduğue diğer bazı çalışmalarla da desteklenmiştir^11,12. COMPACT çalışmasının Almanya’da yedi merkezden toplanan 167 Enterobacteriaceae izolatında MİKe ₉₀ değerleri, doripenem, meropenem ve imipenem için sırasıyla 0.06, 0.06 ve 0.5 μg/ml olarak belirlenirken, Asya-Pasifi k bölgesine ait beş ülkede COMPACT çalışmasına dahil olan 20 merkezden toplanan 500 Enterobacteriaceae izolatında MİKe ₉₀ sonuçları sırasıyla 0.09, 0.09 ve 0.5 μg/ml olarak tespit edilmiştir^11,12.

Enterobacteriaceae izolatlarında bulunan pAmpC türü beta-laktamazların GSBL’leri e maskeleyerek saptanmalarını önledikleri çeşitli çalışmalarda gösterilmiştir¹³. Baykal ve arkadaşlarının¹⁴ yaptıkları bir çalışmada, 99 E.coli ve 114i K.pneumoniae izolatının 10’undae pAmpC pozitifl iği GSBL ile birlikte tespit edilmiş ve bir izolatta GSBL fenotipinin mas- kelenmiş olduğu bulunmuştur. Çalışmamızda, otomatize yöntemle GSBL pozitif sonuç veren izolatlar içinde karbapenem direnci belirlenen 23 izolatın sadece 17’sinde CTX- CLA ve CAZ-CLA kombine disk difüzyon doğrulama testleriyle GSBL pozitif bulunmuş, ancak BA ilavesiyle geriye kalan altı izolatta da GSBL üretimi doğrulanmıştır. pAmpC var- lığı FOX-BA kombine disk difüzyon yöntemiyle araştırılmış ve üç izolatta fenotipik olarak pAmpC varlığı gözlenirken, bunların birinde blaa_AmpC geni tespit edilmiştir. Karbapenem direncinin rutin mikrobiyoloji laboratuvarında belirlenmesi önemlidir. 2010 yılında deği-^p^p şen CLSI sınır değerleri, düşük karbapenem MİK değerlerine sahip karbapenemaz üreten izolatların gözden kaçmasına neden olabildiği gibi, bu izolatların karbapenemaz pozitif olarak değerlendirilip karbapenem tedavisinden gereksiz yere kaçınılmasına da yol aça- bilmektedir. Karbapenemazları belirlemede kullanılan MHT’nin yüksek duyarlılığına rağ- men, bu test özellikle GSBL veya azalmış porinler ile birlikte pAmpC varlığı halinde yanlış pozitif sonuçlar verebilmektedir. Bu nedenle, karbapenemaz üreten Enterobacteriaceae izolatlarının saptanmasında doğrulama testlerinin uygulanmasının önemi büyüktür¹⁵. Düşük özgüllüğe sahip olması nedeniyle MHT’ni yorumlarken olası yanlış pozitif sonuç- ları göz önünde bulundurmak gerekmektedir¹⁶. Çalışmamızda karbapenemaz geni pozitif yedi izolattan sadece birinde MHT pozitif sonuç vermiştir. MHT’nin yanlış pozitif ve/veya negatif sonuç vermesi, izolatlardaki diğer bla_GSBL veya blaa_AmpC gen varlıklarına bağlanmaktadır. Bu açıdan değerlendirme yapıldığında, blaa_AmpC gen pozitifl iği bir izolat-^p ta, fenotipik pAmpC varlığı üç izolatta tespit edilmiştir. İzolatların hepsinin GSBL pozitif ^AmpC oldukları göz önüne alındığında, karbapenemaz varlığı gösterilemeyen izolatlarda, başka antibiyotik direnç mekanizmalarının olduğu düşünülmelidir. Buna benzer nedenlerle, laboratuvarlarda karbapenemazların tanısında tercih edilen fenotipik testlerin, doğru tanıya götürecek yeni modifi kasyonlarının takip edilerek kullanılması önem taşımaktadır.

(9)

Enterobacteriaceae türlerinde görülen karbapenem direncinden en sık sorumlu meka-e nizma, karbapenemaz enzimlerinin üretimi olmakla birlikte, eş zamanlı gelişen porin kaybı veya atım pompası aktivitesindeki artış da direncin ortaya çıkışını kolaylaştırmak- tadır¹⁷. Yapılan çalışmalarda, özellikle bla_KPC pozitif olan K.pneumoniae izolatlarında e karbapenem direnci, porin mutasyonlarına bağlı olarak gelişebilmektedir. Kültür pasajları ve izolatların stoklanması sırasında gelişen gen kayıpları, dirençli izolatların stoklanma sonrasında duyarlı hale geçebildiğini göstermiştir¹⁷. Direnç belirlenen izolatlar içerisinde yedi izolatta karbapenemaz gen varlığı gösterilse de, izolatlardaki karbapenem direnci çok farklı nedenlere bağlı olabilmektedir. Bu direncin GSBL veya AmpC tipi enzimlerle birlikte bakteride bulunan porin kaybı veya artmış atım pompa aktivitesi nedeniyle de gelişebileceği düşünülmelidir^15,18,19. Ayrıca, yüksek MİK değerlerinin sebebi, bu çalışma- da araştırılmayan diğer direnç genlerinin varlığıyla da açıklanabilir.

K.pneumoniae’da bla_OXA-48 varlığı ilk defa 2001 yılında Türkiye’deki bir izolatta bildi- rilmiştir²⁰. OXA-48 üreten K.pneumoniae izolatları Türkiye’yi takiben Orta Doğu, Kuzey e Afrika, Avrupa ve Amerika’dan da bildirilmiştir²¹. Son birkaç yıl içinde Avrupa’da karbapenemaz üreten izolatlara bağlı enfeksiyonlardaki artış, özellikle OXA-48’in toplum kaynaklı yayılımına bağlanmaktadır²². Çalışmamızda, K.pneumoniae izolatlarından birin-e de bla_OXA-48 gen varlığı saptanmış olup, bu izolat bütün karbapenemler için çok yüksek düzey direnci gösteren MİK değerine (256 mg/L) sahiptir. Kullanılan birçok fenotipik test bu izolat açısından pozitif sonuç vermiştir (Tablo II). İzolat yoğun bakım ünitesinde yatan akut miyelositer lösemili bir hastadan elde edilmiş ve hasta tedavisi sırasında imipenem de dahil olmak üzere birçok beta-laktam kullanmasına rağmen hayatını kaybetmiştir.

Yapılan çalışmalar, E.coli ve i K.pneumoniae’ya bağlı septisemi olgularında karbapene- maz varlığının, hastanın morbidite ve mortalitesini artıran sonuçlara neden olduğunu ve bu tip izolatlarda GSBL ve karbapenemazların birlikte bulunmasının, hasta ölüm oran- larını daha da yükselttiğini göstermektedir²³. Karbapenem direnci belirlenen izolatların elde edildiği hastalar hakkındaki bilgilerimiz kısıtlı olmakla birlikte, izolatların hepsinin kan örneği olması, hasta yaş ortalamasının yüksek olması, hastaların tümünde altta yatan hastalıkların bulunması ve yarıdan fazlasının tedavileri sırasında imipenem ve/veya meropenem alma öyküsünün bulunması, karbapenemaz varlığı açısından izolatların değerlendirilmesi gereğini ortaya koymuştur. Karbapenemaz gen varlığı gösterilen yedi izolat, aynı zamanda GSBL pozitif olarak belirlenirken, hastalarda ölüm oranı %39 (9/23) olarak izlenmiştir. Dolayısıyla karbapenemazların tanı ve takibinin, tedavi ve prognoz açısından önemi bu çalışmayla da desteklenmiştir.

Sonuç olarak, 2005-2009 yılları arasında hastanemizde invazif enfeksiyonlardan izole edilen Enterobacteriaceae türlerinde karbapenem direnç değerlerinin düşük olduğu ve e direncin sıklıkla bla_OXA_A tipi karbapenemazlara bağlı olduğu görülmüştür. İzolatlarda bla_KPC ve bla_NDM varlığı saptanmamıştır. Karbapenem direncinin yorumlanmasında uygulanmaya başlanan yeni CLSI MİK sınır değerleri, rutin mikrobiyoloji laboratuvarla- rında, karbapenemaz üretimine bakmaksızın, karbapenem direnci bildirilmesine neden olmaktadır. Ancak, birçok Enterobacteriaceae izolatında karbapenemaz aktivitesi gös-e

(10)

İ

teren enzimler olmadığı halde, karbapenem MİK değerleri yüksek bulunabilmektedir.

Bu durum, birçok antibiyotik grubunun tedavide kullanılabilirliğini kısıtlamaktadır²⁴. Bu nedenle, hastane ortamında enfeksiyon kontrol politikalarının doğru uygulanabil- mesi için, karbapenemazları saptayan güvenilir ve basit testlere gereksinim vardır. Bu araştırma, hastanemizde henüz tehdit edici boyuta varmamış olan düşük karbapenem direncini saptaması ve bu dirence sahip izolatlarda direnç mekanizmalarını analiz etmesi nedeniyle, daha sonra yapılacak çok merkezli araştırmalara ışık tutacaktır.

TEŞEKKÜR

Pozitif kontrol suşları için Prof. Dr. Murat Akova (Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi), Prof. Dr. Rıza Durmaz (Türkiye Halk Sağlığı Kurumu) ve Dr. Thierry Nass (Paris-Sud Üniversitesi Tıp Fakültesi)’a teşekkür ederiz.

KAYNAKLAR

1. Nordmann P, Naas T, Poirel L. Global spread of carbapenemase-producing Enterobacteriaceae. Emerg Infect Dis 2011; 17(10): 1791-8.

2. Miriagou V, Cornaglia G, Edelstein M, et al. Acquired carbapenemases in gram-negative bacterial pathogens: detection and surveillance issues. Clin Microbiol Infect 2010; 16(2): 112-22.

3. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing.

22^nd Informational Supplement. CLSI Document M100-S19, 2009. CLSI, Wayne, PA.

4. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing.

22^nd Informational Supplement. CLSI Document M100-S22, 2012. CLSI, Wayne, PA.

5. Tsakris A, Poulou A, Pournaras S, et al. A simple phenotypic method for the differentiation of metallo-beta- lactamases and class A KPC carbapenemases in Enterobacteriaceae clinical isolates. J Antimicrob Chemother e 2010; 65(8): 1664-71.

6. Song W, Bae IK, Lee YN, Lee CH, Lee SH, Jeong SH. Detection of extended-spectrum beta-lactamases by using boronic acid as an AmpC-lactamase inhibitor in clinical isolates of Klebsiellaf a spp. andEscherichia coli. J Clin Microbiol 2007; 45(4): 1180-4.

7. Costa D, Poeta P, Saenz Y, et al. Prevalence of antimicrobial resistance and resistance genes in faecal Esch- erichia coli isolates recovered from healthy pets. Vet Microbiol 2008; 127(1-2): 97-105.i

8. Perez-Perez FJ, Hanson ND. Detection of plasmid-mediated AmpC beta-lactamase genes in clinical isolates by using multiplex PCR. J Clin Microbiol 2002; 40(6): 2153-62.

9. Kaiser DM, Castanheira M, Jones RN, Tenover F, Lynfi eld R. Trends in Klebsiella pneumoniae carbapenemase-e positive K.pneumoniae in US hospitals: report from the 2007-2009 SENTRY Antimicrobial Surveillance Pro-e gram. Diagn Microbiol Infect Dis 2013; 76(3): 356-60.

10. Leblebicioğlu H, Cakir N, Celen M, Kurt H, Baris H, Laeuffer J; Turkish COMPACT Study Group. Comparative activity of carbapenem testing (the COMPACT study) in Turkey. BMC Infect Dis 2012; 12: 42.

11. Valenza G, Seifert H, Decker-Burgard S, Laeuffer J, Morrissey I, Mutters R. Comparative activity of carbapenem testing (COMPACT) study in Germany. Int J Antimicrob Agents 2012; 39(3): 255-8.

12. Kiratisin P, Chongthaleong A, Tan TY, et al. Comparative in vitro activity of carbapenems against major gram-negative pathogens: results of Asia-Pacifi c surveillance from the COMPACT II study. Int J Antimicrob Agents 2012; 39(4): 311-6.

13. Jacoby GA. AmpC beta-lactamases. Clin Microbiol Rev 2009; 22(1): 161-82.

14. Baykal A, Çöplü N, Şimşek H, Esen B, Gür D. Kan izolatı E.coli ve i K.pneumoniae suşlarında genişlemiş-e spektrumlu beta-laktamaz, KPC-tip karbapenemaz ve plazmid aracılı AmpC beta-laktamaz varlığının araştırılması. Mikrobiyol Bul 2012; 46(2): 159-69.

(11)

15. Birgy A, Bidet P, Genel N, et al. Phenotypic screening of carbapenemases and associated beta-lactamase in carbapenem-resistant Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol 2012; 50(4): 1295-302.

16. Girlich D, Poirel L, Nordmann P. Value of the modifi ed Hodge test for detection of emerging carbapen- emases in Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol 2012; 50(2): 477-9.

17. Gomez E, Urban C, Mariano N, et al. Phenotypic and genotypic screening and clonal analysis of carbapen- em-resistant Klebsiella pneumoniae at a single hospital. Microb Drug Resist 2011; 17(2): 251-7.e

18. Doumith M, Ellington MJ, Livermore DM, Woodford N. Molecular mechanisms disrupting porin expression in ertapenem-resistant Klebsiella and a Enterobacter spp. clinical isolates from the UK. J Antimicrob Chemother r 2009; 63(4): 659-67.

19. Baroud M, Dandache I, Araj GF, et al. Underlying mechanisms of carbapenem resistance in extended-spec- trum beta-lactamase-producing Klebsiella pneumoniae ande Escherichia coli isolates at a tertiary care centre in i Lebanon: role of OXA-48 and NDM-1 carbapenemases. Int J Antimicrob Agents 2013; 41(1): 75-9.

20. Poirel L, Heritier C, Tolün V, Nordmann P. Emergence of oxacillinase-mediated resistance to imipenem in Klebsiella pneumoniae. Antimicrob Agents Chemother 2004; 48(1): 15-22.

21. Patel A, Bonomo RA. Stormy waters ahead: global emergence of carbapenemases. Front Microbiol 2013;

4: 48.

22. Canton R, Akova M, Carmelli Y, et al. Rapid evolution and spread of carbapenemases among Enterobacteria- ceae in Europe. Clin Microbiol Infect 2012; 18(5): 413-31.e

23. Gupta V, Bansal N, Singla N, Chander J. Occurence and phenotypic detection of class A carbapenemases among Escherichia coli andi Klebsiella pneumoniae blood isolates at a tertiary care center. J Microbiol Immunol e Infect 2013; 46(2): 104-8.

24. Tzouvelekis LS, Markogiannakis A, Psichogiou M, Tassios PT, Daikos GL. Carbapenemases in Klebsiella pneu- moniae and other e Enterobacteriaceae: an evolving crisis of global dimensions. Clin Microbiol Rev 2012;

25(4): 682-707.