T.C.
SELÇUK ÜNĠVERSĠTESĠ SAĞLIK BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ
AKUT ROMATİZMAL ATEŞLİ ÇOCUKLARDA NT-PRO
BRAİN NATRİÜRETİK PEPTİD VE OSTEOPONTİN
DÜZEYLERİNİN, HASTALARIN TANI VE TAKİBİNDEKİ YERİ
Eyüp YÜCEL YÜKSEK LİSANS TEZİ
BĠYOKĠMYA ANABĠLĠM DALI
Danışman
Prof. Dr. Sadık BÜYÜKBAŞ
T.C.
SELÇUK ÜNĠVERSĠTESĠ SAĞLIK BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ
AKUT ROMATİZMAL ATEŞLİ ÇOCUKLARDA NT-PRO
BRAİN NATRİÜRETİK PEPTİD VE OSTEOPONTİN
DÜZEYLERİNİN, HASTALARIN TANI VE TAKİBİNDEKİ YERİ
Eyüp YÜCEL YÜKSEK LİSANS TEZİ
BĠYOKĠMYA ANABĠLĠM DALI
Danışman
Prof. Dr. Sadık BÜYÜKBAŞ
Bu araĢtırma Selçuk Üniversitesi Bilimsel AraĢtırma Projeleri Koordinatörlüğü tarafından 09202046 proje numarası ile desteklenmiĢtir.
i
ii. ÖNSÖZ
Yüksek lisans eğitimim süresince hoĢgörü, emek ve desteklerini hiçbir zaman esirgemeyen, tezimin hazırlanmasında bilgi ve deneyimleri ile bana büyük katkıda bulunan tez hocam sayın Prof. Dr. Sadık BÜYÜKBAġ‟a;
Tezimi hazırlamamda emeği geçen, bilimsel yardımlarını esirgemeyen, ilgi ve desteğini gördüğüm Selçuklu Tıp Fakültesi Pediatrik Kardiyoloji Anabilim Dalı BaĢkanı Prof. Dr. Bülent ORAN‟a;
Selçuk Üniversitesi Tıp Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı öğretim üyeleri, asistanlarına ve çalıĢanlarına;
Tez çalıĢmam süresince bana kolaylık sağlayan ve yardımlarını esirgemeyen ArĢ. Gör. Dr. Ekrem ERBAY‟a;
Tezimin hazırlamasında bana Ģimdiye kadar desteğini ve yardımlarını esirgemeyen Serengül LADĠKLĠ‟ye ve ayrıca ismi geçmeyen diğer arkadaĢlarıma;
Ayrıca yüksek lisans eğitimim boyunca maddi ve manevi desteklerini eksik etmeyen sevgili aileme;
En samimi duygularımla teĢekkür ederim.
Sunulan tez projesi Selçuk Üniversitesi Bilimsel AraĢtırma Projeleri (BAP) Koordinatörlüğü tarafından desteklenmiĢtir. (Proje No: 09202046)
ii
iii. İÇİNDEKİLER
SĠMGELER VE KISALTMALAR ... iv
1. GİRİŞ ... 1
1.1. Akut Romatizmal AteĢ ... 2
1.1.1. Epidomiyoloji ... 2 1.1.2. Etiyoloji ... 3 1.1.3. Patojenez ... 5 1.1.4. Patoloji ... 6 1.1.5. Klinik Bulguları ... 7 1.2. Natriuretik Peptidler ... 9
1.2.1. Natriüretik Peptitlerin Biyokimyasal Ve Moleküler Özellikleri ... 10
1.2.2. Natriüretik Peptidlerin Genel Fizyolojik Etkileri ... 13
1.2.3. BNP ve NT-pro BNP ... 14
1.2.4. Kardiyovasküler Sistemde BNP VE NT-proBNP‟ nin Kullanımı ... 16
1.2.5. BNP‟nin Normal Değerleri ... 17
1.3. Osteopontin (OPN) ... 18
1.3.1. Osteopontin Yapısı ... 19
1.3.2. Osteopontin Ekspresyonunun Düzenlenmesi ... 21
1.3.3. Osteopontinin Fonksiyonları ... 21
1.3.3.1.. Biyomineralizasyon da OPN‟nin Rolü ... 21
1.3.3.2. Ġnflamasyonda Opn‟nin Rolü ... 22
1.3.3.3. Kardiyovasküler Sistemde Opn‟nin Rolü ... 24
2. GEREÇ VE YÖNTEM ... 26
2.1. ÇalıĢma ġekli ... 26
2.2. Olgu Seçimi ... 26
2.3. Örneklerin Toplanması ve Saklanması ... 27
2.4. Biyokimyasal Analizler ... 27 2.4.1. NT proBNP Ölçümü ... 28 2.4.2. Osteopontin Ölçümü ... 28 2.4.3. ASO Ölçümü ... 31 2.4.4. CRP Ölçümü ... 32 2.4.5. Sedimantasyon Ölçümü ... 32 2.4.6. Ġstatistiksel Analiz ... 32 3. BULGULAR ... 34 4. TARTIŞMA ... 36 5. SONUÇ VE ÖNERİLER ... 40
iii
6. ÖZET ... 41
7. SUMMARY ... 42
8. KAYNAKLAR ... 43
iv
iv. SİMGELER VE KISALTMALAR
a.a. : Aminoasit
AII : Anjiotensin II
ABD : Amerika BirleĢik Devletleri
ACTH : Adreno Kortiko Tropik Hormon
AKS : Akut koroner sendrom
ANP : Atrial natriuretik peptid
ARA : Akut romatizmal ateĢ
ASO : Antistreptolizin O
BNP : Brain (beyin) Natriuretik Peptid
c-GMP : Siklik Guanozin Monofosfat
CD44 : Cytoplasmic Domain44
CNP : C-tipi natriuretik peptid
CRP : C-reaktive protein
CV : Kardiyovasküler
%CV : Coefficient of Variation
DKM : Dilate Kardiyomiyopati
DNA : Deoksi ribo nükleik asit
DNP : Dendroaspis Natriuretik Peptid
EDTA : Etilen Diamin Tetra Asetik Asit
EF : Ejeksiyon fraksiyonu
EGF : Epidermal büyüme faktörü
EKG : Elektrokardiyografi
EKO : Ekokardiyografi
ESH : Eritrosit sedimantasyon hızı
v
FGF : Fibroblast Growth Faktörü
GFR : Glomerular Filtration Rate
IFN : Ġnterferon
IL : Ġnterlökin
HRP : Horseradish Peroxidase
KTO : Kalp Toraks Oranı
LV : Sol ventriküler
MMP : Matriks Metalloproteinaz
NPR-A : Natriüretik peptit A reseptörü
NPR-B : Natriüretik peptit B reseptörü
NPR-C : Natriüretik peptit C reseptörü
NT-proBNP : N-terminal Pro-brain (beyin) natriuretik peptid
OPN : Osteopontin
PDGF : Platelet-Derived Growth Factor
PNL : Polimorf nüveli lökositler
RA : Romatoid Artrit
RAAS : Renin anjiotensin aldosteron sistemi
RGD : Arginin-Glisin-Aspartat
RHD : Romatizmal heart disease
RKH : Romatizmal kalp hastalığı
RLU : Relative Luminescence Units
RNA : Ribonükleik Asit
SDS-PAGE : Sodyum dodesil sülfat poliakrilamit jel elektroforezi
SPSS : Statistical Package For The Social Science
TGF-β : Transforming growth factor–β
vi
TMB : Tetrametilbenzidin
TNF-α : Tümör nekroz faktörü- α
1
1. GİRİŞ
Akut Romatizmal AteĢ (ARA), eklemleri, kalbi ve daha az olarak deriyi, deri altı dokuyu, santral sinir sistemini ve seröz yüzeyleri tutabilen multisistemik bir hastalıktır. Hastalık 1960‟lara kadar çocukluk çağı ölümlerinin ve yapısal kalp hastalıklarının baĢlıca nedeni olarak bilinmekteydi. 1980‟li yılların baĢında geliĢmiĢ ülkelerde görülme sıklığında azalma olmasına rağmen, 1984‟ten sonra ABD de, kısa bir süre sonra da Avrupa‟da görülme sıklığının tekrar artmaya baĢladığı belirtilmiĢtir. Ülkemizde de 1989 yılından sonra hastalığın görülme sıklığında belirgin bir artıĢ olduğu belirlenmiĢtir (Gerber 2007).
Akut romatizmal ateĢ, geliĢmiĢ ülkelerde antibiyotik kullanımı ile birlikte görülme sıklığı giderek azalmasına rağmen, geliĢmekte olan ve az geliĢmiĢ ülkelerde hala yüksek bir görülme sıklığına sahiptir ve bu ülkelerdeki sonradan kazanılmıĢ kalp hastalıklarının en sık karĢılaĢılan sebebidir (Mirkinson 1998). ARA günümüzde Dünya'da birçok ülkede 5-24 yaĢ gruplarında kalp hastalığından dolayı ölümlere sebep olmaktadır (Tuncer ve ark 1995).
Hastalığın asıl klinik önemi, romatizmal kalp hastalığına (RKH) yol açmasından kaynaklanmaktadır. Bazı Streptokok antijenleri (M proteini) ile insan dokusu antijenleri arasında çapraz reaksiyon oluĢması sonucu kiĢi kendi antijenini yabancı antijen olarak tanır ve doku harabiyeti oluĢur. Bununda kalpteki en önemli etkisi kalp kapaklarını da tutan pankardittir. Pankarditin sonucunda ise RKH oluĢabilir. Ancak, ülkemizde son yıllarda ARA proflaksisine verilen önemin ve tedbirlerin gün geçtikçe arttırılması hem ARA‟nın hem de buna bağlı geliĢen romatizmal ve kalp kapak hastalıklarının sıklığında azalmaya neden olmuĢtur.
Romatizmal Kalp Hastalığının ve ARA karditinin tanısında ekokardiyografik incelemenin önemi tartıĢılmaz; ancak bu tetkik kolay ulaĢılamayan, pahalı ve çeken kiĢinin tecrübesine bağlı bir tetkiktir. Bu olumsuz yönleri ekokardiyografik incelemenin kullanabilirliğini sınırlandırmaktadır. Ġlk defa 1985 yılında kemik dokusundan izole edilen glikofosfoprotein yapısındaki Osteopontin (OPN), (Yasui ve ark 2001) inflamasyon sürecinde önemli bir aracıdır. Ayrıca, kemik matriksinin oluĢmasında ve yeniden düzenlenmesinde de önemli bir role sahiptir. Kemik dokusu baĢta olmak üzere, böbrek epitel hücreleri, endotel hücreleri, damar düz kas
2 hücreleri, infiltrasyon özelliğine sahip makrofajlar ve T hücreleri tarafından eksprese edilen OPN miktarı serumdan ve idrardan ölçülebilir.
Natriüretik peptidler, artrium ve ventriküllerdeki artan duvar gerilimine bağlı olarak kardiyomiyositlerden salınan bir nörohormondur ve bu hormonların natriüretik, diüretik ve vazodilatör etkileri vardır. Bu hormon ailesinin bir üyesi olan NT-proBNP ve BNP kalp yetmezliğinin, miyokarditli hastaların, Kawasaki hastalığı ve inflamatuvar kalp hastalıklarının tanı ve izleminde kullanılmaktadır.
Bu çalıĢmada NT-proBNP ve osteopontin‟in ARA‟lı hastalardan kalp tutulumu olanların belirlenmesinde ve akut romatizmal ateĢ tanısı konulup tedavi edilen hastaların tedavilerinin takibindeki NT-proBNP ve osteopontinin seviyelerinin araĢtırılması amaçlanmıĢtır.
1.1. Akut Romatizmal Ateş
Akut romatizmal ateĢ (ARA), A grubu beta hemolitik streptokok enfeksiyona bir otoimmün tepkinin sonucu olarak ortaya çıkar. Akut rahatsızlığı önemli hastalıklara ve bazen de ölüme sebep olmaktadır. Asıl klinik ve halk sağlığı üzerindeki uzun vadeli etkisi kalp kapaklarındaki hasardan dolayı oluĢan romatizmal kalp hastalığı (RHD) meydana gelmesidir. Kalp, eklem, merkezi sinir sistemi gibi birçok organı tutan inflamatuar bir reaksiyon meydana gelir (Sanyal 1987).
Akut romatizmal ateĢ, son yıllarda geliĢmiĢ ülkelerde az görülen bir hastalık olmasına rağmen geliĢmekte olan ülkelerde halen önemli bir sağlık problemidir (Guidelines 1992). ARA Dünya'da birçok ülkede hala 5-24 yaĢ grubu arasında görülmektedir. Bu hastalık güncelliğini korumakla birlikte, insan sağlığını tehdit etmeye devam etmektedir (Stollerman 1997).
1.1.1. Epidomiyoloji
Akut romatizmal ateĢ, daha çok 5-15 yaĢ grubundaki çocuklarda görülür (Tuncer ve ark 1995) ve doğuĢtan olmayan kalp hastalıklarının en sık karĢılaĢılan nedenidir (Bisno 1980). Streptokoksik enfeksiyonların erken çocukluk döneminde görülme sıklığı düĢüktür. En yüksek insidansa okul çağında ulaĢmaktadır ve bu
3 açıdan ARA‟nın görüldüğü yaĢ aralığı ile paralellik gösterir. Streptokoksik enfeksiyonların arttığı ilkbahar ve kıĢ aylarında, ARA‟nın insidansının da arttığı gözlenmiĢtir (Beyazova ve ark 1987).
Akut romatizmal ateĢ genellikle iki cinste de eĢit sıklıkta görülmesine rağmen Sydenham koresi ergenlik sonrası kızlarda daha sık rastlanır (Sanyal 1987). Cinsiyet farkı kapak lezyonları için de söz konusudur. Mitral kapak tutulumu kızlarda, aort kapak tutulumu ise erkeklerde daha fazla görülmektedir (Bisno 1991).
Dünyanın bazı geliĢmemiĢ bölgelerinde son zamanlarda ARA‟nın yıllık insidansı 282/100.000 olarak bulunmuĢtur. Tüm dünyada ARA‟lı vakalar tüm yaĢ gruplarında kazanılmıĢ kalp hastalığının en sık karĢılaĢılan sebebi olarak görülmektedir. Tüm kalp ve damar hastalıklarının yarısını oluĢturur (Gerber 2007).
Akut romatizmal ateĢ sıklığı, yasam Ģartlarının iyileĢmesine bağlı olarak bir düĢüĢ göstermekle birlikte ekonomik açıdan geri kalmıĢ ülkelerde hala ciddi oranlarda görülmektedir. Amerika‟da 1900 yılında hastalığın görülme sıklığı 200/100.000 iken 1980‟li yıllarda 0.5/100.000‟e kadar gerilemiĢtir. Japonya ve Ġngiltere için bu oran 0.06/100.000 olarak bildirilmiĢtir (Afanas'ev ve ark 1995). Danimarka‟da 1962 yılında 11/100.000 olan oran 1.8/100.000 e kadar gerilemiĢtir. Dünyada ARA sıklığının yüksek olarak bulunduğu yerlerin basında Kuzey Avustralya‟da yaĢayan Aborjinler (9.6/1000), Hawaii‟de yaĢayan Samoan (2,6/1000) ve Yeni Zelanda‟da bulunan Maori çocukları (1,25/1000) gelmektedir (Senitzer ve Freimer 1984).
Ülkemizde ise, 1999‟da yapılan bir çalıĢmada (Olguntürk ve ark 1999), 1974‟de yapılan çalıĢmaya göre 9-10 kat azalarak 0,73/1000 olarak tespit edilmiĢtir (Ġmamoğlu 1975). 1970-73 yılları arasında Beyazova ve ark (1987), yaptıkları çalıĢmada ARA insidansını 56.5/100.000, 1988 yılında ise 36.7/100.000 olarak bulmuĢtur. Son yıllarda romatizmal kalp hastalığı görülme oranının arttığını belirtmiĢlerdir.
1.1.2. Etiyoloji
Streptokoklar Gram (+), yuvarlak veya oval görünümlü, hareketsiz, sporsuz, fakültatif Anaerop mikroorganizmalardır. Sıvı besi yerinde üretildiğinde zincir oluĢturma eğiliminde olan, bazıları kapsüllü olan mikroorganizmalardır. Morfolojik
4 olarak streptokoklara çok benzerler ve katalaz testinin negatif olması ile ayır edilirler. Streptokoklar kanlı agarda 3 tip hemoliz gösterirler. Bu hemoliz özellikleri Brown tarafından, eritrositlerin tam olarak eritildiği Beta hemolitik, eritrositlerin tam eritilmediği alfa hemolitik ve hemoliz yapmayanları da Gama hemolitik Ģeklinde 3 grupta toplamıĢtır (Wannamaker 1970, Gibofsky ve Zabriskie 1993).
Streptokokların yapısal elemanları ve salgıladığı bazı maddeler, patojeniteyi ve hastalığın Ģiddetini belirler (ġekil 1.1.).
Şekil 1.1. A grubu streptokokların hücre duvarının Ģematik görünümü ve
çapraz reaksiyon veren yapılar (www.cocukkardiyoloji.org 2011)
Yapısal Elemanlar:
- Lipoteikoik asit: Hücre duvar proteini olan Protein-F ile birlikte konak
epitelinde fibronektine tutunmayı sağlar.
- M proteini: Hastalığa yol açan baĢlıca kısımdır (Mc Carty 1952,
Wannamaker 1970). M proteini tip belirlemede ve virülansta rol alan en önemli proteindir (Widdowson ve ark 1974). Ġmmunokimyasal açıdan 80'den fazla M proteini vardır (Bisno 1979). Antijeniktir ve tipe özgü anti- M antikorları oluĢur. Bu nedenle anti-M antikorlar çapraz tepkimelere neden olur ve komplikasyonlardan sorumludur. Bu proteinin bazı epitopları kalp myozini, sarkolemma membran proteini, sinoviyum ve eklem kıkırdağı ile benzer antijenik yapıdadır (Mc Carty 1952, Wannamaker 1970).
5
- C polisakkarit: Bu yapı gruba özgüldür. Lancefield tarafından bulunarak
streptokokların serogruplara ayrılmasında kullanılmıĢtır. A‟dan V‟ye kadar 20 serogrup tanımlanmıĢtır. Bu gruplardaki beta hemolitik streptokoklardan insanlarda en sık hastalık etkeni olanlar; A, B, C, D ve G grubunda bulunanlardır (Bisno ve Stevens 2000, Kenneth Todar University 2002).
Salgıladıgı Maddeler:
- Hemolizinler: Ġki kısım hemolizin tanımlanmıĢtır. Streptolizin O, oksijen
duyarlıdır ve oksijenle geri dönüĢümlü, kolesterol ile geri dönüĢümsüz olarak inhibe olmaktadır. 3-6 ay içerisinde geçirilmiĢ enfeksiyonu belirlemede anti streptolizin O miktarı iyi bir belirleyici olarak görülmektedir. Diğer hemolizin olan streptolizin S antijenik değildir ve hemolitik aktiviteyi nötralize edebilecek bir antikor tespit edilmemiĢtir. Streptolizin S, streptolizin O gibi PNL‟ler trombositler ve subselüler organellerin membranlarına hasar verebilmektedir (Bisno 1995).
- Pirojenik toksinler: A-Grubu Beta Hemolitik Streptokok„lar tarafından
salgılanır. Toksin lizojenik bir bakteriyofaj bulunduğunda salgılanır. Kızıl döküntüsünden sorumlu olsa da, ilk etkisi ateĢ oluĢturmak olan bir süper antijendir.
- Nükleazlar: DNA‟ları parçalarlar.
- Streptokinaz: Plazminojen aktivatörü ile birleĢerek plazmojenin plazmine dönüsümünü ve böylece pıhtının erimesini sağlar (Bisno 1995).
- Hyalürinidaz: Asiti parçalayarak mikroorganizmanın derin dokulara
yayılmasını sağlar (Bisno 1995).
1.1.3. Patojenez
Yıllardır süren çalıĢmalar, romatizmal ateĢin ve romatizmal kalp hastalığının patogenezini kesin olarak açıklamayı baĢaramamıĢtır (Smoot ve ark 2002). Akut romatizmal ateĢin patogenezinde bugün kabul edilen teori ise Streptokok enfekiyonunun neden olduğu immünolojik reaksiyonlar sonucunda inflamatuvar yanıtın oluĢmasıdır.
Patogenezde, etkeni meydana getiren organizmanın virulans özelliği, enfeksiyonun yeri ve konakçının genetik yatkınlığı önemli rol oynamaktadır. Akut romatizmal ateĢ patogenezini araĢtırmada en büyük zorluk hayvan deneyleri yapılamayıĢıdır. Çünkü A grubu streptokoklar insan için patojendir, hayvanlarda
6 nadiren enfeksiyon yaparlar (Stollerman 1992, Hoffman ve ark 1997, Gerber 2007). A grubu beta hemolitik streptokokun moleküler biyolojisi ve bu mikroorganizma ile konakçı arasındaki otoimmün yanıtla olan bağlantısı iyi bilinmesine rağmen tam olarak an1aĢı1amamıĢtır. Beta hemolitik streptokoklardan sadece grup A olanları ARA'ya yol açmaktadır (Steer ve ark 1999, Currie ve Carapetis 2000, Carapetis ve Currie 2001). ARA, hastaların tamamına yakınında farenjitten sonra görülmektedir (Ayoub 2001).
Akut romatizmal ateĢte reaksiyon kollajen veya bağ dokusunda olmaktadır. Hastalık vücudu yaygın olarak etkilese de, klinik belirtiler çoğunlukla kalp, beyin ve eklemler de görülmektedir. Hastalığın akut döneminde hastalıklı bölgede ödem, lenfosit ve plazma hücrelerinin infiltrasyonu ile karakterize olan kalp, eklem ve derinin bağ dokularında eksüdatif inflamatuvar reaksiyon olmaktadır (Özyürek 2003).
1.1.4. Patoloji
Akut romatizmal ateĢin bulguları oldukça değiĢiklik gösterir ve klinik olarak geniĢ bir yelpazede ortaya çıkabilir. Hastalık subklinik olarak seyrederek yıllar sonra kapak hastalıkları ile ortaya çıkabileceği gibi, akut olarak ateĢ veya poliartrit ile baĢlayan bir seyir izleyebilir. ARA‟in klinik olarak ortaya çıkısı, streptokok enfeksiyonundan sonra 7- 35 günlük bir latent periyot gerektirdiğinden tanı koymada zorluklara neden olmaktadır. Sydenham koresinde bu periyot 3-6 aya kadar uzayabilmektedir. ARA tanısında, patognomonik olarak değerlendirilen klinik bir belirti veya laboratuar bulgusu yoktur (El-Said ve Sorour 1990, Todd 2004). Bu konudaki zorluk Jones kriterleri kullanılarak aĢılmaya çalıĢılmıĢtır.
Hastalık vücudu yaygın olarak etkilese de, klinik belirtiler çoğunlukla kalp, beyin ve eklemler de görülür. Hastalığın akut döneminde hastalıklı bölge dokusununda ödem, lenfosit ve plazma hücrelerinin infiltrasyonu ile karakterize olan kalp, eklem ve derinin bağ dokularında eksüdatif inflamatuvar reaksiyon görülür (Özyürek 2003).
Ġnflamasyon daha çok endokard ve miyokardla sınırlıdır. Hastalık sürecinde endokardit ve miyokardit olmaksızın sadece perikart tutulumu görülmesi nadirdir. Hastalarda inflamatuar süreç kalbin tüm tabakalarını tutmuĢtur. Kalpte miyokard
7 tutulumu ile Aschoff cisimcikleri, endokard tutulumu ile kapak lezyonları, perikard tutulumu ile serofibrinöz perikardit oluĢmaktadır. En çok mitral kapak etkilenirken, ikinci olarak aort kapağı etkilenir. Triküspid kapak tutulumu nadir olarak gözlenir, pulmoner kapak tutulumu ise pek rastlanmamaktadır (Ayoub 2001 ve Özyürek 2003). Deride ise küçük damarların tutulduğu vaskülit meydana gelir ve vücudun herhangi bir yerinde görülebilir. Eritema marginatum sık olarak gövdede ve ekstremitelerin ekstansör yüzlerinde görülmektedir. Subkutan deri nodülleri genellikle kemik çıkıntıları üzerinde veya tendonların ekstansör yüzlerinde oluĢur. Subkutan deri nodülleri bulunan hastalarda özellikle mitral darlık baĢta olmak üzere kronik valvüler hastalık bulunduğu da görülmüĢtür (Ayoub 2001 ve Özyürek 2003).
1.1.5. Klinik Bulguları
Akut romatizmal ateĢin tanısında saptanmıĢ klinik laboratuvar bulgusu yoktur. 1944' te T. Duckett Jones ARA 'in tanısında kendi adıyla anılan ve ARA tanısında kullanılan kriterlerini bulmuĢtur (Sanyal 1987). Bu kriterler 1992‟de WHO tarafından gözden geçirilerek modifiye edilmiĢtir (WHO 2001).
Akut romatizmal ateĢ de artralji ve ateĢ sıklıkla görülen nonspesifik klinik bulgulardır. Çünkü çok sayıda hastalıkta görülmektedir ve ARA için tanısal değeri sınırlıdır. Bu minor bulgular sadece tek bir major bulgu varlığında ARA tanısını desteklemek amacıyla kullanılmaktadır (Stollerman 1992 ve Guidelines 1992, Ortiz 2002 ve Gerber 2007).
Streptokok enfeksiyonu ile klinik bulguların ortaya çıkmasına kadar belirti vermeyen (latent) bir evrenin geçmesi gerekmektedir. Bu süre 7-35 gün kadardır. Sydenham Koreli hastalarda ise bu dönem 3-6 ay arasında değiĢmektedir (Gerber 2007).
Hastalığın klinik bulguları oldukça değiĢkenlik göstermektedir ve bazen tanı koyduracak bulgu veya tetkik bulunmayabilir (Guidelines 1992).
Jones Kriterleri 1- Major Kriterler
Kardit: Akut dönemde sekel bırakan tek bulgusu olduğundan ARA‟in en
8 katlarını tutarak çok ciddi kalp sekellerine yol açar (El-Said ve Sorour 1990, Todd 2004).
Poliartrit: ARA‟li hastaların yaklaĢık olarak %62-85‟inde bulunur
(Stollerman 1975) . Eklemlerin tutulma sıklığı yaĢla doğru orantılı olarak artmaktadır (Stollerman 1953 ve Sanyal 1974) . Etkilenen eklemler Ģiddetli ağrı, ĢiĢlik, kızarıklık, ısı artıĢı ve hareket kısıtlılığı gibi aktif inflamasyon belirtilerini gösterir. Eklem tutulumu migratuar ve asimetrik özelliktedir ve diz, dirsek, el ve ayak bileği gibi büyük eklemleri tutma eğilimindedir (Pader ve Elster 1959, Silber ve Katz 1975, Stollerman 1975).
Sydenham Koresi: ARA‟de santral sinir sisteminin bu sürece katıldığı
durumlarda ortaya çıkan belirtidir. Ergenlik çağındaki kız çocuklarında daha sık görülür. Genel olarak bu major belirtiye %10 oranında rastlanır. Hastalarda bazal gangliyonlar ve kaudat çekirdek tutulumuna bağlı olarak istemsiz hareketler, istemli kaslarda koordinasyon bozukluğu, kas zayıflığı gibi klinik belirtiler geliĢir. Streptokok farenjiti geçirildikten sonra Sydenham koresinin geliĢmesi için yaklaĢık 1- 6 ay süre geçmesi gerekir (Taranta ve Stollerman 1956).
Derialtı nodülleri: ARA‟lı hastaların %7-15‟inde görülmektedir. Sıklıkla
karditli hastalarda görülen, ağrısız, 0.5-2 cm çapında daha çok diz, dirsek, boyun kemikleri, el ve ayak bileği dıĢ yüzeylerinde yerleĢen hareketli deri altı nodülleridir. Sırtta ve skapula üzerinde de gözlenebilir (Fillit ve ark 1988).
Eritema Marginatum (Eritema Anülare): Daha çok gövdede ve
ekstremitelerin proksimal kısımlarında rastlanır. Etrafı pembe, ortası soluk, harita görünümünde, kaĢıntısız, kabarık olmayan döküntülerdir. Nem, ısı ve sıcak banyo döküntüleri arttırmaktadır (Fillit ve ark 1988).
2- Minör Kriterler
Artralji: ARA‟de sıkça rastlanmaktadır (Stollerman 1975, Feinstein ve
Spagnuolo 1962). Ağrı hareket kısıtlılığı yapabileceği gibi bazen de müphem ağrılar seklinde de olabilir. Poliartrit var ise majör kriter olarak kabul edilmektedir. Monoartrit ise minör kriter olarak değerlendirilir (Sanyal ve ark 1974).
Ateş: ARA‟in baĢlangıcında genellikle saptanır. AteĢ yüksekliği genellikle
37.5-39oC arasındadır. AteĢ düĢürücü (Antipiretik) kullanılmasa da genellikle bir hafta içinde düĢer. AteĢ yüksekliğinin birkaç hafta devam ettiği nadir vakalar da bildirilmiĢtir (Stollerman 1975).
9
EKG bulguları: EKG‟de PR süresinin uzaması görülür. Kardit olmayan
hastalarda da görülebildiğinden, klinik olarak karditin tanısına yardımcı olmaz. Karditin major bulgu olmadığı durumlarda minör bulgu olarak kabul edilmektedir (El-Said ve Sorour 1990, Todd 2004).
Eritrosit sedimantasyon hızı: Kan proteinlerindeki değiĢiklikler kırmızı kan
hücrelerinin rulo Ģekline gelmesine neden olarak eritrosit sedimantasyon hızını (ESH) arttırırlar. ARA‟lı hastalarda kalp yetmezliği olan karditli olgular dıĢında, yüksektir. Hastalığın tedavisi ve seyrini göstermesi bakımından önemli bir olgudur (El-Said ve Sorour 1990, Todd 2004).
CRP: ESH gibi spesifik olmayan bir akut faz reaktanıdır. ESH„ndan daha
hassastır. Konjestif kalp yetmezliğinde ESH normal olsa bile CRP yüksektir. En hafif iltihabi durumlarda hızla pozitifleĢir (Wood ve McCarty 1954, Jones 1965 ve Stollerman 1975).
1.2. Natriüretik Peptidler
Natriüretik peptitler, kalp tarafından salgılanan vazoaktif hormonlardır (Hall ve ark 1995). Natriüretik peptidler, arter ve venler üzerine geniĢletici etkiye sahip olmalarının yanı sıra natriüretik ve diüretik özelliklere de sahiptirler (Wiviott ve ark 2004). Fizyolojik olarak pek çok görevleri vardır. 1950‟lerde kalbin endokrin sistemi ile ilgili çok sayıda çalıĢma yapılmıĢtır. Kisch ve ark (1956), ilk kez kobay atriyumunda salgılayıcı granülleri saptadılar ve daha sonra Henry ve Pearce (1956), köpek sol atriyumunu balonla gerdikleri zaman idrar çıkıĢında bir artıĢın meydana geldiğini tespit ettiler. Bold ve ark (1981), sıçanlarda yaptıkları çalıĢmalarda atriyal ekstreler intravenöz enjekte edildiğinde güçlü bir natriüretik cevap oluĢtuğunu ortaya koydular. Yapılan bu çalıĢmalar, yapısal olarak benzer, fakat genetik olarak ayrı peptidler olan natriuretik peptidlerin bulunmasına katkı sağlamıĢtır (Mair ve ark 1999).
Natriuretik peptidler, kan basıncını, elektrolit dengesini ve sıvı volümünü regüle eden bir hormon sınıfıdır (Friedl ve ark 1996). Natriuretik peptid ailesi, biyokimyasal yapıları birbirine benzeyen dört molekülden oluĢmaktadır (Bold ve ark 2001). Atrial natriuretik peptid (ANP)‟in yapısı 1984 yılında belirlendi. 1988‟de ise ANP‟ye benzer bir Ģekilde natriüretik ve diüretik cevaba neden olan bir madde olan
10 Brain (beyin) natriuretik peptid (BNP) domuz beyninden izole edildi. (BNP) olarak adlandırılmasına rağmen asıl kaynak ve üretim yerinin ventrikül miyokardı olduğu anlaĢıldı (Sudoh ve ark 1988). Natriüretik peptitlerin üçüncü üyesi olan C-tipi natriuretik peptid (CNP) 1990 yılında domuz beyninde tespit edildi. C-tipi natriuretik peptid, ANP ve BNP‟den yapı olarak farklıdır. C-tipi natriuretik peptitler, genel dolaĢımdan çok merkezi sinir sistemi ve damar dokusunda bulunmaktadır (Minamino ve ark 1991). Yakın zamanda natriüretik peptit ailenin yeni üyesi olan dendroaspis natriuretik peptid (DNP) yeĢil mamba yılanı zehrinden elde edildi. Ancak insanlarda henüz DNP‟nin endojen varlığının olup olmadığı kesin bilinmemektedir (Hall 2004).
1.2.1. Natriüretik Peptitlerin Biyokimyasal ve Moleküler Özellikleri
Natriüretik peptitlerin dört üyesi de yüksek moleküler ağırlıklı öncül hormonlar olarak üretilmektedir ve hücre içerisinde çeĢitli üretim aĢamalarından geçtikten sonra aktif formlara dönüĢmektedir (Levin ve ark 1998). Öncü hormonlar her natriüretik peptit üyesi için, ayrı bir gen tarafından kodlanmaktadır (Mair ve ark 1999). Natriuretik peptidler iki sistein arasında oluĢan bir disülfid bağı ile bağlı bir halka yapısına sahiptirler. Bu ortak olan halka yapısı hepsinde aynıdır ve 17 aminoasitten oluĢur, reseptörlere bağlanan kısım bu bölgedir (ġekil 1.2.). Farklı olan yan peptid yapıları, bu peptidlerin farklılıklarını ve özelliklerini sağlar (Hall 2004).
Şekil 1.2. Natriüretik peptitlerin ortak moleküler yüzük yapıları (Suzuki ve
ark 2001)
Atrial natriuretik peptid (ANP), 28 aminoasit (aa) içeren bir polipeptittir (Munagala ve ark 2004) ve atriyal dokuda üretilir. Ventrikül, beyin, hipofiz anterior
11 lobu, akciğer ve böbreklerden salınmaktadır. Ayrıca fetal ve neonatal ventrikül dokusunda, hipertrofik ventriküllerde varlığı tespit edilmiĢtir (Levin ve ark 1998, Stein ve Levin 1998).
Biyolojik olarak aktif olamayan 98 a.a‟lik N-terminal ANP serin proteaz enzimi sayesinde biyolojik olarak aktif olan 28 a.a‟lik ANP‟ye parçalanır (Munagala ve ark 2004). ANP‟nin yarılanma ömrü yaklaĢık 3 dakikadır. N- terminal ANP‟nin yarılanma ömrü ise yaklaĢık 1 saattir (Mair ve ark 1999). ANP, atriyumdan duvar gerilimine cevap olarak salgılanmaktadır. ANP‟nin üretimini ve salgılanmasını uyaran diğer faktörler ise norepinefrin, anjiotensin II, endotelin ve sitokininlerin plazma düzeyinin artmasıdır (Ruskoaho 2003).
Brain (beyin) natriuretik peptid (BNP) ilk kez domuz beyninden izole edilmesine rağmen, asıl üretim yerinin atriyal ve ventriküler miyositler olduğu anlaĢılmıĢtır. DolaĢımdaki BNP‟nin temel kaynağı kalp kası hücreleridir. Son zamanlarda kalpteki fibroblastların da BNP üretebildikleri gösterilmiĢtir. Bu sebepten dolayı diğer natriuretik peptidlerden farklı olarak ventrikuler hastalıkların tanısında daha duyarlı ve özgül bir göstergedir (Munagala ve ark 2004). BNP sentezi uyarı geldiğinde hızlı bir Ģekilde baĢlamaktadır. Ġlk sentezlenen ürün olan pre-pro BNP hücre içerisinde 108 a.a‟lik öncül BNP‟ye dönüĢür. Öncül BNP de parçalanarak 76 a.a‟lik N-terminal BNP‟ye ve 32 a.a‟lik aktif olan C-terminal BNP‟ye dönüĢerek dolaĢıma verilir (Ruskoaho 2003). DolaĢımdaki BNP 32 aminoasitten oluĢur ve 9 a.a‟ten oluĢan amino-terminal ve 6 a.a‟ten oluĢan karboksil terminale, iki sistein arasında bir disulfid bağı ile kapanmıĢ karakteristik halka yapısına sahiptir (Munagala ve ark 2004), (ġekil 1.3.).
12
Şekil 1.3. BNP‟nin yüksek moleküler ağırlıklı öncül hormon hali ile
N-terminal parça ve C- N-terminal parçanın aminoasit dizisi (IFCC 2011)
Brain (beyin) natriuretik peptid (BNP)‟nin yarılanma ömrü (20 dakika) ANP‟den daha uzundur. N-terminal BNP‟nin yarılanma ömrü ise halen bilinmemekte ve 1-2 saat olarak tahmin edilmektedir (Mair ve ark 1999).
C-tip natriuretik peptid, natriuretik peptid ailesinin üçüncü üyesi olup; Ġlk olarak domuz beyninden izole edilmesine rağmen esas olarak endotel hücreleri ile iliĢkilidir (Chen ve Burnett 1998). Beyin, hipofiz anterior lobundan ve böbreklerden salınmaktadır (Levin ve ark 1998, Stein ve Levin 1998). CNP‟de ANP ve BNP gibi öncül hormon olarak sentezlenmektedir. Daha sonra öncül hormon biyolojik olarak aktif olan 22 a.a‟lik CNP ve 53 a.a‟lik aktif olmayan CNP‟ye parçalanır (Kalra ve ark 2001). CNP geni ANP ve BNP geninden yapı olarak farklıdır (Schweitz ve ark 1992). ANP ve BNP dolaĢımdaki kardiyak hormonlardır. CNP ise vasküler dokular üzerine vazorelaksan ve antiproliferatif etkileri olan parakrin faktör olarak davranırlar (Hall 2004).
Natriüretik peptit ailesine en son üyesi ise yeĢil mamba yılanı zehrinden elde edilen DNP‟dir. DNP‟de yapısal olarak diğer natriüretik peptitlere benzemektedir. 38 a.a‟den oluĢur ve 17 a.a‟lik halka yapısı diğer natriüretik peptitlerle aynıdır. Sistemik etkisi ANP ve BNP‟ye benzerlik gösteririr, fizyolojik ve patofizyolojik rolü tam olarak belirlenmemiĢtir (Schweitz ve ark 1992).
13
1.2.2. Natriüretik Peptidlerin Genel Fizyolojik Etkileri
Natriüretik peptitler biyolojik etkilerini hedef hücrelerin yüzeyindeki reseptörlere bağlanarak gösterirler. Memeli hücresinde A, B ve C olmak üzere üç tip natriüretik peptit reseptörü bulunmaktadır. Natriüretik peptit A reseptörü (NPR-A) ANP ve BNP‟yi bağlamaktadır. Natriüretik peptit B reseptörü (NPR- B) ise CNP‟yi bağlar. Natriüretik peptitler guanil siklaz sinyal yolunu sayesinde A ve B reseptörlerine bağlanarak hücre içerisindeki ikincil mesajcı siklik guanozin monofosfat (c-GMP) üretimini uyararak etkili olurlar (Levin ve ark 1998). Büyük kan damarlarında bol miktarda NPR-A ve az miktarda da NPR-B bulunur. Beyinde ise daha çok NPR-B reseptörleri vardır (Levin ve ark 1998, Stein ve Levin 1998). Böbrek ve böbrek üstü bezlerinde her iki reseptör eĢit miktarda bulunur (Levin ve ark 1998). NPR-A reseptörüne afinitesi en yüksek olan ANP, sonra BNP ve en az olan ise CNP‟dir. NPR-B reseptörüne olan afinite sırası ise tam tersidir. NPR-C ise diğerlerinden farklı olarak, guanilat siklaz yolunu kullanmaz; lizozomal degredasyon yoluyla natriuretik peptid yıkımında rol oynar. NPR-C, natriuretik peptidlerin dolaĢımdan uzaklaĢtırılmasında ve plazma konsantrasyonlarının düzenlenmesinde ve böylece plazma natriuretik peptid konsantrasyonlarında büyük dalgalanmaların oluĢmasını önleyen hormonal bir tampon sistemi olarak görev yaptığı sanılmaktadır (Levin ve ark 1998, Stein ve Levin 1998).
Natriuretik peptidlerin bağlanmasından sonra, ligand-reseptör kompleksi internalize olur ve natriuretik peptidler enzimatik olarak yıkılarak, reseptör hücre yüzeyine tekrar geri döner. Natriuretik peptidleri temizleyen bir baĢka mekanizma ise, nötral endopeptidaz tarafından enzimatik olarak yıkımıdır. Nötral endopeptidazlar; endotel hücreleri, düz kas hücreleri, kardiyak myositler, böbrek epitel hücreleri ve fibroblastlarda yoğun olarak bulunur. Ayrıca akciğer, adrenal bezler, sindirim sistemi ve beyinde de bulunmaktadır. Bu enzime en yüksek afiniteyi CNP, onu da ANP ve BNP izler (Levin ve ark 1998, Stein ve Levin 1998).
Atrial natriuretik peptid (ANP) ve Brain (beyin) natriuretik peptid (BNP)‟nin renin anjiotensin aldosteron sistemi (RAAS) içerisinde antagonistik görevleri vardır. Vücut savunmasında mineralokortikoidlerin ve tuzun uyardığı vasküler dirence ve plazma hacim geniĢlemesine karĢı önemli bir rol oynarlar. Bu nedenle kan basıncının, kan hacminin ve sodyum dengesinin düzenlenmesinde büyük iĢlev görürler. Natriuretik peptidler vücutta fazla tuz ve su birikmesini önlerler,
14 vazokonstrüktör peptidlerin üretimini ve aktivitesini inhibe ederler. Vasküler gevĢemeyi aktive ederken, sempatik akıĢı inhibe ederler. ANP üretiminin genetik kaybı veya NPR-A reseptörünün yıkımı, hipertansiyon ve ventriküler hipertrofi ile sonuçlanmaktadır (Lopez ve ark 1995).
Renin Anjiotensin Aldosteron Sistemi (RAAS), vazopressin ve sempatik sinir sistemi, sodyum ve sıvı dengesini sağlayarak kan basıncını düzenler. ANP ve BNP bu sistem içerisindeki tuz ve su fazlalığını veya yükselmiĢ kan basıncıyla ilgili durumlarda bu sistemlere karĢı koyarlar. Bunlar ACTH salınımını ve santral sinir sistemi içerisindeki sempatik sinir sistemini inhibe ederler ve periferik olarak glomerüler filtrasyon hızını, diürezi ve natriürezi arttırırken, sistemik vasküler direnci ve plazma hacmini kalbi ani ve hızlı hacim yüklenmesinden korumak için azaltırlar (Mair ve ark 1999).
Sağlıklı bebeklerde plazma BNP düzeyleri, doğumdan hemen sonra pig yapar ve 3 ay içerisinde eriĢkin düzeylere ulaĢır. Doğum sırasında, perinatal dolaĢım değiĢiklikleri sol ventrikül volüm ve basıncındaki artma, BNP sentez ve salınımının artmasına neden olmaktadır. BNP düzeyleri yaĢlılarda daha yüksek bulunmuĢtur. Ayrıca kadınlarda BNP düzeylerinin erkeklerden biraz daha yüksek olduğu saptanmıĢtır (Yoshibayashi ve ark 1995).
1.2.3. BNP ve NT-proBNP
Ġnsan BNP‟si tek kopya gen olarak üç ekson ve iki intron içerecek Ģekilde kodlanmıĢtır. Messenger RNA‟sı ise RNA‟nın stabilitesini sağladığı düĢünülen translate edilmemiĢ 3′ bölgesinde dört adet AUUUAA tekrarlayan zincirinin bulunmasıyla karakterizedir. BNP öncü geninin post-translasyonel iĢlenmesi insan atriyal natriuretik peptid öncü geninden farklıdır. ANP regülasyonu depo granüllerinin salınımı seviyesinde oluĢurken, BNP regülasyonu gen ekspresyonu ile meydana gelmektedir. DolaĢımdaki BNP‟nin temel kaynağı kalp kası hücreleridir (ġekil 1.4.). Son yıllarda kalpteki fibroblastların da BNP üretebildikleri gösterilmiĢtir (Munagala ve ark 2004). Ancak fibroblastların ürettiği bu BNP‟ nin dolaĢımdaki bulunan BNP düzeyine ne oranda katkıda bulunduğu bilinmemektedir. Hem ANP hem de BNP salgılanması için asıl uyarıcı faktör duvar gerilimidir (Magga ve ark
15 1994). ArtmıĢ duvar gerilimi pek çok kalp hastalığının ortak nedeni olasından dolayı dolaĢımdaki BNP düzeyleri bu hastalıkların klinik göstergesi olarak kabul edilebilir. BNP‟nin kan düzeyinin ventrikül ejeksiyon fraksiyonu ile ters orantılı olduğu gösterilmiĢtir (Wei ve ark 1993). Biyolojik olarak aktif BNP, 108 aminoasit içeren pro-BNP ve pro-BNP‟nin geri kalan kısmı NT-proBNP plazmada bulunur ve immün analiz testleri ile ölçülebilirler (Munagala ve ark 2004).
Yapılan çalıĢmaların sonucunda NT-proBNP ile BNP ölçümü benzer değerler göstermiĢtir. BaĢka bir ifadeyle BNP ve NT-proBNP‟nin plazma düzeyleri birbirine paralellik gösterir. Ancak, BNP serumdan natriüretik peptid reseptor-C ve endopeptidazlar aracılığı ile ortadan uzaklaĢtırılır. NT-proBNP ise daha uzun ömürlü ve kararlı bir serum düzeyine sahiptir, gece ve gündüz varyasyon göstermez. Ayrıca bu test hızlı bir Ģekilde çalıĢılabilmektedir (Munagala ve ark 2004).
Şekil 1.4. Brain natriüretik peptidin (BNP) kalp kası hücresinden sekresyonu.
(aa= aminoasit, NTproBNP) (Anonim)
BNP ve NT-proBNP arasındaki farklar
• NT-proBNP değerleri pozisyonla değiĢmez. • NT-proBNP kan yarı ömrü daha uzundur.
• NT-proBNP için alınan daha az kan örneği ve oda sıcaklığında 3 gün stabil kalabilir.
• Ventrikuler fonksiyon bozukluğunda NT-proBNP salınımı daha fazladır. • Sol ventrikul fonksiyon bozukluğunda:
16 NT-proBNP > BNP (2-10 kat)
• NT-proBNP, BNP‟ye göre GFR‟ den daha fazla etkilenir.
Brain (beyin) natriuretik peptid (BNP)‟nin fizyolojik etkileri, organizmaya BNP enjeksiyonu, hücre ya da organlara artan konsantrasyon düzeylerinde BNP uygulanması veya aĢırı BNP ekspresyonu yapan genetik fare modelleri üzerinde araĢtırılmıĢtır. Yapılan bu çalıĢmalarda BNP‟nin ANP‟ye benzer Ģekilde natriuretik reseptor tip A ile bağlanarak intraseluler cGMP yapımına neden olduğu bulunmuĢtur. Sonuç olarak biyolojik etkileri diurez, vazodilatasyon, renin ve aldosteron üretimi ile kalp ve vasküler kas hücre büyümesinin inhibisyonu Ģeklinde gerçekleĢmektedir. Santral sinir sistemindeki ve periferik dokulardaki aktivitesi aracılığı ile sıvı elektrolit dengesini sağlar. Özellikle volüm fazlalığı durumunda BNP‟nin damar gevĢetici etkisi belirgindir ve kan basıncında belirgin bir düĢme sağlar. BNP sempatik tonusu, RAAS‟ni, katekolamin ve endotelin gibi vazokonstriktor moleküllerin sentezini inhibe eder. Renal etkileri arasında sodyum atılımını artırması ve glomerül filtrasyon hızı sayılabilir (Koller ve Goeddel 1992, Davidson ve ark 1996).
1.2.4. Kardiyovasküler Sistemde BNP ve NT-proBNP’nin Kullanımı
Konjestif kalp yetmezliği: Yapılan çalıĢmalar sonucunda, BNP‟nin
ventrikülden salgılandığı için sol ventrikül fonksiyon bozukluğunu daha iyi göstereceği düĢünülmektedir. Serum BNP düzeyi sol ventrikül disfonksiyonunu belirlemede oldukça sensitiftir ve sol ventrikül disfonksiyonunun ciddiyeti arttıkça BNP düzeyi de yükselir. BNP‟ nin konjestif kalp yetmezliği tanısındaki önemi giderek artmaktadır. BNP, tanı ile birlikte prognoz tayini ve tedaviye cevabı değerlendirmede de kullanılmaya baĢlanmıĢtır. BNP kan düzeyinin sol ventrikul ejeksiyon fraksiyonu ile ters orantılı olduğu da bulunmuĢtur (Ari ve ark 2008).
Ventrikül Disfonksiyonu: Semptomatik ve asemptomatik ventrikül
disfonksiyonlarının tanısında ve takibinde yardımcı tetkik olarak kullanılmaktadır. Kalp Kapak Hastalıkları: Aort darlığı olan hastalarda yapılan
17 transvalvüler gradient, duvar stresi, sol ventrikül diyastol sonu basınç ve sol ventrikul hipertrofi miktarı ile korelasyon gösterdiği bildirilmiĢtir (Qi ve ark 2001). BNP‟nin hastalığın progresyonu ve sol ventrikul disfonksiyonun erken göstergesi olarak kullanılabileceği de düĢünülmektedir.
Akut Romatizmal Ateş: Son yıllarda ülkemizde yapılan çalıĢmalarda
akut romatizmal ateĢli hastalarda NT-proBNP düzeylerinin hastalığın akut döneminde yüksek olduğu ve hastalığın tedaviyle birlikte gerilediği, ilerleyen zamanda normale döndüğünü ortaya konmuĢtur. Yapılan bu çalıĢmalar, NT-proBNP‟nin ARA‟nın tanısında kullanılabileceğini, kalpteki inflamasyonu yansıttığından hastaların tedavilerinin takibinde de diğer laboratuvar bulgularını destekleyici olarak kullanılabilir.
Akut Koroner Sendrom: Miyokard infarktüsünün deneysel
çalıĢmaları BNP gen transkripsyonunun enfarkt alanında ve çevresindeki sağlıklı miyokard dokusunda arttığını gösterilmiĢtir. Hipoksinin BNP salınımını bizzat tetiklediği de bilinmektedir.
Akut koroner sendrom (AKS)‟lu hastalarda subakut evrede yapılan NT-proBNP ölçümünün mortalite üzerindeki prognostik değeri çeĢitli çalıĢmalarla araĢtırılmıĢ ve doğru yorumlandığında NT-proBNP ölçümünün çok yararlı tanısal bilgi sağlayabileceği sonucuna varılmıĢtır.
1.2.5. BNP’nin Normal Değerleri
Serum BNP düzeyinin normal olarak kabul edilen değerleri seçilen hasta gruplarına göre değiĢiklik göstermektedir. Konjestif kalp yetersizliği bakımından değerlendirilen hastalarda ölçülen serum NT-proBNP değeri 125 pg/ml altında bulunması durumunda kalp yetersizliği tanısı kuĢkuludur ve yüksek olasılıkla kardiyak fonksiyon bozukluğu dıĢlanır (negatif tanısal değeri ≥% 97). NT-proBNP değerinin 125 pg/ml üzerinde olması durumunda kardiyak fonksiyon bozukluğu olduğu düĢünülmelidir. Acil servise nefes darlığı ile baĢvuran hastalarda akut kalp yetersizliği tanısında NT-proBNP serum düzeyine bakıldığında 300 pg/ml altında kalp yetersizliği tanısından uzaklaĢılırken, 300-1800 pg/ml arasında kalp yetmezliğinden kuĢkulanılır ve 1800 pg/ml üzerinde kalp yetmezliği tanısı kesinleĢmektedir (Bergler-Klein ve ark 2004). Kronik kalp yetersizliği olmadığı
18 halde BNP‟nin yüksek olduğu bazı durumlar vardır. Bunlar ileri yaĢ, kadın cinsiyet, böbrek yetersizliği, akut miyokard infarktüsü, sağ kalp fonksiyonlarını etkileyen akciğer hastalıkları ve pulmoner embolidir. Ancak bazen kalp yetmezliği olduğu halde serum BNP düzeyi normal bulunmaktadır. Bu durumlar ise, ani akciğer ödemi, ventrikül fonksiyon bozukluğu olmadan kalp yetersizliğine sebep olan mitral stenoz, atriyal miksoma ve akut mitral yetersizliğidir (Georges ve ark 2004).
1.3. Osteopontin (OPN)
Ġlk defa Ahnders Franzen ve Dick Heinegard tarafından 1985 yılında kemik dokusundan izole edilen (Yasui ve ark 2001) osteopontin (OPN), asit karakterli, negatif yüklü, hidrofilik, O ve N- bağlı oligosakkaritler içeren bir glikofosfoproteindir ve yaklaĢık 300 aminoasitten oluĢan tek zincirli bir polipeptittir (Ullrich ve ark 1991).
Osteopontin, osteoblast, osteoklast, makrofajlar, T hücreler, hemotopoetik hücreler, vasküler düz kas hücreleri, fibroblastlar, miyokardial hücreler ve diğer birçok hüclerce salgılanan fosforillenmiĢ glikoproteindir (Okamoto 2007). Vücut sıvılarının büyük bir kısmına salgılanmaktadır. Kanda, sütte (laktopontin), idrarda (üropontin) ve seminal sıvıda bulunduğu gibi en çok tükürük, süt ve safrada da bulunur (Mazzali ve ark 2002).
Normal dokuda osteopontin mineralize kemik matriksi, fibroblast ve epitelyal alanda bulunur (Denhardt ve Guo 1993). Böbreklerdeki görevi nitrik oksit sentazın (NOS) düzenlenmesi ve üriner kalsiyum oksalat birikim inhibisyonudur (Yamate ve ark 2000). Patolojik süreçde endotelyal hücreler, T hücreleri, tümör hücreleri, makrofajlar ve düz kas hücrelerinde görülür (Denhardt ve Guo 1993). OPN‟nin esas olarak immünite ile iliĢkili hücrelerde infiltrasyon ve selüler migrasyonda olmak üzere, dokuların restorasyonunda ve anjiogenesis, hücre ölümünün inhibisyonu ve tümör metazlarında ekstrasellüler matriksin yeniden düzenlenmesinide içeren inflamatuar hastalıklarda önemli rol oynadığı belirlenmiĢtir. OPN romatoid artirit gibi otoimmün hastalıklarla ve sarkoidoz gibi granülomatoz hastalıklarla da iliĢkilidir (Okamoto 2007).
19 OPN, kemik dokusunda çeĢitli diferensiyon aĢamalarından sonra, diferensiye olmuĢ osteoblast ve osteositler ve ayrıca osteoklastlar tarafından sentezlenmektedir. Embriyonik stromada ve yara iyileĢmesinde fibroblastlardan salgılanmaktadır. Gebe farelerde embriyonun implantasyonu öncesinde osteopontin ekspresyonunun yüksek olduğu gözlenmiĢtir (Sodek ve ark 2000).
OPN, kemik siyaloproteini 1, idrar taĢı proteini, sekrete edilen fosfoprotein1, nefropontin, üropontin, ETA-1 isimleriyle de bilinmektedir (Gericke ve ark 2005).
OPN salgısının arttığı bazı hastalıklar aĢağıdadır: Malignensiler
Arteryal restonoz Arteryoskleroz
Native valvuler stenoz Bioprostetik valvuler stenoz Renal tubulointerstiyal fibroz Miyokart infarktüsü Serebrovasküler hastalıklar Sarkoidoz Granülomlar Tüberküloz Nefrolitiyaz (Taylan 2007) 1.3.1. Osteopontin Yapısı
Osteopontin aspartik asitden zengin, azot ucu glikolizlenmiĢ bir proteindir, trionin ve serinden zengin hücrelere yüksek düzeyde bağlanabilir (Scatena ve ark 2007). Osteopontinin 2 adet heparin bağlama bölgesi, 1 adet trombin bağlama bölgesi ve 1 adet kalsiyum bağlama bölgesi bulunduğu ileri sürülmektedir. Bu bağlanma sayesinde osteopontine bağlı 2 fonksiyonel bölüm oluĢmaktadır. Bu bölümler; N terminal ve C terminal bölümleridir. N terminal bölümü, integrin
20 reseptörlerinin osteopontine bağlanmasını sağlayan kısım olan RGD (arginin-glisin-aspartat)‟dir. C terminal bölümü ise CD44 varyantlarının bağlandığı kısımdır. Buna ilaveten C terminal bölümü 2 heparin bağlama bölgesi içermektedir. Hem bağlı osteopontinin hem de natif osteopontinin integrin bağlama özelliği bulunmaktadır (ġekil 1.5.). Ancak bazı hücrelerde bağlı osteopontin formu, natif formdan daha güçlü Ģekilde integrinlere bağlanma özelliğine sahiptir (Standal ve ark 2004).
Sekil 1.5. Osteopontinin yapısal Ģekli (Anonim)
OPN, tek kopyalı bir gen tarafından eksprese edilmektedir. Bu proteinin olgunlaĢmamıĢ hali yaklaĢık olarak 34 kDa ağırlığındadır ve posttranslasyonal modifikasyonlardan sonra olgunlaĢmaktadır. Memeli ve kanatlı OPN proteinleri benzer sayıda aminoasit içerse de modifikasyonlar ve SDS-PAGE de farklı davranıĢlar sonucu 44 kDa ile 75 kDa arasında ağırlıklara sahip formları gözlenmektedir. Bu proteinin aspartik asit, glutamik asit ve serin aminoasitlerinden zengin olmasından dolayı hidroksiapatit ve kalsiyum iyonlarını bağlayabilmektedir. Ayrıca RGD kısmı hücreler arası bağlantıya aracılık etmektedir. Bunlara ek olarak serin-treonin kaynaklı fosforilize kısım, N ve O bağlı glikozile kısımlar trombin bağlama bölgesi ile beraber hücreler arası bağlantıyı sağlamaktadır. Fosforilasyon, glikozilasyon ve sülfatlanmasındaki değiĢiklikler osteopontinin farklı veya aynı dokularda değiĢik fonksiyonel formlarının oluĢmasına neden olmaktadır (Sodek ve ark 2000).
21 Ġnsan osteopontini yaklaĢık 32 kDa moleküler ağırlığa sahip, 4. kromozomda lokalize (4ql3), 7 tane ekzon içeren (Young ve ark 1990), 314 aminoasitten oluĢan tek sarmallı bir polipeptitdir. OPN proteini üretiminden sonra Ser/Thr kinaz enzimince fosforillenir ve ardından bu fosfoprotein zincirine Ģeker ilave edilir. Tüm bu hücre içi değiĢikliklerin ardından da hücrelerden salgılanır. Bu posttranslasyonel değiĢiklikler organlar ve dokular arasındaki moleküler ağırlıklarına ve üretim zamanlarına göre çeĢitlilik gösterir (Okamoto 2007).
1.3.2. Osteopontin Ekspresyonunun Düzenlenmesi
Osteopontin ekspresyonunun düzenlenmesi tam olarak anlaĢılamamıĢtır. D vitamini cevabı, interferon uyarıcı elementler, glukokortikoidler, pürinden zengin dizilim OPN‟yi uyarır (Denhardt ve Guo 1993, Patarca ve ark 1993, Koszewski ve ark 1996). Öncül yangı sitokini olan nitrik oksit (NO) ve endotoksin de makrofaja etkileyerek OPN transkripsiyonunu ve ekspresyonunu artırır (Guo ve ark 2001). Ayrıca, OPN‟nin TGF-β, EGF, TNF-α, PDGF, bFGF gibi büyüme faktörleri, IL-1α, IL-2 gibi sitokinler, retinoik asit, endotelin ve concanavalin A tarafından transkripsiyonu artırılır (Okamoto 2007). Bunların dıĢında, anjiotensin 2, TGF-β, hipoksi, hiperglisemi de OPN‟nin düzenlenmesinde rol alır (Ricardo ve ark 2000, Takemoto ve ark 2000, Sodhi ve ark 2001, Hullinger ve ark 2001).
1.3.3. Osteopontinin Fonksiyonları
1.3.3.1. Biyomineralizasyon da OPN’nin Rolü
Son yıllarda kemikte kollajen yapılı olmayan birçok protein izole ve karakterize edilmiĢtir. Bu proteinlerden biri olan osteopontin, hidroksiapatit yapıya çok sıkı Ģekilde bağlanan bir proteindir ve osteoklast ile osteoblastlar tarafından sentezlenmektedir. Kemik dokusunun tüm kısımlarında bulunmaktadır. Ġçerdiği asidik aminoasitler ve fosfor sayesinde hidroksi apatit yapıya sıkı bir Ģekilde bağlanmaktadır. OPN varlığının normal kemik oluĢumu ve geliĢiminin parçası olan osteoklast farklılaĢmasında çok önemli bir rolü olmadığı düĢünülürken patolojik durumlarda ise osteoklast sayısının ve aktivitesinin artmasında osteopontinin önemli role sahip olduğu gözlenmiĢtir. OPN sentezi kalsitrol tarafından stimüle
22 edilmektedir. Osteopontinin, osteoklastların kemik yüzeyine bağlanmasına yardımcı olduğu düĢünülmektedir (Reinholt ve ark 1990, Standal ve ark 2004).
Mineralize dokularda osteopontin hem osteoblastlardan hem de osteoklastlardan sekrete edilebilmektedir. Osteopontin, yoğun Ģekilde önceden var olan veya yeni oluĢan kemik kısımlarında (sement kısmında) ve hücrelerle temas halindeki lamina limitans katmanında, kemik yüzeyinde bulunmaktadır. Lamina limitanstaki osteopontin, osteoklastların kemiğe bağlanmasına aracılık etmektedir (Standal ve ark 2004).
Kemik matriksinde, inorganik yapıları içeren hidroksiapatit (HA- [Ca10( PO4)6(OH)2]) ile protein ve proteoglikanları içeren organik kısımlardan oluĢmaktadır. Osteopontin, kemikteki kollajen olmayan büyük proteinlerden biridir. Osteopontindeki elektronegatif karakterli glutamik ve aspartik asit kalıntıları, kalsiyumun bağlanmasında olduğu gibi hidroksiapatite sıkı Ģekilde bağlanmasını sağlar. Osteopontin, potansiyel bir mineralizasyon sürecini engeller. Bu da osteopontinin hidroksiapatite bağlanması böylelikle de hidroksiapatit kristallerinin geliĢiminin engellenmesi Ģeklinde gerçekleĢir (Standal ve ark 2004).
Farelerde OPN ile yapılan birkaç çalıĢma göstermiĢtir ki biyomineralizasyonun kontrolünde OPN‟nin major fizyolojik fonksiyonu vardır. OPN, farelerde mekaniksel veya parotroit hormon uyarısına cevaben trabeküler kemiklerde artmıĢtır ve OPN bu kemiklerde rezorbsiyonu yönlendirmektedir (Ishijima ve ark 2002, Kitahara ve Ishijima 2003). Farelerde yapılan çalıĢmalarda OPN apatitkristallerinin büyümesi ve geliĢmesinde regülatör bir rol oynar (Boskey ve ark 1993). Bunlara ilaveten OPN‟nin osteoklast hücrelerinin diferansiyasyonunu modüle ettiği de görülmüĢtür (Chellaiah ve Hruska 2003).
1.3.3.2. İnflamasyonda OPN’nin Rolü
Osteopontin dolaĢan monositlerden salgılanmaz fakat makrofajlarca salgılanan çoğu hayati proteinlerden ve makrofaj–kemotaktik güçlü uyaranlardan biridir. OPN, inflamatuvar yanıt süresince makrofaj infiltrasyonunu düzenlediği gösterilmiĢtir (Weber ve Cantor 1996, Crawford ve ark 1998). Farelerde OPN‟nin fonksiyonel inhibisyonu ve genetik ablazyonu makrofajların düzenlenmesini önemli derecede bozmuĢtur. OPN antibody (antikor) ile nötralize edilmiĢ, kresentirik
23 glomerülonefritli bir modelde makrofaj infiltrasyonun önemli düzeyde azaldığı gösterilmiĢtir (Yu ve ark 1998). Benzer bir Ģekilde antikor ile nötralize edilmiĢ OPN‟li bir çalıĢmada bakteriyal kemotaktik peptide cevaben makrofaj infiltrasyonunun da bloke olduğu gösterilmiĢtir (Ophascharoensuk ve ark 1999). OPN‟nin akut inflamatuvar süreçte lökositlerin ve diğer hücre tiplerinin infiltrasyonun da da yüksek düzeylerde salgılandığı, farelerde yapılan yara iyileĢmesi çalıĢmaların da gösterilmiĢtir. Bir indirekt mekanizma olmasına rağmen OPN düzeyinin stromal (yapısal) ve fibriler kollejenlerin organizasyonunda önemli rolünün olduğunu tüm bu sonuçlar desteklemektedir (Liaw ve ark 1998). Aynı zamanda bu veriler OPN‟nin fagositik hücrelerin aktivitelerini destekledikleri sonucuna da varılabilir. Kemik hasarının iyileĢmelerinde ve mikrogliya hücrelerin beyinde geliĢiminde OPN‟nin fagositik aktiviteyi pozitif yönde düzenlediğini diğer çalıĢmalar da desteklemektedir. Böylece OPN‟nin sadece inflamatuvar hücrelerin düzenlenmesinde değil aynı zamanda aktivasyon süreçlerinin düzenlenmesinde de rol aldığını gösterir (Choi ve ark 2004, McKee ve Nanci 1996).
OPN inflamatuvar reaksiyonların akut fazını düzenlediği gibi kronik inflamatuvar süreçlerce de uyarılabilir. Kronik inflamasyonla karakterize yaralanmalar ve hastalıklarda makrofajların infiltrasyonlarını sağlar. Ateroskleroz, granülomatuar hastalıklar, anti tip II kollajen ile iliĢkili artiritler ve biyomateryal implantasyonlarında makrofajların birikmesini OPN‟nin desteklediği farelerde yapılan çeĢitli çalıĢmalarda gösterilmiĢtir. Tüm bu veriler, OPN‟nin kronik inflamasyon sürecinde makrofajların yığılmasını (toplanmasında) uyardığını desteklemektedir (Scatena ve ark 2007).
OPN makrofaj üzerindeki rolü açıktır. Ancak OPN lenfositleride etkilemektedir. Aktive CD4 hücreleri OPN‟ni yüksek düzeyde salgıladıkları bilinmektedir (Weber ve Cantor 1996). Sarkoidoz ile iliĢkili hastalıklarda lenfositlerce OPN salgılatıldığı tespit edilmiĢtir ve OPN‟nin salgılanması granülomun matrasyonu ile de uyumludur. OPN; T hücrelerinin kemotaksisini azaltır, adezyonunu destekler ve proliferasyonunda yardımcı uyarandır (O‟Regan ve ark 1999). OPN aynı zamanda insan T hücrelerinde IFN (interferon)–gama ve CD40 ligand (CD40L) salınımını azaltmaktadır ve CD-3 stimülasyonu ile beraberce üretilen IFN gama bağımlı IL-12 (interlökin-12) üretimini de azaltmaktadır. Bu bulgular OPN‟nin erken dönem TH1 (T-helper1) cevabında fonksiyonel bir rolünün
24 olduğunu desteklemektedir. Yani IL-12 üretimi ile bağımlı T hücrelerinin düzenlenmesini sağlar (O‟Regan ve ark 2000, O‟Regan ve ark 2000). Son dönemde ki çalıĢmalar, CD8 ve CD4 T hücrelerinin hayati rol oynadığı otoimmün ensefalopati ve multiple sklerozlu deneysel çalıĢmalarda (farelerde multiple skleroz ve otoimmün ensefalopati geliĢtirilmiĢ deney modellerinde) OPN‟nin bu otoimmün hastalıkların ilerlemesine neden olduğunu desteklemektedir. Ancak tüm bu verilere rağmen günümüzde hala OPN‟nin tipleri, reseptörleri ve uyarı yollarının ne gibi prosesler içerdiği bilinmemektedir (Hur ve ark 2007).
1.3.3.3. Kardiyovasküler Sistemde OPN’nin Rolü
Osteopontin sağlıklı kalp kası dokusundan salgılanmaz. OPN‟nin kalp kası dokusundan salınımını hipoksi ve basınç/volüm değiĢiklikleri gibi mekaniksel uyarılar arttırır. Buna ilaveten OPN‟nin salınımı sıçan kardiyak fibroblastlarındaki anjiotensin II (AII) tarafından da arttırılır. OPN kardiyak fibroblastlarda MMP-2 (matrix metalloproteinaz) ve MMP-9‟un aktivasyonu ile stimüle olan IL-1β‟ı inhibe eder (Okamoto 2007).
OPN esas olarak miyokard infarktüsünün 1-3. günlerinde oluĢan intersisyel dokulardaki makrofajlar gibi infiltratif hücrelerce üretilir (Okamoto 2007). Suezawa ve arkadaĢları yapmıĢ oldukları çalıĢmada akut miyokard infarktüsünün baĢlangıçından sonraki iki hafta boyunca serum OPN düzeyinin yüksek seyrettiğini buldular. BaĢka bir ifadeyle serum OPN düzeyi ile akut miyokard infarktüsü arasında önemli bir iliĢki vardır. Koroner arter hastalığının ciddiyeti ile serum OPN düzeyi arasında da kolerasyon olduğu yapılan çalıĢmalarla tespit edildi. Ayrıca, anjina pektorisli hastalarla yapılan bir çalıĢmada serum OPN düzeyinin yüksek olduğunu gösterdiler (Suezawa ve ark 2005). Tüm bu bulgular serum OPN düzeyinin iskemik kalp hastalığının, aterosklerozun ciddiyetinin ve kalp yetmezliğinin tanısında kullanılabileceğini iĢaret etmektedir.
OPN düzeyi azaltılmıĢ farelerde yapılan çalıĢmada yara iyileĢmesinde büyümenin normal olduğu ancak kollajenlerin yara sahasında depolanmalarının anormal olduğu gösterilmiĢtir (Liaw ve ark 1998). OPN düzeyi azaltılmıĢ farelerde oluĢturulan miyokardial infarktüs modellerinde yapılan çalıĢmada fibrosise kollajen
25 depolanmasının eĢlik etmediği ve ventriküler dilatasyon oluĢtuğu gösterilmiĢtir. Özellikle de Tip I kollejen ile iliĢkili kollejen depolanmasının oluĢmadığı tespit edilmiĢtir (Trueblood ve ark 2001). Yukarıdaki tüm bu bulgular OPN‟nin inflamasyonu takiben doku iyileĢmesi sürecinde, miyokardial fibrosis ve remodelingde etkili ve önemli olduğu hipotezini desteklemektedir. Fibrosis kalp kasının yapısal bütünlüğünü korumak amacıyla hasarlı kalp kası tarafından aktivite edilir ve miyokardiyal remodeling sistemininde temelini oluĢturur. AII tarafından düzenlenen miyokardial remodeling ve fibrosis sürecinde OPN‟nin aĢırı salgılandığı ve OPN düzeyinin azaldığı durumda ise kontraktilitenin ve fibrosis sisteminin bozulduğu sonucuna varılmıĢtır (Okamoto 2007). OPN salınımını optimize ederek miyokardial remodelingi kontrol edebilmeyi tedavi stratejesi olarak kullanabiliriz.
Stawowy ve ark (2002), dilate kardiyomiyopatili on kalp hastasından aldıkları miyokardiyal biyopsilerde miyokardiyal hücrelerden OPN salgılandığını ve bunun ejeksiyon fraksiyonun (EF) artıĢını ve Sol Ventriküler (LV) dilatasyonunu azalttığını tespit ettiler. Satoh ve ark (2005), Dilate Kardiyomiyopatili (DKM) 51 hastadan aldıkları biyopsilerle yaptıkları çalıĢmada da sadece miyokardiyal hücrelerden OPN salgılandığını ve bununda Tip I kollejen değiĢiklikleri, LV dilatasyonu ve EF ile iliĢkili olduğunu tespit ettiler.
26
2. GEREÇ VE YÖNTEM
2.1. Çalışma Şekli
ÇalıĢmaya Mayıs 2009 - Nisan 2011 tarihleri arasında Selçuk Üniversitesi Meram Tıp Fakültesi Çocuk Kardiyoloji Kliniğine Akut Romatizmal AteĢ tanısı ile yatırılıp tanı anında kalp kapağı tutulumu tespit edilen ve Akut Romatizmal AteĢ tanısı alan, yaĢları 6-16 arasında değiĢen toplam 15 hasta alındı. Kontrol grubu olarak çeĢitli nedenlerle çocuk kardiyolojisi polikliniğine yönlendirilen ve Akut Romatizmal AteĢ açısından herhangi bir kardiyak patolojisi olmayan yaĢları 6-16 arasında değiĢen 21 sağlıklı çocuk alındı. Bu tez proje çalıĢması; Selçuk Üniversitesi Tıp Fakültesi Etik Kurulunun 2009/077 numaralı kararı ile onaylanmıĢtır.
2.2. Olgu Seçimi
Selçuk Üniversitesi Meram Tıp Fakültesi Çocuk Kardiyoloji Kliniğine Akut Romatizmal AteĢ tanısı ile yatırılıp tanı anında kalp kapağı tutulumu veya tutulum Ģüphesi tespit edilen ve Akut Romatizmal AteĢ tanısı alan, yaĢları 6-16 arasında değiĢen toplam 15 (7 erkek ve 8 kız) hasta alındı. Kontrol grubu olarak çeĢitli nedenlerle çocuk kardiyolojisi polikliniğine yönlendirilen ve Akut Romatizmal AteĢ açısından herhangi bir kardiyak patolojisi olmayan yaĢları 6-16 arasında değiĢen 21 (12 erkek ve 9 kız) sağlıklı çocuk alındı.
Jones kriterlerine göre iki major veya bir majör iki minör bulgusu olup, ASO titresi 200 ĠÜ üzerinde olan ve akut faz reaktanları yüksek bulununan hastalar aktif ARA olarak kabul edildi. Bu hastalardan; ARA tanısı sırasında pediatrik kardiyolog tarafından yapılan renkli Doppler ekokardiyografik (EKO) incelemede karditi tespit edilip, hipertansiyon, renal ve hepatik fonksiyon bozukluğu olmayanlar çalıĢmaya alındı.
Çocuk kardiyoloji servisine yatırılan hastaların anamnez bilgileri alınıp, sistem muayeneleri özellikle kardiyolojik değerlendirmesi ayrıntılı olarak yapıldı. YatıĢ anında kiloları, vücut ısısı, istirahattaki sistolik ve diyastolik kan basıncı ile nabız sayısı ölçüldü. Rutin laboratuvar incelemelerinde eritrosit sedimentasyon hızı
27 ve CRP düzeylerine bakıldı. Tele kardiyografi çekilerek kalp/toraks oranları (KTO) hesaplandı ve 0.50‟nin üzerinde olması kardiyomegali olarak kabul edildi. Elektrokardiyografi (EKG) çekilip P-R aralığı ölçüldü. Sıklıkla 5-15 yaĢları arasında görülen ARA için 0,16 saniye ve üzerindeki değerler uzamıĢ P-R aralığı olarak kabul edildi.
ÇalıĢma hakkında bireylere projenin amacı ve kapsamını açıklayıcı bilgiler verildikten sonra kendilerinden yazılı aydınlatılmıĢ onay belgesi alındı.
2.3. Örneklerin Toplanması ve Saklanması
Hastaların NT-proBNP ve OPN ölçümü için kan örnekleri, tedavi öncesi (0. hafta) ve tedavi sonrası (ortalama 12. hafta) olmak üzere toplam iki kez alındı. Kan örnekleri sabahları, istirahat halinde, hasta otururken, antekübital venden, lityum-heparinli tüplere alındı. Örnekler yarım saat içinde pıhtılaĢmayı takiben 2500 devirde 10-15 dakika santrifuj iĢlemi uygulanarak serum örnekleri elde edildi. Ayrılan serum örnekleri 1 ml‟ lik ependorf tüplerine konularak (-)80 derecede dondurulup ölçüm yapılana kadar bekletilmek üzere saklandı. Analiz günü (-)80 deceden çıkarılan numumeler oda ısısına getirilerek çalıĢmalar yapıldı.
2.4. Biyokimyasal Analizler
Cihazlar ve Teknik Araç-Gereçler
Siemens Advia Centaur XP (U.S.A.) otoanalizörü
Osteopontin ELISA okuyucu ve yıkayıcısı (BĠOTEK)
Beckman Coulter Ġmmage 800 Ġmmunochemistry System (U.S.A.) otoanalizörü
Alifax s.p.a (Italy) otoanalizörü
Santrifüj (Hettich Rotina 46R- Beckman Coulter Microfuge 22R Centrifuge)
28
Ultra saf su
2.4.1. NT-proBNP Ölçümü
Plazma NT proBNP düzeyi analizi için ADVIA Centaur BNP kiti (Siemens Healthcare Diagnostics Inc, USA, Ref no: 02816138) kullanılarak Siemens Advia Centaur XP otoanalizöründe ölçüm yapıldı. Test prensibi kısaca Ģu Ģekildedir: Bu test iki monoklonal antikorun sabit miktarlarda kullanıldığı, direkt kemilüminesans yöntemiyle yapılan iki bölgeli bir sandviç immün testidir. Numuneler kendilerine karĢılık gelen küvetler içine alınarak Lite reaktif (akridinyum esteri ile iĢaretlenmiĢ insan anti-BNP antikoru) eklenmesiyle inkübe edilir. Daha sonra Katı Faz (manyetik streptavidin patiküllerine bağlanmıĢ BNP‟ye karĢı oluĢturulan biotinlenmiĢ insan anti-BNP antikoru) aktarımıyla tekrar inkübe edilerek, aspirasyon ve ardından yıkama reaktifi ile yıkama gerçekleĢtirilir. Kemilüminesans reaksiyonu baĢlatmak için Asit reaktif ve Baz reaktif eklenilir. Numune içindeki NT proBNP miktarı ile sistem tarafından saptanan rölatif ıĢık birimi (RLU) miktarı arasında bir direkt iliĢki mevcuttur. Sonuçlar sistem çalıĢtırma talimatlarında belirtildiği Ģekilde ng/mL cinsinden hesaplandı.
2.4.2. Osteopontin Ölçümü
Plazma Osteopontin düzeyi RayBio Human Osteopontin ELĠSA kiti (RayBiotech, Inc., USA, Cat#: ELH-OPN-001) kullanılarak enzim immunoassay yöntemi ile ölçüldü. Test prensibi kısaca Ģu Ģekildedir: Standartlar, kontrol örnekleri ve insan serum numuneleri; insan OPN antikoru ile kaplanmıĢ kuyucuklarda inkübe edilir. Ġnkübasyon ve yıkamanın ardından biotin ile iĢaretli insan OPN antikoru kuyucuklara ilave edilir. Ġmmobilize OPN antikor kompleksi ile inkübe edilir. Ġkinci yıkamanın ardından streptavidin-HRP konjugatı eklenir. Ġnkübasyon ve son yıkamanın ardından kalan konjugat, substrat solusyonu (TMB) ile reaksiyona girer. Reaksiyon asidik solusyon eklenerek durdurulur. Meydana gelen sarı rengin absorbansı 450 nm dalga boyunda spektrofotometrik olarak ölçülür. Absorbanslar OPN konsantrasyonu ile doğru orantılıdır. Standart OPN konsantrasyonlarına karĢılık
29 gelen absorbans değerleri ile standart eğrisi çizilir. Bu standart eğrisi kullanılarak numunelerin OPN konsantrasyonları pg\ml cinsinden hesaplandı.
Yöntemin çalıĢma içi ve çalıĢmalar arası %CV (Coefficient of Variation) değerleri sırasıyla <%10 ve <%12 Ģeklindedir. Saptayabildiği en düĢük osteopontin konsantrasyonu ise <50 pg/ml‟ dir.
Kullanılan Malzemeler
1. OPN mikroplate (A maddesi) : Ġnsan OPN antikoru ile kaplanmıĢ 96
kuyucuk
2. Konsantre Yıkama Tamponu (20x) (B maddesi): 25 ml (20x) konsantre
çözelti
3. Standartlar (C maddesi): 2 ĢiĢe rekombinant insan OPN‟i
4. Çözelti Seyreltici A (D maddesi): 30 ml serum ile koruyucu olarak %0.09
sodyum azit
5. Çözelti Seyreltici B (E maddesi): 5x konsantre tampon (15 ml.) (Standart
seyreltmek için).
6. OPN Antikor Tespiti (F maddesi): 2 ĢiĢe BiotinlenmiĢ anti-insan OPN (Her
bir ĢiĢeye yarım mikroplate çözelti yeterlidir)
7. Konsantre Streptavidin-HRP (G maddesi): 25.000x konsantre
HRP-konjuge streptavidin (8 μl)
8. TMB Tek Adım Substrat Reaktifi (H maddesi): Tampon çözelti içinde
3,3‟,5,5‟- Tetrametilbenzidine (TMB) (12 ml)
9. Stop solüsyonu (I maddesi): 2 M sülfürik asit (8 ml) Reaktiflerin Hazırlanması
1. Kullanmadan önce tüm reaktifleri ve örnekleri oda sıcaklığına getirin.
2. Örnek seyreltme: Örnekleri seyreltmek gerekiyorsa, (Madde D)
serum/plazma örneklerinin seyreltilmesi için kullanılır ve (Madde E) kültür süpernatantlar ve idrarın seyreltilmesi için kullanılır.
