Türk Mikrobiyol Cem Derg (2004) 34:211-214
211 G‹R‹fi
Staphylococcuscinsi içinde en önemli insan patojeni S.aureus’tur. S.aureus burun ön kanatlar›nda,koltuk altlar›nda s›kl›kla kolonize olarak bulunur ve uygun koflullar alt›nda ciddi f›rsatç› infeksiyonlara yol açar. S.aureus’un daha az virulan olan stafilokok türlerin-den ayr›m› klinik aç›dan önem tafl›maktad›r (1). Tüp koagülaz testi S.aureus’un identifikasyonunda en güvenilir yöntemdir.Test, koagülaz enziminin prot-rombine ba¤lanarak trombin oluflumuna, bunun da fibrinojenin fibrin p›ht›s›na dönüflmesine yol açmas›-na dayan›r(2,3). S.aureus’un di¤er stafilokoklardan ay›rdedilmesi için araflt›r›lan bir özelli¤i de deoksiri-bonükleaz (DNaz) aktivitesidir; baz› laboratuvarlar-da S.aureus’un rutin tan›mlamas› için kullan›lmakta-d›r (3,4). Son y›llarda h›zl› aglütinasyon testleri kul-lan›ma girmifltir. Bu testler S.aureus’un farkl› yüzey
yap›lar›na ba¤lanarak reaksiyon verebilen molekül-lerle kapl› lateks partikülleri içermektedirler. Bunlar-dan Staphaurex (Murex) ProteinA ve Clumping fak-törü saptayabilen bir kittir(2,5). Stafilokok türlerinin ayr›m›nda kullan›lmak üzere gelifltirilmifl, biyokim-yasal testlere dayanan ticari kitler de mevcuttur. Bu kitler S.aureus ayr›m›n› yapman›n yan›nda, koagülaz negatif stafilokoklar›n tür düzeyinde tan›s›n› da ola-nakl› k›lmaktad›r(6,7).
Bu çal›flmada tavflan plazmas› ile yap›lan tüp koagü-laz metodu referans metod seçilerek, DNaz, aglüti-nasyon kitlerinden Staphaurex ve ticari identifikas-yon kitlerinden ID 32 Staph’›n (BioMerieux) S.aure-ustan›mlamas›ndaki duyarl›l›k ve özgüllü¤ünün kar-fl›laflt›r›lmas› yap›lm›flt›r. Ayr›ca ID32 Staph kiti ile etken koagülaz negatif stafiloklar›n tür da¤›l›m› ve-rilmifltir.
Staphylococcus aureus’un ‹dentifikasyonunda Kullan›lan
Üç Metodun De¤erlendirilmesi (*)
(*) Microbiologia Balcanica 2003,3rd Balkan Conference of Microbiology ‘de sunulmufltur (Eylül 4-6,2003 ‹stanbul) (**) fiiflli Etfal E¤itim ve Araflt›rma Hastanesi, Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Laboratuar›, ‹stanbul (***) fiiflli Etfal E¤itim ve Araflt›rma Hastanesi, Enfeksiyon Hastal›klar› ve Klinik Mikrobiyoloji Klini¤i, ‹stanbul
Banu BAYRAKTAR(**), Dilek YILDIZ (***), Emin BULUT(**) fieyda ÖCALMAZ(***), Engin SEBER(***)
ÖZET
Bu çal›flmada Staphylococcus aureus identifikasyonunda kullan›lan DNase, Staphaurex ve ID32 Staph metodlar› karfl›laflt›-r›lm›flt›r. 80 stafilokok izolat› çal›flmaya dahil edilmifltir. Sitratl› tavflan plazmas› ile yap›lan tüp koagülaz testi referans me-tod olarak kullan›lm›flt›r. Genel olarak tüm meme-todlar birbiriyle uyumlu sonuçlar vermifltir. Yöntemlerin duyarl›l›k ve özgül-lükleri s›ras›yla DNaz için %96,7 ve %94,7; Staphareux için %95 ve %84,2; ID32 Staph için %94,6 ve %100 olarak bulun-mufltur.
Anahtar sözcükler: Staphylococcus aureus, identifikasyon, tüp koagülaz, DNaz, Staphaurex, ID32 Staph, SUMMARY
Evaluation of Three Methods for Identification of Staphylococcus aureus
In this study DNase, Staphaurex, ID32 Staph methods were compared for identication of staphylococci. A total of 80 staph-ylococcal isolates were included. A tube coagulase test using citrated rabbit plasma was used as a reference method. In ge-neral all methods gave concordant results. The sensitivities and specificities, respectively, were 96,7% and 94,7% for DNa-se, 95% and 84,2% for Staphaurex, 94,9% and 100% for ID32 Staph.
Türk Mikrobiyol Cem Derg (2004) 34:211-214
212
GEREÇ VE YÖNTEM
fiiflli Etfal E¤itim ve Araflt›rma Hastanesi Mikrobi-yoloji Laboratuvar›nda çeflitli klinik örneklerden so-yutlanan toplam 80 stafilokok izolat› çal›flmaya dahil edilmifltir. Tüp koagülaz testi ile izolatlar›n 61 tane-si S.aureus, 19 tanetane-si koagülaz negatif stafilokok (KNS) olarak tan›mlanm›flt›r.
Tüp koagülaz için serum fizyolojik ile 1/5 oran›nda suland›r›lm›fl sitratl› tavflan plazmas› kullan›lm›flt›r. Bir gecelik saf stafilokok kültüründen öze ile bir ko-loni al›narak plazma içinde süspanse edilmifl, 37
o
C’de inkübe edilmifltir. Ekimi takiben ilk dört saat ve 24’üncü saatte tüpler koagülasyon varl›¤› aç›s›n-dan incelenmifltir. 24 saatlik süre içinde koagülasyon oluflturmayan sufllar koagülaz negatif kabul edilmifl-tir(8).
DNaz testi için tüm kökenlerden DNaz agara yo¤un nokta ekimleri yap›lm›fl, 37 oC’de 24 saat inkübe edilmifltir. Ertesi gün 1 N HCl ile tüm agar yüzeyi göllendirilmifltir. Nokta ekimler çevresinde fleffaf zon oluflmas› pozitif reaksiyon olarak kabul edilmifl-tir (3,9).
Staphaurex (Murex) ayn› anda hem protein A hem de clumping faktörü saptayabilen bir aglütinasyon kitidir. Üretici firma önerilerine göre aglütinasyon kartlar› üzerinde bakteri kolonileri reaktifle kar›flt›-r›lm›fl, aglütinasyon de¤erlendirilmifltir(2,5). ID32 Staph striplerine önerildi¤i üzere ekim yap›l-m›fl ve sonuçlar 35oC’de 24 saat inkübasyon sonras› de¤erlendirilmifltir. ‹dentifikasyon bilgisayar yaz›l›-m› arac›l›¤› ile yap›lyaz›l›-m›flt›r (6).
BULGULAR
Tablo 1’de S.aureus tan›mlamas›nda kullan›lan üç metodun sonuçlar› özetlenmifltir (Tablo1). Stafilokok sufllar›n›n 72’sinde uygulanan testlerde korelasyon, 8’inde uyumsuzluk gözlenmifltir (Tablo2).
ID 32 Staph ile KNS sufllar›n›n tür düzeyinde identi-fikasyonlar› Tablo 3’de gösterilmifltir(Tablo3). TARTIfiMA
S.aureus tan›mlamas›nda tüp koagülaz testi hala re-ferans metoddur. Ancak,tüp koagülaz metoduyla, baz› S.aureus sufllar›n›n koagülaz enzimi
olmad›¤›n-dan yalanc› negatif, baz› koagülaz negatif stafilo-koklar›n ise proteaz üretimine ba¤l› yalanc› pozitif reaksiyon verebildi¤i bilinmektedir. (5,9). Ayr›ca S.intermedius, S.hyicus, S.delphini gibi baz› koagülaz negatif stafilokok türlerinde de koagülaz etkinli¤i mevcuttur. Uzam›fl inkübasyonda ise baz›
Tablo1. S.aureus tan›mlamas›nda kullan›lan üç metodun sonuçlar›
Tablo 2. Uyumsuz sonuç veren sufllar Test Gerçek pozitif Yalanc› pozitif Gerçek negatif Yalanc› negatif Uninterpretable Duyarl›l›k (%) Özgüllük (%) DNaz 59 1 18 2 -96.7 94.7 Staphaurex 58 3 16 3 -95 84.2 ID32 Staph 56 -19 3 2* 94.9 100 *ID 32 Staph ile S. chromogenes olarak tan›mlanan 2 suflun identifi-kasyonu %65 alt›ndad›r. Bilgisayar yaz›l›m› ile ‘kabul edilemez’ olarak tan›mlam›flt›r. No 1 2 3 4 5 6 7 8 DNaz + + -+ -+ Staphareux + + -+ + + ID32Staph S.chromogenes S.chromogenes S.hominis S.epidermidis S.epidermidis S.sciuri S.haemolyticus S.hominis Tüp koagülaz S.aureus S.aureus S.aureus S.aureus S.aureus KNS KNS KNS
Tablo 3. ID32 Staph ile koagülaz negatif stafilokoklar›n tür da¤›l›m›
B. Bayraktar ve ark., Staphylococcus aureus’un ‹dentifikasyonunda Kullan›lan Üç Metodun De¤erlendirilmesi
213 sufllar›n oluflturdu¤u stafilokinazlar fibrini lizis
ede-rek p›ht›y› çözerler ve yalanc› negatif sonuç oluflabi-lir(4,9).
S.aureusd›fl›nda baz› bakteriler örne¤in Pseudomo-nas aeruginosa, Serratia marcescens ve Enterococ-cus faecalisgibi baz› enterokoklar sitrat› metabolize ederek yalanc› pozitif sonuç verebilirler. Bu nedenle tüp koagülaz testlerinde sitrat yerine EDTA kullan›l-mas› önerilmektedir(4).
Kolay haz›rlanmas› ve ucuz olmas›yla DNaz testi S. aureustan›mlamas›nda yayg›n olarak kullan›lmakta-d›r. Bu yöntemle aras›ra DNaz negatif S.aureus sufl-lar›na rastland›¤› gibi, DNaz pozitif koagülaz negatif stafilokok sufllar›yla da karfl›lafl›lmaktad›r(3). Mor-ton ve Cohn (10) koagülaz pozitif S.aureus n›n %98’› ve koagülaz negatif S.epidermidis sufllar›-n›n %13.5’inin DNaz yapt›klar›n› bildirmifllerdir. Jack ve ark’n›n (3) çal›flmas›nda 450 S.aureus suflun-dan üç tanesinde DNaz saptanmazken, 70 S.epider-midissuflundan üçünde DNaz aktivitesi saptanm›fl-t›r. Ülkemizde DNaz testi ile bildiriler s›n›rl›d›r.Ulu-türk ve ark (4) çal›flmalar›nda DNaz ve tüp koagülaz aras›nda çok iyi uyumluluk saptanm›flt›r. Çal›flma-m›zda DNaz yüksek duyarl›l›k (96.7) ve yüksek öz-güllükte (%94.7) bulunmufltur.
Son y›llarda S.aureus’un h›zl› identifikasyonunu sa¤layan ticari aglütinasyon kitleri gelifltirilmifltir. Bu testler bafllang›çta clumping faktörü tespit eder-ken, 2.kuflak testler hem clumping faktör hem de protein A’y› ayn› anda tespit etmektedirler(6,11) Smole ve ark (5)yeterli serbest koagülaz aktivitesi olmayan S.aureus sufllar›n›n h›zl› aglütinasyon kitle-ri ile tan›mlanabilece¤ini bildirmifllerdir. Gkitle-riethuy- Griethuy-sen ve Bes (6) S. lugdunensis, S. schleiferi ve S hae-molyticussufllar›n›n clumping factor üretebilece¤ini ve yalanc› pozitif sonuca neden olabilece¤ini belirt-mifllerdir. Ayr›ca özellikle MRSA sufllar› aras›nda yalanc› negatif sonuçlar elde edilmifltir(6,11). Lu›-jend›ck ve ark (2) çal›flmalar›nda S. aureus identifi-kasyonunda kullan›lan üç h›zl› testi karfl›laflt›rm›fllar, Staphaurex plus için %100, Staphaurex için %95.3 ve Pastorex Staphplus için %100 duyarl›l›k bulmufl-lard›r. Smole ve arkadafllar› (5) Staphaurexi %99 du-yarl›l›k ve %97.1 özgüllükte saptam›fllar. Personne ve ark (12) %99.7 duyarl›l›k ve %72.7 özgüllükte
saptam›fllard›r. Bu yöntemle S.aureus ayr›m›n›n ya-p›lmas›n›n, bir miktar yanl›fl identifikasyona yol aça-bilece¤ini, bu nedenle sonuçlar›n tüp koagülaz gibi ikinci bir testle do¤rulanmas› gerekti¤ini bildirmifl-lerdir. Bizim çal›flmam›zda Staphaurex %95 duyarl›-l›k ve %84.2 özgüllükte bulunmufltur.
ID32 Staph koagülaz negatif stafilokoklar›n tür dü-zeyinde isimlendirilmesinde kullan›lmaktad›r. Ko-agülaz negative stafilokoklar›n patojenik rollerini aç›klamak güçtür. Koagülaz negatif stafilokoklar›n isimlendirilmesi patojenik rollerini anlamam›z› sa¤-lamakta ve epidemiyolojik çal›flmalara yard›mc› ol-maktad›r(7). Çal›flmam›zda ID32 Staph S. aureus’un tan›mlanmas›nda en yüksek özgüllü¤ü göstermifltir. ‹ki sufl ise cins düzeyinde tan›mlanamam›flt›r Sonuç olarak tüp koagülaz, DNaz, Staphaurex, ID32 Staph metodlar›yla genel olarak birbiriyle uyumlu sonuçlar elde edilmifltir.
KAYNAKLAR
1. Cengiz T: Staphylococcuc, ‘Ustaçelebi fi(eds): Temel ve Klinik Mikrobiyoloji’ S.339. 1. bask› Günefl Kitabevi, Ankara (1999)
2. Lu›jend›ck AD, Belkum AV:Comparison of five tests for identification of Staphylococcus aureus from clinical samples. J Clin Microbiol 34: 2267 (1996)
3. Zarzour JY, Belle EA:Evaluation of three tests for identification of Staphylococcus aureus from clinical sour-ces. J Clin Microbiol 7: 133 (1978)
4. Ulutürk R, Eren G:Stafilokoklar›n ayr›m›nda kullan›-lan tüpte koagülaz, lamda koagülaz, lateks aglütinasyon ve deoksiribonükleaz testlerinin karfl›laflt›r›lmas›. Türk Mik-robiyol Cem Derg 32: 13 (2002)
5. Smole SC, Aronson E:Sensitivity and specificity of an improved rapid latex agglutination test for identification of methicillin-sensitive and resistant Staphylococcus aureus isolates. J Clin Microbiol 36: 1109 (1998)
6. Griethuysen AV, Bes M:International multicenter eva-luation of latex agglutination tests for identification of Staphylococcus aureus . J Clin Microbiol 39: 86 (2001) 7. Rhoden DL, Miller JM:Four Year prospective study of STAPH-IDENT system and conventional method for reference identification of Staphylococcus ,
Stomatococ-Türk Mikrobiyol Cem Derg (2004) 34:211-214
214
cus and Micrococcus spp. J.Clin.Microbiol.33:96( 1995). 8. Bilgehan H:Klinik Mikrobiyolojik Tan›, Gram Olum-lu Koklar. S.498. 2.bask› Bar›fl Yay›nlar›, ‹zmir (1995) 9. Koneman EW,Allen SD,Janda WM,Scheckenberger PC,Winn WC Jr:Color atlas and textbook of diagnostic Microbiology, p.405 4th Edition.JB Lippincott Company, Phyladelphia (1992).
10. Morton HE, Cohn J:Coagulase and deoxyribonuc-lease activities of staphylococci isolated from clinical so-urces. Apll Microbiol 23: 723 (1972)
11. Carricajo A, Treny A:Performance of the chromoge-nic medium CHROMagar Staph aureus and Staphycrom coagulase test in the detection and identification of Staph-ylococcus aureus in clinical specimens. J Clin Microbiol 39: 2581 (2001)
12. Personne P, Bes M:Comparative performances of six agglutination kits assessed by using typical and atypical strains of Staphylococcus aureus . J Clin Microbiol 35: 1138 (1997)
