DEĞİŞİK ANTİOKSİDANLARIN KOMBİNE
KULLANIMI İSKEMİK HASARI AZALTMADA DAHA FAZLA ETKİLİ Mİ?
Erol BENLİER*, Oğuz ÇETİNKALE, Remisa ŞENGÜL, Sabiha CİVELEK, Can ÇINAR, Şükrü YAZAR
* Serbest Hekim, İstanbul Üniversitesi Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Plastik ve Rekxmstrüktif Cerrahi Anabilim Dalı, Biyokimya Anabilim Dalı,
Ö Z E T
Iskemik hasar Biyolojisinde çeşitli hasar yollarının serbest oksijen radikallerinde birleştiği bilinmektedir. Bu çalışmanın amacı, iskem't hasarım oluşturan mekanizmaların her birine etkisi olduğu çeşitli çalışmalarla gösterilmiş ajanların birlikte kullanımlarında etld artışı olup olmayacağını gözlemekti. Bu amaçla sıçanlarda "kaudal tabanlı sırt cildi flep " modelinde SiklosporinA (CsA) (30 mg/kg ven içi) , Allopürinol (50 mgZ kgven içi) ve Deferoksamin (150 mg/kg ven İçi) adlı ajanların tek başına, ikili ve üçlü birliktelikleri çalışıldı. Her biri 10 sıçandan oluşan gruplarda flep kaldırılmadan 15 dakika önce bu ajanlar verildi ve flep kaldırıldıktan 1 saat sonra lipid perolcsidasyonunun son ürünü olan Malonildialdehid (MDA), notrofıl injiltrasyonunun göstergesi olan Miyeloperoksidaz (MPO) aktivitesi ve hücre İçi doğal antioksidan sistemin hassas bir göstergesi olan indirgenmiş glutatyon (GSH) düzeylerinin belirlenmesi için flepten cilt dokusu örnekleri alındı. Cerrahi girişim sonrası 3. ve 7. günlerde flep canlılığı değerlendirildi.
CsA ve allopürinol tek başına jlebin canlılık oranını kontrole göre anlamlı olarak (P<0,05) arttırdıkları halde, ikili ve üçlü k o m b in a syo n la r ca n lılığ ı a rttırm a d a aynı etkiy i gösterememiştir. CsA ’ nın ve CsA + deferoksamin ’in lip'ıd p e ro ksid a syo n u n u anlam lı (P < 0,01) azalttığ ı, üçlü kombinasyonun M PO aktivİtesini kontrole ve diğer gruplara göre anlam lı (P < 0,001) o la ra k a za lttığ ı saptandı.
Allopürinolün tek başına ve kombine kullanımlarında GSH düzeylerinde anlamlı azalma (P<0,0001) olduğu saptandı, îsk e m ik hasarın değişik basam aklarına etkiyle hasarı azaltm ayı a m açlayan ça lışm a la rın bu ilk ö rneğinde ko m binasyonlarda a m açlanan ölçü d e e tk i artışı görülememiştir.
Anahtar Kelimeler: Iskemi hasarı, antioksidanlar, siklosporin A , deferoksamin, allopürinol.
SU M M ARY
Is I t M or e Ejfective to Use Combined Antioxidents in Or- der to Reduce Ischem ic Injury?
Xanthine oxidase, iron~catalyzed reactions ( Fenton, Haber- Weiss ) and neutrophil - endothelial celi interaction are known to give rise tofree radicals in the ethiology o f ischemia injury. Oıır aim was to observe whether agents that have been shown to be ejfective in ischemic injury by single use, were going to show additive effects when they were used combined. For this purpose a caudally based rat dorsal skin fla p was used. Cyclosporine — A (CsA), Allopürinol and Deferoxamine were injected 15 minutes before fla p eleva- tion. Skin biopsies were taken firom both lateral side o f mid- dle portion to measure malonyldealdehyde [(MDA) is the last production o f lipid peroxidation], Myeloperoxidase [(MPO) activity is the indicator o f neutrophil infıltrationj and reduced glutathione [(GSH) level is the sensitive indi
cator o f native antioxidantofintracellular area j. Biochemi- cal results revealed that CsA and CsA + Deferoxamine re
duced lipidperoxidation significantly (P<0,01) compared to controlgroup. Trİple combination decreasedM PO activ
ity significantly (P<0,001) compared to control and signifi
cantly compared to other groups (P<0,05). Although CsA (P<0,05) and allopürinol (P<0,01) enhanced survival o f flaps significantly, triple combinations fa iled to show the same eff'ect. Both single and combined use o f allopürinol wasshown to lower GSHlevels significantly (p<0,0001). As a resıılt, CsA and allopürinol were successful to improve ischemic injury as expected. Triple combination significantly decreased M PO activity which is the indicator o f neutrophil infıltration, but surprisingly could not improve flap survival.
Thİs İs the first experimental study, in which the aim was reduce damage by affecting the various steps o f İschemic injury. Hoyvever combined use o f the agents showed no ad
ditive effects compared to their single use.
Key Words: ischemic injury, antioxidants, cyclosporine A, deferoxamine, allopürinol
Geliş Tarihi : 21.12.2001
İSKHMtK HASAR
GİRİŞ
Dokudaki kan dolaşımını yavaşlatan çeşitli cerrahi girişimler, travma, damar yaralanması ve değişik doku aktarımları hücre ve dokularda tam veya kısmi iskemiye yol açarlan İskemik olayların sonunda gelişebilen doku ölümü yani nekroz sebebi ne olursa olsun arzu edilmeyen bir komplikasyondur. İskemik hasar ile birlikte çeşitli organların serbest oksijen radikali oluşturm asının iskem iden çok iskem inin hem en sonrasında gelişen reperfüzyona bağlı olarak meydana geldiği ortaya konmuştur. Oksijen radikali oluşumunda önemli bir yolun Ksantin oksidazdan geçtiği açıkça M cCord ve arkadaşları (1985)1 tarafından ortaya konmuştur. Ada ve serbest cilt fleplerinde ksantin oksid az y o lu y la o rtay a çıkan serb est oksijen radikallerinin hasar oluşturucu etkisi bir çok çalışmada gösterilmiştir2'6.
Bir ksantin oksidaz inhibitörü olan allopürinol ksantin oksidaza bağlı serbest radikal üretimini azaltarak flep canlılığını arttırır23’7’8. Allopürinolün etkinliği sıçan modelleri dışında tartışılabilir olmasına rağmen 9 sıçanlarda cilt flebi canlılığım arttırmada güvenli ve iyi çalışılmış bir ajandır.
İskemik hasarda serbest radikal oluşturan bir diğer mekanizma olan demirin katalizlediği reaksiyonların (Fenton, H aber-W eiss) etkisinin gösterilm esiyle gündem e gelen defero k sam in , güçlü b ir dem ir bağlayıcı10 ve serbest radikal süpürücüsü11 olup, bu ö ze llik leriy le iskem ik dokuda gelişecek hasarı azaltabilen bir ajandır12. Deferoksamin, streptomyces pilosus’tan elde edilen çok güçlü ve spesifik demir bağlayıcıdır. İskemik deri fleplerinde oluşan nekrozun deferoksamin ile engellenebileceği konusunda çeşitli deney hayvanlarında oluşturulmuş flep modelleri vardır12'16.
İmmunosupresan ilaçlar (Siklosporin-A, FK506, v.s.) çeşitli hayvan modellerinde cilt flepleri 17-19, karaciğer 20,21, mezenter23 ve bars aklarda23 nötrofıl infîltrasyonunu azaltarak serbest radikal hasarım azaltır. Bu hasarı önlemede hem flep canlılık artışı ortaya konmuş hem de immunosupresan ilaçların miyeloperoksidaz (MPO) enzim aktivitesini ve malonildialdehid (MDA) düzeylerini düşürdüğü ortaya konmuştur.
Tek tek kullanım larında iskemi veya iskemi- reperfüzyon hasarını azalttığı gösterilmiş olan ajanlar
“birlikte kullanıldıldarmda daha fazla antioksidan etki gösterir mi ?” sorusuna cevap aranmak üzere bu çalışma planlandı.
İskemi reperfüzyon hasarının belli başlı bilinen temel elemanlarının nötrofıl - endotel ilişkisi, ksantin oksidaz aktivasyonu ve eritrosit stazına bağlı demir reaksiyonları olm ası nedeniyle bu çalışm ada bu mekanizmalar esas alındı ve antioksidan ajan seçimi buna göre yapıldı. Böylece çeşitli deneysel modellerde etkinlikleri gösterilmiş ve etki mekanizmalarının her biri
iskemi hasarının değişik yolundan etki eden Siklosporın A l7JS’20'22'23, Allopürinol3’24'26 ve Deferoksamin 12-16 adlı ajanların iskemik dokuda tek tek ve olası sinerjistik etkileri deneysel olarak araştırıldı.
GEREÇ VE YÖNTEM
Deneysel çalışma İstanbul Üniversitesi, Cerrahpaşa Tıp Fakültesi, Plastik ve Rekonstrüktif Cerrahi Anabilim dalı deney laboratuarında gerçekleştirildi. Deney süresince fare yemi ve su ile beslenen ağırlıkları 200 - 250 gram arasında değişen Wistar Albino tipi dişi sıçanları kullanıldı. Cerrahi girişimler için genel anestezi periton içi yolla verilen ketamin hidroklorid [Ketalar amp. (Parke-D avis) 50 m g/ mİ flakon ] 5 0 m g /k g ve ksilazin hidroklorid (Rompun flk.) 6 mg / kg ile sağlandı.
CERRAHİ YÖNTEM
Sıçanların sırtları elektrikli traş makinesiyle traş edildikten sonra kalça eklemlerinden skapula uçlarına ulaşan 3 x 9 cm boyutlarında ters McFarlane flebi işaretlendi . Flebin orta üçte birlik bölümünün her iki yanma 1 mm x 3 cm boyutlarında uzantılar dahil edildi.
Böylece iskemik hasar parametrelerini çalışmak için fiepten ö rneklem e y a p ıld ığ ın d a flep in orjinal boyutlarında olması ve dolaşım ında bir değişiklik olmaması sağlandı. Flep cilt, ciltaltı yağ dokusu ve pan- niculus camosus ile birlikte kaldırıldı ve yatağına dikildi.
1. saatin sonunda flebin orta 1 / 3 ‘ ünün her iki yanındaki işaretli parçalar alınıp sıvı nitrojende donduruldu ve jelatinle sarılıp numaralandırıldıktan sonra C 0 2 buzu içeren (-80 santigrad derece) m uhafazalar içine yerleştirildi. Doku örnekleri alındıktan sonra orijinal boyutuna gelen flepler tekrar yerine sütüre edildi.
DENEY PROTOKOLÜ
Sıçanlar her grupta 10 denek olan 8 gruba ayrıldı ve tüm kullanılan ajanlar cerrahi işlemden 15 dakika kadar önce ven içinden sıçanlara enjekte edilerek verildi.
Verilen ajanların dozları (Tablo 1) literatürde en etkin ve yaygın olarak kullanılan dozlardan seçilerek kullanılmıştır. Gruplandırma şöyle yapıldı; Bir grup kontrol grubu (grup A) olarak bırakılırken, ilaç verilen diğer gruplardan ilk üçüne her bir ajan (grup B,C,D) tek başına verildi. îkinci üçlü grupta ajanlar (grup E,F,G) ikili olarak aynı anda ayrı ayrı verildi. Son gruba ise üç ajan (grup H) birden birbiri ardına verildi.
DEĞERLENDİRME YÖNTEMLERİ I- Flep canlılığı
Flebin nekroze olan ve canlı kalan kısım ları ameliyat sonrası 3 ve 7. günlerde olmak üzere Sasaki ve Pang’ m tariflediği metodla27 değerlendirildi. Siyah renk, dehidratasyon ve eskar formasyonunu içeren bölüm tipik belirtileriyle nekroz olarak tanımlandı.
Saydam bir şablona flebin canlı ve nekroze alanları
Türk Plast Rekoııstr Est Cer Derg (2002) Cilt: 10, Sayı;3
çizildikten sonra milimetrik kağıtla canlı alan % ‘ si hesaplandı.
Tablo 1: Deney protokolü ve gruplar
Grup Denek sayısı
Verilen Ajan
Doz Veriliş
Yolu
A 10 _ .
B 9 Siklosporin A 30 mg/kg Ven içi
C 8 A llopurinol 50 mg/kg Ven içi
D 10 Deferoksamin 150 mg/kg Ven içi
E 9 Siklosporin A 30 mg/kg Ven içi
A llopürinol 50 mg/kg Ven içi F 10 Siklosporin A 30 mg/kg Ven içi Deferoksamin 150 mg/kg Ven içi
G 8 A llopürinol 50 mg/kg Ven içi
Deferoksamin 150 mg/kg Ven içi
H 9 Siklosporin A 30 mg/kg Ven içi
A llopürinol 50 mg/kg Ven içi Deferoksamin 150 mg/kg Ven içi
II- Biyokimyasal analizler
a) Doku Malonildialdehid (MDA) ölçümü Lipid peroksidasyonu, peroksidasyonunun son ürünü olan M DA5 nın ölçümü ile değerlendirildi.
Fleplerin yanlarından alman dokular, % 0.001 butile hidroksitoluen (BHT), % 0.07 sodyum dodesil sülfat (SDS) içeren soğuk şalin çözeltisi içinde potter tipi homojenizatör kullanılarak homojenize edildi ( 20 mg doku / 1.5 mİ şalin çözeltisi). Salin-BHT çözeltisi herbir kullanımdan önce 10 dakika süre ile azot gazı ile m uam ele edildi. H o m ojenata h em oglobini uzaklaştırmak için etanol-kloroform (3:2) katıldıktan sonra, MDA konsantrasyonu Shin ve arkadaşları28 tarafından önerilen tiobarbitürik asit ile reaksiyona dayanan k o lo rim e trik yön tem le tay in edildi.
Homojenattaki protein konsantrasyonu Lowry metodu ile29 ölçüldü. MDA konsantrasyonu nmol/mg protein olarak ifade edildi.
b) Doku Miyeloperoksidaz aktivitesi ölçümü (MPO)
Flepten alman 20 mg doku örneği 0.5 mî 50 mM fo sfat tam ponu (pH: 6.0) için d e P o tte r tipi h o m o jen izatö r k u lla n ıla ra k h o m ojenize edildi.
Homojenatlardakinötrofıllerin grandilerinden MPO’yu serbestleştirmek için 50 mM fosfat tamponu (pH 6.0) içinde hazırlanan heksadesilltrimetil amonyum bromür çözeltisinden ilave edildi. 1 dakika süreyle sonike edildi, 3 kez dondurulup eritildi ve tekrar 1 dakika sonike edildi. Homojenat 32.000 g de 15 dakika santrifüj edildi.
Tagesson ve arkadaşlarının30 önerdiği yöntemdeki gibi süpematant guaicol ile muamele edilerek, 470 nm de absorbanstaki artış 15 saniye aralıklarla 5 dakika b oyunca k ay d e d ild i. S ü p ern a ta n tm p ro tein
konsantrasyonu Lowry29 metoduyla tayin edildi. Enzim aktivitesi U/g protein olarak ifade edildi.
c) Doku Glutatyon (GSH) ölçümü
D oku h o m o jen atm d a indirgenm iş GSH konsantrasyonu, Beutler ve arkadaşiarınmın metodu31 kullanılarak tayin edildi. Protein presipitasyonu için metafosforik asid, renk oluşumu için 555 ’ ditiobis 2- nitrobenzoik asid kullanıldı. GSH konsantrasyonu 1,36X104 M '1 cm '1 m olar absorbsiyon koefisienti kullanılarak hesaplandı. Sonuçlar mg/g protein olarak ifade edildi.
III-İstatistiksel değerlendirme
Çalışmada elde edilen rakamsal veriler metin ve tablolarda “ortalam a ± standart hata ortalam ası“
( Standart error mean : S E M ) ile ifade edildi. Tamamı 8-105 ar sıçandan oluşan 8 gruptan alman veriler ANOVA istatistik yöntemiyle analiz edilip , anlamlılık Student-N ew m an-K eul testi ile elde edildi. P < 0,05 ve daha küçük değerler anlamlı olarak kabul edildi.
SONUÇLAR
Deney süresince çeşitli sebeplerden kaybedilen 6 sıçan değerlendirmeden çıkarıldı. Kullanılan ajanların verildiği dozlarda herhangi bir belirgin klinik yan etki saptanmadı.
I- Flep Canlılığı
A m eliyat sonrası 3 .gün flep ca n lılığ ı değerlendirilmesinde sadece Allopurinol grubu ( % 78 ± 2,3 ) (P< 0,01) ve Siklosporin A grubu (% 79,4 ± 6,1) (P<0,05) kontrole (% 53,2±4) göre anlamlı bulundu.
Ameliyattan 7. gününde flep canlılığı değerlendiril
diğinde yine B (Siklosporin A) (% 73,3 ± 8,4) ve C (Allopurinol) (% 69,3± 2,6) gruplarında ölçülen flep canlılığı kontrolden (% 48,2 ± 4,6) anlamlı olarak (P<0,05) yüksek bulundu. (Şekil 1)
□ 3. gün İB7.aün
A B C D E F G H
Gruplar
Şekil 1: 1-3 ve 7. günlerdeki canlı flep bölüm ünün flebin tamamına oranlarının gruplara göre dağılımı
ÎSKEMİK HASAR
OMDA
Gruplar
Şekil 2: M alonildialdehit seviyesinin gruplara dağılımı
ûifter
Şekil 3: Miyeloperoksidaz aktivitesi ölçüm lerinin gruplara göre dağılımı
mg/gr protein
gruplar
Şekil 4: Glutatyon seviyesi ölçüm lerinin gruplara dağılımı
II- Biyokimyasal analizler a- Malonildialdehid düzeyi
MDA düzeylerinin B (CsA) grubu (0,112 ± 0,014) ve F (CsA + Deferoksamin) grubunda (0,108 ± 0,016) kontrol gruba (0,201±0,016) göre anlamlı derecede düşük olduğu (P<0,01) saptandı. D (Deferoksamin) (0,121 ± 0,014) ve E (C s A+Allopürinol) (0,139 ± 0,025) gruplan ile kontrol arasında anlamlı farklılık (P<0,05) bulundu. B ( C sA ) ve F (CsA+ Deferoksamin) gruplan, C (Allopürinol) grubuna (0,186 ± 0,012) göre anlamlı fark (P<0,05) gösterdi (Şekil 2).
b- Miyeloperoksidaz aktivitesi
MPO aktivitesinin, H (CsA + A llopürinol + Deferoksamin) grubunda (1,152 ± 0,221) kontrol grubuna göre (3,939 ± 0,449) ileri derecede anlamlı düşük olduğu saptandı (P<0,001). H (CsA + Allopürinol + Deferoksamin) grubu ile D (Deferoksamin ) grubu (3,891 ± 0,303) arasında ileri derecede anlamlı (P<
0,001) ve H(CsA+Allopürinol + Deferoksamin) grubu ile E ( CsA+Allop.) (2,877 ± 0,559) ve G (Allop. +Def.) (3,056±0,636) grupları arasında anlamlı fark(P<0,05) saptandı (Şekil 3).
c- Glutatyon düzeyi
Doku örneklerinde ölçülen GSH düzeyi C grubunda (Allopürinol) (44.57 ± 8,07 ??) ?kontrol grubuna (64.68
± 4.88) göre ileri derecede anlamlı düşük (P<0,001) bulundu, E grubunda (CsA+Allopürinol) (24.61±5.63) G grubun da (Allopürinol+Deferoksamin) (15.854=3.05) ve üçlü k o m b inasyonun olduğu H grubunda (C sA + A llopürinol+ D eferoksam in) ölçülen GSH (24.39±5.56 ) düzeyleri kontrol grubuna (64.68±4.88) göre ileri derecede anlamlı düşük (P<0.0001) bulundu.
F grubunun (CsA+Deferoksamin) ölçülen GSH düzeyi (77.63±7.62) kontrol grubuna (64.68± 4.88) ???göre anlamlı yüksek (P<0.05) bulundu (Şekil 4). Tüm gruplar içinde özellikle Allopürinol içeren, gruplarda GSH düzeylerinin belirgin olarak düşük olduğu saptandı.
TARTIŞMA
Hayvan modellerinde birçok ajanın flep canlılığım arttırdığı bildirilmiş olmasına rağmen halen hiçbir ajan klinik kullanımda yaygın kabul görmemiştir. Birbirinden farklı ajanların sonuçta benzer etki göstermeleri ilaç seçim inde karm aşaya yol açmaktadır. Farklı etki mekanizmasına sahip ajanlar hasarı farklı seviyelerde azaltmaktadır.
Bu güne kadar bu oksidatif hasarı azaltmak amacı ile bir çok ajan deneysel olarak kullanılmış ve etkinliği çeşitli parametrelerle gösterilmiştir. Ancak bu kullanılan ajanların etki mekanizmaları aynı yolla olmamaktadır ve değişik aşamalarda ve yerlerde etkin olarak oksidatif hasarı azaltmaktadır. Farklı aşamalarda etkin olan iki ya da daha fazla ajan kullanıldığında “hasarı azaltmada daha fazla etkin olunabilir m il “sorusuna yanıt aramak gayesiyle gerçekleştirilen bu çalışmada her biri değişik yollardan iskemi ve iskemi-reperfüzyon hasarına etki ettiği bildirilm iş ajanların kom bine kullanım ıyla oluşacak etki gözlendi. Böylece tek tek etkinlikleri ve olası etki şekilleri çeşitli çalışmalarla gösterilmiş olan ajanların birlik te ku llan ım ların d a oluşacak etki gözlenecek ve böylece etki yolları açısından daha net bilgiler elde edilecekti. Eğer farklı yollardan da olsa antioksidan etki elde edildiğinde hasar muhtemelen daha fazla önlenebilir miydi?
Türk Plast Rekonstr Es t Cer Derg (2002) Cilt: 10, Sayr3
İskemi, dokuda kısmen serbest oksijen radikalleri nedeniyle bir miktar nekroza yol açabilir’*’32"34. Bu ra d ik a lle r b a rs a k la rd a 23, random cilt Heplerinde8’9’12’1831*35"4’ ve venöz cilt Heplerinde42 kısmi iskemik olaylarda sorumlu bulundu. Reaktif oksijen radikalleri çeşitli kaynaklardan salınırlar, bunlar arasında esas rolü oynayanın aktive olmuş polimorf nüveli lökositler olduğu görülm ektedir. İskem ik yaralanmada nötrofil infiltrasyonunun etkisine ait önemli sayıda kanıt m ev cu ttu r18,2032,43"49 . Artmış inHltrasyonla birlikte doku MDA, MPO aleti vitesi artışı ve glutatyon düzeyinde azalma; serbest radikal üretimi, nötrofil birikimi ve iskemi arasındaki yakın ilişkiyi göstermiştir. Hücreden okside glutatyon ( GSSG) atılımı da izole reperfüze organlarda50 hücre içi reaktif oksijen oluşumunun duyarlı bir göstergesi olarak gösterilmiştir.
Lipid peroksidasyonu maloniidialdehid ve konjüge dienler13 kullanılarak Ölçülebilmektedir. Hücre içinde doğal olarak oluşan bir serbest radikal süpürücüsü olan glutatyon, güvenilir ve duyarlı bir belirteç olduğu51-54 için bu çalışmada değerlendirmeye alındı. S tein ve arkadaşları 6 ve 12 saatiskemiye maruz kalan sıçan cilt Heplerinden alman doku örneklerinde indirgenmiş glutatyon azalmasına dikkat çekmişlerdir55'58
A ktive p o lim o rf nüveli lökositler tarafından oluşturulan reaktif oksijen türlerinin in vitro olarak sadece 15-90 dakikalık bir sessiz dönemden sonra oluştukları bilinir59.Bu nedenle çalışılan modelde doku GSH düzeyleri reaktif oksijen türlerinde artışın olduğu 1. saatte alman doku örneklerinde ölçüldü. Kullanılan iskemik model doku iskemisine yol açan yetersiz kan desteğinin olduğu herhangi bir klasik flebin uzatılmış distal bölümünü taklit eder39. Kısmi iskemik durumda eritrositlerin birikmesiyle kanıtlanan distal düşük akım hem damarlarda periferik olarak hem de damar dışı alanlarda nötrofil birikimine neden olur. Flebin distal kısmı serbest radikal üretimine izin veren düşük akımlı durumu gösterir8,12,3637,39,41,00-62 . Sıçan dorsal flebinin distal kısmı altına silikon konularak yatakla ilişkisinin kesilmesi de mümkün olmakla beraber flebin distalinde MDA düzeyi ve MPO aktivitesi ölçümlerinin yüksekliği ve nötrofil sayısının artmış olması ile bu flebin bir iskem ik h asa r m odeli olarak k u llan ılm a sı d esteklenm iştir . İskem i ve iskem i-reperfüzyon hasarında nötrofil infiltrasyonu barsaklarda23,60,63 , cilt Heplerinde32,38,46 ,karaciğerde20,21 ve kalp kasında43 g ö ste rilm ftir44,48,49. Bu hasarının im m unsupresan ilaçlarla azaltılması iskemiyi takiben Hep yaşamında yeni bir immünolojik anlayışı getirdi. İskemik cilt Heplerinde siklosporin A nın etkisi1739 daha önce gösterilmiştir. İmmunosupresan ilaçlar çeşitli hayvan m o d ellerin d e M PO ve M DA d ü ze y le ri kadar karaciğer20,21 , mezenter22 ve barsaklarda23 artmış canlılık ve nötrofil infiltrasyonunun azalm asını sağlayarak etki ederler. CsA dokuya göç eden nötrofil
sayısını önemli derecede azaltır.
Allopürinol bir ksantin oksidaz inhibitörü olup ksantin oksidaza bağlı serbest radikal üretimini azaltarak Hep canlılığını arttırdığı iddia edilmiştir2,3,7,8 . Picard- Ami ve arkadaşları ise9 son zamanlarda allopürinolün gerçek etki m ek an iz m a sın ın ksan tin oksidaz inhibisyonundan farklı bir yolla olduğunu söylediler.
Allopürinol ksantin oksidaz inhibitörü olmanın dışında Hep canlılığını direkt veya indirekt vazodilatasyon yoluyla da arttırır.
Çalışmamızın sonuçlarma bakıldığında, özellikle ajanların tek olarak kullanıldığı tedavi gruplarında literatürle uyum lu olarak MDA düzeyi ve MPO aktivitesi düşerken bu düşüşte istatistiksel olarak bazı gruplarda beklenen anlamlılık saptandı.
Flep canlılığına bakıldığında allopürinol ve CsA verilen gruplarda daha belirgin olm ak üzere tüm gruplarda kontrolden daha fazla canlı flep alanı ölçüldü.
Verilen ajanlardan CsA ve allopürinol flep canlılığı arttırmada deferoksamine göre daha başarılıydı. İlginç olan etkisinin nötrofiller üzerinden olduğunu bildiğimiz C sA ‘n m hem tek b aşın a hem de ikili kombinasyonlarında lipid peroksidasyonunun son ürünü olan m aloniidialdehid düzeyini azaltırken, nötrofil ak tiv asy o n u n u n biy o k im y asal g ö sterg esi olan M iy elo p ero k sid a z a k tiv ite si ü zerin e bu etkiyi gösterememiş olmasıdır.
Ç alışm anın am acına uygun olarak üçlü kom binasyon grubunun nötrofil infiltrasyonunun göstergesi olan MPO aktivİtesini ileri derecede anlamlı olarak düşürdüğü saptandı. Bu bulgu seçilen ajanların iskemik hasar mekanizmasının değişik basamaklarına etki ettiklerini ve bu şekilde etkide sinerjik bir artış sağlanabileceği tezini destekledi. Ancak bu etkinin flep canlılığında arzu edilen faydayı sağlamaması nedeniyle MPO aktivitesi ile flep canlılığı arasında kurulmuş olan doğru orantıyı18,19,64,65 gelecekte tekrar irdelemek gereğini ortaya koydu.
Bütün veriler bir arada değerlendirildiğinde üçlü kombinasyon sadece MPO aktivİtesini engellemede yararlı oldu. Fakat kombinasyonun bu etkisini flep ca n lılığ ın ı arttırm ak ta görem ed iğ im iz için, mekanizmalarda şu anda açıklanamayan diğer bazı etkilerin de rol aldığı fikri güçlenmektedir,
C sA ‘nın hem tek b aşın a hem de ikili kombinasyonunun lipid peroksidasyonunu anlamlı azalttığı, üçlü kom binasyonun MPO aktivİtesini kontrole ve diğer g ru p lara göre anlam lı olarak düşürdüğü tespit edildi. Yine, CsA ve allopürinol flebin canlılık oranını kontrole göre anlamlı olarak arttırdığı halde ikili ve üçlü kombinasyonlar canlılığı arttırmada aynı etkiyi gösterememiştir. Allopürinolün tek başına ve kombine kullanımlarında GSH düzeylerinde anlamlı derecede düşüş olduğu saptandı. A llopürinolün kullanılan dozunda flep yaşayabilirliğine etkisi olmadığı
Angel ve arkadaşları tarafından iddia edilmiştir36. Ancak çalışmamızda diğer çalışmalarla24^ 62 uyumlu şekilde kullanılan dozun sıçanlarda iskeminin biyokimyasal göstergelerini yeterli şekilde düşürdüğü saptanmıştır.
Sonuç olarak, nötrofiller tarafından oluşturulan hasarın göstergesi sayılan MPO aktivitesini etkili şekilde düşürebilen üçlü kombinasyonun, bu iyileştirici etkisini flep canlılığında gösterememiş olması nedeniyle, MPO aktivitesi ölçüm ünün prognoz ile korelasyonunun geçerliliği konusunda şüpheler oluşmuştur. İskemik hasarın farklı ana basamaklarına etkiyle hasarı azaltmayı am açlayan ça lışm aların bu ilk örneğinde kom binasyonlarda am açlanan ölçüde etki artım ı sağlanamamıştır.
Dr. Erol BENLİER
İnönü Cad. Hamzaoğulları İş Merkezi No; 9 Daire: 7 Dağkapı, Dörtyol DİYARBAKIR
KAYNAKLAR
1 . Mc Cord JM .O xygen-derived frcc radicals in postischemİc tissue injury. N Engl J Med 312:150- 163,1985
2. Manşon PN, Anthenelli RM, Im MJ, Bulkley GB, Hoopes JE.The role of oxygcn-free radicals in İschemic tissue injury in İsland skin flaps. Ann Surg 198:87- 90,1983
3. İm MJ, Shen W, Pak CJ, Manşon PN, Bulkley GB, Hoopes JE. Effect of allopurinol on the survival of hyperemic island skin flaps. Pİast Rcconstr Surg 87:276- 278,1984
4. Narayanan KK, Im MJ, Manşon PN, Bulkley GB, Hoopes JE.Mechanism and prevention of ischemia reperfusion injury in island skin flaps. Surg Forum 36:593-7,1985
5. Manşon PN, Narayanan KK, Im MJ, Bulkley GB, Hoopes JE. Improved survival in free skin flaps trans- fers in rats. Surgery 99:211-7,1986
6. Sagi A, Ferder M, Lcvens D, Strauch B. Improved sur
vival of island flaps after prolonged ischemia by perfu- sion wİth superoxide dismutase. Pİast Reconstr Surg 77:639-7,1986
7. Im MJ, Manşon PN, Bulkley GB, Hoopes JE. Effects of superoxide dismutase and allopurinol on the survival of acute island skin flaps. Ann Surg 201:357-359,1985 8. Angel MF, Ramasastry SS, Swartz WM, Narayanan K,
Kuhns DB, Basford RE, Fntrell JW. The crİtical rela- tionship between free radicals and degrees of ischemia:
evidence for tissue İntolerance of margtnal perfusion.
Pİast Reconstr Surg 81:233-239,1988
9. Pİcard-Ami LA,Jr, MacKay A, Kerrigan CL. Pathophysi- ology of ischemic skin flaps: Dıfferences in xanthine oxidase levels among rats,pigs and humans. Pİast Reconstr Surg 87:750-755,1991
10. Meyer-Brunot HG , Keberle H. The metabolism of desferioxam ine B and ferrioxamine B. Biochem Pharmacol 16:527-535;1967
11. Sinaceur J , Ribiere C, Nordmann J, Nordmann R:
ÎSKEMİK HASAR
Desfemoxamine: a scavenger of superoxide radicals 7 Biochem Pharmacol 33:1693-1694; 1984
12. Angel MF, Narayanan K, Swartz WM, Ramasastry SS, Kuhns DB, Basford RE, Futrell JW. Deferoxamine in- creases skin flap survival : additional evidence of free radical involvement in ischaemic flap surgery. Br JPlast Surg 39:469-472,1986
13. Green CJ, Dhami L, Prasad S, Healing G, Shurey C.
The effect of desferrİoxamine on lipid peroxidation and survival ischaemic İsland skin flaps in rats. Br J Pİast Surg 42:565-569,1989
14. Emekli U. Deferoksaminin iskemik deri Heplerinde serbest oksijen radikali hasarını önleyici etkisi, vazodilatasyonun rolü. Uzmanlık Tezi, İstanbul, 1992 15. Angel MF, Narayanan K, Swartz WM. The aetiologic
role of free radicals in hematoma-induced flap necrosis.
Pİast Reconstr Surg 77:795-803,1986
16. Morris SF, Pang CY, LofchyNM, Davidson G, Lindsay WK, Zuker RM, Boy d B. D efe rox amine attenuates ischcıuia-induced reperfusion injury in the skin and muscle of myocutaneous flaps in the pig. Pİast Reconstr Surg 92:120-132,1993
17. Küçükçe!ebi A, Özcan M. The beneficial effect of cyclosporine-A on the no-reflow phenomenon in rat skin island flaps. Br J Pİast Surg 45:512-514,1992
18. Çetinkalc O, Bilgiç L, Ayan F, Kandilci A. Neutrophİl- mediated injury in İschemic skin flaps: Amelioration of ischemic injury by Cyclosporine in the rat. Ann Pİast Surg 37:66-74,1996
19. Yücel A, Şenyuva C, Andican G, Benlier E, Bolayırlı M, Çetinkale O, Gelişgen R, Burçak G. Secondary venous ischemic injury associated with neutrophİl infıltration and lipid peroxidation: amelioration of injury by eyelosporin A in a rat inguinal island flap. Ann Pİast Surg 45:54-60,2000
20. Suzuki Ş, Toledo-Pereyra LH, Rodriguez FJ, et al.
Neutrophİl infıltration as an important factor in liver ischemia and reperfusion injury. Modulating effects of FK506 and cyclosporine.Transplantation 55:1265- 1272,1993
21. Kawano K, Kim YI,Goto S, et al. A proteetive effect of FK506 in ischemically injuredrat livers. Transplantation 52:143-145,1991
22. Asako H, Kubes P, Baethge BA, et al. Reductİon of leukocyte adherence and emigration by cyclosporine and L683,590 ( FK506 ) in postcapillary venules.
Transplantation 54: 686-690,1992
23. Kubes P, Hunter J, GrangerN. Effects of eyelosporin A and FK506 on ischemia / reperfusion - induced neutrophİl infıltration in the cat. Dig Dis Sci 36:1469-
1472,1991
24. Price MA, Pearl RM. Multiagcnt pharmacotherapy to enhance skin flap survival : Lack of additive effect of nİtroglycerin and allopurinol. Ann Pİast Surg 18:494- 498,1987
25. Picard-Ami LA, Jr., MacKay A, Kerrigan CL. Effect of allopurinol on the survival of experimental pig flaps.
Pİast Reconstr Surg 89:1098-1103,1992
26. Tamir G, Yaffe B, Pri-Chen S, Hauben DJ, Tsur H. The effect of allopurinol on experimental island skin flap survival under prolonged periods of arterial ischaemia.
Türk Plast Rekoııstr Est C erD erg (2002) Cilt: 10, Sayı:3
Br J Plast Surg 47:155-157,1994
27. Sasaki GH, Pang CY, Hemodynamics and vîability of acııte neurovascular island skin flaps in rats. Plast Recontsr Surg 65:152-158,1980
28. Shin MS, AngelMF, Im MI, manşon PN. Effects of 21- aminosteroid U74389F on skin — flap survival after secondary ischemia. Plast Reconstr Surg 94:661- 666,1994
29. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr A, Randall AR. Protein measurement with folin phenol reagent. J Biol Chem
193:265-275,1951
30. Tagesson C, Stendahl D, Magnusson KE, Edebo L.
Disintegration of single cells in suspension. Tsolation of rabbît polymorphonuclear leucocytc granules. Açta Pathol Microbiol Immunol Scand (B) 81:464-472,1973 31. Beutler E, Duran O,Kelly B.M. Improved method for
the detennination of blood glutathione. J.Lab Clin Med 61(5) :882-SSS ; 1963
32. Vedder NB, Bucky LP, Lopez I. Inhİbİtİon of neutrophil adherence improves survival of random flaps in rabbits.
Surg Forum 42:619-620,1991
33. Cotran RS, Kumar V, Robbins SL, Cellular injury and cellular death, In: Schoen FJ, ed, Pathologİc basis of disease, 5 th ed. London : WB Saunders, p. 1-34, 1994 34. Vedder NB, Bucky LP, Richey NL, et al. Improved
survival rates of random flaps in rabbits with a monoclonal antibody that blocks lcukocyte adherence.
Plast Reconstr Surg 93:1035-1040,1994
35. Kerrigan CL, Daniel RK. Pharmacologİcal treatment of the failing skin flap. Plast Reconstr Surg 70:541- 548,1982
36. Angel MF, Ramasastry SS, Swartz WM, Narayanan K, Basford RE, Futrell JW. Augmentation of skin flap survival with allopurinol. Ann Plast Surg 18:494- 498,1987
37. Suzuki S, Matsushita Y, lsshiki N, et al. Salvage of distal flap necrosis by topical superoxidc dismutase. Ann Plast Surg 27:253-257,1991
3 8. Rees R, Punch J, Shabcen K, Cashmer B, Guice K, Smith DJ,Jr. The stress response in skin: The role of neutrophil products in preconditioning. Plast Reconstr Surg 92:110-
117.1993
39. Rees R, Smith D, Li TD, Cashmer B, Gamer W, Punch J, Smith DJ,Jr. The role of xanthine oxidase and xanthine dehydrogenase in skin ischemia. J Surg Res 56:162- 167.1994
40. Stewart RJ, Moore T, Bcnnett B, et al. Effect of free radical scavengers and hyperbaric oxygen on random - pattem skin flaps. Arch Surg 129:982-987,1994 41. Ashoori F, Suzuki S, Zhou JH, et al. Involvement of
lipid peroxidation in necrosis of skin flaps and its suppression by ellagic acid. Plast Reconstr Surg 94:1027-1037,1994
42. Xiu ZF, Chen ZJ. The effect of glutathione , superoxide dismutase and adenosine triphosphate on venous flap survival. Eur J Plast Surg 19:170-173,1996
43. Romson JL, Hook BG, Kunkel SL, et al. Reductİon of ischemic myocardial injury by neutrophil depletion in the dog. Cİrculation 67:1016-1023,1983
44. Weiss SJ. Tissue destruction by neutrophils. N Engl J Med 320:365-376,1989
45. Sİmpson PJ, Todd RF, Mickelson JK, et al. Sustained limîtation of myocardial reperfusion injury by a monoclonal antibody that alters îeukocyte adhesion.
Cİrculation 81:226-237,1990
46. Lee C, Kerrigan CL. Neutrophil loçalization followİng reperfusion of ischemic skin flâp. Plast Reconstr Surg 89:910-915,1992
47. Lee C, Kerrigan CL, Tellado JM. Altered neutrophil function follow ing reperfusion o f an ischemic myocutaneous flap. Plast Reconstr Surg 89:916- 923,1992
48. De la Ossa JC, Malago M, Gewert BL. Neutrophil- endothelİal celi binding in neutrophil-mediated tissue injury. J Surg Res 53:103-107,1992
49. McMillen MA, Huribal M, Sunıpio B, Common pathway of endotheliai-leukocyte interaction in shock, ischemia and reperfusion. Am J Surg 166:557-562,1993 50. Jaeschke H, Mİtchell JR. Use of isolatedpcrfused organs
in hypoxia and ischemia/reperfusion oxidant stress.
Methods Enzymol 186:752-759,1990
51. Adams JD Jr., Lauterburg BH, Mİtchell JR. Plasma glu
tathione and glutathione dîsulflde in the rat: regulation and response to oxİdative stress. J Pharmacol Exp Ther 227:749-754,1983
52. Adams JD Jr,, Lauterburg BH, Mİtchell JR. Plasma glutathione disulfide as an index of oxidant stress in vivo:
carbon tetracloride, dimethylnitrosamine, nitrofurantoİn, metronİdazole, doxorubicin and diquat. Res Commun Chem Pathol Pharmacol 16:401-410,1984
53. Slater TF. Overview of methods used for detecting lipid peroxidation. Methods Enzymol 105.283-293,1984 54. Hughes H, Jaeschke H, Mİtchell JR. Measurement of
oxidant stress in-vivo. Methods Enzymol 186:681- 685.1990
55. Paller MS, Sİkora JJ. Renal work, glutathione and sus- ceptibility to İrce radical-mediated postischeıuic injury.
Kidney Int 1988;33:843-849
56. Ceconi C, Curello S, Cargnoni A, Ferrari R, Albertini A, Visioli O. The role of glutathione status in the pro- tection against ischaemic and reperfusion damage : cf- fects of N-acetyî cysteine. J Molec Celi Cardiol 1988;20:5-13
57. Stein HJ, Faymana S, Oosthuizen MMJ, Hinder RA.
Verapamil improves survival of rat hyperemİc İsland skin flaps. Surgery 106:617-623,1989
58. Jaeschke H. Glutathione disulfide as index of oxidant strees in rat liver during hypoxia. Am JPhysiol 258:499- 505.1990
59. Nathan CF. Neutrophil activation on biological surfaces:
Massive secretİon of hydrogen peroxide in response to products of macrophages and lymphocytes J Clin Invest 80:1550-1560,1987
60. Simpson R, Alon R, Kobzik L, et al. Neutrophil and neutrophil - mediated injury in intestinal ischemia - reperfusion. Ann Surg 218:444-454,1993
61. Suzuki S,Miyachi Y, Nİwa Y, lsshiki N. Significance of reactive oxygen species in distal flap necrosis and its salvage with Iiposomal SOD. Br J Plast Surg 42:559- 564,1989
62. Suarez Nieto C, Suarez Garcia MJ, Barthe Garcia P. A
İSKEMİK HASAR
com parative study on the effect of various pharmacological agents on thc survival of skin flaps in the rat. Br J Plast Surg 45:113-116,1992
63. Schoenberg MH, Poch B, Younes M,et a l . Involvement of neutrophils in postischaemİc damage to the s m ali intestine. Gut 32:905-912,1991
64. Çetinkale O, Şengül R, Bilgiç L, Bolayırlı M, Şenel O, Burçak G. Involvement of neutrophils in ischemic
injury.I. Bİochemical and histopathological investigation of the effect of FK506 on dorsal skin flaps in rats. Ann Plast Surg 39:505-515,1997
65. Çetinkale O, Bilgiç L, Bolayırlı M, Şengül R, Ayan F, Burçak G. Involvement of neutrophils İn ischemia- reperfusion injury of inguinal island skin flaps İn rats.
Plast Reconstr Surg 102:153-160,1998
