NKUBAP.03.GA.17.105 nolu proje
FLOW SİTOMETRİ İLE KOSOVA FLORASINDA DOĞAL OLARAK YETİŞMEKTE OLAN TULİPA TAKSONLARININ ÇEKİRDEK DNA İÇERİKLERİNİN BELİRLENMESİ VE PLOİDY ANALİZİ İLE TAKSONOMİK
SINIFLANDIRILMALARINDA KULLANIMI
Yürütücü: Prof. Dr. Metin TUNA Araştırıcılar: Dr. Bekim GASHİ
Mirsade OSMANİ
i ÖNSÖZ
Tulipa cinsi içerisinde yer alan türler bahar aylarında çiçeklenen ve ciddi bir ekonomik değere sahip süs bitkileridirler. Dünyada yaklaşık 5000 tesçilli Tulipa çeşidi bulunmakta ve her yıl bu çeşitlere ait milyonlarca soğanın satışı yapılmaktadır.
Dünya Tulipa kontrol listesine (WCSP 2014) göre cins içerisinde yaklaşık farklı ploidy düzeylerine sahip 100 tanesi tür olarak kabul edilen 500 civarında takson bulunmaktadır. Tür içerisinde gözlenen varyasyondan dolayı cinsin taksonomisi bir çok diğer cinste olduğu gibi zordur.
Ekonomik önemlerinden dolayı Tulipa türleri üzerinde yoğun ıslah çalışmaları yapılmaktadır. Ancak, doğadan yeni toplanmış Tulipa genetik kaynakları ıslah çalışmalarına dahil edilmeden önce ploidy düzeyleri belirlenerek taksonomik teşhislerinin muhakkak doğru bir şekilde yapılması gerekmektedir. Flow sitometri ile belirlenen çekirdek DNA içeriği bilgisi bir türün tüm bireyleri ile bir bireyin tüm hücrelerinde sabittir ve değişmez. Bununla birlikte türler arasında ise çekirdek DNA içeriği bakımından farklılık 1000 misli kadar olabilmektedir. Sahip olduğu bu karakteristiklerden dolayı çekirdek DNA içeriği türlere özeldir. Bu nedenle flow sitometri ile belirlenmiş çekirdek DNA içeriği bilgisi türlerin taksonomik teşhislerinde, ploidy düzeylerinin belirlenmesinde, genomların yapıları ile ilişkilerinin saptanması ve evrimlerinin incelenmesinde son derece yararlı olmakta ve yaygın olarak kullanılmaktadır
Sunulan bu araştırma projesinin amacı flow sitometri ile Kosova' nın bazı bölgelerinde doğal olarak yayılış gösteren Tulipa taksonlarının çekirdek DNA içeriklerini ilk defa belirlemek ve elde edilen bilgiyi taksonların ploidy düzeyi, taksonomik teşhisleri ve varsa melez türlerin belirlenmesinde kullanmaktır. Elde ettiğimiz sonuçların Tulipa üzerinde çalışan araştırıcılara (taksonomi, botanik, genetik ve ıslah) katkı sağlayacağını umuyoruz.
Projemize sağladığı maddi kaynaktan dolayı Namık Kemal Üniversitesi Araştırma Fonuna teşekkür ederiz.
Prof. Dr. Metin TUNA Dr. Bekim GASHİ Mirsade OSMANİ
ii
İÇİNDEKİLER Sayfa No
ÖNSÖZ……….…...i
İÇİNDEKİLER LİSTESİ…...………...……...ii
TABLOLAR LİSTESİ….………...iii
ŞEKİLLER LİSTESİ..………...iv
ÖZET………..………...v
ABSTRACT……….……….…...vi
1. GİRİŞ………...1
2. GEREÇ VE YÖNTEM………..………..………...3
2.1.Bitki materyali………..……….. ...3
2. 2. Flow Sitometri ile Çekirdek DNA analizi…..………..…….………...3
2. 3. Çekirdek DNA İçeriğinin Hesaplanması……..………... ...4
2. 4. İstatistiksel analiz………...4
2. 5. Kromozom sayımı..………..……...5
2. 6. Kök uçlarının eldesi……….……..………..….……...5
2. 7. İlk İşlem………..…….……….……...5
2. 8. Materyalin tespiti……….……….……...5
2. 9. Hidroliz……….… ...5
2. 10. Boyama……….………...5
2. 11. Peparatların hazırlanması……….………...5
2. 12. Fotoğraf çekimi……….……… ...5
3. Sonuçlar ve tartışma……….…………...6
4. Sonuç……….…..………...12
5. Kaynaklar...13
iii
TABLOLAR Sayfa No
Tablo 1. Çalışmada analiz edilmiş olan Tulipa örnekleri (ilk 22 örnek T. luanica daha sonraki örnekler T. kosovarica türlerine aittir) ile internal standarda (çavdar) ait florasan yoğunluğu (G1 pik) değerleri ve örneklerin hesaplanan çekirdek DNA içerikleri (2C/pg)………...7 Tablo 2. Çalışmada incelenen Tulipa türlerinin 2C ortalama çekirdek DNA içerikleri ve standart sapma değerleri……… 8
iv
ŞEKİLLER Sayfa no
Şekil 1. Kosova' nın bu günkü haritası ve çalışmada analiz edilen Tulipa bitkilerinin toplandığı lokasyonlar……….………….……...3 Şekil 2. Çalışmada kullanılan flow sitometri cihazının görünüşü ……..….……...4 Şekil 3. Bir T. luanica örneğinin flow sitometri ile analizi sonucunda elde edilen flow histogramlarının görüşü...9 Şekil 4. Bir T. kosovorica örneğinin flow sitometri ile analizi sonucunda elde edilen flow histogramlarınıngörünüşü....………...10 Şekil 5. T. luanica metafaz kromosomlarının görünüşü (2x=2n=24)…………...11 Şekil 6. T. kosovarica metafaz kromosomlarının görünüşü (2x=2n=24).…...11
v
Flow Sitometri ile Kosova Florasında Doğal Olarak Yetişmekte Olan Tulipa Taksonlarının çekirdek DNA içeriklerinin Belirlenmesi ve Ploidy Analizi ile Taksonomik Sınıflandırmada Kullanılması
ÖZET
Tulipa cinsi farklı ploidy düzeylerine sahip yaklaşık olarak 100' ü tür olarak kabul görmekte olan 500 civarında taksonu içermektedir. Cinsin üyeleri bahar aylarında açan şahane çiçeklere sahiptir ve bu özelliklerinden dolayıda çok eski tarihlerden beri büyük bir ekonomik değere sahiptirler.
Sunulan bu araştırma projesinin amacı flow sitometri ile Kosova' nın bazı bölgelerinde doğal olarak yayılış gösteren Tulipa taksonlarının çekirdek DNA içeriklerini ilk defa belirlemek ve elde edilen bilgiyi taksonların ploidy düzeylerinin belirlenmesi ve taksonomik teşhislerinde kullanmaktır.
Çalışmada flow sitometri ile Kosova' nın iki farklı lokasyonundan toplanmış ve iki farklı türe (T. luanica ve T. kosovorica) ait 45 Tulipa genotipinin 2C çekirdek DNA içerikleri belirlenmiştir. Analizlerde florasan boya olarak propidium iodide ve internal standard olarak çavdar bitkisi kullanılmıştır.
Elde edilen sonuçlara göre analiz edilen genotiplerin 2C çekirdek DNA içeriklerinin 42.58 pg ile 48.36 pg arasında değiştiği belirlenmiştir. T. luanica ve T. kosovorica türlerinin ortalama 2C çekirdek DNA içerikleri ise sırasıyla 46.80 ve 44.41 pg olarak belirlenmiştir. İki tür arasındaki çekirdek DNA içeriği bakımından farklılık küçük olmakla beraber istatistiki açıdan önemli bulunmuştur. Bu nedenle Tulipa türlerinin teşhisinde yararlı olabileceği belirlenmiştir. Türlerin çekirdek DNA içeriği ile ploidy düzeylerini ilişkilendirmek için klasik yöntemle her türden bir bitkinin kromozomları sayılmış ve her iki bitkininde Tulipa cinsi içerinde en yaygın ploidy düzeyi olan diploid (2x = 2n = 24) kromozom sayısına sahip oldukları gözlenmiştir. Benzer DNA içeriklerine sahip oldukları için diğer 43 bitkininde ploidy düzeylerinin diploid olduğu kabul edilmiştir.
Sonuç olarak flow sitometri ile belirlenen çekirdek DNA içeriği bilgisi Tulipa türlerinin ploidi düzeylerinin belirlenmesi, ve taksonomik teşhisleri ile sınıflandırılmalarında son derece yararlı olacağı belirlenmiştir.
Anahtar kelimeler: Tulipa, flow sitometri, çekirdek DNA içeriği, ploidy, taksonomi
vi
Determination of Nuclear DNA Content of Tulipa Taxons from Kosovo by Flow Cytometer and Usage in Ploidy Analysis and Classification
ABSTRACT
Genus Tulipa includes approximatelly 500 taxons and about 100 of them already accepted as species. Members of the genus have spectacular flowers in spring and therefore, they have a big economic importance since very old times.
The objectives of this research project were to determine nuclear DNA content of Tulipa taxons from Kosovo for the first time by using flow cytometer and use it in ploidy analysis and taxonomic identification.
In the study, 2C nuclear DNA content of 45 Tulipa plants, representing two different Tulipa species (T. luanica ve T. kosovorica), collected from two different locations of Kosovo were determined. Propidium iodide was used as florescent dye in preparation of samples while rye was the internal standard.
Based on the results of the study, 2C nuclear DNA content of Tulipa plants analysed in the study varied from 42.58 pg to 48.36 pg. However, the mean 2C nuclear DNA content of T. luanica ve T. kosovorica species were determined as 46.80 pg and 44.41 pg respectively. The mean 2C nuclear DNA content differences between two species species was small but, statistically significant. Therefore, the nuclear DNA content information can be usefull in taxonomic identification and classification of the species in the genus Tulipa.
Nuclear DNA content of the taxons were correlated with their ploidy levels by counting mitotic chromosomes of two plants, one for each taxons with classical methods. The rest was assumed to have same ploidy levels since they have very similar nuclear DNA content. Based on the results of chromosome analysis, ploidy of all of the genotypes were diploid with 2x = 2n = 24 chromosome number.
In conclusion, nuclear DNA content information determined by flow cytometer can be usefull in analysing ploidy of Tulipa taxons, and in their taxonomic identification and classification.
Key words: Tulipa, flow cytometer, nuclear DNA content, ploidy, taxonomy
1 1. GİRİŞ
Tulipa' lar bahar aylarında çiçeklenen ve ciddi bir ekonomik değere sahip süs bitkileridirler. Dünyada yaklaşık 5000 tesçilli Tulipa çeşidi bulunmakta ve her yıl bu çeşitlere ait milyonlarca soğanın satışı yapılmaktadır. Dünya Tulipa kontrol listesine (WCSP 2014) göre cins içerisinde yaklaşık 100 tanesi tür olarak kabul edilen 500 civarında takson bulunmaktadır. Tulipa' lar Güney Avrupa, Kuzey Afrika, Orta Doğu, Kafkaslar ve Çin cumhuriyetinide içine alan Orta Asyayı kapsayan bölgelerde doğal olarak yayılış göstermektedir (Hoog 1973; Botschantzeva, 1982). Bununla birlikte türlerin çoğunluğu Orta Asyada bulunan Tien Shan and Pamir-Alai dağları arasındaki coğrafi bölgede bulunmaktadır. Bu nedenle bu bölge Tulipa' ların ana gen merkezi olarak kabul edilmektedir (Hoog 1973; Botschantzeva, 1982; Terzioğlu ve Coşkunçelebi 2002). Kafkaslar ise Tulipa' ların ikinci gen merkezidir. Iranda 36 Tulipa türü bulunurken, ülkemizde ise yaklaşık 20 Tulipa türü bulunmaktadır. Nispeten daha az sayıda (15-20) Tulipa türünün de Balkan yarım adasında doğal olarak yetiştiği bilinmektedir (Shuka ve ark., 2010).
Başlangıçta Tulipa'lar morfolojik olarak bir birinden kolayca ayrılan Tulipa (Leiostemones Bois.) ve Eriostemones Bois. olmak üzere 2 alt seksiyona ayrılmıştır (Terzioğlu ve Coşkunçelebi, 2002). Leiostemones seksiyonu içerisinde yer alan türler başlıca Orta Asyada (ana gen merkezi) bulunmakta iken Eriostemones seksiyonu içerisinde yer alan türler ise ana gen merkezinden kafkaslara (ikinci gen merkezi) ve daha batıya doğru (Avrupa) göç etmiştir. Daha sonraları ise sitogenetik ve biyokimyasal yöntemlerden de yararlanılarak Tulipa cinsi Tulipa, Eriostemones, Clusianae and Orithyi gibi 4 seksiyona ayrılmıştır (Zonneveld, 2009).
Tulipa' lar ile ilgili çok sayıda literatür bilgisi bulunmakla birlikte, cinsin taksonomisi zordur. Bunun başlıca nedeni bir çok karakterin tür içerisinde varyasyon göstermesidir. Buna ilave olarak cinsin içerisinde yer alan türler doğada kendi aralarında da melezlenebilmektedir. Tulipa türlerinin çoğunluğu diploid (2x = 2n = 24) olmakla beraber bazıları triploid (3x = 2n = 36), tetraploid (4x = 2n = 48) veya pentaploittir (5x = 2n = 60) (Wafai & Koul, 1983).
Ekonomik önemlerinden dolayı Tulipa türleri üzerinde yoğun ıslah çalışmaları yapılmaktadır. Yeni Tulipa genetik kaynakları ıslah çalışmalarına dahil edilmeden önce taksonomik teşhislerinin doğru bir şekilde yapılarak, sahip oldukları genomlar karakterize edilmeli ve diğer türler ile ilişkileri saptanmalıdır. Flow sitometri ile belirlenen çekirdek DNA içeriği bilgisi bir türün tüm bireyleri ile bir bireyin tüm hücrelerinde sabittir ve değişmez. Bununla birlikte türler arasında ise çekirdek DNA içeriği bakımından farklılık 1000 misli kadar olabilmektedir. Sahip olduğu bu karakteristiklerden dolayı çekirdek DNA içeriği türlere özeldir ve türlerin taksonomik teşhislerinde, ploidy düzeylerinin belirlenmesinde, genomların yapıları ve ilişkilerinin saptanmasında son derece yararlı olmakta ve yaygın olarak kullanılmaktadır (Johnson ve ark., 1998; Brummer ve ark., 1999; Arumuganathan ve ark., 1999; Tuna ve ark., 2001;Tuna ve ark., 2007).
2
Flow sitometri ile daha önce bazı Tulipa türlerininde Çekirdek DNA içerikleri belirlenmiştir (Zonneveld, 2009; Shuka ve ark., 2010). Zonneveld (2009)' in yapmış olduğu çalışmada yaklaşık 125 taksonu temsilen 400 aksesyon analiz edilmiş ve taxonların 2C çekirdek DNA içeriğinin 32 pg ile 69 pg arasında büyük bir değişim gösterdiğini saptamıştır. Buna ek olarak araştırıcı çalışmasında taksonların çekirdek DNA içeriğinin taksonların ploidy düzeyi ile doğru orantılı bir artış gösterdiğini gözlemiştir. Örneğin yapılan bu çalışmada 2X, 3X ve 4X gibi farklı ploidy düzeyine sahip olan T. clusiana taksonlarının ortalama 2C çekirdek DNA içerikleri sırasıyla 32.1, 47.3 ve 65.8 pg olarak belirlenmiştir. Yapılan bu çalışmada her üçüde 2X ploidy düzeyine sahip olan, morfolojik olarak birbirlerine benzeyen ve bu yüzden sık sık karıştırılan T. armena Boiss., T. systola Stapf, and T. julia K., Koch türlerinin çekirdek DNA içeriklerinin sırasıyla 51.8, 56.3 ve 61.6 pg olduğu belirlenmiş ve sadece çekirdek DNA içeriklerine bakarak bu üç Tulipa türünün birbirinden kolayca ayrılabileceği saptanmıştır. Yine aynı şekilde her üçüde 2X ploidy düzeyine sahip ve yine çok benzer morfolojiye sahip olan T. biebersteiniana Schult. f., T.sylvestrisssp.australis(Link)Pamp., and T. primulina Baker türlerinin 2C ortalama çekirdek DNA içeriklerinin sırasıyla 56.9, 62.0, ve 64.6 pg olduğu belirlenmiştir.
Shuka ve ark., (2010) Arnavut' luğun kuzey doğusunda bulunan Kukesi bölgesinde doğal olarak yetişmekte olan Tulipa taksonunu benzer morfolojiye sahip olan ve Makedonya ile Kosova da yayılış gösteren T. scardica ve Ukrayna, Kafkaslar, ve Asyada yayılış gösteren T. schrenkii ile karşılaştırmış ve gözlediği önemli farklılıklardan dolayıda taksonu T. albanica olarak adlandırarak Arnavutluk için yeni bir tür olarak bildirmiştir. Yapılan bu çalışmada Shuka ve ark., (2010) ilave olarak Arnavutluk florasından ilk defa bir Tulipa türünün, T. albanica' nın 2C çekirdek DNA içeriğini flow sitometri ile 54.15 (± 0.23) pg olarak belirlemiş ve türün çekirdek DNA içeriğinin T. schrenkii (61.50 pg) ve T. scardica (69 pg) için Zonneveld (2009) tarafından bildirilen değerlerden ciddi anlamda düşük olduğunu belirlemiştir. T.
albanica' nın çekirdeği içerisinde bulunan toplam DNA miktarının T. schrenkii ve T.
scardica türlerinden önemli derecede düşük olması morfolojik olarak benzer olan bu üç türün ayrımında kullanılabilecek önemli bir diğer özellik olarak kabul edilmiştir.
Küçük bir ülke olmasına rağmen Kosova florasında T. luanica, T. kosovarica, T.
serbica, T. scardica, T. gesneriana and T. sylvestris gibi 6 Tulipa türü bulunmaktadır ( Millaku ve ark., 2018). Sunulan bu araştırma projesinin amacı flow sitometri ile Kosova' nın bazı bölgelerinde doğal olarak yayılış gösteren Tulipa taksonlarının çekirdek DNA içeriklerini belirlemek ve elde edilen bilgiyi taksonların ploidy düzeyi, taksonomik sınıflandırması ve varsa melez türlerin belirlenmesinde kullanmaktır.
3 2. GEREÇ VE YÖNTEM
2.1. Bitki materyali
Tulipa bitkileri projemizde araştırıcı olarak yer alan Kosova' nın Pristina Üniversitesi öğretim üyeleri tarafından Kosovada iki ayrı lokasyondan toplanmıştır (Şekil 1).
Başlangıçta bitki toplanması planlanan üçüncü lokasyonda ise bölgede halen devam eden politik ve güvenlik sorunlarından dolayı bitki örnekleri toplanamamıştır.
Şekil 1. Kosova' nın bu günkü haritası ve çalışmada analiz edilen Tulipa bitkilerinin toplandığı lokasyonlar.
2. 2. Flow Sitometri ile Çekirdek DNA analizi
Çekirdek DNA analizleri Namık Kemal Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Tarla bitkileri Ana Bilim Dalı, Bitki Genetiği ve Sitogenetiği Laboratuarında bulunan PARTEC marka flow sitometri cihazı kullanılarak yapılmıştır. Analizlerde Tulipa bitkilerinin taze yaprak dokuları kullanılmıştır. Yaprak dokuları Kosovadan laboratuara petri kabı içerisine yerleştirilmiş iki ıslak kağıt havlu arasında tranfer edilmiştir. Çalışmada çekirdek DNA içeriği 16.5 pg olan çavdar (podujevo çeşidi) bitkisi internal standard olarak kullanılmıştır. Analizler için örnek hazırlama işlemi PARTEC firmasının hazır kitleri kullanılarak üretici firmanın önerdiği şekilde yapılmış olup, çalışmada kullanılan yöntem kısaca aşağıdaki gibidir.
1-Yaklaşık olarak 0,5 cm2 büyüklüğünde taze yaprak dokusu (hem örnek hemde standart bitki için) petri kabına konur ve üzerine 500 µl Exraction Buffer ilave edilir 2- Yaprak dokusu keskin jilet ile 30-60 saniye süresince küçük parçalara ayrılana kadar parçalanır. Bu şekilde hazırlanmış örnek petri kabı içerisinde hafifçe 10-15 saniye kadar çalkalanır.
3- Çalkalama işleminden sonra 40 saniye kadar petri kabında bekletilen örnek Partec marka 50 µl CellTrics filtre ile süzülerek tüp içerisine transfer edilir.
4
4-Tüp içerisine daha önce hazırlanmış 2ml staining solüyonu ilave edilerek hazırlanan örnek ışıksız bir ortamda 30-60 dakika inkübe edilir. Bu sürenin sonunda örnekler flow sitometri cihazı kullanılarak analiz edilir
Şekil 2. Çalışmada kullanılan flow sitometri cihazının görünüşü 2. 3. Çekirdek DNA İçeriğinin Hesaplanması
Çekirdek DNA içeriği mutlak olarak belirlenmek istendiğinde, örneğin DNA içeriği, DNA içeriği bilinen bir standart bitki ile kıyaslanır. Bu durumda standart bitkinin dokularıda analiz edilecek örneğe ait dokularla birlikte aynı anda hazırlanır. Bu şekilde hazırlanmış bir örnek analiz edildiğinde elde edilecek olan flow histogramda 2 pik gözlenir (Şekil 3 ve 4). Bu piklerden biri analiz edilen örneğe, diğeri ise standart bitkiye aittir. Piklerin hangisinin örneğe hangisinin standarda ait olduğunu saptamak için örnek ile standardın dokularından hazırlanmış numuneler önce ayrı olarak analiz edilirler ve piklerin yerleri gözlenir. Bir örneğin mutlak çekirdek DNA içeriği, örnek ile seçilen standardın G1 piklerinin florasan yoğunluklarına ait değerler kullanılarak aşağıdaki formül aracılığıyla pikogram olarak hesaplanır.
Örneğin Çekirdek DNA içeriği: [(örneğin florasan yoğunluğu (G1 pikinin değeri) / (standardın florasan yoğunluğu (G1 pikinin değeri)] X standardın pikogram olarak bilinen çekirdek DNA içeriği
2. 4. İstatistiksel analiz
Her bir taksona ait bitkilerin çekirdek DNA ortalamaları basit bir istatiksel yöntem olan confidence intervalları kullanarak kendi aralarında kıyaslanmıştır. Her ortalama için confidence interval aşağıdaki eşitlik kullanılarak hesaplanmıştır.
P (x 1 - t0.05Sx ˂ µ ˂ x 1 + t0.05Sx ) = 0.95
Formülde t0.05 “t” statistiği ve Sx = s/n1I2. Eşitlikte n her bir takson için analiz edilen bitki sayısı ve s onların standard sapmasıdır. Confidence intervalleri örtüşen ortalamaların bir birinden farklı olmadığı kabul edilir. Bu bakımdan yapılan analiz ortalamaları kıyaslamak için yapılan 't' testi ile aynıdır (Steel and Torrie, 1960).
5 2. 5. Kromozom sayımı
Kromozom sayımı işlemleri projemizde araştırıcı olarak yer alan Kosova' nınPristina Üniversitesi öğretim üyeleri tarafından kendi laboratuarlarında yapılmış ve izlenen prosedür aşağıda sunulmuştur.
2. 6. Kök uçlarının eldesi
Kök uçları saksılarda yetiştirilmekte olan ergin Tulipa bitkilerinden yada soğanlarının köklendirilmesi suretiyle sabah erken saatlerinde (8-10) elde edilmiştir.
2. 7. İlk İşlem:
Kök uçları 24 saat soğuk su (+4 0C) ile muamele edilmiştir.
2. 8. Materyalin tespiti:
24 saat soğuk su muamelesinden sonra kök uçları 3:1 etanol : asetik asit solusyonunda tespit edilmiş ve kullanılana kadar -20 0C de muhafaza edilmiştir.
2. 9. Hidroliz
Kök uçları 1N HCL ile 60 0C de 12 dakika hidroliz edilmiştir.
2. 10. Boyama
Kök uçları hidrolizden sonra, kök uçlarının 1–2 mm’lik meristem bölgelerinin koyu viyole rengine boyanması için 30-90 dakika Feulgen solusyonu içerisinde bekletilmiştir.
2. 11. Peparatların hazırlanması
Kök uçlarının koyu viyole rengine boyanan kısımları jilet ile kesilerek lam üzerine alınmış ve bistürü ucu ile ezmek suretiyle lam üzerine yayılmıştır. Dağılmış olan meristem dokusu üzerine 1 damla asetokarmin damlatılarak üzerine lamel kapatıldıktan sonra düz bir zemin üzerinde lamelin üzerine baş parmak ile bastırılarak preparatın hazırlanması tamamlanmıştır.
2. 12. Fotoğraf çekimi
Hazırlanmış olan preparat mikroskop altında incelenmiş ve kromozomları iyi dağılmış, kolayca sayılabilen, ve tam kromozom sayısına sahip olan hücrelerin kromozomları sayılmış ve fotoğrafları çekilmiştir.
6 3. SONUÇLAR VE TARTIŞMA
Yürütülmüş olan bu çalışmada flow sitometri yöntemi ile ilk defa Kosovadan 2 Tulipa taxonunun (T. luanica ve T. kosovorica) daha önce bilinmeyen 2C çekirdek DNA içerikleri belirlenmiştir. Yürütülen çalışmada bu iki taksona ait olan ve iki farklı lokasyondan toplanmış 45 örnek başarılı bir şekilde analiz edilmiş ve sonuçlar topluca Tablo 1 de sunulmuştur. Tablo 1 de görüleceği üzere analiz edilmiş olan Tulipa örneklerinin 2C çekirdek DNA içerikleri 42.58 pg ile 48.36 pg arasında değişmektedir. Elde edilen sonuçlara göre bazı T. luanica türleri ile T. kosovorica türlerine ait örnekler bir birine çok yakın çekirdek DNA içeriklerine sahip olmakla birlikte genel olarak T. luanica türüne ait örnekler T. kosovorica örneklerinden daha yüksek çekirdek DNA içeriğine sahip olduğu belirlenmiştir. Tulipa taksonlarının ortalama çekirdek DNA içerikleri ise T. luanica için 46.80 pg olarak hesaplanırken, T.
kosovorica için ise 44.41 pg olarak hesaplanmıştır. İki Tulipa taksonunun ortalama 2C çekirdek DNA içerikleri birbirine oldukça yakın olmakla birlikte, yapılan istatistiksel analiz sonuçlarına göre aralarındaki farklılığın istatistiksel açıdan önemli olduğu saptanmıştır. Bu nedenle flow sitometri ile belirlenmiş çekirdek DNA içeriği bilgisi bu iki türün bir birlerinden ve diğer Tulipa türlerden taksonomik olarak ayrımında (teşhislerinde) yararlı olabilecek ve bu amaçla kullanılabilecek nitelikte bir özelliktir. Çalışmadan elde edilen sonuçlar (44.41- 46.80 pg) daha önce flow sitometri ile Tulipa taksonlarının analiz edildiği çalışmalarda bildirilen değerler ile karşılaştırıldığında yürütülen bu çalışmadan elde edilen sonuçların Zonneveld (2009)' in bildirmiş olduğu Tulipa taksonlarına ait çekirdek DNA içeriği değerlerinin (32-69 pg) ortasında bir yerde yer aldığı görülmektedir. Bununla birlikte T. luanica ve T. kosovorica türleri için bu çalışmada elde edilmiş olan 2C çekirdek DNA içeriklerinin (44.41- 46.80 pg) Zonneveld (2009)' in çalışmasında yer alan ve Tulipa alt cinsi içerisinde bulunan Kolpakowskiana seksiyonunu türlerinden olan T. anisohylla(42- 44.4 pg), T. korshirkyi (43.5-44.5 pg), T. ferganica(44.3-45.6 pg), F. altaica (43.2-46.5 pg)' ye ait değerler ile çok yakın olduğu görülmüştür. Bu sonuçlar Kosovada doğal olarak yayılış gösteren T. luanica ve T. kosovorica türlerinin Kolpakowskiana seksiyonu içerisinde yer alan T. anisohylla, T. korshirkyi, T. ferganica, F. altaica türleri ile genetik olarak yakın ilişkili olabileceğini işaret etmektedir.
Çalışmamızda T. luanica ve T. kosovorica türleri için elde edilmiş olan 2C çekirdek DNA içerikleri (44.41- 46.80 pg) Shuka ve ark., (2010)' nın Arnavutlukta doğal olarak yayılış gösteren T. albanica türü için bildirmiş oldukları 2C çekirdek DNA içeriğinden (54.15 pg) daha düşük olduğu görülmektedir. Bu iki çalışma arasındaki farklılıkların ise çalışmalarda analiz edilen taksonların farklı olmasından kaynaklanmaktadır.
T. luanica ve T. kosovorica türlerinin çekirdek DNA içerikleri ile ploidy düzeylerini ilişkilendirmek amacıyla yapılan mitotik kromozom sayımlarında her iki türünde Tulipa cinsi içerisinde en yaygın ploidy düzeyi olan diploid (2x=2n=24) kromozom sayısına sahip olduğu belirlenmiştir. Kromozom sayısı ile ilgili olarak çalışmamızda elde
7
Tablo 1. Çalışmada analiz edilmiş olan Tulipa örnekleri (ilk 22 örnek T. luanica daha sonraki örnekler T. kosovarica türlerine aittir) ile internal standarda (çavdar) ait florasan yoğunluğu (G1 pik) değerleri ve örneklerin hesaplanan çekirdek DNA içerikleri (2C/pg)
Örnek No
Örneğin pik değeri
Standardın pik değeri
Standardın bilinen çekirdek DNA içeriği
Örneğin hesaplanan çekirdek DNA içeriği
1 361,450 124,690 16,5 47,83
2 352,640 121,940 16,5 47,72
3 386,810 133,410 16,5 47,84
4 314,800 111,850 16,5 46,44
5 353,925 122,973 16,5 47,49
6 370,568 130,278 16,5 46,93
7 341,880 119,950 16,5 47,03
8 390,430 137,630 16,5 46,81
9 361,230 127,580 16,5 46,72
10 388,730 135,950 16,5 47,18
11 343,440 119,640 16,5 47,37
12 317,510 109,330 16,5 47,92
13 349,893 121,640 16,5 47,46
14 376,690 128,530 16,5 48,36
15 412,490 144,440 16,5 47,12
16 352,340 126,200 16,5 46,07
17 352,890 128,990 16,5 45,14
18 389,250 139,850 16,5 45,93
19 335,410 122,070 16,5 45,34
20 357,473 129,278 16,5 45,63
21 350,218 126,815 16,5 45,57
22 353,420 127,020 16,5 45,91
23 344,130 125,580 16,5 45,22
8
24 333,880 120,360 16,5 45,77
25 333,120 120,790 16,5 45,50
26 399,370 144,910 16,5 45,47
27 368,300 132,250 16,5 45,95
28 344,730 125,360 16,5 45,37
29 324,790 118,250 16,5 45,32
30 350,218 126,815 16,5 45,57
31 365,960 139,850 16,5 43,18
32 352,820 135,420 16,5 42,99
33 357,260 135,260 16,5 43,58
34 349,490 131,910 16,5 43,72
35 359,550 135,240 16,5 43,87
36 361,020 134,520 16,5 44,28
37 336,150 130,260 16,5 42,58
38 356,330 135,200 16,5 43,49
39 364,430 135,200 16,5 44,48
40 361,240 136,510 16,5 43,66
41 362,770 135,350 16,5 44,22
42 325,690 120,830 16,5 44,47
43 365,200 136,430 16,5 44,17
44 362,890 135,350 16,5 44,24
45 334,750 128,560 16,5 42,96
Tablo 2. Çalışmada incelenen Tulipa türlerinin 2C ortalama çekirdek DNA içerikleri ve standart sapma değerleri
Tulipa Türleri Ortalama SD T*Sx Confidence Intervals
Lower Upper
T. luanica 46,80 0,931 0,762 46,04 47,57
T. kosovarica 44,41 0,980 0,802 43,61 45,21
9
Şekil 3.Bir T. luanica örneğinin flow sitometri ile analizi sonucunda elde edilen flow histogramlarında (alt histogram üstteki orjinal histogramın flomax programı ile analiz edilerek değiştirilmiş halidir) örnek ve standardın (çavdar) G1 piklerinin bir birlerine göre nispi pozisyonları (histogramda 1 nolu pik T. luanica' ya, 2 nolu pik standart bitkiye aittir).
Yukarıdaki (alt histogram) histogramın sağ üst köşesinde yer alan ve örnek ile standardın G1 piklerine ait ortalama florasan yoğunluğu değerlerini formülde yerlerine koyarak T. luanica için çekirdek DNA içeriği aşağıdaki gibi hesaplanmıştır.
Örneğin Çekirdek DNA içeriği: (örneğin G1 piki değeri / standardın G1 piki değeri) X standardın pikogram olarak bilinen çekirdek DNA içeriği
Örneğin çekirdek DNA içeriği (T. luanica) = (341,88 / 119,95) X 16,5 = 47,02 pg
10
Şekil 4. Bir T. kosovorica örneğinin flow sitometri ile analizi sonucunda elde edilen flow histogramlarında (alt histogram üstteki orjinal histogramın flomax programı ile analiz edilerek değiştirilmiş halidir) örnek ve standardın (çavdar) G1 piklerinin bir birlerine göre nispi pozisyonları (histogramda 1 nolu pik T. kosovorica' ya, 2 nolu pik standart bitkiye aittir).
Yukarıdaki (alt histogram) histogramın sağ üst köşesinde yer alan ve örnek ile standardın G1 piklerine ait ortalama florasan yoğunluğu değerlerini formülde yerlerine koyarak T. kosovorica için çekirdek DNA içeriği aşağıdaki gibi hesaplanmıştır.
Örneğin Çekirdek DNA içeriği: (örneğin G1 piki değeri / standardın G1 piki değeri) X standardın pikogram olarak bilinen çekirdek DNA içeriği
Örneğin çekirdek DNA içeriği(T. kosovorica) = (382,41 / 143,78) X 16,5 = 43,88pg
11
Şekil 5. T. luanica metafaz kromosomlarının görünüşü (2x=2n=24).
Şekil 6. T. kosovarica metafaz kromosomlarının görünüşü (2x=2n=24).
12
edilmiş olan sonuçlar daha önce yapılmış olan çalışmaları (Zonneveld, 2009; Shuka ve ark., 2010; ) teyit eder niteliktedir.
4. SONUÇ
Yürütülmüş olan bu araştırma projesinde flow sitometri yöntemi ile ilk defa Kosova dan 2 Tulipa taxonunun (T. luanica ve T. kosovorica) daha önce bilinmeyen 2C çekirdek DNA içerikleri başarılı bir şekilde belirlenmiştir. Türlerin çekirdek DNA içerikleri arasındaki farklılıklar çok belirgin olmakla birlikte istatistiki açıdan önemli düzeydedir. Bu nedenle türlerin diğer türlerden ayırt edilmelerinde yararlı olacaktır.
Buna ek olarak türlerin belirlenmiş olan çekirdek DNA içerikleri türlerin ploidy düzeylerinin belirlenmesinde başarılı bir şekilde kullanılmış ve çalışmada analiz edilen tüm taksonların (2x=2n=24) diploid olduğu saptanmıştır.
13 5. KAYNAKLAR
Arumuganathan, K., S. P. Tallury, M. L. Fraser, A. H. Bruneau, and R. Qu. 1999.
Nuclear DNA content of Thirteen turfgrass species by flow cytometry. Crop sci.
39:1518-1521.
Zonneveld B. J. M.. 2009. The systematic value of nuclear genome size for ‘‘all’’
species of Tulipa L. (Liliaceae). Plant Syst Evol, 281:217–245.
Botschantzeva Z.P. 1982: Tulips: taxonomy, morphology, cytology, phytogeography and physiology. — Balkema, Rotterdam.
Brummer, E. C., P. M. Cazcarro, and D. Luth. 1999. Ploidy determination of alfalfa germplasm accessions using flow cytometry. Crop sci. 39:1202-1207.
Johnson, P. G, T. P. Riordan, and K. Arumuganathan. 1998. Ploidy level determinations in buffalograss clones and populations. Crop sci. 38:478-482.
Johnson, P. G, K. E. Kenworthy, D. L. Auld, and T. P. Riordan. 2001. Distribution of buffalograss polyploid variation in the southern great plains. Crop sci. 41:909-913.
Tuna, M., K. P. Vogel, K. Arumuganathan, and K. S. Gill. 2001. DNA content and ploidy determination of bromegrass germplasm accessions by flow cytometery. Crop sci. 41:1629-1634.
Tuna, M., E. Teykin, A. Buyukbasar. 2007. Nuclear DNA content and ploidy determination of Dactylis germplasm accessions using flow cytometer” Eucarpia conference, Proceedings of XIXth congress of Fodder crops and Amenity grasses, Kopenhag, Denmark.
Shuka L., Tan K. & Siljak-Yakovlev S. 2010. Tulipa albanica (Liliaceae), a new species from northeastern Albania. — Phytotaxa 10: 17–25.
Terzioğlu, S. & Coşkunçelebi, K. 2002. Tulipa gumusanica (Liliaceae), a new species from Turkey. Annales Botanici Fennici 39: 149–151.
Wafai BA, Koul AK, 1983. Some naturally occurring chromosome anomalies in Tulipa clusiana DC; Genetic Journal. Springer Netherlands. 60(2): 157-160.
