Aydın’da Echinococcus granulosus İzolatlarının
Mitokondriyal Sitokrom C Oksidaz Alt Ünite 1 Geni
(cox1) Dizi Analizi ile Genotiplendirilmesi*
Genotyping of Echinococcus granulosus Isolates by Sequencing
of Mitochondrial Cytochrome C Oxidase Subunit 1
(cox1) Gene in Aydin
Aylin ORAL BABAOĞLU1, Aykut SOYDER2, Erdoğan MALATYALI3, Sema ERTUĞ3, Hatice ERTABAKLAR3
1 Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi, Parazitoloji Anabilim Dalı, İzmir.
1 Ege University Faculty of Medicine, Department of Parasitology, Izmir, Turkey. 2 Adnan Menderes Üniversitesi Tıp Fakültesi, Genel Cerrahi Anabilim Dalı, Aydın.
2 Adnan Menderes University Faculty of Medicine, Department of General Surgery, Aydin, Turkey. 3 Adnan Menderes Üniversitesi Tıp Fakültesi, Parazitoloji Anabilim Dalı, Aydın.
3 Adnan Menderes University Faculty of Medicine, Department of Parasitology, Aydin, Turkey.
* Bu çalışma, Adnan Menderes Üniversitesi, Bilimsel Araştırma Projeleri kapsamında desteklenmiştir (TPF-13036).
ÖZ
Kist hidatik (KH), Echinococcus granulosus metasestod formunun insan ve otçullarda başta karaciğer olmak üzere değişik organlarda gelişmesi sonucu meydana gelen zoonotik karakterli bir enfeksiyondur. Küresel bir yayılıma sahip olan bu enfeksiyon gelişmekte olan diğer ülkelerde olduğu gibi ülkemizde de halen halk sağlığını tehdit eden önemli bir parazitik hastalık olarak görülmektedir. Parazitin morfolojik ve biyolojik özellikleri izolatların tiplendirilmesinde yetersiz kaldığı ve bu nedenle moleküler yöntemlerin kullanılmasının gerektiği bildirilmektedir. Günümüze kadar 11 farklı genotipi (G1-G10 ve aslan suşu) tanımlanan E.granulosus’un genotipleri ile konak özgüllüğü arasında doğrudan bir ilişki olduğu gösterilmiştir. Bu çalışmada, Aydın’da insanlardan elde edilen E.granulosus izolatlarının genotiplerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Adnan Menderes Üniversitesi Tıp Fakültesi Eğitim ve Uygulama Hastanesinde KH nedeniyle cerrahi operasyon geçiren olgulardan alınan kist sıvıları değerlendirilmiştir. Bu örnekler
Geliş Tarihi (Received): 30.10.2017 • Kabul Ediliş Tarihi (Accepted): 19.03.2018
fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile yıkanarak %70 etil alkolde -20ºC’de kullanılıncaya kadar saklanmıştır. İzolatların mitokondriyal sitokrom C oksidaz alt ünite 1 (cox1) geni kısmi olarak polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile çoğaltılmıştır. Elde edilen PCR ürünleri sekanslandıktan sonra Genbank’da bulunan diziler ile karşılaştırılmış ve referanslar ile evrimsel uzaklıkları belirlenmiştir. İzolatların genotipleri tam veya en fazla benzerlik gösterdikleri referanslar göz önüne alınarak belirlenmiştir. Çalışmamızda toplam 20 E.granulosus izolatının genotipi belirlenmiş olup koyun suşu olarak tanımlanan Genotip 1’in (G1) izolatların büyük kısmını (15 izolat, %75) oluşturduğu ve bunu domuz/deve suşu olarak tanımlanan G6/7’nin (5 izolat, %25) izlediği saptanmıştır. Diğer bölgelerden bildirilen E.granulosus cox1 gen dizileri ile bu çalışmadakiler birlikte değerlendirildiğinde ülkemizin coğrafi konumuyla muhtemel ilişkili sonuçlara ulaşıldığı görülmüştür. Çalışmamızda koyun suşu olan G1’in yanı sıra G6/7’ye rastlanması deve ve yaban domuzlarının da bölgemizde KH hastalığının yayılmasında rolünün olabileceğini ve insanlar için bulaş riskini artırabileceğini düşündürmektedir. Ülkemizde E.granulosus’un moleküler epidemiyolojisi konusunda sınırlı sayıda çalışma bulunmaktadır. Bu çalışma ile ilimizde ilk kez E.granulosus izolatları genotiplendirilmiş olup elde edilen bulguların epidemiyolojik verilerle birleştirilerek bundan sonra alınacak koruyucu önlemlerde yol gösterici olabileceği düşünülmektedir.
Anahtar sözcükler: Echinococcus granulosus; genotip; Aydın; Türkiye.
ABSTRACT
Cyst hydatid (CH) is a zoonotic infection that is characterized by the development of metacestode form of Echinococcus granulosus primarily in liver of humans and ruminants. With a worldwide distribution, the infection is still considered as an important parasitic disease that threatens the public health in Turkey as in the other developing countries. Morphological and biological features of parasite fail to discriminate isolates for typing so molecular methods should be used for this purpose. Recently, a total of eleven genotypes of E.granulosus (G1-10 and lion strain) have been identified and these genotypes are highly correlated with host specificity of the parasite. The aim of this study, was to determine the genotypes of E.granulosus isolates from human samples in Aydın. Cyst fluids from CH operated cases in Adnan Menderes University Faculty of Medicine, Training and Research Hospital were used in the present study. Samples were washed with phosphate buffered saline (PBS) and stored in 70% ethanol at -20ºC. Mitochondrial cytochrome C oxidase subunit 1 (cox1) gene was amplified partially by polymerase chain reaction (PCR). The PCR products were sequenced initially, compared to other database in Genbank and evolutionary distances were estimated with references. The genotypes of E.granulosus isolates were determined according to the closest or exact matches to the references. A total of 20 E.granulosus isolates were genotyped in the present study, most of them (15 isolates, 75%) were identified as Genotype 1 (G1), that is defined as sheep genotype and the remaining isolates were defined as pig/camel genotype G6/7 (five isolates, 25%). A possible explanation to our results may be related to the geographical position of Turkey. The identification of G6/7 in addition to sheep genotype G1 indicated that pigs and camels in this area have role in the transmission and distribution of E.granulosus to humans. There is still limited information about the molecular epidemiology of E.granulosus in Turkey. This study reveals the first data about the genotype distribution of E.granulosus in our city, therefore the findings may help to design control program for the disease with a combination of epidemiological data.
Keywords: Echinococcus granulosus; genotype; Aydin; Turkey.
GİRİŞ
ülke-mizde de halk sağlığını tehdit eden ve hayvansal üretimde ciddi ekonomik kayıplara yol açan bir sorun olarak önemini korumaktadır1.
Filogenetik analizlere dayanarak E.granulosus 11 farklı genotipe (veya türe) ayrılmış (G1-G10 ve aslan suşu) olup ayrıca genotipler E.granulosus sensu stricto (G1-G3), (G4),
E.ortleppi (G5) ve E.canadensis (G6-G10) olmak üzere dört ana grup altında
toplanmış-tır. Genotiplendirme çalışmalarında sitokrom c oksidaz (cox1), NADH dehidrogenaz alt ünite I (nad1) ve adenozin trifosfat (ATP6) gibi mitokondriyal genlerin yanı sıra nükleer genlerden ribozomal DNA, internal transkript spacer (ITS1) de kullanılmaktadır. Bu gen-ler arasında haploid yapısı, evrimsel hızı, homoplazmik karakteri, rekombinasyon gös-termemesi nedeniyle cox1 diğerlerine göre daha sık tercih edilmektedir2. Echinococcus cinsinde görülen tür içi çeşitliliğin konak özgüllüğü, büyüme hızı, patojenite, bulaşma dinamikleri, epidemiyoloji ve kontrol stratejileri açısından önemli olduğu bildirilmiştir3. Özellikle KH’nin endemik olduğu Türkiye gibi ülkelerde KH için kontrol programlarının başarısı yaygın genotiplerin ve enfeksiyon kaynaklarının saptanması ile ilişkili görülmek-tedir. Bu çalışmada Aydın’da KH’li olgulardan elde edilen E.granulosus izolatlarının geno-tiplendirilmesi amaçlanmıştır.
GEREÇ ve YÖNTEM Örnekler
Bu çalışma için Adnan Menderes Üniversitesi Tıp Fakültesi Girişimsel Olmayan Klinik Araştırmalar Etik Kurulu’ndan (GOEK) (Protokol No: 2017/1216) onay alınmıştır (Proto-kol No: 2017/1216).
Adnan Menderes Üniversitesi Tıp Fakültesi Genel Cerrahi Anabilim Dalında 2013-2016 yılları arasında opere edilen 20 olgunun (yaş 11-66, ortalama: 41.7 ± 12.4; 11 erkek ve 9 kadın) kist materyalinden kist sıvısı ayrılarak santrifüj edildi. Örnekler fosfat tamponlu tuzlu suyla (PBS) yıkandı ve elde edilen çökelti %70 etil alkol içinde -20ºC’de DNA izolasyonu yapılana kadar saklandı.
DNA İzolasyonu ve Polimeraz Zincir Reaksiyonu
DNA izolasyonu -20ºC’de saklanan protoskoleks içeren örnekler kullanılarak, QIAmp DNA Mini Kit (Qiagen, Almanya) ile kit prosedürüne uygun olarak yapıldı. Elde edilen DNA örnekleri kullanılıncaya kadar -20ºC’de saklandı.
Dizi Analizi ve Evrimsel Uzaklıkların Belirlenmesi
PCR ile beklenen boyutta (yaklaşık 450 bp) amplifikasyon saptanan örneklere Med-santek (İstanbul, Türkiye) firması aracılığıyla dizi analizi yapıldı. Diziler “Molecular Evo-lutionary Genetics Analysis version 6.0 (MEGA)” programında ClustalW algoritması kul-lanılarak GenBank’taki referans diziler G1-G10 (sırasıyla; U50464, M84662, M84663, M84664, M84665, M84666, M84667, AB235848, KX685897 ve AF525457) ile karşı-laştırıldı. Referans E.granulosus cox1 gen dizilerı ve bu çalışmada elde edilen diziler kul-lanılarak Neighbor-Joining bootstrap testi (1000 tekrar) ile filogenetik ağaç oluşturuldu. İzolatlar arasındaki evrimsel uzaklık Maximum Composite Likelihood yöntemi kullanıla-rak belirlendi4.
BULGULAR
Çalışma kapsamında değerlendirilen 20 örnekte mitokondriyal cox1 geni çoğaltılmış ve dizi analizi yapılmıştır. Bazı örneklere ait agaroz jel görüntüleri Şekil 1’de verilmiştir
Mitokondriyal cox1 gen dizileri kendi içinde sıralandığında dört farklı sekans tipi sap-tanmıştır. Literatürdeki G1-G10 referansları, ülkemizden bildirilenler ve çalışmamızda elde edilen diziler ile oluşturulan filogenetik ağaç Şekil 2’de verilmiştir.
Çalışmamızda elde edilen diziler BLAST analizi ile Genbank’dakiler ile karşılaştırılmış ve tam (%100) benzerlik gösterenler belirlenmiştir. Ülkemizden ve sınır komşularımızdan bildirilen diziler Tablo I’de özetlenmiştir.
Dizi analizi sonucunda 20 izolatın 15 (%75)’i koyun suşu olan G1, diğer beş (%25)’i deve/domuz suşu olan G6/7 olarak tiplendirilmiştir. Ayrıca G6/7 olarak tanımlanan beş izolattan birinde tek nükleotit farkı (T141C) saptanmış ve benzer şekilde G1 olarak ta-nımlanan 15 izolattan birinde de tek nükleotit farkı (C234T) görülmüştür. Çalışmamızda elde edilen diziler Genbank’a KX447497-500 numaraları ile kaydedilmiştir.
Şekil 1. Bazı örneklerin PCR sonuçlarına ait agaroz jel elektroferez görüntüsü (1-11 pozitif örnekler, N:
Tablo I. E.granulosus cox1 Dizilerinın %100 Benzerlik Gösterdiği Ülkemizden ve Komşu Ülkelerden Bildirilen
Genbank’da Kayıtlı Diziler
Bu çalışma Ülke Konak Genbank Erişim No./Genotip
KX447497 İran Deve KP751430/G6 KX447498 Yunanistan Keçi DQ856468/G7 KX447499 Türkiye (Siirt) İnsan AJ08022/Belirtilmemiş KX447500 Türkiye (Kayseri),
İran
Koyun KP751431/G1; KM100575/G1
Şekil 2. Cox1 gen dizilerina göre E.granulosus izolatlarının evrimsel
TARTIŞMA
KH hastalığı ülkemiz için önemli zoonotik hastalıkların başında gelmektedir. Hem in-san hem de hayvan sağlığında önem taşıyan bu hastalığın etkeni olan E.granulosus’un farklı konaklarda görülen çok sayıda genotipe sahip olduğu bildirilmiştir5. Moleküler yön-temler kullanılarak E.granulosus genotiplerinin belirlenmesi parazitin moleküler epide-miyolojisinin anlaşılmasına katkı sağlamaktadır. Ayrıca, enfeksiyonun zoonotik karakteri nedeniyle bu çalışmaların insanlara bulaş kaynağının ortaya konulmasında önemli oldu-ğu ve buna bağlı olarak da kontrol stratejilerinin geliştirilmesinde yol gösterici olduoldu-ğu bildirilmektedir6.
Çalışmamızda KH’li olgulardan operasyon sonrası elde edilen kist örnekleri kullanılarak toplam 20 izolatın genotipleri belirlenmiştir. İzolatların 15 (%75)’i koyun genotipi (G1), beş (%25)’i domuz/deve genotipi (G6/7) olarak tanımlanmıştır. Bu bulgu Türkiye’nin coğrafi konumu göz önüne alınarak değerlendirildiğinde anlamlı hale gelmektedir. Ül-kemiz Avrupa ile Asya’nın arasındaki karasal geçişte yer aldığı için E.granulosus genotip dağılımı açısından her iki bölgeden de etkilenmektedir. Farklı ülkelerde insanlardan elde edilen E.granulosus izolatlarının genotiplendirildiği çalışmalar incelendiğinde saptanan genotipler: Çin’de G1 ve G6, Peru’da G1 ve G6, Kenya‘da G1 ve G6, Moğolistan’da G1-G3 ve G6-G10, Polonya’da G7, Rusya’da G1 ve G6 şeklinde bildirilmiştir7-12. Bu çalış-maların birçoğunda bizim bulgularımıza benzer şekilde en sık rastlanılan insan genotipi G1-G3 olarak bildirilmiştir. Ayrıca Türkiye’nin doğu komşusu İran’da insan ve hayvan izolatlarının genotiplendirildiği çalışmalarda en çok genotip G1, sonrasında G6, G1-G3 kompleksi ve G2 genotipleri saptanmıştır13. Sınır komşuluğumuz nedeniyle besi hay-vanlarının ve köpeklerin ülkeler arasında yer değiştirmesi olağan olup benzer türlerin görülmesi beklenen bir durumdur. Çalışmamızdaki dizi analiz sonuçları incelendiğinde G1 genotipindeki dizilerin, İran’daki izolatlarla tam benzerlik gösterdiği görülmektedir. Ayrıca, ülkemizin batı sınırında yer alan Yunanistan’da koyun ve keçilerde G1, G3 ve G7 genotiplerinin varlığı bildirilmiştir14. Bizim çalışmamızda saptanan G6/7 genotipinin BLAST analizi sonucunda, Yunanistan’da keçilerden izole edilen G7 genotipi ile %100 benzerlik gösterdiği saptanmıştır. Yine çalışmamıza benzer şekilde, Bulgaristan’da geno-tip G1’in en yaygın E.granulosus genogeno-tipi olduğu bildirilmiştir15.
Türkiye’de E.granulosus’un moleküler epidemiyolojisini araştıran çalışmalar ayrıntılı olarak incelendiğinde bizim bulgularımızı destekler nitelikte sonuçların ortaya konuldu-ğu görülmektedir. İnsan dışındaki canlılardan da örneklerin alındığı bu çalışmalarda sığır, koyun, manda ve attan elde edilen izolatlar ile çalışılmış ve en yaygın olarak G1 genotipi-nin görüldüğü bildirilmiştir16-18. Bunun yanı sıra G1-G3 kompleksi ile karşılaştırıldığında G6 ve G7 genotiplerinin çalışmamızda olduğu gibi daha az gözlendiği saptanmıştır19. Ege bölgesinde farklı illerdeki (İzmir, Uşak, Manisa ve Denizli) insanlardan elde edilen
E.granulosus izolatlarının genotiplendirildiği bir çalışmada en sık olarak G1 genotipi
Çalışmamızda koyun, deve ve domuz suşu olarak tanımlanan genotiplere rastlanmış olması Aydın’da bu hayvan gruplarının görülmesi ile ilişkilendirilebilir. Ülkemizde olduğu gibi bölgemizde de koyun yetiştiriciliği yapılmakta ve kurban bayramlarında çoğunluk-la koyun kesilmektedir. Kesimde çıkan kistli organçoğunluk-ların uygun şekilde imha edilmemesi, köpeklere atılması gibi sebeplerle hastalık halen bölgemizde ve ülkemizde yaygın olarak görülmektedir. Çalışmamızda G1’in yanı sıra G6/7’ye rastlanması, bölgemizde deve ve yaban domuzlarının da KH hastalığında rolünün olabileceğini düşündürmektedir. Aydın ilinde deve yetiştiriciliği yapılmakta, ayrıca yaban domuzlarının özellikle Güzelçamlı Milli Parkı başta olmak üzere bölgede varlıkları bilinmektedir.
Sonuç olarak bu çalışma verileri değerlendirildiğinde, ülke genelinde yapılacak kap-samlı moleküler epidemiyolojik araştırmaların hem KH hastalığının kontrolüne hem de enfeksiyon kaynaklarının belirlenmesine önemli katkı sağlayacağı sonucuna varılmıştır.
KAYNAKLAR
1. Özbilgin A, Kilimcioğlu AA. Kistik Echinococcosis, pp: 541-66. In: Özcel MA, Özbel Y, Ak M (eds), Özcel’in Tıbbi Parazit Hastalıkları. 2007, Türkiye Parazitoloji Derneği Yayınları, İzmir.
2. Boufana B, Lett WS, Lahmar S, et al. Echinococcus equinus and Echinococcus granulosus sensu stricto from the United Kingdom: genetic diversity and haplotypic variation. Int J Parasitol 2015; 45(2-3): 161-6.
3. Eckert J, Thompson RCA. Intraspesific variation of Echinococcus granulosus and related species with emphases on their infectivity to humans. Acta Tropica 1997; 64(1-2): 19-34.
4. Tamura K, Nei M, Kumar S. Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbour-joining method. Proc Natl Acad Sci USA 2004; 101(30): 11030-5.
5. de la Rue MR, Takano K, Brochado JF, et al. Infection of humans and animals with Echinococcus granulosus (G1 and G3 strains) and E.ortleppi in Southern Brazil. Vet Parasitol 2011; 177(1-2): 97-103.
6. Nikmanesh B, Mirhendi H, Ghalavand Z, et al. Genotyping of Echinococcus granulosus isolates from human clinical samples based on sequencing of mitochondrial genes in Iran, Tehran. Iranian J Parasitol 2014; 9(1): 20-7.
7. Bart JM, Abdukader M, Zhang YL, et al. Genotyping of human cystic echinococcosis in Xinjiang, PR China. Parasitology 2006; 133(5): 571-9.
8. Santivanez SJ, Gutierrez AM, Rosenzvit MC, et al. Human hydatid diseases in Peru is basically restricted to
Echinococcus granulosus genotype 1. Am J Trop Med Hyg 2008; 79(1): 89-92.
9. Casulli A, Zeyhle E, Brunetti E, et al. Molecular evidence of the camel strain (G6 genotype) of Echinococcus
granulosus in humans from Turkana, Kenya. Trans R Soc Trop Med Hyg 2010; 104(1): 29-32.
10. Jabbar A, Narankhajid M, Nolan MJ, Jex AR, Campbell BE, Gasser RB. A first insight into the genotypes of
Echinococcus granulosus from humans in Mongolia. Mol Cell Prob 2010; 25(1): 49-54.
11. Konyaev SV, Yanagida T, Ingovatova GM, Shoikhet YN, Nakao M, Sako Y. Molecular identification of human echinococcosis in the Altai region of Russia. Parasitol Int 2012; 61(4): 711-4.
12. Dybicz M, Gierczak A, Dabrowska J, Rdzanek L, Michalowicz B. Molecular diagnosis of cystic echinococcosis in humans from central Poland. Parasitol Int 2013; 62(4): 364-7.
13. Sharbatkhori M, Mirhendi H, Harandi MF, et al. Echinococcus granulosus genotypes in livestock in Iran indicating high frequency of G1 genotype in camels. Exp Parasitol 2010; 124(4): 373-9.
15. Breyer I, Georgieva D, Kurdova R, Gottstein B. Echinococcus granulosus strain typing in Bulgaria: the G1 genotype is predominant in intermediate and definitive wild hosts. Parasitol Res 2004; 93(2): 127-30. 16. Erdoğan E, Özkan B, Mutlu F, Karaca S, Şahin İ. Molecular characterization of Echinococcus granulosus isolates
obtained from different hosts. Mikrobiyol Bul 2017; 51(1): 79-86.
17. Ergin S, Sarıbaş S, Yüksel P, et al. Genotypic characterisation of Echinococcus granulosus isolated from human in Turkey. Afr J Microbiol Res 2010; 4(7): 551-5.
18. Utuk AE, Simsek S, Koroglu E, McManus DP. Molecular genetic characterization of different isolates of
Echinococcus granulosus in east and southeast regions of Turkey. Acta Trop 2008; 107(2): 192-4.
19. Simsek S, Kaplan M, Özercan IH. A comprehensive molecular survey of Echinococcus granulosus in formalin-fixed paraffin-embedded tissues in human isolates in Turkey. Parasitol Res 2011; 109(2): 411-6.
