İlk Trimester LMWH ve HB-EGF’nin İnsan Trofoblastlara Etkisi
AMAÇ:İlk trimesterde LMWH ve HB-EGF’ün insan trofoblastlarda biyolojik fonksiyonlarını değerlendirme
YER:İki akademik üreme merkezi DİZAYN:Kontrollü çalışma
HASTALAR:İlk trimesterde elektif küretajdan elde edilen 5-6 hf’lık insan plasentası MÜDAHALE:Trofoblat kültürünün LMWH veya LMWH ve HB-EGF ile muamele edilmesi.
AMAÇ:İn vitro olaraktrofoblastın biyolojik fonksiyonunu(proliferasyon,invazyon,differansiyasyon)ve LMWH ve HB-EGF arasındaki etkilişimi gözlemlemek.
SONUÇ:1-0,25İU/ml-2,5İU/ml LMWH dozları troblast invazyonu,proliferasyonu ve hCG sekresyonu artırmaktır.LMWH farklı konsantrasyonlarda minimal veya ters etkiye sahiptir.Bu farklılık isatatiksel olarak anlamlıdır.
2-LMWH ve HB-EGF’ün kombine kullanımında özallikle proliferasyonu ve invazyonu desteklemekte, ancak tek başına LMWH veya HB-EGF ile karşılaştırıldığında hCG sekresyonunda fark yoktu.
TARTIŞMA:LMWH hücre koruyucu etkisini trofoblast proliferasyon,invazyon ve diferansiyasyonu sağlar.LMWH trofoblast fonksiyonu üzerine etkisinde HB-EGF önemli faktördür.
ANAHTAR KELİME:LMWH,HB-EGF,trofoblast,in vitro
Tekrarlayan düşüklerin(TD) trombofili ıle ilişkili olduğu birçok deliller ile ortaya konmuştur.Antikoagulan tedavi ençok da tekrarlayan düşükleri ve trombofilili hastalara önerilmektedir.
LMWH daha güvenli takibinden dolayı anfraksiyone heparine tercih edilmektedir.Günümüzde TD ve trombofilili hastalarda en sık kullanılan antikoagulandır(4).2005’de Tzafettas ve ark.nedeni bilinmeyen TD’lere sahip 27 hastalarda LMWH sonrası başarı oranını%85,1 olarak bulmuşlardır.Bu da LMWH’nın antikoagulandan ziyade embrioyu farklı mekanizmalar ile koruduğunu ortaya koymaktadır.En son kanıtlar LMWH’nin antienflamatuar ve immunomodulatör etkisinin olduğunu göstermektedir.
Bununla beraber, LMWH insan trofoblastında biyolojik fonksiyonu regüle edebilmektedir.
Antifosfolipid antikorlarının inhibe ettiği trofoblast invazyon ve diferansiyasyon fonksiyonunu LMWH’nin in vitro olarak restore edebildiği rapor edilmiştir. Kanıtlar LMWH’nin trofoblast üzerine direkt etkisinin olduğunu göstermektedir.
subtipinini aktive etmektedir ve heparin sülfat poliglikanı hücre yüzeyine bağlamaktadır .Desidua ve trofofisitin HB-EGF reseptörü eksprese ettiği gösterilmiştir. HB-EGF trofoblast migrasyon ve invazyonu destekleyerek embrionun sağkalım oranını artırmaktadır. HB-EGF’ün farklı strüktürü heparin ve EGF reseptörlerini bağlayabilmektedir. Bazı araştırmacılar LMWH’nin trofoblastı etkilemesinde HB-EGF’ün önemli rol oynadığını tahmin etmektedir.
MATERYAL VE METOD:
Araştıma iki kısımdan oluşmaktadır. Birinci grupta LMWH’nin kültüre trofoblastlarda biyolojik etkisini proliferasyon,invazyon ve diferansiyasyonu çıkarmaktır.Bu grup 6 subgruba ayrıldı.Araştırma grubunda 5 grup(enoxaparin 0,025 ;0,25 ;2,5 ;25 ve 250IU/ml)LMWH ile ve kontrol grubu ise Dulbecco’s modifiye Eagle medyum(DMEM)yüksek D-glikoz(GİBCO)ile tedavi edildi.
İkinci grupta in vitro trofoblast üzerine LMWH ve HB-EGF etkileşimini ve LMWH trofoblast fonksiyonunun HB-EGF üzerinden olup olmadığı araştırmaktı. LMWH trofoblast fonksiyonunu HB-EGF ile regüle etmektedir. Bu grup 4 altgruba ayrıldı: LMWH grubu (enoxaparin 0,25IU/ml), HB-EGF grubu (10ng/ml), kombine grup(enoxaparin 0,25IU/ml ve HB-EGF 10ng/ml) ve kontrol grubu(DMEM).
SONUÇ:
İn Vitro Kültüre İnsan Trofoblastı İzolasyonu ve İdentifikasyonu
İmmunositokimyasal sonuçlar trofoblastların sitokeratin positif, vimentin negatif olduğunu gösterdi.
Aynı zamanda immunositomya izole trofoblast hücrelerin %90 oranında saflaştırılmış olduğunu ortaya koydu.
LMWH’nin Trofoblast Hücrelerinde Biyolojik Fonksiyonlara Etkisi
Konsantrasyon arttıkça LMWH’in trofoblast hücrelerine etkisi değişmekteydi.0,025İU/ml LMWH dozunda trofoblast proliferasyonu ve invazyona etkisi minimaldi (P>05);ama 0,25-2,5İU/ml LMWH dozunda trofoblast proliferasyon ve invazyondaki gelişim en fazla, ancak artan 25-250İU/ml konsantrasyonlarda hücrelerin proliferasyon ve invazyonu suprese olmaktaydı
LMWH’in aynı zamanda trofoblastlardan hCG sekresyon etkisi mevcuttur.Terapötik dozlarda (0,025- 0,25İU/ml), LMWH hCG sekresyonunu kuvvetle inhibe edicidir (P<0.5). LMWH konsantrasyonu arttırıldığında LMWH ‘nin hCG sekresyonunu inhibisyonu da giderek azalmaktadır ama istatistiksel fark anlamlı değildir (P>0.5). 2.5-25 İU/ml konsantrasyonda LMWH anlamlı biçimde hCG sekresyonunu artırmaktadır (P<0.5). Ancak 250 İU/ml LMWH hCG sekresyonunu inhibe etmektedir (P<0.5). Bu test trofoblast proliferasyonu ve invazyonu ile LMWH ve HB-EGF’ nin arasında simultane uygulandığında ilişki olduğunu gösterdi (P<0.5). Tek başına (solo) LMWH veya HB-EGF karşılaştırıldığında iki ajanın simultane uygulanması trofoblast proliferasyon ve invazyonunu anlamlı derecede iyileştirdiği saptandı (P<0.5). Kontrol grubu solo LMWH ve solo HB-EGF ile karşılaştırıldığında simultane uygulama proliferasyon ve invazyonu artırmaktadır (P<0.5).
İn vitro hCG sekresyonuna simultane LMWH ve HB-EGF uygulandığında aralarında ilişki olmadığı görüldü (P>05).Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında hCG salgısına solo LMWH’nin inhibisyonu anlamlı idi (P<05). Solo HB-EGF tanıtımı ve simultane uygulamada hCG sekresyonu anlamlı idi (P<05). Ancak hCG sekresyonu için solo HB-EGF etkisi ve simultane uygulama arasında fark yoktu (P>05).
TARTIŞMA:
LMWH ve Trofoblast
Trofoblastın proliferasyonu fizyolojik bir procesdir ve fetomaternal yüzeyde dokunun yeniden şekillenmesinde önemlidir. Bizim sonuçlarımız LMWH’nin trofoblast proliferasyonuna ikili etki
gösterdiği, düşük konsantrasyonda (0,25-2,5İU/ml) hücre proliferasyonunu desteklediğini ve yüksek konsantrasyonda (25-250İU/ml) inhibe ettiği görülmüştür. Proflaktik heparin dozu alan hastalarda 0,05-0,25İU/ml) aralığı sabitlendi (18). Quenby ve ark. anfraksiyone heparine ve LMWH ‘nin terapötik dozun 0,025-0,25 İU/ml olduğunu gösterdiler.
LMWH ‘nin trofoblast invazyonu için benzer eğilimi vardır. Terapötik dozda (0,25-2,5 İU/ml) LMWH trofoblast invazyonunu desteklemekte, ama konsantrasyon 25-250 İU/ml ulaştığında suprese etmektedir. Ancak tüm araştırmacılar aynı sonucu elde edememişlerdir. Ramesh ve ark. fraksiyone heparinin SGHPL4 hücre dizisinde ve plasental dokuda doza bağımlı invazyonu azalttığını bulmuşlardır.
Di Simone ve ark. LMWH in vitro trofoblast invazyonunu indüklediğini belirtmişlerdir. Quenby ve ark.
terapötik 0,25İU/ml dozda LMWH ‘nin trofoblast motilitesini etkilemediğini amasupraterapötik dozun hücre motilitesini inhibe ettiğini bildirmişlerdir. Bu çelişki araştırma metodunun, materyalin, olgu içeriğinin vs. farklı olmasından kaynaklanmaktadır.
Bilgilerimize göre, erken gebelik döneminde trofoblast invazyon yetersizliği daima gebeliği komplike eden hastalığa preeklampsi ve fetal büyüme geriliğine neden olmaktadır . Tümör invazyonun aksine trofoblast invazyonu dikkatle regüle ve kontrol edilmektedir. Birçok araştırmalar LMWH ‘nin trofoblast invazyonunu regüle eden faktörlerden biri olduğunu ve sonuçların her zaman tutarlı olmadığını göstermiştir. 2006 yılında Erden ve ark. altta yatan mekanizma ile ilgili gebelik kaybı öyküsü olan hastalarda LMWH kullanılması trofoblast invazyonunu iyileştirdiğini bulmuşlardır. Di Simone ve ark.
trofoblast invazyonu için LMWH modulasyonunda matriks metalloproteinlerin ve doku inhibitörlerin de etkin bir rol oynadıklarını vurgulamışlardır.
Sitotrofoblastlar sınır bölgesinde yüzen villiler hücre-hücre füzyonu ile multinukleer sinsityotrofpblastlara diferansiye olurlar ki bunlar yüzen villileri örterek fetus ve anne arasında madde alışverişine aracılık ederler. Ayrıca onların endokrin fonksiyonları vardır.Az miktarda hCG sinsityotrofoblastlardan fertilizasyonun 6.gününde sentezlenmeye başlamakta ve ilk trimester boyunca hızla artmaktadır. hCG sekresyonu trofoblast diferansiyasyonun önemli göstergesi olarak kabul edilmektedir. hCG trofoblast fonksiyonunu otoregüle ettiği görülmektedir. Plasenta tarafından üretilen düşük hCG miktarı diferansiyasyonu stimule ederek kendi sentezini arttırmaktadır. Yeterince yüksek hCG değerine ulaşıldığında, diferansiyasyon hCG değerinin kontrolsüz artışını önlemek için inhibe olmaktadır. Bunun yanında diferansiyasyon regülasyonundaki fonksiyonu için hCG trofoblast migrasyon ve invazyonu in vitro stimule etmektedir. Ancak hCG ‘nin trofoblast invazyonundaki mekanizması halen anlaşabilmiş değildir.
Biz sonuçlarımızda trofoblastın hCG sekresyonunda LMWH etkisinin olduğunu bulduk. Terapötik dozlarda LMWH çoğunlukla trofoblast diferansiyasyonunu inhibe etmektedir. LMWH konsantrasyonu arttırıldığında LMWH ‘nin hCG sekresyon inhibisyonunu uygun biçimde azalmaktadır. Supraterapötik LMWH konsantrasyonda (2,5-25 İU/ml) belirgin olarak hCG sekresyonu artmaktadır. Ancak LMWH 250 İU/ml dozlarda hCG sekresyonunu düşürmektedir. Çünkü hCG ‘nin otoregülasyon mekanızması tam anlaşılamadığı ve birçok faktörün invivo hCG değerlerini etkilediği için, hCG sekresyonu ve gebelik sonuçlarına LMWH ‘nin terapötik dozlarının kesin rolünü açıklayamıyoruz.
HB-EGF ve Trofoblast
Büyüme faktörlerinden biri olan HB-EGF ‘nün üreme fonksiyonunda önemli yeri olduğu saptandı.
Biyolojik aktif çözünen ve transmembran formların olduğu açıklandı.
Gebelik sırasında villöz sitotrofoblastlar ve extravillöz sitotrofoblastlar HB-EGF exprese etmekte ve bunun fetal gelişimde önemli faktör olduğu düşünülmektedir. Leach ve ark ilk trimester koriyonik villusa explant kültürüne HB-EGF ilavesinin extravillöz trofoblast invaziv aktivitesini arttırdığını bldular.
Lala ve Chakraborty HB-EGF ‘ün matür blastokistin matrigele adezyonu ve aşırı büyümesini desteklediğini bildirmişlerdir. Bunun trofoblast gelişimi sırasında HB-EGF sinyalizasyonunu olumsuz etkileyerek preeklamptik trofoblastlarda apopitozun artmasına ve ınvazyonun bozulmasına neden olmaktadır. Keza Fisher ve Laksmanan da HB-EGF ‘ün trofoblast diferansiyasyonunu trofoblasttan human plasental laktojen ve hCG sekresyonunu destekleyerek gerçekleştirdiğini kanıtladılar.
Bizim sonuçlarımız, diğer araştırmacıların sonuçları ile benzer şekilde HB-EGF ‘ün (10ng/m l) insan trofoblast proliferasyon, invazyon ve diferansiyasyonu kolaylaştırdığını gösterdi. Ayrıca in vitro simultane uygulandığında HB-EGF ve HB-EGF arasında trofoblast proliferasyonu ve invazyonu üzerinde etkileşim vardı. Ancak trofoblast diferansiyasyonu yönünde etkisi yoktu. Biz LMWH ‘nin trofoblast etkisi için HB-EGF ‘ün önemli faktör olduğunu ama yegane faktör olmadığını tahmin ediyoruz.
Bu arada veriler kuvvetle LMWH ‘nin sitoprotektif etkisini trofoblast proliferasyon, invazyon ve diferansiyasyon regülasyonu sayesinde gösterdiğini telkin etmektedir. Bu duruma ilaç konsantrasyonu ve başlama zamanı gibi faktörlerinde etkisi olabilir. LMWH ile HB-EGF arasındaki etkileşim, LMWH ‘nin trofoblast fonksiyonuna etkisinde HB-EGF ‘ün önemli bir faktör olduğunu göstermiştir. Bu araştırma sonucu olarak gebelik kayıplarında daha geniş uygulama ve gebeliği komplike eden hastalıklarda LMWH potansiyel ilaç olarak kullanılabilinir.
