Salmonella Serotip Enteritidis İzolatlarının Plazmid Profil Analizi ve “Pulsed Field” Jel Elektroforezi ile İncelenmesi

Salmonella Serotip Enteritidis İzolatlarının Plazmid

Profil Analizi ve “Pulsed Field” Jel Elektroforezi ile

İncelenmesi

Investigation of Salmonella Serotype Enteritidis Isolates By

Plasmid Profile Analysis and Pulsed Field Gel Electrophoresis

Ebru US, Birsel ERDEM, Alper TEKELİ, Devran GERÇEKER, Begüm SARAN, Mehseti BAYRAMOVA, Fikret ŞAHİN

Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Ankara.

Ankara University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Ankara, Turkey.

ÖZET

Bu çalışmada, Salmonella serotip Enteritidis’in moleküler epidemiyolojisinin aydınlatılması amacıyla, An-kara Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Enterobakteri Laboratuvarının kültür kolek-siyonlarından seçilen 122 Salmonella Enteritidis suşu, Kado ve Liu yöntemine göre plazmid profil analizi (PPA) ile ve Dünya Sağlık Örgütü protokollerine göre, SpeI ve XbaI enzimleri kullanılarak “pulsed field” jel elektroforezi (PFGE) ile incelenmiştir. Çalışmaya dahil edilen suşlar, 2000 yılından sonra 10 farklı ildeki klinik mikrobiyoloji laboratuvarında, salgın (n= 13) ve sporadik (n= 109) olgulara ait klinik örneklerden (103 dış-kı, 16 kan ve birer adet safra, idrar ve beyin omurilik sıvısı) izole edilen suşlardır. PFGE ile elde edilen bant sayı ve ilişkileri GeneDirectory (Syngene, İngiltere) jel analiz programı kullanılarak; küme analizi Dice ben-zerlik katsayısı ve UPGMA (Unweighted Pair Group Method Average) ilişki kuralı parametreleriyle değerlen-dirilmiştir. Çalışmada, plazmid taşıyan 110 (%90) suşun, büyüklükleri 2.0 ile 100 kb arasında değişen 1-4 plazmid taşımakta olduğu ve 14’ten fazla plazmid profili (p1-p14) gösterdiği belirlenmiştir. Seksen beş (%69.7) izolatın, 57 kb büyüklüğündeki plazmidi tek olarak ya da başka plazmidlerle birlikte bulundurdu-ğu izlenmiştir. PFGE yönteminde SpeI ve XbaI enzimleri ile 11’er farklı PFGE modeli elde edilmiş; SpeI ile olu-şan modeller A-K; XbaI ile oluolu-şanlar a-k şeklinde adlandırılmıştır. SpeI ile model A’da 93 (%76.2) suşun; XbaI ile model a’da 53 (%43.4) ve model b’de 42 (%34.4) suşun kümelendiği belirlenmiştir. İki enzim birlikte değerlendirildiğinde ortaya çıkan 17 farklı PFGE kümesi içinde, suşların çoğunluğunun Aa (50 suş, %40.9) ve Ab (42 suş, %34.4) kümelerinde toplandığı görülmüştür. PFGE yönteminde SpeI ve XbaI enzimlerinin

bir-Geliş Tarihi (Received): 18.10.2010 • Kabul Ediliş Tarihi (Accepted): 14.02.2011

İletişim (Correspondence): Dr. Ebru Us, Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı,

likte kullanılması ile ayırım gücünün arttığı belirlenmiş ve bulgularımız Türkiye’de dolaşımdaki S. Enteritidis izolatlarının çoğunluğunun benzer PFGE modelleri gösteren suşlar olduğunu ortaya çıkarmıştır. Bu nedenle S. Enteritidis suşlarının PFGE ile araştırılması durumunda, en azından plazmid profil analizi gibi bir başka yöntemle beraber uygulanması, izolatların ilişkilerini ortaya çıkarmak için daha yararlı olacaktır.

Anahtar sözcükler: Salmonella serotip Enteritidis; plazmid profil analizi; PFGE.

ABSTRACT

In this study a total of 122 Salmonella serotype Enteritidis stock strains selected from the culture col-lection of Enterobacteriaceae Laboratory of Ankara University Faculty of Medicine, Department of Medi-cal Microbiology, were investigated by plasmid profile analysis with the method defined by Kado and Liu and pulsed field gel electrophoresis (PFGE) according to World Health Organization protocols using SpeI and XbaI macrorestriction enzymes, for better understanding of the molecular epidemiology of S. Enteritidis. The study strains were selected from a collection of previously isolated epidemic (n= 13) and sporadic (n= 109) strains (103 stool, 16 blood and one each bile, urine and cerebrospinal fluid) obta-ined from 10 different cities after the year 2000. PFGE patterns were analyzed with Gene Directory soft-ware (Syngene, UK) and a similarity index was determined by using Dice coefficient and the unweigh-ted pair group method with mathematical averaging (UPGMA). Plasmid-carrying 110 (90%) strains that harbored 1-4 plasmids with sizes ranging from 2.0 to 100 kb were separated into patterns more than 14 (p1-p14). A total of 85 (69.7%) isolates harbored the 57 kb plasmid solely or in combination with other plasmids. By PFGE, 11 distinct patterns were shown with each enzyme SpeI and XbaI. S. Enteriti-dis strains after digestion with macrorestriction enzyme SpeI generated 11 different PFGE patterns (A to K), whereas XbaI generated also 11 different PFGE patterns (a to k). PFGE pattern A consisted of 93 stra-ins (76.2%) after digestion with macrorestriction enzyme SpeI, while PFGE pattern a consisted 53 (43.4%) and PFGE pattern b 42 strains (34.4%) after digestion with macrorestriction enzyme XbaI. Using two macrorestriction enzymes two PFGE cluster profiles Aa (50 strains, 40.9%) and Ab (42 strains, 34.4%) were found to be predominating among 17 different PFGE clusters. Our results confirmed the clonal nature of S. Enteritidis strains in Turkey. The use of two enzymes in PFGE analysis appeared to inc-rease the discriminatory power of PFGE, leading to greater diversity among strains. PFGE analysis perfor-med by SpeI and XbaI enzymes combined with plasmid profiling could be established as a useful tool for detection of genetic relationship between isolates.

Key words: Salmonella serotype Enteritidis; plasmid profile analysis; PFGE.

GİRİŞ

Salmonella enfeksiyonları Türkiye’de önemli bir halk sağlığı sorunudur1. Dünyada son 25 yılda Salmonella serotiplerinden Salmonella enterica subsp. enterica ser. Enteritidis be-lirgin bir şekilde yaygınlaşırken, Türkiye’de de 1990’lı yıllardan beri insan enfeksiyonla-rında en sık karşılaşılan serotip olmuştur2,3.

Salmonella cinsindeki bakteriler, lipopolisakkarid O (somatik) antijenleri ve protein H (kirpik) antijenlerinin farklılıklarına dayanılarak, 1926 yılında White’ın düzenlediği ve 1972-1978 yıllarında Kauffmann’ın genişlettiği şemaya göre serogruplara ve sero-tiplere ayrılır1. Salmonella izolatları, Türkiye’de çoğu çalışmada serotiplendirme ve antimikrobiyal duyarlılık testleriyle araştırılmıştır6. İzolatların çoğunun benzer antibi-yogramlar gösterdiği epidemiyolojik çalışmalarda, bu fenotipik yöntem Salmonella serotiplerini tiplendirmede yeterli ayırt edici güce sahip değildir. Epidemiyolojik çalış-malarda Salmonella serotiplerinin alttiplendirmesi (subtyping) için ve izolatların ara-larındaki ilişkinin gösterilebilmesi amacıyla standart tekniklere ihtiyaç vardır. Son yıl-larda Salmonella izolatlarının ileri ayırımı için moleküler tiplendirme yöntemleri geliş-tirilmiştir7_{. Plazmid ve kromozom DNA’sının incelenmesine dayanan plazmid analizi,}

ribotiplendirme, “pulsed field” jel elektroforezi (PFGE) gibi moleküler yöntemler her geçen gün geliştirilmekte ve yeni yöntemler eklenmektedir8_{. PFGE, Salmonella}

suşla-rının ayırımında kullanılan moleküler yöntemler içinde yaygın olarak önerilen ve Amerika Birleşik Devletleri’nde 1996 yılından beri Salmonella alttiplendirmesinde uy-gulanan başlıca yöntemdir9.

Bu çalışmada, S. Enteritidis’in moleküler epidemiyolojisine katkıda bulunmak üzere Türkiye’de salgın ve sporadik olgulardan izole edilen S. Enteritidis suşlarının plazmid pro-fil analizi (PPA) ve iki enzim (SpeI ve XbaI) kullanılarak PFGE yöntemleriyle araştırılması amaçlanmıştır.

GEREÇ ve YÖNTEM Suşlar

Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Enterobakteri La-boratuvarının kültür koleksiyonlarında bulunan 122 S. Enteritidis suşu çalışmaya alındı. Bu suşlar, daha önceki bir çalışma kapsamında3_{2000 yılından itibaren, 10 ildeki}

[Anka-ra (n= 43), Antalya (n= 2), Bursa (n= 12), Edirne (n= 27), Eskişehir (n= 7), İstanbul (n= 2), İzmir (n= 2), Kayseri (n= 17), Konya (n= 8), Trabzon (n= 2)] klinik mikrobiyoloji labo-ratuvarlarında, salgın (n= 13) ve sporadik (n= 109) olgulara ait klinik örneklerden [dışkı (n= 103), kan (n= 16), safra (n= 1), idrar (n= 1), beyin omurilik sıvısı (BOS) (n= 1)] standart yöntemlerle izole edilmiş; Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Da-lında serotiplendirilmiş; “Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI; eski adı ile NCCLS)” kılavuzunda açıklandığı şekilde agar dilüsyon yöntemiyle antibiyotik duyarlılıkla-rı belirlendikten sonra, mikrobank kültür saklama tüpleri içinde -80°C’de saklanmakta olan izolatlardı. Bu suşlar, yaşları 1-90 yıl arasında değişen 101 gastroenterit, 13 sepsis, 8 pa-ratifo olgusundan (38 kadın, 84 erkek) izole edilmişti. Bu izolatların 13’ü, Edirne yakın-larındaki bir askeri birlikte meydana gelen gıda kaynaklı bir salgın sırasında 20-22 yaşla-rındaki gastroenteritli olguların dışkı kültürlerinden elde edilen suşlardı.

Plazmid Eldesi ve Plazmid Profil Analizi

içeren %0.7’lik horizontal agaroz jelde (Serva, Heidelberg, Almanya) 100 V’da iki saat yürütülerek ayrıldı. İncelenen suşların plazmid büyüklükleri, plazmid büyüklükleri bilinen Escherichia coli V517 suşu (53.7, 7.2, 5.6, 5.1, 3.9, 3.0, 2.7, 2.1 kb), Salmonella Typhi-murium 020255-Ankara suşu (90 kb), Salmonella Enteritidis 006956-Ankara (57, 5.8, 4.8 kb) suşu ve bir moleküler büyüklük belirteci (gene ruler 1 kb DNA Ladder, Fermen-tas, Vilnius, Litvanya) ile birlikte elektroforez uygulanarak belirlendi. Plazmid DNA bantları, UV ışığı altında (TFX 20M-Vilber Lourmat, Marna la Vallee, Fransa) görüntü-lendi. Kontrol suşları (E.coli V517, S. Typhimurium 020255-Ankara ve S. Enteritidis 006956-Ankara) Refik Saydam Hıfzıssıhha Merkezi Bulaşıcı Hastalıklar Araştırma Bölü-münden sağlandı. İzolatların plazmid DNA içerikleri kilobaz (kb) şeklinde molekül ağır-lıklarına uygun olarak tanımlandı.

PFGE

PFGE, Dünya Sağlık Örgütü (DSÖ) protokolüne göre uygulandı11. Bu yönteme göre her bir izolat SpeI ve XbaI enzimleri (Fermentas, Vilnius Litvanya) ile ayrı ayrı kesim işle-mine tabii tutuldu. Tüm izolatlar bir gece 37°C’de üretildikten sonra %1.3’lük düşük eri-me ısılı agaroz ile agaroz kalıpları hazırlandı. Genomik DNA, 20 U’lik kesim enzimleri SpeI ve XbaI ile üreticinin önerileri doğrultusunda dört saat inkübe edildi. CHEF DR II (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) sisteminde, %1.3’lük agaroz jel ile uygulanan elektroforez ko-şulları başlangıç vuruş süresi 2.2 saniye, bitiş vuruş süresi 63.8 saniye, akım 6 V/cm, sı-caklık 14°C, süre 18 saat olacak şekilde ayarlandı. Jeller etidyum bromür (0.2 µg/ml) so-lüsyonunda boyandı ve UV ışığı altında görüntülendi. Elektroforez sonrasında jel fotoğ-rafları DigiGenius görüntüleme sistemi (Syngene-UK) kullanılarak çekildi. PFGE paternle-ri, hem Tenover ve arkadaşları12_{tarafından tarif edildiği şekilde gözle, hem de Gene}

Di-rectory (Syngene, Cambridge, İngiltere) programı kullanılarak değerlendirildi. “Unwe-ighted Pair Group Method with Mathematical Averaging (UPGMA)” yöntemi ve “Dice” benzerlik katsayısı kullanılarak PFGE paternlerinin %1’lik bant toleransı ile dendrogramı oluşturuldu ve kümelenme analizi yapıldı. Kontrol olarak bir moleküler büyüklük belirte-ci (M) [N0340S, New England Biolabs, Hetfordshire, İngiltere (Band büyüklüğü 48.5-1018.5 kb)] kullanıldı. Kontrol suşu (Salmonella Braenderup H9812) Refik Saydam Hıfzıs-sıhha Merkezi Başkanlığı Bulaşıcı Hastalıklar Araştırma Bölümünden sağlandı.

BULGULAR

İzolatların antimikrobiyal duyarlılıkları, plazmid profilleri, PFGE modelleri (paternleri) ve diğer özellikleri Tablo I-VII’de gösterilmiştir.

Enteritidis suşlarından elde edilen altı plazmid (85, 70, 60, 55, 4.0, 3.5 kb), diğer illerin izolatlarında görülmemiştir (Tablo II ve IX). Sadece Edirne’de belirlenen p2 profili (57, 40, 3.0 kb) gösteren suşların 13‘ü gıda kaynaklı salgın suşlarıdır (Tablo I). Ayrıca, p5 pro-fili (100, 57 kb) sadece Kayseri suşlarında belirlenmiştir (Tablo VI).

Tablo I. Edirne’de Salgından ve Sporadik Olgulardan İzole Edilen Salmonella Enteritidis Suşlarının Plazmid Profilleri, SpeI ve XbaI Enzimleri ile Elde Edilen PFGE Modelleri

PFGEa_Kümeler

Suş Direnç Plazmidler Plazmid Spel Xbal

no Klinik Örnek modeli (kb) profili modeli modeli

1* Ge Dışkı S 57, 40, 3.0 p2 A b 2* Ge Dışkı S 57, 40, 3.0 p2 A b 3* Ge Dışkı S 57, 40, 3.0 p2 A b 4* Ge Dışkı S 57, 40, 3.0 p2 A b 5* Ge Dışkı S 57, 40, 3.0 p2 A b 6* Ge Dışkı S 57, 40, 3.0 p2 A b 7* Ge Dışkı S 57, 40, 3.0 p2 A b 8* Ge Dışkı S 57, 40, 3.0 p2 A b 9* Ge Dışkı S 57, 40, 3.0 p2 A b 10* Ge Dışkı S 57, 40, 3.0 p2 B j 11* Ge Dışkı S 57, 40, 3.0 p2 A b 12* Ge Dışkı S 57, 40, 3.0 p2 A b 13* Ge Dışkı S 57, 40, 3.0 p2 A b 14 Ge Dışkı S 57 p1 A a 15 Ge Dışkı S 57, 40, 6.5, 4.5 p3 A b 16 Ge Dışkı S 57, 40, 6.5, 4.5 p3 A b 17 Ge Dışkı S - B j 18 Ge Dışkı S 57, 40, 3.0 p2 A b 19 Ge Dışkı S 57, 40, 6.5, 4.5 p3 A b 20 Ge Dışkı S 57, 40, 3.0 p2 A b 21 Ge Dışkı A 57, 2.5 p9 A b 22 Ge Dışkı A 57 p1 A b 23 Ge Dışkı AA/CT 57, 5.8, 4.8 p4 A a 24 Ge Dışkı AA/CG 90, 57, 3.0, 2.0 pD A b 25 Ge Dışkı S 57, 40, 6.5, 4.5 p3 A b 26 Ge Dışkı S 57, 6.5, 4.5 p7 A b 27 Ge Dışkı S 57, 40, 6.5, 4.5 p3 A b * Salgın suşu. a _{Kümeler (3 tip): Aa (2); Ab (23); Bj (2).}

Tablo II. Ankara’da İzole Edilen Salmonella Enteritidis Suşlarının Plazmid Profilleri, SpeI ve XbaI Enzimleri ile Elde Edilen PFGE Modelleri

PFGEaKümeler

Suş Direnç Plazmidler Plazmid Spel Xbal

no Klinik Örnek modeli (kb) profili modeli modeli

28 Se Kan S 57 p1 C a 29 Ge Dışkı C - K h 30 Pt Kan S 57 p1 A a 31 Ge Dışkı C - A a 32 Ge Dışkı S 57, 3.5 p10 A b 33 Ge Dışkı S 57 p1 A a 34 Ge Dışkı C 57 p1 A a 35 Ge Dışkı C 6.0 p12 B c 36 Ge Dışkı S 57, 2.5 p9 A b 37 Ge Dışkı AA/CT 6.0, 2.0 pD G f 38 Se Kan A 57 p1 A a 39 Pt Kan AA/CCT 90 p6 C e 40 Ge Dışkı S 57 p1 A a 41 Ge Dışkı A 90 p6 F e 42 Ge Dışkı C 57 p1 A a 43 Ge Dışkı AA/CCT - F e 44 Ge Dışkı T 57, 4.0, 3.0 pD A a 45 Ge Dışkı C 85 pD H g 46 Ge Dışkı AA/CT 30 pD H a 47 Ge Dışkı AA/C 57 1 H d 48 Ge Dışkı A 57, 3.5, 2.5 pD H d 49 Ge Dışkı GCT 100, 57, 5.8, 4.8 p13 A a 50 Ge Dışkı GCT 90, 5.0 pD A a 51 Se Safra ACT - G f 52 Ge Dışkı AT - A a 53 Se Kan AC - J k 54 Ge Dışkı AA/C 57 p1 A a 55 Ge Dışkı AT 57 p1 I d 56 Pt Dışkı A 70 pD A b 57 Ge Dışkı A 57, 3.5 p10 A a 58 Se Kan A 2.0 p14 A b 59 Ge Dışkı A 2.0 p14 A a 60 Ge Dışkı AA/CG 100, 55 pD A b 61 Pt Kan CT 60 pD A b 62 Ge Dışkı S 57, 5.8, 4.8 p4 A a 63 Ge Dışkı S 57, 4.5 p11 A a 64 Ge Dışkı S 57, 4.5 p11 A b 65 Ge Dışkı C 90, 3.5 pD A b 66 Ge Dışkı T 55 pD A a 67 Ge Dışkı S 57 p1 A a 68 Ge Dışkı S 57 p1 A a 69 Ge Dışkı S 57 p1 A a 70 Se Dışkı S 57 p1 A a a_{Kümeler (13 tip): Aa (21); Ab (8); Ca (1); Kh (1); Bc (1); Gf (2); Ce (1); Fe (2); Hg (1); Ha (1); Hd (2); Jk (1); Id (1).}

Tablo IV. Bursa’da İzole Edilen Salmonella Enteritidis Suşlarının Plazmid Profilleri, SpeI ve XbaI Enzimleri ile Elde Edilen PFGE Modelleri

PFGEa_Kümeler

Suş Direnç Plazmidler Plazmid Spel Xbal

no Klinik Örnek modeli (kb) profili modeli modeli

79 Ge Dışkı GC 100, 57, 5.8, 4.8 p13 A a 80 Se Kan S 57 p1 A a 81 Ge Dışkı S 57, 40, 6.5, 4.5 p3 A b 82 Se Dışkı S 57, 40, 6.5, 4.5 p3 A b 83 Ge Kan S 57, 5.8, 4.8 p4 A a 84 Ge Dışkı S 57 p1 A a 85 Se Kan A 57, 3.0 pD A b 86 Ge Dışkı AT 57, 40, 30, 3.0 pD A b 87 Ge Dışkı S 90, 57, 4.5 pD A b 88 Se İdrar A 57, 2.0 pD A b 89 Ge Dışkı S 57 p1 A a 90 Ge Dışkı S 57, 5.8, 4.8 p4 A a a _{Kümeler (2 tip): Aa (6); Ab (6).}

PFGE: Pulsed field jel elektroforezi, Ge: Gastroenterit, Se: Septisemi, S: Denenen tüm antimikrobiyallere duyarlı, A: Ampisiline dirençli, C: Kloramfenikole dirençli, T: Tetrasikline dirençli, G: Gentamisine dirençli, pD: Diğer plazmid profilleri.

Tablo III. Antalya, İstanbul, İzmir ve Trabzon’da İzole Edilen Salmonella Enteritidis Suşlarının Plazmid Pro-filleri, SpeI ve XbaI Enzimleri ile Elde Edilen PFGE Modelleri

PFGEa_Kümeler

Suş Direnç Plazmidler Plazmid Spel Xbal

no Şehir Klinik Örnek modeli (kb) profili modeli modeli

71 Antalya Ge Dışkı TT/S 90 p6 A b 72 Antalya Ge Dışkı A 57 p1 A a 73 Istanbul Ge Dışkı A - A a 74 İstanbul Ge Dışkı AA/C - B c 75 Izmir Pt Kan C 57 p1 A a 76 Izmir Ge Dışkı S 57 p1 A i 77 Trabzon Pt Kan S 57 p1 A a 78 Trabzon Ge Dışkı S 57, 40 pD A a a_{Kümeler (4 tip): Aa (5); Ab (1); Bc (1); Ai (1).}

Tablo VI. Kayseri’de İzole Edilen Salmonella Enteritidis Suşlarının Plazmid Profilleri, SpeI ve XbaI Enzimleri ile Elde Edilen PFGE Modelleri

PFGEaKümeler

Suş Direnç Plazmidler Plazmid Spel Xbal

no Klinik Örnek modeli (kb) profili modeli modeli

98 Ge Dışkı G 100, 57 p5 A a 99 Ge Dışkı S 57 p1 A a 100 Ge Dışkı G 100, 57 p5 A a 101 Ge Dışkı S 100, 57 p5 A a 102 Ge Dışkı C - B c 103 Se Kan C - B c 104 Ge Dışkı AA/CCT 90 p6 F e 105 Ge Dışkı AC 7.0 pD B c 106 Ge Dışkı A 57 p1 A a 107 Ge Dışkı G 100, 57 p5 A a 108 Pt Kan AA/C 90, 3.0, 2.0 pD A b 109 Ge Dışkı G 100, 57 p5 A b 110 Ge Dışkı S 57, 6.5, 4.5 p7 A b 111 Ge Dışkı S 57, 6.5, 4.5 p7 A b 112 Ge Dışkı S 57, 5.8, 4.8 p4 A a 113 Ge Dışkı AA/CGCT/S 40 p8 B c 114 Pt Kan AA/CGCT/S 40 p8 B c a _{Kümeler (4 tip): Aa (7); Ab (4); Bc (5); Fe (1).}

PFGE: Pulsed field jel elektroforezi, Ge: Gastroenterit, Se: Septisemi, Pt: Paratifo, S: Denenen tüm antimikrobiyallere duyarlı, A: Ampisiline dirençli, A/C: Amoksisilin/klavulanik aside dirençli, C: Kloramfenikole dirençli, T: Tetrasikline dirençli, G: Gentamisine dirençli, T/S: Trimetoprim/sülfametoksazole dirençli, pD: Diğer plazmid profilleri. Tablo V. Eskişehir’de İzole Edilen Salmonella Enteritidis Suşlarının Plazmid Profilleri, SpeI ve XbaI Enzimleri ile Elde Edilen PFGE Modelleri

PFGEa_Kümeler

Suş Direnç Plazmidler Plazmid Spel Xbal

no Klinik Örnek modeli (kb) profili modeli modeli

91 Ge Dışkı S 2.6 pD D c 92 Ge Dışkı S 6.0 p12 B c 93 Ge Dışkı S 57 p1 C a 94 Ge Dışkı C 5.8 pD B c 95 Ge Dışkı A 5.0 pD B c 96 Ge Dışkı S 57 p1 A a 97 Ge Dışkı S 57 p1 A a a _{Kümeler (4 tip): Aa (2); Bc (3); Dc (1); Ca (1).}

S. Enteritidis suşlarının PFGE yöntemi ile SpeI ve XbaI makrorestriksiyon enzimleri ile ke-simlerinin ardından, molekül büyüklükleri her iki enzimle de 48.5-1018.5 kb arasında de-ğişen 8-13 adet bant elde edilmiştir. “Dice” benzerlik katsayısı ve UPGMA yöntemi kulla-nılarak oluşturulan PFGE modellerinin dendogramları sırasıyla Şekil 1 ve 3’te gösterilmiştir.

SpeI enzimi ile kesilen S. Enteritidis suşları 8-13 bant içeren 11 farklı PFGE modeli (A-K) oluşturmuştur. İki ana PFGE modeli olan A ve B’nin genetik benzerliklerinin %38 ol-duğu gösterilmiştir. İzolatların 93 (%76.2)’ü PFGE modeli A’yı, 12 (%9.8)’si PFGE model B’yi oluşturmuştur (Şekil 1, Tablo X). Kalan 17 izolatın oluşturduğu dokuz PFGE modeli (C-K) üçten fazla bant farkı ve %80’in altında benzerlik göstermiştir. S. Enteritidis suşla-rının SpeI enzimi ile kesiminin ardından elde edilen PFGE modellerine ait örnekler Şekil 2’de verilmiştir.

XbaI enzimi ile kesilen S. Enteritidis suşları 8-13 bant içeren 11 farklı PFGE modeli (a-k) oluşturmuştur. Üç ana PFGE modeli a, b ve c, sırasıyla tüm izolatların %43.4, %34.4 ve %9’unda saptanmıştır (Şekil 1, Tablo X). Kalan sekiz PFGE modeli 16 izolattan elde edilmiş; bu modeller arasında üçten fazla bant farkı ve %80’in altında benzerlik gözlen-miştir. PFGE model a ve model b arasındaki genetik benzerlik %91’den fazladır. Bu iki PFGE modeli ile model c arasındaki genetik benzerlik ise %10’dur (Şekil 3). S. Enteritidis suşlarının XbaI enzimi ile kesiminin ardından elde edilen PFGE modellerine ait örnekler Şekil 4’te gösterilmiştir.

İki enzim birlikte değerlendirildiğinde, S. Enteritidis suşlarının 17 farklı PFGE kümesi-ne ayrıldığı görülmüştür (Tablo X). Üç ana küme olan Aa, Ab, Bc’nin tüm izolatlar ara-sındaki dağılımı sırasıyla %40.9, %34.4 ve %8.1 olarak belirlenmiştir.

Tablo VII. Konya’da İzole Edilen S. Enteritidis Suşlarının Plazmid Profilleri, SpeI ve XbaI Enzimleri ile Elde Edilen PFGE Modelleri

PFGEa_Kümeler

Suş Direnç Plazmidler Plazmid Spel Xbal

no Klinik Örnek modeli (kb) profili modeli modeli

115 Se Kan S - E i 116 Ge Dışkı S 57 p1 A a 117 Ge Dışkı AA/CCT 57 p1 A a 118 Ge Dışkı S 57 p1 A a 119 Ge Dışkı S 57 p1 A a 120 Ge Dışkı S 57 p1 A a 121 Se BOS AA/C 40 p8 A a 122 Ge Dışkı S 57 p1 A a a_{Kümeler (2 tip): Aa (7); Ei (1).}

Tablo VIII. S. Enteritidis Suşlarında Plazmid Profillerini Oluşturan Plazmidler ve Profilleri Bulunduran İzolat Sayısı

Profiller Plazmidler (kb) Suş sayısı

p1 57 34 p2 57, 40, 3.0 15 p3 57, 40, 6.5, 4.5 7 p4 57, 5.8, 4.8 5 p5 100, 57 5 p6 90 4 p7 57, 6.5, 4.5 3 p8 40 3 p9 57, 2.5 2 p10 57, 3.5 2 p11 57, 4.5 2 p12 6.0 2 p13 100, 57, 5.8, 4.8 2 p14 2.0 2

Diğer plazmid profilleri 57, 4.0, 3.0 1

Tablo IX. S. Enteritidis Suşlarında Bulunan Plazmidlerin Büyüklükleri

Plazmid büyüklüğü (kb) Suş sayısı (%)

57 85 (69.7) 40 27 (22.1) 3.0 20 (16.3) 4.5 13 (10.6) 6.5 10 (8.2) 90 9 (7.3) 100 8 (6.5) 5.8 8 (6.5) 4.8 7 (5.7) 2.0 6 (4.9) 3.5 4 (3.2) Ankara* 6.0 3 (2.4) Ankara, Eskişehir* 2.5 3 (2.4) Ankara, Edirne* 55 2 (1.6) Ankara* 30 2 (1.6) Ankara, Bursa* 5.0 2 (1.6) Ankara, Eskişehir* 85 1 (0.8) Ankara* 70 1 (0.8) Ankara* 60 1 (0.8) Ankara* 7.0 1 (0.8) Kayseri* 4.0 1 (0.8) Ankara* 2.6 1 (0.8) Eskişehir*

* Sadece belirtilen şehirlerdeki izolatlarda bulunan plazmidler.

38 44 50 57 63 69 75 81 88 94 100

PFGE modeli

A B

Şekil 2. S. Enteritidis suşlarının SpeI enzimi ile kesimin ardından oluşan PFGE modellerine ait örnekler (M: Lamb-da ladder PFGE belirteci; 42, 43, 103, 104, 105, 37 suş noları; suşların PFGE modelleri, sırasıyla; A, F, B, F, B, G).

M 42 43 103 104 105 37

Tablo X. S. Enteritidis Suşlarının PFGE Modellerine ve Her İki Enzimin (SpeI ve XbaI) Birlikte Değerlendirilme-siyle Oluşturulan PFGE Kümelerine Dağılımı

Suş Suş Kümeler Suş

Spel sayısı (%) XbaI sayısı (%) (SpeI/XbaI) sayısı (%)

A 93 (76.2) A 53 (43.4) Aa 50 (40.9) B 12 (9.8) B 42 (34.4) Ab 42 (34.4) C 3 (2.4) C 11 (9) Bc 10 (8.1) D 1 (0.8) D 3 (2.4) Ai 1 (0.8) E 1 (0.8) E 4 (3.2) Bj 2 (1.6) F 3 (2.4) F 2 (1.6) Ca 2 (1.6) G 2 (1.6) G 1 (0.8) Ce 1 (0.8) H 4 (3.2) H 1 (0.8) Dc 1 (0.8) I 1 (0.8) I 2 (1.6) Ei 1 (0.8) J 1 (0.8) J 2 (1.6) Fe 3 (2.4) K 1 (0.8) K 1 (0.8) Gf 2 (1.6) Ha 1 (0.8) Hd 2 (1.6) Hg 1 (0.8) Id 1 (0.8) Jk 1 (0.8) Kh 1 (0.8)

11 model 11 model 17 küme 122

TARTIŞMA

Türkiye’de en sık izole edilen Salmonella enterica serotipi S. Enteritidis’dir1,3_.

Dünya-nın pek çok bölgesinde de yaygın olduğundan S. Enteritidis enfeksiyonları küresel bir pandemi olarak kabul edilmektedir13. 1997 yılında Avrupa’da bildirilen tüm insan salmo-nelloz olgularının %85’i S. Enteritidis kaynaklı iken, bu yüksek seviyeden itibaren insidan-sın düştüğü gözlenmiştir7. Avrupa’da gıda kaynaklı enfeksiyonların en sık nedeni Salmo-nella’lardır ve S. Enteritidis de en sık tanımlanan serotiptir2_{. İngiltere ve İspanya’dan}

ya-pılan son çalışmalar S. Enteritidis’in sırasıyla %60 ve %86 insidans ile en sık rastlanan

se-PFGE modeli b a c 10 19 28 37 46 55 64 73 82 91 100

Şekil 3. S. Enteritidis izolatlarının başlıca PFGE XbaI bant modellerine ait Gene Directory programı ve UPGMA yöntemi kullanılarak oluşturulan dendogramlar.

Şekil 4 S. Enteritidis suşlarının XbaI enzimi ile kesimin ardından oluşan PFGE modellerine ait örnekler (M: Lamb-da ladder PFGE belirteci; 38, 95, 117, 41, 45, 44, suş no’ları; suşların PFGE modelleri, sırasıyla; a, c, a, e, g, a)

rotip olduğunu göstermiştir. 2000-2002 yılları arasında S. Enteritidis Avrupa’da Enter-net’e bildirilen suşların %53’ünü oluşturmuştur14_.

Avrupa’da salgınların incelemesinde, Salmonella serotiplerinde suşların ileri ayırımı (alttiplendirme) gerektiğinde, DNA parmak izi incelemesiyle beraber yapılan Ward ve arkadaşlarının15_{yöntemine dayanan faj tiplendirme, uluslararası standart bir yöntem}

olarak kullanılmaktadır2. Geniş konak çeşitliliğine sahip bir patojen olan S. Enteritidis faj tipleri, çeşitli bölgelerde ve hayvan türlerinde bildirilmiştir13. Erdem ve arkadaşla-rı16_{1994 yılında Türkiye’de faj tip 4’e (PT4) ait suşların hakimiyetini göstermişlerdir.}

Daha sonra Avrupa’da 1998-2003 yılları arasında insan izolatlarına ait faj tiplerinde değişiklik olduğu, PT4’te azalma ve PT8 ile PT21’in yaygınlığında artış olduğu bildi-rilmiştir5. Plazmid ve kromozom DNA’sının incelenmesine dayanan yöntemler, faj tip-lendirmeye ek olarak kullanılmaktadır16-18_{. Geleneksel faj tiplendirme yöntemi zaman}

alıcıdır, faj süspansiyonlarının devam ettirilmesi güçtür ve belirli referans merkezlerin-de uygulanabilmektedir13_.

Günümüzde etkenin belli bölgelerde endemik olması nedeniyle, epidemiyolojik sür-veyans için duyarlı ve standart yöntemler gereklidir19. Moleküler tiplendirme, Salmonel-la sürveyansının duyarlılık ve özgüllüğünü büyük ölçüde artırmakta8,20ve geleneksel sür-veyans yöntemleriyle saptanamayacak salgınları belirleme ve halk sağlığı için önemli özel klonları hızla tanımlama olanağı sağlamaktadır13. PPA (plasmid profile analysis), RAPD (randomly amplified polymorphic DNA), IS200 RFLP (restriction fragment length poly-morphism), ribotiplendirme ve PFGE muhtemel genetik ilişkileri belirleme ve tanımlama-da kullanılan yöntemlerdir21_.

Plazmidler, çoğunlukla kovalan olarak kapalı, dairesel yapıda, çift iplikçikli kromozom DNA molekülleridir ve bakteri kromozomundan bağımsız olarak replike olur. Epidemiyo-lojik amaçlar için uygulanan PPA, suşlardaki plazmid DNA’sının ekstraksiyonundan sonra her bir suşun taşıdığı plazmidlerin sayı ve moleküler ağırlıklarının belirlenmesi temeline dayanır. Çeşitli Salmonella salgınlarının aydınlatılmasını sağlamasına karşın PPA, plazmid taşıyan suşlarla sınırlıdır. S. Enteritidis izolatlarının çoğu çevresel konaklarda devam ede-bilmesi için önemli olduğu düşünülen 38 MDa’luk serovara özgül virülans plazmidini ta-şımaktadır. Salmonella serotiplerinin alttiplendirmesinde, suşların plazmid taşımadığı; suşların sadece serotipe özgü plazmid taşıdığı ya da suşların çok azının plazmidi olduğu durumlarda PPA faydalı olamamaktadır16,22_.

PFGE, ilk tarif edildiği 1983 yılından sonra birçok bakteri için kullanılan moleküler epi-demiyolojik yöntemler içinde, suşlar arasındaki genetik ilişkiyi ortaya koymada güvenilir standart bir yöntem haline gelmiştir. PFGE, günümüzde Salmonella serotipleri için de standart bir yöntem olarak kabul edilmektedir14. Bu teknikte, megabaz büyüklüğündeki kromozom DNA’sı, seyrek olarak, aralıklı kesen makrorestriksiyon enzimleriyle kesilmek-te; kesilen büyük DNA parçaları, farklı yönlerden elektrik akımı uygulayabilen elektrofo-rez aygıtı ile jel üzerinde yürütüldükten sonra görüntülenebilmektedir12_{. PFGE, ABD’de}

ve çeşitli Avrupa ülkelerinde Salmonella salgın araştırmalarında elde edilen bulguları kar-şılaştırabilmek amacıyla standart protokolle uygulanmaktadır8,14. PFGE’nin XbaI ile kulla-nımı, Salmonella serotipleri için yaygın olarak kabul görmektedir23,24. Bazı çalışmalarda, kontamine etten insana Salmonella bulaşının gösterilmesi örneğinde olduğu gibi enfek-siyon zinciri PFGE ile doğrulanmıştır7,16.

2001 yılında kurulan uluslararası bir proje olan Avrupa Birliği DG Araştırma-Fonu giri-şimi Salm-gene tarafından, PFGE modellerinin (paternlerinin) gerçek zamanlı olarak onaylanması ve ileri sürveyans için kriterlerin belirlenmesi amacıyla, dokuz Avrupa ülke-sindeki insan izolatlarından elde edilen PFGE modellerine ait taranabilir bir veri bankası geliştirilmiştir. En sık rastlanan PFGE modelleri olan SENTXB.0001 (%56), SENTXB.0002 (%16) ve SENTXB.0005 (9.5%) veri bankasına gönderilen tüm S. Enteritidis izolatlarının neredeyse %82’sini oluşturmaktadır. Peters ve arkadaşlarına2göre, PFGE modellerinin yüksek derecede benzerliği ve dağılımının ortaya koyduğu bu veriler, S. Enteritidis’in klo-nal yapısını vurgulamaktadır2_{. Bu bulgu, tüm hayvan ve insan izolatlarının %64’ünün tek}

bir PFGE modelinde toplandığının belirlendiği diğer bir çalışma ile uyumlu bulunmakta-dır25. Çalışmamızda da, Salm-gene projesinde görüldüğü gibi S. Enteritidis izolatlarının belirli PFGE kümelerinde (Aa ve Ab) toplanması (Tablo X), bu izolatlarının klonal olduğu-nu düşündüren verilerle uyumludur.

Çeşitli çalışmalar, PFGE’de BlnI gibi ikinci bir enzim veya birden fazla teknik kullanıldı-ğında S. Enteritidis izolatlarının daha fazla ayırt edilebildiğini göstermiştir2,26_{. PFGE’de}

ikinci bir kesim enziminin kullanılması, belli serotiplerde ve S. Enteritidis’in PT4 gibi ha-kim faj tiplerinin ayırt edilmesinde faydalı görülmektedir2. Çalışmamızda da, S. Enteriti-dis klinik izolatlarının tiplendirilmesinde iki kesim enziminin kullanılmasının, tek bir enzi-min kullanılmasına göre biraz daha ayırt edici olduğu görülmüştür. Çalışmamızda SpeI ve XbaI enzimlerinin her biri ile 11 PFGE modeli; her iki enzim birlikte değerlendirildiğin-de ise 17 farklı PFGE kümesi eldeğerlendirildiğin-de edilmiştir. SpeI enzimi ile 11 farklı modeğerlendirildiğin-del arasında bir model (A) esas olarak hakimken (93 izolat; %76.2); XbaI enzimi ile elde edilen bantların dendogramında %91’den fazla genetik benzerliğe (muhtemel ilişkili) sahip olduğu be-lirlenen iki modelin (a ve b) hakim olduğu görülmüştür (sırasıyla; 53 izolat, %43.4 ve 42 izolat, %34.4). Her iki enzim birlikte değerlendirildiğinde ise 17 farklı PFGE kümesi için-de iki kümenin (Aa ve Ab) hakim olduğu ortaya çıkmıştır (sırasıyla; 50 izolat, %40.9 ve 42 izolat, %34.4) (Tablo X).

plazmid profilini (p2) gösteren ve biri dışında benzer PFGE kümesine (Ab) ait olan izolatlar olduğu görülmüştür. Çalışmada elde edilen bu moleküler bulgular, PFGE kü-mesi Bj’ye ait suşun (suş no. 10) gerçek bir salgın izolatı olmadığını, izole edildiği ol-gunun aynı yerde, aynı zaman diliminde benzer semptomları göstermesinden dolayı izolatın salgın şüpheli suşlara dahil edildiğini göstermiştir. Bu bulgular, S. Enteritidis’e ait salgın suşlarının ayırt edilmesinde, PPA ve PFGE’nin yararlı olduğunu göstermiştir (Tablo I).

Türkiye’de izole edilen suşların incelendiği bir çalışmada, 2001-2004 yılları arasın-da toplanan ve genetik olarak benzer olmayan 26 S. Enteritidis suşunun %92’sinin ay-nı plazmidi (38 MDa) taşıdığı görülürken, XbaI enzimi ile kesimin ardından tip I, II, III ve IV olmak üzere dört PFGE kümesi elde edilmiştir21. Rivoal ve arkadaşlarının7 çalış-masında, üç örnekleme periyodu boyunca üç farklı yumurta fabrikasından toplanan 144 sıvı yumurta örneğinden elde edilen S. Enteritidis izolatları, genomik DNA’nın XbaI ve SpeI enzimleri ile kesimini takiben PFGE ile tiplendirilmiş ve S. Enteritidis’in klo-nal yapıda olduğunu doğrulayacak şekilde benzerlik oranları yüksek olan (%88) üç kü-me belirlenmiştir. Bu durum pek çok çalışmada da gösterilmiştir27-31. Pang ve arkadaş-ları32,33_{Tayvan ve Almanya’da S.Enteritidis insan izolatlarına ait genomların 13 yıl}

bo-yunca (1991-2002) çok iyi korunduğu sonucuna varmışlardır. Murase ve arkadaşları34 ise, Salmonella serotiplerinin PFGE alt tiplendirmesinde iki makrorestriksiyon enzimiy-le yapılan inceenzimiy-lemenin daha ayırt edici olduğunu göstermişenzimiy-lerdir. Çalışmamızda da, iki enzimi (SpeI ve XbaI) bir arada değerlendirdiğimizde daha fazla sayıda PFGE kümeleri ortaya çıkmıştır. Ayrıca benzer direnç modeli gösteren S. Enteritidis suşlarının, PPA ve iki enzimli PFGE ile kolayca ayrılabildiği görülmüştür (Tablo I-VII). Yapılan çalışmalar-da, farklı kaynaklardan elde edilen S.Enteritidis izolatlarının alttiplendirilmesinde PPA ve PFGE’nin faydalı yöntemler olduğu rapor edilmektedir13,33_{. Çalışmamızda, sırasıyla}

tüm izolatların %40.9, %34.4 ve %8.1’ini oluşturan Aa, Ab ve Bc kümelerindeki S.En-teritidis izolatları, antibiyotik direnç modelleri ve plazmid profilleri açısından farklı bu-lunmuştur (Tablo I-VII). Direnç modelleri ve genotipler arasında ilişki saptanmazken, antibiyotiklere çoklu direnç gösteren izolatların farklı PFGE kümelerine ve farklı plaz-mid profillerine dağıldığı belirlenmiştir.

TEŞEKKÜR

Çalışmada izolatları sağlayan öğretim üyelerine [A.D. Aysev, Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi (ÜTF); G. Hasçelik, D. Gür ve S. Ercis, Hacettepe ÜTF; S. Gedikoğlu, Uludağ ÜTF; B. Sümerkan ve D. Eşel, Erciyes ÜTF; İ. Tuncer, Selçuk ÜTF; M. Tuğrul ve M. Tat-man-Otkun, Trakya ÜTF; A. Tünger, Ege ÜTF; Y. Akgün, Osmangazi ÜTF; M. Gültekin, Akdeniz ÜTF; İ. Köksal, Karadeniz Teknik ÜTF; G. Söyletir, Marmara ÜTF] ve kontrol suş-larını [Salmonella Braenderup (H9812), E.coli (V517), Salmonella Typhimurium (020255-Ankara) ve Salmonella Enteritidis (006956-(020255-Ankara)] sağlayan Refik Saydam Hıfzıssıhha Merkezi Başkanlığı Bulaşıcı Hastalıklar Araştırma Bölümünden B. Esen ve B. Levent’e te-şekkür ederiz.

KAYNAKLAR

1. Toreci K, Ang O. Türkiye’de saptanmış olan Salmonella serovarları ve salmonellozların genel değerlendiril-mesi. Türk Mikrobiyol Cem Derg 1991; 21(1): 1-18.

2. Peters TM, Berghold C, Brown D, et al. Relationship of pulsed-field profiles with key phage types of

Salmo-nella enterica serotype Enteritidis in Europe: results of an international multi-centre study. Epidemiol Infect

2007; 135(8): 1274-81.

3. Erdem B, Hasçelik G, Gedikoğlu S, et al. Salmonella enterica serotipleri ve Salmonella enfeksiyonları: Türki-ye’de on ili kapsayan çok merkezli bir çalışma. Mikrobiyol Bul 2004; 38(3): 173-86.

4. Fisher IS. The Enter-net international surveillance network-how it works. Euro Surveill 1999; 4(5): 52-5. 5. Fisher IS and Enter-net participants. Dramatic shift in the epidemiology of Salmonella enterica serotype

En-teritidis phage types in western Europe, 1998-2003-results from the Enter-net international salmonella

da-tabase. Euro Surveill 2004; 9(11): 43-5.

6. Aysev AD, Güriz H, Erdem B. Drug resistance of Salmonella strains isolated from community infections in Ankara, Turkey, 1993-99. Scand J Infect Dis 2001; 33(6): 420-2.

7. Rivoal K, Protais J, Quéguiner S, et al. Use of pulsed-field gel electrophoresis to characterize the heteroge-neity and clonality of Salmonella serotype Enteritidis, Typhimurium and Infantis isolates obtained from who-le liquid eggs. Int J Food Microbiol 2009; 129(2): 180-6.

8. Liebana E, Garcia-Migura L, Breslin MF, Davies RH, Woodward MJ. Diversity of strains of Salmonella

enteri-ca serotype enteritidis from English poultry farms assessed by multiple genetic fingerprinting. J Clin

Micro-biol 2001; 39(1): 154-61.

9. Swaminathan B, Barrett TJ, Hunter SB, Tauxe RV, CDC PulseNet Task Force. PulseNet: the molecular subtyping network for foodborne bacterial disease surveillance, United States. Emerg Infect Dis 2001; 7(3): 382-9. 10. Kado CI, Liu ST. Rapid procedure for detection and isolation of large and small plasmids. J Bacteriol 1981;

145(3): 1365-73.

11. Hendriksen RS (2003). A global Salmonella surveillance and laboratory support project of the World Health Organization: Laboratory Protocols Level 1 Training Course Identification of Salmonella. 2003, 4th _ed. http://www.antimicrobial resistance.dk/data/images/salmonella2-pdf.pdf

12. Tenover FC, Arbeit RD, Goering RV, et al. Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis: criteria for bacterial strain typing. J Clin Microbiol 1995; 33(9): 2233-9. 13. Chu C, Wong DW, Wang MH, et al. Genotyping, plasmid analysis, and antimicrobial susceptibility of

Sal-monella enterica serotype Enteritidis isolates from humans and chickens in central Taiwan. J Formos Med

As-soc 2009; 108(10): 765-71.

14. Gatto AJ, Peters TM, Green J, et al. Distribution of molecular subtypes within Salmonella enterica serotype Enteritidis phage type 4 and S. Typhimurium definitive phage type 104 in nine European countries, 2000-2004: results of an international multi-centre study. Epidemiol Infect 2006; 134(4): 729-36.

16. Erdem B, Threlfall EJ, Schofield SL, Ward LR, Rowe B. Plasmid profile typing provides a method for the dif-ferentiation of strains of Salmonella enteritidis phage type 4 isolated in Turkey. Lett Appl Microbiol 1994; 19(4): 265-7.

17. Threlfall EJ, Hampton MD, Ward LR, Rowe B. Application of pulsed-field gel electrophoresis to an interna-tional outbreak of Salmonella agona. Emerg Infect Dis 1996; 2(2): 130-2.

18. Threlfall EJ, Ward LR, Hampton MD, et al. Molecular fingerprinting defines a strain of Salmonella enterica serotype Anatum responsible for an international outbreak associated with formula-dried milk. Epidemiol Infect 1998; 121(2): 289-93.

19. Stanley J, Goldsworthy M, Threlfall EJ. Molecular phylogenetic typing of pandemic isolates of Salmonella

enteritidis. FEMS Microbiol Lett 1992; 69(2): 153-60.

20. Cardinale E, Perrier Gros-Claude JD, Rivoal K, et al. Epidemiological analysis of Salmonella enterica ssp. en-terica serovars Hadar, Brancaster and Enteritidis from humans and broiler chickens in Senegal using pulsed-field gel electrophoresis and antibiotic susceptibility. J Appl Microbiol 2005; 99(4): 968-77.

21. Aktas Z, Day M, Kayacan CB, Diren S, Threlfall EJ. Molecular characterization of Salmonella Typhimurium and Salmonella Enteritidis by plasmid analysis and pulsed-field gel electrophoresis. Int J Antimicrob Agents 2007; 30(6): 541-5.

22. Helmuth R, Stephan R, Bunge C, Hoog B, Steinbeck A, Bulling E. Epidemiology of virulence-associated plas-mids and outer membrane protein patterns with seven common Salmonella serotypes. Infect Immun 1985; 48(1): 175-82.

23. Lukinmaa S, Schildt R, Rinttila T, Siitonen A. Salmonella Enteritidis phage types 1 and 4: pheno- and ge-notypic epidemiology of recent outbreaks in Finland. J Clin Microbiol 1999; 37(7): 2176-82.

24. Liebana E, Guns D, Garcia-Migura L, Woodward MJ, Clifton-Hadley FA. Molecular typing of Salmonella

seroty-pes prevalent in animals in England: assessment of methodology. J Clin Microbiol 2001; 39(10): 3609-16.

25. Liebana E, Clouting C, Garcia-Migura L, et al. Multiple genetic typing of Salmonella Enteritidis phage-types 4, 6, 7, 8 and 13a isolates from animals and humans in the UK. Vet Microbiol 2004; 100(3-4): 189-95. 26. Fernandez J, Fica A, Ebensperger G, et al. Analysis of molecular epidemiology of Chilean Salmonella

enteri-ca serotype enteritidis isolates by pulsed-field gel electrophoresis and bacteriophage typing. J Clin

Micro-biol 2003; 41(4): 1617-22.

27. Avery SM, Liebana E, Hutchison ML, et al. Pulsed field gel electrophoresis of related Escherichia coli O157 isolates associated with beef cattle and comparison with unrelated isolates from animals, meats and hu-mans. Int J Food Microbiol 2004; 92(2): 161-9.

28. Chung YH, Kwon YI, Kim SY, Kim SH, Lee BK, Chang YH. Antimicrobial susceptibilities and epidemiological analysis of Salmonella enteritidis isolates in Korea by phage typing and pulsed-field gel electrophoresis. J Fo-od Prot 2004; 67(2): 264-70.

29. De Cesare A, Manfreda G, Dambaugh TR, Guerzoni ME, Franchini A. Automated ribotyping and random amplified polymorphic DNA analysis for molecular typing of Salmonella enteritidis and Salmonella

typhimu-rium strains isolated in Italy. J Appl Microbiol 2001; 91(5): 780-5.

30. Selander RK, Beltran P, Smith NH, et al. Evolutionary genetic relationship of clones of Salmonella serovars causing human typhoid and other enteric fevers. Infect Immun 1990; 58(7): 2262-75.

31. Tsen HY, Lin JS. Analysis of Salmonella enteritidis strains isolated from food-poisoning cases in Taiwan by pul-sed field gel electrophoresis, plasmid profile and phage typing. J Appl Microbiol 2001; 91(1): 72-9. 32. Pang JC, Chiu TH, Chiou CS, et al. Pulsed-field gel electrophoresis, plasmid profiles and phage types for the

human isolates of Salmonella enterica serovar Enteritidis obtained over 13 years in Taiwan. J Appl Microbi-ol 2005; 99(6): 1472-83.

33. Pang JC, Chiu TH, Helmuth R, Schroeter A, Guerra B, Tsen HY. A pulsed field gel electrophoresis (PFGE) study that suggest a major world-wide clone of Salmonella enterica serovar Enteritidis. Int J Food Microbiol 2007; 116(3): 305-12.

34. Murase T, Okitsu T, Suzuki R, et al. Evaluation of DNA fingerprinting by PFGE as an epidemiologic tool for