• Sonuç bulunamadı

EKSOZOM YÜKLÜ SIKIŞTIRILABİLİR KEMİK GREFTLERİ

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2023

Share "EKSOZOM YÜKLÜ SIKIŞTIRILABİLİR KEMİK GREFTLERİ "

Copied!
120
0
0

Yükleniyor.... (view fulltext now)

Tam metin

(1)
(2)
(3)

EKSOZOM YÜKLÜ SIKIŞTIRILABİLİR KEMİK GREFTLERİ

COMPRESSIBLE BONE GFAFTS LOADED BY EXOSOMES

TÜLAY SELİN ERTEKİN

PROF. DR MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU Tez Danışmanı

Hacettepe Üniversitesi

Lisansüstü Egitim-Öğretim ve Sınav Yönetmeliğinin KİMYA MÜHENDİSLİĞİ Anabilim Dalı için Öngördüğü

YÜKSEK LİSANS TEZİ olarak hazırlanmıştır.

2020

(4)
(5)

TÜLAY SELİN ERTEKİN’in hazırladığı “Eksozom Yüklü Sıkıştırılabilir Kemik Greftleri” adlı bu çalışma aşağıdaki jüri tarafından KİMYA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI’nda YÜKSEK LİSANS TEZİ olarak kabul edilmiştir.

Prof. Dr. Mehlika PULAT

Başkan ..………

Prof. Dr. Menemşe GÜMÜŞDERELİOĞLU

Danışman ..………

Prof. Dr. Zümriye AKSU

Üye ....………..

Prof. Dr. Deniz TANYOLAÇ

Üye ………..

Doç. Dr. Özer Aylin Gürpınar

Üye …….………

Bu tez Hacettepe Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü tarafından YÜKSEK LİSANS TEZİ olarak ... / ... /... tarihinde onaylanmıştır.

Prof. Dr. Menemşe GÜMÜŞDERELİOĞLU Fen Bilimleri Enstitüsü Müdürü

(6)
(7)

ETİK

Hacettepe Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, tez yazım kurallarına uygun olarak hazırladığım bu tez çalışmasında,

 tez içindeki bütün bilgi ve belgeleri akademik kurallar çerçevesinde elde ettiğimi,

 görsel, işitsel ve yazılı tüm bilgi ve sonuçları bilimsel ahlak kurallarına uygun olarak sunduğumu,

 başkalarının eserlerinden yararlanılması durumunda ilgili eserlere bilimsel normlara uygun olarak atıfta bulunduğumu,

 atıfta bulunduğum eserlerin tümünü kaynak olarak gösterdiğimi,

 kullanılan verilerde herhangi bir değişiklik yapmadığımı,

 ve bu tezin herhangi bir bölümünü bu üniversite veya başka bir üniversitede başka bir tez çalışması olarak sunmadığımı

beyan ederim.

___ / ____ / 2020

TÜLAY SELİN ERTEKİN

(8)
(9)

YAYINLANMA FİKRİ MÜLKİYET HAKKLARI BEYANI

Enstitü tarafından onaylanan lisansüstü tezimin/raporumun tamamını veya herhangi bir kısmını, basılı (kağıt) ve elektronik formatta arşivleme ve aşağıda verilen koşullarla kullanıma açma iznini Hacettepe üniversitesine verdiğimi bildiririm. Bu izinle Üniversiteye verilen kullanım hakları dışındaki tüm fikri mülkiyet haklarım bende kalacak, tezimin tamamının ya da bir bölümünün gelecekteki çalışmalarda (makale, kitap, lisans ve patent vb.) kullanım hakları bana ait olacaktır.

Tezin kendi orijinal çalışmam olduğunu, başkalarının haklarını ihlal etmediğimi ve tezimin tek yetkili sahibi olduğumu beyan ve taahhüt ederim. Tezimde yer alan telif hakkı bulunan ve sahiplerinden yazılı izin alınarak kullanması zorunlu metinlerin yazılı izin alarak kullandığımı ve istenildiğinde suretlerini Üniversiteye teslim etmeyi taahhüt ederim.

Yükseköğretim Kurulu tarafından yayınlanan “Lisansüstü Tezlerin Elektronik Ortamda Toplanması, Düzenlenmesi ve Erişime Açılmasına İlişkin Yönerge”

kapsamında tezim aşağıda belirtilen koşullar haricince YÖK Ulusal Tez Merkezi / H. Ü.

Kütüphaneleri Açık Erişim Sisteminde erişime açılır.

□ Enstitü / Fakülte yönetim kurulu kararı ile tezimin erişime açılması mezuniyet tarihimden itibaren 2 yıl ertelenmiştir.

□ Enstitü / Fakülte yönetim kurulu gerekçeli kararı ile tezimin erişime açılması mezuniyet tarihimden itibaren .... ay ertelenmiştir.

□ Tezim ile ilgili gizlilik kararı verilmiştir.

... / ... /...

(İmza) TÜLAY SELİN ERTEKİN

(10)
(11)

i

ÖZET

EKSOZOM YÜKLÜ SIKIŞTIRILABİLİR KEMİK GREFTLERİ

Tülay Selin ERTEKİN

Yüksek Lisans, Kimya Mühendisliği Anabilim Dalı Tez Danışmanı: Prof. Dr. Menemşe GÜMÜŞDERELİOĞLU

Eş Danışman: Dr. Öğr. Üyesi Soner ÇAKMAK Ocak 2020, 96 sayfa

Bu çalışma, ‘Eksozom Yüklü Sıkıştırılabilir Kemik Greftlerinin Geliştirilmesi’ başlıklı Hızlı Destek Projesi kapsamında (FHD-2017-16332 nolu) Hacettepe Üniversitesi Bilimsel Araştırma Koordinasyon Birimi tarafından desteklenmiştir.

Sunulan tez çalışmasında amaç, biyoaktivitesi artırılmış, biyouyumlu, fiziksel ve mekanik özellikleri geliştirilmiş, sıkıştırılabilir formdaki doku iskelelerinin, üç boyutlu (3B) in vitro kültür çalışmaları ile kemik onarımı ve rejenerasyonuna olan etkisinin incelenmesidir. Belirtilen amaç kapsamında ilk olarak bir mikrodalga reaktörü içerisinde, 9 kez 30 s süresince 600 Watt mikrodalga ışıması altında, yapay vücut sıvısından (SBF) hidroksiapatit (HA) partikülleri çöktürülmüştür. Elde edilen HA partikülleri 1,1,1,3,3,3-hekzafloro-2-propanol (HFIP) içerisinde kütlece % 7’lik oranda çözünmüş olan poli(laktik-ko-glikolik asit) (PLGA;50:50) kopolimeri içerisine katılarak 3B elektroeğirme yöntemi ile 3B (PLGA)/HA kompozit doku iskeleleri üretilmiştir.

Üretilen 3B PLGA/HA kompozit doku iskelelerinin ıslatılabilirlik özelliklerinin geliştirilmesi için NaOH ile alkali muamelesi uygulanmış ve yüzeyi modifiye edilen doku iskelelerinin fizikokimyasal yapısı çeşitli yöntemler ile karakterize edilmiştir.

Uygulanan bu yüzey modifikasyonunun hücre canlılığı üzerine olan etkisi 3B in vitro

(12)

ii çalışmalar ile değerlendirilmiş ve 0.1M derişimdeki NaOH ile muamele edilen örneklerin kontrol grubuna göre hücre proliferasyonunu artırdığı görülmüştür.

Ardından ultrasantrifüj yöntemi ile MC3T3-E1 kemik öncülü hücre kaynaklı eksozomların izolasyonu gerçekleştirilmiş ve çeşitli karakterizasyon çalışmaları (TEM, Bradford Protein Testi, Nanodrop A280 Protein Testi, Akış sitometrisi, boyut ve çap analizi) ile izole edilen yapının eksozom olduğu kanıtlanmıştır. Ultrasantrifüj yöntemi ile izole edilen eksozomların hücreler üzerindeki etkisi MC3T3-E1 hücre hattı ile gerçekleştirilen hücre kültür çalışmaları ile incelenmiştir. Sonuçlar eksozomların hücre proliferasyonunu desteklediğini göstermiştir. Son aşamada ise yüzey özellikleri alkali yüzey işlemi ile geliştirilmiş 3B PLGA/HA doku iskelelerine kemik öncülü türevli eksozomlar yüklenerek, eksozom yüklü sıkıştırılabilir kemik greftlerinin kemik doku ve onarımı üzerindeki etkisi incelenmiştir. Üç boyutlu fibröz PLGA/HA kompozitleri ile yapılan in vitro kültür çalışmalarında iskelelerin 2 saat boyunca 37°C'de hücre kültür ortamında bekletildiğinde hacminin yaklaşık % 80’ini kaybederek küçüldüğü görülmüştür. Boyut ve gözeneklerdeki bu önemli değişiklik nedeniyle, hücrelerin iskeleye tutunmadığı ve iskele içine penetre olmadığı sonucuna varılmıştır.

Eksozomlarla gerçekleştirilen 3B in vitro hücre canlılık analizlerinde kontrol ve deney gruplarında herhangi bir hücresel aktivite gözlenmemesi bu sonucu desteklemiştir. Bu bilgiler doğrultusunda 3B PLGA/HA kompozit doku iskeleleri elektroeğirme ile üretildikten sonra yüzey aktif madde olan Pluronik® ile muamele edilmiş ve büzüşmenin engellendiği belirlenmiştir.

Tez kapsamında elde edilen veriler ışığında, alkali yüzey modifikasyonu ile biyouyumluluğu artırılmış fibröz 3B PLGA doku iskeleleri başarıyla üretilmiştir. Hücre kültür çalışmalarında iskelelerin kültür ortamı içinde gözenek ve boyutunda görülen büzüşme sorunları ortadan kaldırılmıştır. İlerleyen çalışmalarda eksozom yükleme ve kültür çalışmalarının Pluronik® ile muamele edilen iskelelerde yapılmasına karar verilmiştir.

Anahtar Kelimeler: Kemik doku mühendisliği; üç-boyutlu elektroeğirme; poli(laktik- ko-glikolik asit); hidroksiapatit; mikrodalga; eksozom.

(13)

iii ABSTRACT

COMPRESSIBLE BONE GFAFTS LOADED BY EXOSOMES

Tülay Selin ERTEKİN

Master of Science, Department of Chemical Engineering Supervisor: Prof. Dr. Menemşe GÜMÜŞDERELİOĞLU

Co- Supervisor: Asst. Prof. Soner ÇAKMAK January 2019, 96 pages

This study was financially supported by Hacettepe University Scientific Research Projects Coordination Unit with the project entitled “Compressible Bone Gafts Loaded By Exosomes” (FHD-2017-16332).

The goal of this thesis is to investigate the effect of enhanced bioactive, biocompatible, improved physical and mechanical properties of compressible scaffolds on bone repair and regeneration with three-dimensional (3D) in vitro culture studies. Within the scope of the thesis purpose, firstly, hydroxyapatite (HA) particles were precipitated from synthetic body fluid (SBF) in a microwave reactor under 600 Watt microwave irradiation for 9 times 30 s. The obtained HA particles were added to the poly(lactic-co- glycolic acid) (PLGA, 50:50) copolymer dissolved in 1,1,1,3,3,3 hexafluoro-2 propanol (HFIP) 7% by mass, and the 3D PLGA / HA composite scaffolds were fabricated by 3D electrospinning method. In order to improve the wettability of the fabricated 3D PLGA / HA composite tissue scaffolds, alkali treatment with NaOH was applied and the physicochemical characterization of the surface modified scaffolds were done by various methods. The effect of the applied surface modification on cell viability were

(14)

iv evaluated with in vitro studies and it was seen that the samples treated with NaOH at 0.1M concentration increased the cell proliferation as compared to the control group.

Afterwards, the isolation of MC3T3-E1 pre-osteoblasts derived exosomes was performed by ultracentrifugation method and by applying various characterization studies (TEM, Bradford Protein Test, Nanodrop A280 Protein Test, Flow cytometry, size and diameter analysis), it was proved that the isolated structures were exoxomes.

The effect of exosomes on cell proliferation was examined by in vitro cell culture studies carried out with MC3T3-E1 cell line. The results showed that exosomes has no toxic effect on cells. In the last stage, the effect of exosome loaded compressible bone grafts on bone tissue and repair was investigated by loading pre-osteoblast derived exosomes on 3D PLGA/HA scaffolds which surface properties were improved by alkali surface treatment. In vitro culture studies showed that 3D fibrous PLGA / HA composite scaffolds lost approximately 80% of their volume when scaffolds were immersed into the cell culture medium at 37°C for 2 h. Due to this significant change in size and pore structures, it was concluded that the cells did not attach to the scaffold and did not penetrate into the scaffold. The absence of any cellular activity in the control and experimental groups in 3D in vitro cell viability assays performed with exosomes supported this result. In order to prevent the shrinkage of scaffolds, they were treated by surfactant Pluronic®.

In the light of the data obtained within the scope of this thesis, fibrous 3D PLGA scaffolds with increased biocompatibility via alkali surface modification have been successfully produced. The shrinkage problem that was seen in the pore structure and size of the scaffolds during cell culture studies were eliminated. It was decided that the exosome loading and culture studies are to be performed on scaffolds treated with Pluronic® in the outgoing studies.

Keywords: Bone tissue engineering; three-dimensional electrospinning; poly (lactic- co-glycolic acid); hydroxyapatite; microwave; exosome.

(15)

v

TEŞEKKÜR

Tez çalışmalarım ve deneylerim süresince benden desteğini hiçbir zaman esirgemeyen, bilgi ve tecrübesiyle her daim bana yol gösteren, lisans hayatımdan bu yana asilliği, duruşu, karakteri, eğitimci kişiliği ve insani yönü ile hayatımın her alanında kendime örnek aldığım, öğrencisi olmaktan her zaman büyük gurur ve mutluluk duyduğum, değerli danışmanım Prof. Dr. Menemşe GÜMÜŞDERELİOĞLU’na sonsuz teşekkürlerimi sunarım.

FHD-2017-16332 numaralı Hızlı destek Projesi kapsamında çalışmalarımda maddi destek sağlayan Hacettepe Üniversitesi Bilimsel Araştırmalar Birimi’ne,

Tez çalışmamım her aşamasında değerli katkıları ve eleştirileri ile yolumu aydınlatan, çalışmalarım boyunca bana gösterdiği sabır ve anlayış ile yanımda olan ve beni çalışmaya teşvik eden eş danışmanım Dr. Öğr. Üyesi Soner ÇAKMAK’a,

Tez çalışmamda değerli yorumları, fikirleri ve yardımları ile bana her zaman destek olan, Özge Ekin AKDERE’ye, içten davranışları, motivasyonları ve tüm destekleri için Dr. Öğretim Görevlisi Anıl Sera ÇAKMAK’a, Dr. Öğr. Üyesi Damla ÇETİN ALTINDAL’a ve Dr. Öğr. Üyesi Işıl GERÇEK’e

Birlikte olmaktan ve çalışmaktan büyük mutluluk duyduğum Burcu SARIKAYA, Zeynep ALTINIŞIK, Gülnihal TOK İLHAN, Demet ÇAKIR, Sitem ŞAHİN, Elvan KONUK, Caner KARAASLAN, Gökçe MÜLAZIMOĞLU, Tuğçe GÜLTAN, Ayfer KOYUNCU, Sümeyra Nur TURGUT, Sema COŞKUN, Fayid PHURKAT , Sena KOÇ olmak üzere Hacettepe Üniversitesi Hücre ve Doku Mühendisliği Araştırma Grubu’nu oluşturan tüm çalışma arkadaşlarıma,

Tez ile ilgili tüm süreçlerimde bana destek olan sevgili dostlarım Aslı Sena KARANFİL, Nurgül BEKDEMİR, Ayçin KÖYÇEKAŞ, Hasan YARADILMIŞ ve Merve ZORTAŞ’a,

Gösterdiği sabır, anlayış ve yardımlarıyla her an yanımda olan, mutluluk kaynağım Volkan ERKUT’a

Hayatımı anlamlı kılan, aldığım her kararda beni destekleyen, isteklerime ve hayallerime ulaşmak için her koşulda arkamda duran, çocukları olmaktan gurur duyduğum canım annem Hayat ERTEKİN, canım babam Ferruh ERTEKİN ve neşe kaynağım abim Kıvanç ERTEKİN’e,

En içten sevgi ve teşekkürlerimi sunarım.

Tülay Selin ERTEKİN Ocak 2020, Ankara

(16)

vi

İÇİNDEKİLER

ÖZET ... i

TEŞEKKÜR ... v

İÇİNDEKİLER ... vi

ÇİZELGELER DİZİNİ ... xii

SİMGELER VE KISALTMALAR ... xiii

1. GİRİŞ ... 1

2. GENEL BİLGİLER ... 3

2.1. Doku Mühendisliği... 3

2.1.1. Kemik Doku Mühendisliği ... 4

2.1.2. Kemik Yapısı ve Özellikleri ... 5

2.1.3.1. Doğal Polimerler ... 7

2.1.3.2. Sentetik Polimerler ... 8

2.1.3.3. Biyoaktif inorganik malzemeler ... 9

2.1.3.4. Kompozitler ... 9

2.2. Kemik Doku İskelesi Fabrikasyon Yöntemleri ... 9

2.2.1. Geleneksel Yöntemler ... 10

2.2.2. Kemik Doku İskelesi Üretiminde Elektroeğirme Yöntemi ... 11

2.2.2.1. Geleneksel Elektroeğirme Yöntemi ... 11

2.2.2.2. Üç Boyutlu Elektroeğirme ile Kemik Doku İskelesi Üretim Yöntemleri ... 12

2.2.2.3. Elektroeğirme ile Elde Edilen Fiberlerde Yüzey Modifikasyonu ... 13

2.3. Ekstraselüler veziküller ... 14

2.3.1. Ekstraselüler Veziküllerin Sınıflandırılması ... 15

2.3.2. Eksozomların Biyogenezi, Yapısı ve İçeriği ... 17

2.3.3. Eksozomların Moleküler Bileşimi ... 20

2.3.4. Eksozomların Hedef Hücreye Alınması ... 22

(17)

vii

2.3.5. Eksozom İzolasyon Teknikleri ... 25

2.3.5.1. Santrifüj ... 25

2.3.5.2. Ultrafiltrasyon (UF) ... 26

2.3.5.3. Büyüklükçe Ayırma Kromatografisi (SEC) ... 26

2.3.5.4. Polimer Esaslı Çöktürme ... 27

2.3.5.5. İmmünolojik İzolasyon ... 27

2.3.6. Eksozom Karakterizasyon Teknikleri ... 29

2.3.7. Eksozomların Fizyolojik ve Biyolojik Görevleri ... 29

2.3.7.1. Doku Mühendisliğinde Eksozomlar ... 31

2.3.7.2. Kemik Doku Mühendisliğinde Eksozomlar ... 32

3. DENEYSEL ÇALIŞMALAR ... 36

3.1. Kullanılan Malzemeler ... 36

3.2. Biyomalzeme ve Eksozom Üretimi ... 37

3.2.1. SBF ile Mikrodalga Destekli HA Üretimi ... 37

3.2.2. Elektroeğirme ile Üç Boyutlu (3B) PLGA/HA Doku İskelesi Üretimi ... 38

3.2.3. Üç Boyutlu PLGA/HA Doku İskelelerinde Yüzey Modifikasyon Çalışmaları ... 38

3.2.4. Eksozom Üretimi ve İzolasyonu ... 39

3.3. Karakterizasyon Çalışmaları ... 42

3.3.1. Üç Boyutlu PLGA/HA Doku İskelelerinin Karakterizasyonu ... 42

3.3.2.Yüzeyi Modifiye Edilen PLGA Doku İskelelerinin Karakterizasyon Çalışmaları ... 42

3.3.3. Eksozom Karakterizasyonu ... 43

3.4. Hücre Kültür Çalışmaları ... 45

3.4.1. Hücre Canlılık Analizleri ... 45

4. DENEYSEL SONUÇLAR ve TARTIŞMA ... 48

4.1. Üç Boyutlu Kompozit Fiber Doku İskelesi Üretimi ve Karakterizasyonu ... 48

(18)

viii

4.1.1. SBF ile Mikrodalga Destekli Hidroksiapatit Üretimi ve Karakterizasyonu .. 48

4.1.2. Elektroeğirme ile Üç Boyutlu (3B) PLGA/HA Doku İskelesi Üretimi ve Karakterizasyonu ... 52

4.2. Üç Boyutlu PLGA/HA Doku İskelelerinde Yüzey Modifikasyon Çalışmaları ... 60

4.3. Eksozom Üretimi, İzolasyonu ve Karakterizasyonu ... 71

4.4. Hücre Kültür Çalışmaları ... 79

5. GENEL SONUÇLAR ... 82

KAYNAKLAR ... 85

ÖZGEÇMİŞ ... 95

(19)

ix

ŞEKİLLER DİZİNİ

Şekil 2.1. Doku mühendisliği yaklaşımları ... 4

Şekil 2.2. Kemiğin mikro ve nano ölçeklerdeki hiyerarşik yapısı. Kemik silindirik yapıdaki çok sayıda Havers kanalından (a) ya da osteonlardan (b) oluşan çok sert kalsifiye bir tabaka ile çevrilidir. Hücreler ise spesifik bağlanmalara yanıt oluşturacak membran reseptörleri (c) ve çok iyi nano mimariye sahip ECM (d) ile çevrilmiştir ... 6

Şekil 2.3. Kemik doku mühendisliğinde kullanılan doku iskelelerinin özellikleri . ... 7

Şekil 2. 4. PLGA kopolimeri ve monomerlerinin kimyasal yapısı ... 8

Şekil 2.5. Geleneksel elektroeğirme düzeneği ... 11

Şekil 2.6. İçerisine metal çiviler yerleştirilen yarım küre şeklinde toplayıcıya sahip elektroeğirme düzeneği ... 12

Şekil 2.7. Mikroveziküllerin oluşum mekanizması ... 15

Şekil 2.8. Apoptotik cisimciklerin oluşum mekanizması ... 16

Şekil 2.9. Eksozomların oluşum mekanizmaları ... 19

Şekil 2.10. Eksozomların hücre içine alım mekanizmaları ... 24

Şekil 2.11. Eksozomların ultrasantrifüj yöntemi ile izolasyonu. ... 25

Şekil 2.12. Eksozomların doku mühendisliğindeki uygulama alanları. ... 31

Şekil 3.1. Eksozomların ultrasantrifüj yöntemiyle izolasyonu. İlk üç basamakta 300xg, 2,000xg ve 10,000xg hızlarında santrifüjleme işleminden sonra, pelletler (hücreler, ölü hücreler, hücre artıkları) atılmış ve süpernatan bir sonraki santrifüj için alınmıştır. Buna karşılık, son iki basamakta 100,000xg hızda santrifüjden sonra, pelletler (eksozomlar + kontamine proteinler, eksozomlar) alınmış ve süpernatanlar atılmıştır. ... 41

Şekil 4.1. Biyomimetik yöntem ile mikrodalga destekli sentezlenen HA partiküllerine ait düşük ve yüksek büyütmelerdeki TEM görüntüleri. ... 49

Şekil 4.2. Biyomimetik yöntemle sentezlenen HA partiküllerine ait FTIR spektrumu. . 50

Şekil 4.3. Sentezlenen HA partiküllerine ait XRD grafiği (HA-JCPDS: HA partiküllerinin Toz Kırınım Standartları Ortak Komitesi’ne ait kırınım verileri). ... 51

Şekil 4.4. Sentezlenen HA partiküllerine ait TGA grafiği. ... 52

(20)

x Şekil 4.5. Aynı elektroeğirme koşullarında üretilen PLGA/HA doku iskelelerine ait düşük ve yüksek büyümelerdeki SEM görüntüleri. (a) ve (b) 2B doku iskelesi, (c) ve (d) 3B doku iskelesi. ... 55 Şekil 4.6. (a) Üç boyutlu PLGA/HA doku iskelelerinin 3B üretim sonrası makroskobik görüntüsü, (b) 2B ve 3B PLGA/HA doku iskelelerinin makroskobik götüntüsü. Fotoğraftaki soldaki görüntü 2B doku iskelesine ve sağdaki görüntü 3B doku iskelesine aittir. ... 56 Şekil 4.7. (a) PLGA doku iskelesine, (b) PLGA/HA kompozit doku iskelesine, (c) HA partüküllerine ait XRD grafikleri, (d) HA partiküllerinin Toz Kırınım Standartları Ortak Komitesi ’ne ait kırınım verileri. ... 57 Şekil 4.8. PLGA doku iskelelerine, PLGA/HA kompozit doku iskelelerine ve HA’ya ait FTIR spektrumları. ... 58 Şekil 4.9. PLGA doku iskelelerine ve PLGA/HA kompozit doku iskelelerine ait termogramlar. ... 58 Şekil 4.10. PLGA doku iskelelerine ve PLGA/HA doku iskelelerine ait gerilim-gerinim grafiği. ... 59 Şekil 4.11. 2B PLGA doku iskelelerine ait su temas açısı görüntüleri. (a) kontrol grubu, (b) 0.1M NaOH ve (c) 0.2M NaOH ile muamele edilmiş örnekler. ... 61 Şekil 4.12. 3B Boyutlu PLGA doku iskelelerinin düşük ve yüksek büyütmelerdeki SEM görüntüleri. (a) ve (b) kontrol grubu, (c) ve (d) 0.1 M NaOH ile 5 dk süre ile muamele edilmiş, (e) ve (f) 0.2 M NaOH ile 5 dk süre ile muamele edilmiş örmekler. ... 62 Şekil 4.13. 0.1 M NaOH çözeltisinde (a) 5 dk, (b) 10 dk, (c) 15 dk ve (d) 30 dk süreyle bekletilmiş PLGA doku iskelelerine ait görüntüler. Doku iskeleleri beyaz renkte olan yapılardır. ... 63 Şekil 4.14. PLGA doku iskelelerine ait 2B su temas açısı görüntüleri. (a) kontrol grubu, b) 0.1M NaOH ile 5 dk muamele edilmiş, c) 0.1M NaOH ile 10 dk muamele edilmiş örnekler. ... 64 Şekil 4.15. Üç Boyutlu PLGA/HA doku iskelerine ait (a) ve (b) kontrol grubu, (c) ve (d) maumele ve sterilizasyon sonrası, (e) ve (f) Pluronik® F127 ile muamele sonrası düşük ve yüksek büyütmelerdeki SEM görüntüleri. ... 67 Şekil 4.16. 3B PLGA/HA doku iskelerine ait makroskobik görüntüler. (a) İki saat süre ile 37˚C sıcaklıkta bekletilmeden önce ve bekletildikten sonra doku

(21)

xi iskelelerine aittir. (b) Pluronik® F127 ile muamele öncesi ve sonrasındaki doku iskelelerine aittir. ... 68 Şekil 4.17. PLGA/HA kompozit doku iskelelerinin zamanla su tutma kapasitelerindeki değişim (PLGA/HA-M: HA ve NaOH ile muamele edilmiş PLGA/HA doku iskelesi). ... 69 Şekil 4.18. PLGA/HA ve NaOH ile muamele edilmiş PLGA/HA (PLGA/HA-M) kompozit doku iskelelerine ait FTIR spektrumları. ... 70 Şekil 4.19. MC3T3-E1 hücrelerine ait (a) büyüme eğrisi, (b) fibroblastik morfololijeki görüntüsü. ... 72 Şekil 4.20. Bradford protein analizinde Coomassie Brillant mavi organik boyasının proteinlerle etkileşimi sonucu mavi renk oluşturması. ... 74 Şekil 4.21. Bradford protein analizine ait kalibrasyon grafiği. ... 75 Şekil 4. 22. MC3T3-E1 kemik öncülü hücrelerinden izole edilen eksozomlara ait (a) düşük ve (b) yüksek büyütmelerdeki TEM görüntüleri. Kırmızı okla gösterilen yapılar kupa şeklindeki görünüme sahip eksozomları temsil etmektedir. ... 76 Şekil 4.23. Pre-osteoblast kemik öncülü türevli eksozomların çap dağılım histogramı. 77 Şekil 4.24. CD9 ve CD81 antikorları ile gerçekleştirilen FACS analizi. ... 78 Şekil 4.25. MC3T3-E1 hücrelerinin NaOH ile muaemele edilen 3B PLGA/HA doku iskelelerindeki proliferasyon grafiği. İstatistiksel olarak anlamlı farklar şu sembollerle gösterilmiştir; * p<0.05, ** p<0.01 ve *** p<0.001, n=3. ... 79 Şekil 4.26. Farklılaşma ortamında izole edilen pre-osteoblast türevli eksozomlar ile kültüre edilen MC3T3-E1 hücrelerinin proliferasyon grafiği. İstatistiksel olarak anlamlı farklar şu sembollerle gösterilmiştir; * p<0.05, ** p<0.01 ve

*** p<0.001, n=3. ... 80 Şekil 4.27. Pre-osteoblast türevli eksozomlar yüklenmiş 3B PLGA/HA doku iskeleleri ile kültüre edilen MC3T3-E1 hücrelerinin proliferasyon grafiği. ... 81

(22)

xii ÇİZELGELER DİZİNİ

Çizelge 2.1. Geleneksel kemik doku iskelesi fabrikasyon yöntemleri ... 10 Çizelge 2.2. Ekstraselüler veziküllerin sınıflandırılması ... 17 Çizelge 2.3. Eksozomların protein içeriği . ... 21 Çizelge 2.4. Eksozom izolasyon yöntemlerinin avantaj ve dezavantajları ... 28 Çizelge 2.5. Eksozomların Rejeneratif Tıp Uygulamaları ... 32 Çizelge 2.6. Kemik Türevli Eksozomların Özellikleri ve Kemik Doku Uygulamaları .. 34 Çizelge 2.6. Kemik Türevli Eksozomların Özellikleri ve Kemik Doku Uygulamaları .. 35 Çizelge 3.1. 10XSBF hazırlanmasında kullanılan malzemeler. ... 37 Çizelge 4.1. Pre-osleoblast hücreleri tarafından salınan toplam eksozom miktarı. ... 74

(23)

xiii

SİMGELER VE KISALTMALAR

Simgeler

nm Nanometre

µm Mikrometre

Ca2+ Kalsiyum

g Gram

g Rölatif santrifüj kuvveti

dk Dakika

sa Saat

kDa Kilo Dalton

s Saniye

cm Santimetre

kV Kilovolt

μM Mikromolar

rpm Dakikadaki devir sayısı

w/v Kütle/hacim oranı

β Beta

α Alfa

Kısaltmalar

α-MEM Minimum esansiyel Eagle ortamı α modifikasyonu KBH Kritik büyüklükteki kemik hasarları

ECM Ektraselüler matriks

(24)

xiv

HA Hidroksiapatit

PLA Polilaktik asit

PGA Poliglikolik asit

PCL Polikaprolakton

PLGA Poli(laktik-ko-glikolik asit)

LA Laktik asit

GA Glikolik asit

THF Tetrahidrofuran

HFIP 1,1,1,3,3,3-hekzafloro-2-propanol

Tg Camsı geçiş sıcaklığı

TCP Trikalsiyum fosfat

3B Üç boyutlu

2B İki boyutlu

FDA Amerikan Gıda ve İlaç Kurumu

EV Ekstraselüler veziküller

mRNAs Mesajcı ribonükleik asitler miRNAs Mikro ribonükleik asitler

PS Fosfotidilserin

MVB Multiveziküler cisimcik

ESCRT Taşınım için Gerekli Endozomal Ayırma Kompleks Proteinleri nSMase Nötr sfingomiyelinaz

aSMase Asit sfingomiyelinaz

(25)

xv

PC Fosfatidilkolin

EGFR Epidermal büyüme faktörü reseptörü

PE Fosfatidiletanolamin

PI Fosfotidilinositol

UF Ultrafiltrasyon

MWCO Molekül ağırlığı ayırma sınırı SEC Büyüklükçe ayırma kromatografisi

PEG Polietilen glikol

DLS Dinamik ışık saçılımı

TEM Geçirimli elektron mikroskobu

WB Western boyama

NTA Nanopartikül izleme analizleri

MKH Mezenkimal kök hücre

DPSCs Diş pulpası kök hücreleri

RANK Reseptör aktivator nükleer kappa B

RANKL RANK ligand

SBF Yapay vücut sıvısı

KCl Potasyum klorür

NaCl Sodyum klorür

CaCl2 . 2H2O Kalsiyum klorür dihidrat MgCl2 . 6H2O Magnezyum klorür hekzahidrat NaH2PO4 . H2O Sodyum dihidrojen fosfat monohidrat

(26)

xvi

NaHCO3 Sodyum bikarbonat

FBS Fetal sığır serumu

MTT 3-[4,5-dimetiltiyazol-2-il]-difeniltetrazolyum bromür

HCl Hidroklorik asit

DMSO Dimetilsülfoksit

DPBS Dulbecco’s fosfat tampon çözeltisi

PBS Fosfat Tampon Çözeltisi

BSA Sığır serum albümin

RIPA Radyoimmüno-çökeltme tamponu

ATR-FTIR Fourier dönüşümlü kızılötesi spektroskopisi XRD X-ışını kırınımı spektroskopisi

TGA Termogravimetrik analiz

DSC Diferansiyel taramalı kalorimetre

PFA Paraformaldehit

FACS Akış sitometrisi

TCPS Polistiren hücre kültür kabı

(27)

1

1. GİRİŞ

Eksozomlar ara bir endositik kompartmanın (multiveziküler cisimcik, MVB), plazma membranı ile birleşmesi sonucu ortama salınan nanoveziküllerdir. Birçok hücre türünden salınan eksozomlar, büyüme faktörleri, sitokinler, kemokinler, proteinler, mRNA ve miRNA gibi sahip olduğu kargo içeriği sayesinde hücre içi iletişim, bağışıklık modülasyonu, hücresel proliferasyon ve farklılaşmada önemli bir yere sahip olduğu son yıllarda yapılan çalışmalarda açıkça ortaya konulmuştur. Eksozomlar proteinleri ve genetik bilgiyi hedef hücreye aktararak hücreler arası iletişimde kilit rol oynamaktadır. Bu nedenle, miRNA, mRNA ve proteinlerin ana hücrelerden alıcı hücrelere aktarımı için nanotaşıyıcı olarak hizmet eder ve hedef hücrelerin biyoaktivitelerini düzenleyerek alıcı hücrelerin gen ekspresyonunu değiştirmektedir.

Eksozomal içerik büyük ölçüde köken alınan hücre türüne, hücrenin patofizyolojik özelliklerine bağlı olarak değişmektedir ve hücre üzerinde hiçbir belirgin ters etkiye sahip olmadığı bildirilmiştir. Bilinen tüm hücrelerden salınan bu nanotaşıyıcılar, hücre yenileme ve farklılaşmadaki rolü nedeniyle rejeneratif tıp alanında önem teşkil eden biyoaktif veziküllerdir [1].

Dünya çapında çeşitli enfeksiyonlar ve kazalar nedeniyle oluşan kemik bozuklukları ve hasarları, özellikle zayıf fiziksel aktivite ve obezite sonucu giderek artan bir eğilim göstermektedir. Kemik onarımı ve rejenerasyonunu artırmak için ortopedik işlemlerde yaygın bir şekilde kullanılan kemik greftlerinde karşılaşılan ve aşılması gereken en önemli sorunlar sınırlı miktarda greft uygunluğu, ikincil bir cerrahi müdahaleye gerek duyulması ve ameliyat bölgesindeki enfeksiyon riskidir. Kemik doku mühendisliği, ortopedik işlemlerde karşılaşılan bu problemlere çözüm getiren bir yaklaşımdır. Kemik doku mühendisliği yaklaşımı kemik hasarı onarımı sırasında sentetik ve doğal polimerleri, seramik veya kompozit malzemeleri kemiğin bulunduğu 3 boyutlu mikroyapıyı taklit etmek için kullanmaktadır. Ayrıca, rejenerasyon tamamlandığında hastanın ikincil bir cerrahi müdahaleye gerek duymadan kendi dokusuyla devam etmesini sağlayan bir tedavi yöntemi sunmaktadır [2-4].

Poli(laktik-ko-glikolik asit) (PLGA), laktik asit (LA) ve glikolik asit (GA) monomerlerinin farklı oranlarda birleştirilmesiyle sentezlenen bir kopolimerdir.

Yapısındaki monomerlerin vücut içerisinde toksik olmayan ürünlere dönüşümü ve biyouyumluluğu sayesinde PLGA, kemik doku mühendisliği çalışmalarında sıklıkla

(28)

2 kullanılmaktadır. Ancak PLGA kopolimeri ile gerçekleştirilen kemik doku mühendisliği çalışmalarında başarılı sonuçlar elde edilmesine rağmen, PLGA kopolimerinin hidrofobik yapısı hücrelerin tutunması, çoğalması ve farklılaşması açısından bir dezavantaj oluşturmaktadır. Literatürde hidrofobik yapıdaki biyomalzemelerin ıslatılabilirlik özellikleri çeşitli yüzey modifikasyon teknikleri ile geliştirilebilmektedir.

Bu teknikler; plazma işlemi, ıslak kimyasal yöntemler ve yüzey aşı polimerizasyonudur.

Bunlar içerisinde ıslak kimyasal aşındırma yöntemi, 3 boyutlu (3B) iskeleler içerisine nüfuz edebilme özelliği sayesinde nanofiber ağların yüzey modifikasyonunda diğer yöntemlere kıyasla daha etkin bir sonuç sağlamaktadır.

Sunulan tez kapsamında kemik doku mühendisliği uygulamaları için, yapısal ve işlevsel açıdan kemik dokunun doğal ECM yapısını taklit edebilen, biyuyumluluğu yüksek, osteoindüktif özellikte ve iyi mekanik özelliklere sahip sıkıştırabilir formda doku iskelesi oluşturulması hedeflenmiştir. Bu amaçla, tez kapsamında ilk olarak biyomimetik yöntem ile mikrodalga destekli HA partikülleri üretilmiştir. Üretilen HA partikülleri sonraki aşamada PLGA kopolimeri ile birleştirilmiş ve toplayıcısı modifiye edilmiş 3B elektroeğirme tekniği kullanılarak 3B kompozit biyomalzemelere dönüştürülmüştür. Elde edilen kompozit yapının kemik doku mühendisliği çalışmalarına uygunluğu çeşitli karakterizasyon yöntemleri ile belirlenmiştir. Çalışma kapsamında, 3 boyutlu kompozit biyomalzemelerin ıslatılabilirlik özelliklerinin geliştirebilmesi için doku iskelelerine ıslak kimyasal aşındırma yöntemi uygulanmıştır. Uygulanan bu yöntemin hücre canlılığı ve proliferasyonuna olan etkisi in vitro ortamda 3B hücre canlılık analizleri ile değerlendirilmiştir. Ardından hem osteojenik hem de büyüme ortamlarında kültüre edilen pre-osteblastik MC3T3E1 hücrelerinden ultrsantrifüj yöntemi kullanılarak eksozom izolasyonu gerçekleştirilmiş ve eksozom için uygun karakterizasyon çalışmaları yapılmıştır. Eksozomların hücreler üzerindeki etkisi in vitro koşullarda gerçekleştirilen hücre canlılık analizleri ile değerlendirilmiştir. Son aşamada yüzey topografisi değiştirilmiş ve eksozom yüklenerek biyoaktivitesi artırılan eksoozm yüklü 3B PLGA/HA kompozit iskelesinin kemik doku onarımı ve rejenerasyonu üzerindeki etkileri in vitro çalışmalarla değerlendirilmiştir.

(29)

3

2. GENEL BİLGİLER

Bu kısımda, sunulan tezin temel literatür bilgisi dört ana başlık altında incelenmiştir. İlk bölümde, doku mühendisliği ve temel bileşenleri hakkında bilgi verilmiştir. İkinci kısımda doku iskelelerinin özelliklerinden ve temel fabrikasyon yöntemlerinden bahsedilmiştir. Üçüncü bölümde temel fabrikasyon yöntemlerinden biri olan elektroeğirme yöntemi ve elektroeğirme ile üretilen fibröz doku iskelelerindeki yüzey modifikasyon uygulamaları detaylandırılmıştır. Son kısımda ise ekstraselüler veziküller ve çeşitleri, eksozomlar, eksozomların yapısı ve içeriği, biyogenezi, moleküler bileşimi, eksozomların doku mühendisliği ve kemik doku mühendisliği alanındaki uygulamaları ayrıntılı bir şekilde açıklanmıştır.

2.1. Doku Mühendisliği

Doku mühendisliği laboratuvar ortamında yapay doku ve organların oluşumu ya da hasarlı dokunun onarımına yönelik mühendislik ve canlı biliminin birlikte uygulandığı disiplinler arası bir alandır [5, 6]. Doku mühendisliği, temelinde canlı hücrelerin biyobozunur özellikteki doğal/sentetik bir destek malzemesi (doku iskelesi) ile birleştirilmesi sonucunda işlevsel, yapısal ve mekanik açıdan tamiri ya da oluşumu hedeflenen dokuya eşdeğer üç boyutlu canlı bir yapı oluşturulmasını hedefler [7]. Doku mühendisliği teriminin 1980’li yıllarında ilk kez kullanılmasından bu yana farklı yaklaşımlar geliştirilmiştir. Geleneksel doku mühendisliği yaklaşımında (yukarıdan aşağı) hücreler, gözenekli ve istenilen hücresel cevabın verilmesine olanak sağlayan, biyouyumlu ve biyobozunur doku iskelelerine ekilmektedir. Ekilen hücrelerin çoğalması ve iskelenin bozunması sonucu, hücrelerin kendi ürettiği ekstraselüler matriks (ECM) ile kaplı mühendislik ürünü doku oluşmaktadır. Modüler yaklaşımda ( aşağıdan yukarı) ise, makro ve nano boyuttaki hücre, hücre agregatları veya partiküller çeşitli yöntemlerle birleşerek mühendislik ürünü dokuyu oluşturmaktadır. Geleneksel yaklaşımda, doku iskelesi üretimi için, seramikler, polimerler ve hidrojeller gibi geniş çeşitlilikte biyomalzemeler kullanılmaktadır. Ek olarak bu yaklaşımda gözenek yapısı ve dağılımı değiştirilerek istenilen mekanik özellikte doku iskeleleri üretilebilmektedir.

Ancak hücrelerin iskele merkezine doğru penetre olamaması, hücre dağılımının düzensiz ve hücre yoğunluğunun az olması, besin gibi sıvıların difüzyonundaki kısıtlamalar, yöntemde karşılaşılan en önemli sorunlardır. Doku iskelesi temelli yaklaşımdaki bu olumsuzluklara çözüm bulmayı amaçlayan modüler yaklaşımda ise en

(30)

4 önemli problem büyük ölçekte doku üretiminde istenilen düzen ve kontrolde mühendislik ürünü dokunun oluşturulamamasıdır (Şekil 2.1) [8].

Şekil 2.1. Doku mühendisliği yaklaşımları [9].

2.1.1. Kemik Doku Mühendisliği

Kemik, kendini iyileştirme özelliği ile bilinen bir dokudur. Ancak kritik büyüklükteki kemik hasarlarında (KBH) kemiğin rejenerasyon kapasitesi yetersiz kalmaktadır ve kişinin yaşamı boyunca hasarlı kemiğin tam olarak iyileşmesi mümkün olamamaktadır.

Büyük çaplı kemik hasarlarının tedavisinde altın standart kişinin sağlıklı bölgesinden alınan kemik dokunun kişinin kendisine transplante edilmesidir (otogreft). Otogreft kemik transplantasyonunun en önemli avantajı histouyumlu olması ve immünojenik özellik göstermemesidir. Çok pahalı bir yöntem olmasının yanı sıra, otogreft işlemi sağlıklı dokunun alınması için ikincil operasyon gerektirmektedir. İkincil müdahaleler sonucunda ameliyat bölgesinde inflamasyon oluşumu, enfeksiyon, kanama ve kronik ağrı gibi hastanın yaşam kalitesini önemli ölçüde etkileyecek cerrahi risklerle karşılaşılmaktadır [10]. Allogreftler kemik hasarlarının tedavisinde kullanılan en yaygın

(31)

5 ikinci yöntemdir [4]. Bunlar, aynı türdeki canlılar arasında birinden diğerine transplante edilen kemik greftleridir [11]. Daha çok kadavradan alınan allogreftlerin en önemli avantajı ikincil cerrahi müdahalelere ihtiyaç duyulmamasıdır. Ancak bu yöntemin donör sayısının yeterli olmaması, pahalı bir yöntem olması, viral ya da bakteriyel hastalık bulaştırma riski ve greft reddi gibi önemli kısıtlamaları mevcuttur [10, 12]. Geleneksel yöntemlerdeki bu kısıtlamalar, kemik hasarlarının rekonstrüksiyonu için kemik doku mühendisliği gibi yeni yaklaşımların ortaya çıkmasına neden olmuştur [3].

Kemik doku mühendisliği yeni ve işlevsel bir kemik doku oluşturmak için doğal kemik yapısının, doku oluşumunun ve kemiğin rejenerasyon mekanizmasının anlaşılması temeline dayanmaktadır [4]. Kemik doku mühendisliğinde amaç hasarlı bölgede kemik rejenerasyonu için gerekli yanıtın oluşmasını sağlamaktır. Klinik açıdan oluşturulan dokunun başarısı, kemik doku oluşumuna yardımcı olacak mekanik bir destek malzeme sayesinde, oluşan kemiğin anatomik bölgeye uyumlu, çevre dokuyla yapısal olarak bütünleşmiş ve yeterli işlevsel özelliklere sahip olmasıyla belirlenir [11].

2.1.2. Kemik Yapısı ve Özellikleri

Kemiğin rejenerasyonunun mekanik, fizyolojik ve biyolojik açıdan istenilen dokuya eşdeğer olması için kemik biyolojisi ve rejenerasyon mekanizmalarının anlaşılması çok önemlidir [4].

Şekil 2.2.’de belirtildiği gibi kemik, osteoblast, osteoklast ve osteositlerden oluşan hücresel bileşiminin yanı sıra, nano ve makro kompozit doku olarak sınıflandırılan oldukça karmaşık bir hiyerarşik düzene sahiptir [13]. Kemik ektraselüler matriksinin organik kısmı çoğunlukla tip 1 kollajenden oluşurken, inorganik kısmı mineralize yapıdaki hidroksiapatit (HA, Ca10(PO4)6(OH)2) partiküllerinden oluşmaktadır. İnorganik kısımdaki diğer bileşenler ise florür, potasyum, sodyum ve magnezyumdur [14].

Organik kısmı ayrıca glikoproteinler, proteoglikanlar, sialoproteinler, osteonektin, osteokalsin ve osteopontin gibi kollajen yapıda olmayan 200’den fazla farklı matriks proteinleri içermektedir. Bu proteinler ECM’de birçok sinyalin iletilmesine katkıda bulunur [14, 15]. Sonuç olarak kemik, memeli canlılarda en yüksek kalsiyum miktarına sahip, seramik ve organik yapısı ile biyokompozit bir yapıdır [12].

(32)

6 Şekil 2.2. Kemiğin mikro ve nano ölçeklerdeki hiyerarşik yapısı. Kemik silindirik yapıdaki çok sayıda Havers kanalından (a) ya da osteonlardan (b) oluşan çok sert kalsifiye bir tabaka ile çevrilidir. Hücreler ise spesifik bağlanmalara yanıt oluşturacak membran reseptörleri (c) ve çok iyi nano mimariye sahip ECM (d) ile çevrilmiştir [16].

2.1.3. Kemik Doku Mühendisliğinde Kullanılan Doku İskeleleri

Doku mühendisliği stratejilerinde kullanılan doku iskelelerinin görevi üç boyutlu doku gelişimi için yapısal destek sağlamak ve hücreler için uygun bir ortam oluşturmaktır.

Genel olarak ideal bir doku iskelesi, hücrelerin iskele yüzeyine tutunmasını, proliferasyonunu ve farklılaşmasını in vitro ve in vivo’da desteklemelidir [17]. Kemik doku için ideal bir iskele osteokondüktif, biyobozunur ve oluşacak kemiğin anatomik bölgesine uygun mekanik özellikte olmalıdır [18]. Bir kemik doku iskelesinin biyolojik ve yapısal açıdan sahip olması gereken özellikler Şekil 2.3’te belirtilmiştir.

Kollajen Molekülleri

Kollajen Fiberler

(33)

7 Şekil 2.3. Kemik doku mühendisliğinde kullanılan doku iskelelerinin özellikleri [17, 18].

Kemik doku iskelesinin biyouyumlu olması herhangi bir inflamasyon ve immünolojik yanıt oluşturmadan in vitro ya da in vivo koşullarda hücre çoğalmasını destekleme ve yeni doku oluşumunu sağlayabilme özelliğidir. İskelenin yerini yeni oluşan dokuya bırakması için doku oluşumuyla eş zamanlı olarak bozunması ve bozunma ürünlerinin canlı vücudunda toksik etki göstermemesi iskelenin biyobozunur özelliğini ifade eder.

Kemik doku iskelesi olarak kullanılan biyomalzemenin türü, mikro ve makro yapısı, iskelenin biyobozunur ve biyouyumlu olma özelliklerini etkilemektedir. Kemik doku mühendisliğinde iskele üretimi için kullanılan biyomalzemeler dört ana başlık altında toplanmaktadır. Bunlar; doğal polimerler, sentetik polimerler, biyoaktif organik malzemeler ve kompozitlerdir.

2.1.3.1. Doğal Polimerler

Kemik doku mühendisliği çalışmalarında iskele üretiminde en çok kullanılan doğal polimerler kollajen, fibrin, aljinat, ipek, hiyalüronik asit ve kitosandır. Doğal polimerler hücre dışı matriksin sahip olduğu birçok özelliği taklit edebilmesi sayesinde hücrelerin iskele üzerinde tutunma, proliferasyon, farklılaşma ve migrasyonunu artırmaktadır.

Ancak doğal polimerlerin en önemli dezavantajı mekanik özelliklerinin zayıf olmasıdır [19]. Ek olarak doğal polimerlerin yapıları ve özellikleri elde edildikleri kaynağa göre değişmektedir. Bu sebeple doğal polimerlerden istenilen özellikte tekrarlanabilir iskele üretimi gerçekleştirilememektedir [20].

Biyolojik Gereksinimler

Biyouyumlu

Biyobozunur

Biyoaktif

Toksik olmama

Immünojenik olmama

Yapısal Özellikler

Biyomimetik Yüksek gözeneklilik

Gözenekler arası bağlantı Mekanik özellikler

Yüzey topografisi

(34)

8 2.1.3.2. Sentetik Polimerler

Sentetik polimerler mekanik özelliklerinin çok iyi olması sayesinde kemik doku mühendisliği çalışmalarında yaygın bir şekilde kullanılmaktadır [17]. Polilaktik asit (PLA), poliglikolik asit (PGA), polikaprolakton (PCL) ve poli(laktik-ko-glikolik asit) (PLGA) gibi biyouyumlu, biyobozunur ve kolayca şekil alabilen alifatik poliesterler özellikle ortopedik uygulamalarda istenilen birçok mekanik özelliği karşılayabilmektedir [19]. Ancak sentetik polimerlerin bozunması sonucu oluşan asidik yan ürünler ortam pH’sını düşürerek hücre çoğalmasını azaltabilir ve in vivo koşullarda inflamatuar bir cevaba neden olabilir [21]. Kemik doku mühendisliğinde üç boyutlu doku iskelesi üretiminde kullanılan en yaygın sentetik polimerlerden biri olan PLGA, laktik (LA) ve glikolik asit (GA) monomerlerinin farklı oranda kullanmasıyla elde edilen lineer bir kopolimerdir [18, 22]. Şekil 2.4.’te PLGA kopolimerinin yapısı gösterilmektedir.

Şekil 2. 4. PLGA kopolimeri ve monomerlerinin kimyasal yapısı [22].

PLGA kopolimeri için farklı sentez yöntemleri mevcuttur. Üretimin gerçekleştirildiği işlem parametreleri ürünün fizikokimyasal özelliklerini önemli ölçüde etkilemektedir.

Herhangi bir LA:GA oranında (50:50, 65:35, 75:25, 85:15) sentezi gerçekleştirilebilen PLGA kopolimerinin molekül ağırlığı 10,000-200,000 g/mol aralığında değişmektedir [23]. Polilaktik-ko-glikolik kopolimeri, tetrahidrofuran (THF), aseton, etil asetat ve 1,1,1,3,3,3-hekzafloro-2-propanol (HFIP) gibi çok çeşitli organik çözücülerde çözülebilir. Camsı geçiş sıcaklığı (Tg) 37℃’den yüksek olan PLGA kopolimeri, yüksek kristalin formda ya da tamamen amorf yapıda sentezlenebilmektedir [22, 24].

Biyomedikal uygulamalarda PLGA’nın kullanımı uygun LA:GA oranının seçimine bağlı olarak değişmektedir. Kemik doku mühendisliği uygulamalarında PLGA film, hidrojel, mikroküre ya da gözenekli doku iskelesi gibi çok çeşitli formlarda kullanılabilmektedir [22].

(35)

9 2.1.3.3. Biyoaktif inorganik malzemeler

Kemik doku ağırlığının yaklaşık %70’i HA partiküllerinden oluşmaktadır. Kemiğin yapısal özellikleri açısından biyoseramik malzemeler (trikalsiyum fosfat, TCP, HA, biyoaktif camlar ve bunların karışımları) diğer materyallere kıyasla kemik dokuyu daha iyi taklit edebilmektedir [19]. Özellikle HA ve TCP gibi kalsiyum fosfat içerikli seramikler kemik doku mühendisliği klinik uygulamalarında en yaygın kullanılan biyoseramiklerdir. Hidroksiapatit ve TCP kemiğin mineral fazına benzer, biyouyumlu ve osteokondüktif yapıda olmasına rağmen, kırılgan özellikleri nedeniyle kırılma toklukları ve gerilme dayanımları doğal kemiğin mekanik özellikleriyle eşleşmemektedir [15].

Kemik doku mühendisliği uygulamalarında kullanılan sentetik mikro ve nano boyuttaki HA partikülleri hidrotermal, ıslak kimyasal yöntemler, emülsiyon ve piroliz yöntemleri kullanılarak sentezlenebilmektedir [25, 26]. Bu yöntemlere ek olarak, biyomimetik HA partiküllerinin mikrodalga destekli üretimi de mümkündür. Bu yöntem sayesinde kısa sürelerde, yüksek verimlilikte ve saflıkta nano boyutta HA partikülleri elde edilmektedir [27].

2.1.3.4. Kompozitler

Kompozit doku iskeleleri seramik ve polimer gibi iki veya daha fazla farklı tür biyomalzemenin birleştirilmesi ile elde edilmektedir [21]. İşlevselliği geliştirilmiş kompozit biyomalzemeler sayesinde tek bir biyomalzemeden üretilen iskelelerde karşılaşılan sorunların büyük ölçüde önüne geçilmektedir [18]. Yapılan birçok in vitro ve in vivo çalışmada, HA partiküllerinin PLA, PGA, PLGA, kollajen ve kitosan gibi çeşitli polimerler ile kompozitlerinin kemik doku oluşumunu artırdığı gösterilmiştir [4].

2.2. Kemik Doku İskelesi Fabrikasyon Yöntemleri

In vitro ve in vivo koşullarda istenilen şekil ve büyüklükte fonksiyonel bir kemik dokusu oluşumu için geometrik açıdan iyi tasarlanmış bir doku iskelesi kullanımı son derece önemlidir. Bu fonksiyonel kemik dokunun, insan vücudundaki üç boyutlu yapıya uygun bir şekilde oluşması için çeşitli doku iskelesi üretim yöntemleri geliştirilmiştir.

Kemik doku iskelesi temel fabrikasyon yöntemleri geleneksel yöntemler ve hızlı prototipleme olmak üzere ikiye ayrılmaktadır.

(36)

10 2.2.1. Geleneksel Yöntemler

Kemik doku mühendisliği uygulamalarında kullanılan geleneksel yöntemlerinin avantaj ve dezavantajları Çizelge 2.1’de özetlenmiştir.

Çizelge 2.1. Geleneksel kemik doku iskelesi fabrikasyon yöntemleri [28-32].

Fabrikasyon Yöntemi

Avantaj Dezavantaj

Dondurarak Kurutma - Yüksek gözeneklilik - İçsel bağlantısı yüksek gözenekli yapı

- Düşük sıcaklık

- Gözenek çapının küçük olması

Çözücü Döküm/

Partikül Uzaklaştırma

- Kolay bir yöntem - Yüksek gözeneklilik - Gözenek çapının kontrolü

-Porojen ve çözücülerin tam olarak uzaklaştırılamaması - Sınırlı membran kalınlığı Faz Ayrımı - Gözenek morfolojisi ve

dağılımının kontrolü - Yüksek gözeneklilik

- Toksik çözücü kullanımı - Düşük ölçekli üretim

Gaz Köpükleştirme - Toksik çözücü içermemesi - Yüksek gözeneklilik - Düşük sıcaklık

- Film tabaka oluşumu

Fiber Bağlama - Yüzey alanı / hacim oranının yüksek olması

- Yüksek gözeneklilik

- Zayıf mekanik özellikler - Çözücü kalıntılarının uzaklaştırılamaması - Sınırlı uygulama alanı Elektroeğirme - Kolay bir yöntem

- Yüksek verimlilik - Gözenek çapı ve morfolojisinin kontrolü - Yüzey alanı / hacim oranının yüksek olması

- Çözelti kalıntılarının uzaklaştırılamaması - Gözenek dağılımının homojen olmaması

(37)

11 2.2.2. Kemik Doku İskelesi Üretiminde Elektroeğirme Yöntemi

2.2.2.1. Geleneksel Elektroeğirme Yöntemi

Elektroeğirme elektrostatik kuvvetlerden yararlanılarak biyomalzemelerden fibröz doku iskelelerin üretildiği bir fabrikasyon yöntemidir. Literatürde, elektroeğirme işlem parametrelerini (uygulanan elektriksel alan, akış hızı, iğne ve toplayıcı arasındaki uzaklık, iğnenin çapı, sıcaklık, nem) ve çözelti parametrelerini (konsantrasyon, viskozite, çözelti iletkenliği, dielektrik sabiti, yüzey gerilimi) kontrol ederek biyomimetik doku iskelelerinin üretildiği çok sayıda çalışma mevcuttur [33, 34].

Elektroeğirme yöntemleri pozitif yüklü bir voltaj kaynağının uygulandığı geleneksel elektroeğirme ve farklı amaçlar için geliştirilmiş elektroeğirme yöntemlerinden oluşmaktadır. Geleneksel elektroeğirme yüksek voltaj güç kaynağı, toplayıcı ve besleme ünitesi (pompa, şırınga ve iğne) olmak üzere 3 ana kısımdan oluşmaktadır. Geleneksel elektroeğirmeye ait düzenek Şekil 2.5’te gösterilmiştir [35].

Şekil 2.5. Geleneksel elektroeğirme düzeneği [35].

Bu teknikte, organik çözücülerde çözünür hale getirilen polimer çözeltileri elektriksel alan kullanılarak çap dağılımı 100 nm-1 µm arasında değişen fiberlere dönüştürülmektedir. Yöntemde şırınga içerisindeki polimer çözeltisi şırınga pompası yardımıyla sabit bir akış hızında iğne ucuna doğru itilir ve çözelti iğne ucunda yüzey gerilim kuvvetleri nedeniyle asılı olarak durur. Yüksek pozitif voltaj uygulandığında iğne ve toplayıcı arasında bir elektriksel alan meydana gelir. Oluşan bu elektrostatik kuvvetler, pozitif yüklü çözeltinin yüzey gerilim kuvvetine eşit olduğu anda iğne

(38)

12 ucunda asılı duran polimer çözeltisi şekil değiştirerek Taylor konisi şeklini alır. Taylor konisi şekli alındığı andaki voltaj değerine kritik voltaj denir ve elektrostatik kuvvetler bu kritik noktayı geçtiğinde jet akışı oluşturur. Jet akış sırasında oluşan fiberler toplayıcı plakaya doğru yönlenirken çözücü buharlaşır ve fiberler katı bir halde toplayıcıda birikir [36, 37].

2.2.2.2. Üç Boyutlu Elektroeğirme ile Kemik Doku İskelesi Üretim Yöntemleri Elektroeğirme nanofiber yapıdaki kemik doku iskelesi üretiminde uygulaması kolay ve maliyeti düşük bir yöntemdir. Ancak geleneksel elektroeğirmede aşılması gereken önemli sorun, üretilen fibröz doku iskelelerinin içsel bağlantılı gözeneklere sahip üç boyutlu bir yapı yerine genellikle iki boyutlu olmasıdır. Bu nedenle farklı elektroeğirme teknikleri kullanılarak üç boyutlu (3B) kemik doku iskelesi üretim yöntemleri geliştirilmiştir. Bu yöntemler ıslak elektroeğirme, kendiliğinden yönlenme, fibröz iplik iskele oluşum tekniği, gaz köpükleştirme ve 3B yazıcı teknolojisine sahip elektroeğirme olarak sıralanabilir [34]. Belirtilen yöntemler dışında, geleneksel elektroeğirmede toplayıcı geometrisinin değiştirilmesiyle 3B kemik doku iskelelerinin üretilmesi de mümkündür. Blakeney ve ark. (2011) çalışmalarında toplayıcı olarak düz metal plaka yerine; yalıtkan, içi boş yarım küre şeklinde bir geometriye sahip ve içerisine belli aralıklar ve sıralarla metal çivi yerleştirilmiş bir toplayıcı kullanarak üç boyutlu ve pamuk formunda, içsel bağlantısı yüksek iskeleler üretmeyi başarmışlardır [38].

Şekil 2.6. İçerisine metal çiviler yerleştirilen yarım küre şeklinde toplayıcıya sahip elektroeğirme düzeneği [38].

(39)

13 Blakeney ve ark. tarafından üç boyutlu pamuk benzeri iskele üretimi için kullanılan elektroeğirme düzeneği Şekil 2.6.’da gösterilmektedir. Düzenekte şırınga içerisinden (I) iğne ucuna (II) gelen polimer çözeltisi, oluşturulan voltaj farkı sayesinde (III) yalıtkan yarım küre şeklinde geometriye sahip toplayıcı (IV) üzerinde birikmektedir.

2.2.2.3. Elektroeğirme ile Elde Edilen Fiberlerde Yüzey Modifikasyonu

Amerikan Gıda ve İlaç Kurumu (FDA) tarafından onaylı, biyouyumlu PCL, PLA, PGA ve PLGA polimerleri elektroeğirme ile doku iskelesi üretiminde yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Ancak iyi mekanik özelliklere sahip olmaları nedeniyle rejeneratif tıp uygulamalarında sıklıkla kullanılan sentetik polimerlerin hidrofobik yapıları hücrelerin biyomalzeme yüzeyine tutunmasını engellemektedir. Bu nedenle elektroeğirme yöntemiyle elde edilen nanofiberlerin doku mühendisliği uygulamalarında etkinliğinin artırılması için çeşitli modifikasyon teknikleri uygulanmaktadır [39]. Bu teknikler genel olarak plazma işlemi, yüzey aşı polimerizasyonu ve ıslak kimyasal metot olmak üzere üç kısma ayrılmaktadır.

Plazma İşlemi: Plazma işlemi, biyomalzemelerin yüzey özelliklerini değiştirmede kullanılan etkin bir yöntemdir. Plazma uygulaması, sıcak ve soğuk plazma olmak üzere ikiye ayrılmaktadır. Ancak, yüksek sıcaklık plazmada, yüzey moleküllerinin sahip olduğu termal hareketler nedeniyle plazma etkilerinin uygulama boyunca sabit tutulması oldukça zordur. Bu nedenle, yüzey modifikasyonunda plazma kaynaklı etkilerin daha iyi korunduğu soğuk plazma işlemi tercih edilmektedir [40].

Yöntemde, uygun bir plazma kaynağı seçilerek nanofiberler üzerinde çeşitli fonksiyonel gruplar oluşturulmaktadır. Plazma işleminde genel olarak oksijen, amonyak ya da hava ile biyomalzemenin yüzeyinde hidrofilisite özelliğini artıran karboksil ve amin grupları oluşturulmaktadır [41]. Plazma işlemi çevre dostu ve polimer nanofiberlerin yığın özelliklerini değiştirmeyen bir modifikasyon yöntemidir. Ancak, yöntemin en önemli dezavantajı modifikasyonun 3B doku iskelelerinde belirli bir derinliğe kadar penetre olabilmesidir [40].

Yüzey aşı polimerizasyonu: Greft kopolimerler, biyomalzemelerin topografisini ve hidrofilisite özelliklerini önemli ölçüde değiştirebilmektedir [42]. Yüzey aşı polimerizasyonunda modifikasyon, makromoleküler yapıların biyomalzemelerin yüzeyine kovalent bağlarla bağlanmasıyla gerçekleştirilir. Yöntem, polimerizasyon için serbest radikallerin oluşumunda kullanılan farklı tekniklere göre kimyasal,

(40)

14 radyasyon, fotokimyasal ve plazma kaynaklı olmak üzere çeşitli sınıflara ayrılmaktadır [43].

 Islak Kimyasal Metot: Kimyasal yüzey modifikasyonu, polimer yüzeyinde fonksiyonel grupların oluşması ile başlamaktadır. Alifatik poliester yüzeyler için en yaygın kullanılan ıslak kimyasal metot alkali ile hidroliz işlemidir. Bu yöntemde, yüzeyde meydana gelen hidroliz, polimer yapısında yer alan ester bağlarının kopmasına neden olarak yapıya hidrofilik özellik kazandıran serbest karboksil ve hidroksil grupları oluşmasını sağlamaktadır [40]. Alkali işleminde polimer yığın özelliklerinin minimum düzeyde değiştirilmesi ve optimum miktarda fonksiyonel grup oluşturulması hedeflenmektedir. Bu nedenle uygulanan çözeltinin derişimi ve hidroliz süresi çok önemlidir. Plazma yöntemi ile karşılaştırıldığında alkali muamelesinin en önemli avantajı, üç boyutlu nanofibröz doku iskelelerinin içine nüfuz edebilme özelliğidir [44]. Alkali işleminin sahip olduğu bu avantaj küçük ve oldukça hareketli, yüksüz polimer zincirleri arasında kolayca hareket edebilen protonların etkin olduğu mekanizmayla açıklanmaktadır [40].

2.3. Ekstraselüler veziküller

Hücreler arası iletişim, çok hücreli organizmalar için ayırt edici ve önemli bir özellik olup doğrudan hücre-hücre etkileşimi veya hücreler tarafından ortama salınan moleküllerin alıcı hücreye iletilmesi yoluyla gerçekleşmektedir. Ancak son yirmi yıl içerisinde hücre dışı veziküllerin hücreler arası taşınmasını içeren üçüncü bir mekanizma ortaya çıkmıştır [45].

Ekstraselüler veziküller (EV) hücre dışı ortama salınan tüm membran veziküller için kullanılan genel bir terimdir [46]. Bu veziküller işlevsellik, oluşum mekanizmaları ve biyofizyolojik açıdan farklı özellikteki birçok vezikül türünü içinde bulundurmaktadır [47, 48]. Ekstraselüler veziküller, içerisinde mesajcı ribonükleik asitler (mRNAs) ve mikro ribonükleik asitler (miRNAs) dâhil olmak üzere çeşitli RNA türlerini, çözünür proteinleri ve transmembran proteinlerini barındıran lipid membranla çevrili yapılardır.

Ekstraselüler veziküller, prokaryot gibi organizmalardan yüksek ökaryotlara ve bitkilere kadar değişen hücreler tarafından evrimsel olarak salınmaktadır [49]. Bu yapılar hücre içi iletişim, membran proteinlerinin ve lipitlerin geri dönüşümü, bağışıklık modülasyonu, anjiyogenez ve hücresel proliferasyon ve farklılaşma gibi birçok süreçte rol oynamaktadır [50].

(41)

15 2.3.1. Ekstraselüler Veziküllerin Sınıflandırılması

Hücreler, farklı oluşum mekanizmalarından dolayı farklı fizyolojik özelliklere, içeriğe ve fonksiyona sahip çeşitli veziküller salgılamaktadır [51]. Bu yapılar mikroveziküller, apoptotik cisimcikler ve eksozomlardır [52].

Mikroveziküller: Hücre membranından tomurcuklanarak doğrudan hücre dışına salgılanan veziküllerdir. Bu sebeple, endozomal yol ile meydana gelen eksozomlara göre, mikroveziküller türedikleri hücrenin membran bileşimini daha iyi yansıtmaktadır [53]. Mikroveziküllerin boyutları 50-1000 nm arasında değişir ve şekil açısından heterojen bir özellik gösterirler [51, 52]. Mikroveziküllerin, yapısında plazma membran lipidleri ve proteinleri, sitoplazmik lipidler, proteinler ve nükleik asitler bulunmaktadır [54]. Mikroveziküller Ca2+ veya fosfolipid bağlayıcı proteinlerin aracılık ettiği hücre içi olayların bir uyaran tarafından (hipoksi, oksidatif stres veya kayma gerilimi) tetiklenmesiyle oluşmaktadır [54]. Mikrovezikül oluşumunda kalpain, flippaz, floppaz, skramblaz ve gesolin gibi birçok enzim görev almaktadır [55] (Şekil2.7).

Şekil 2.7. Mikroveziküllerin oluşum mekanizması [55].

Flippazlar hücre membranının dış kısmındaki fosfolipidleri sitozolik kısma taşırken, floppazlar hücre membranının iç tabakasında yer alan fosfolipidlerin membranın dış kısmına taşınmasında rol almaktadır. Fosfotidilserinin (PS), hücre membranının dış tabakasına translokasyonu ve vezikül oluşumunu indükleyen bir sinyaldir. Ayrıca,

(42)

16 mikrovezikül oluşumunda bir GTPaz proteini olan ADP – ribozilasyon faktör 6 rol oynamaktadır [55].

Apoptotik Cisimcikler: Nekroz ve apoptoz en önemli hücre ölüm mekanizmalarıdır.

Her iki mekanizma da biyolojik uyaranlar tarafından aktive edilmektedir. Nekroz, mekanik hasar veya patojenik bir etki sonucu meydana gelirken, apoptoz programlanmış hücre ölümüdür [55]. Apoptoz sırasında hücreler, toksik veya immünojenik olabilecek hücresel içeriklerin ekstraselüler matrikse geçişini önlemek amacıyla apoptotik cisimcik adı verilen daha küçük yapılar oluşturmaktadır [56]. Bu yapılar içerisinde DNA, RNA parçaları, histonlar ve organeller bulunabilir [1].

Boyutları 50- 5000 nm arasında değişen apoptotik cisimcikler, eksozom ve mikroveziküller gibi şekil açısından heterojen özellik gösterir. Hücrenin salgıladığı apoptotik cisimcikler fagositoz yoluyla makrofajlar tarafından yok edilmektedir. Bu süreçte PS’nin hücre plazma membranının dış kısmına geçmesi ile hücre dışında yarattığı sinyaller etkili olmaktadır [56]. Şekil 2.8’ de Apoptotik cisimlerin oluşum mekanizması şematize edilmiştir.

Şekil 2.8. Apoptotik cisimciklerin oluşum mekanizması [55].

 Eksozomlar: Fonksiyonel açıdan pleiotropik özellikteki eksozomlar boyutları ortalama 30-150 nm arasında değişen hücre dışı veziküllerdir [57, 58]. Eksozom terimi ilk olarak 1981 yılında Trams ve arkadaşları tarafından kültüre edilmiş çeşitli hücrelerden salınan 40-1000 nm boyutundaki veziküller için kullanılırken, 1983

(43)

17 yılında bu terim retikülositleirn olgunlaşması sırasında ekstraselüler boşluğa salınan 40-100 nm boyutundaki veziküller (transferrin reseptörleri) için kullanılmıştır [59].

Çizelge 2.2’de ekstraselüler veziküllerin özellikleri karşılaştırmalı olarak sunulmuştur.

Çizelge 2.2. Ekstraselüler veziküllerin sınıflandırılması[60].

Eksozomlar Mikroveziküller Apoptotik cisimcikler

Boyut 30-150 nm 100-1000 nm 500-4000 nm

Yoğunluk 1.13-1.16 g/mL Tanımlı değil 1.16 – 1.28 g/mL Morfoloji Kupa şeklinde Heterojen Heterojen

Biyogenez Multiveziküler cisimcik (MVB) içerisinde oluşumu ve MVB’nin plazma membranı ile birleşimi sonucu içeriğinin ekstraselüler çevreye salımı

Hücre

membranından tomurcuklanarak doğrudan hücre dışına salımı

Apoptoz sırasında meydana gelme

Yüzey Belirteçleri

Alix, TSG101, GTPaz, anneksin, flotilin, CD9, CD81,

CD40 ligandı, adenozin

difosfat

ADP6, integrin, selektin

DNA parçaları, histonlar, organeller

Bileşim Lipidler, proteinler, mRNA, miRNA

Lipidler, proteinler, mRNA, miRNA

Lipidler,

proteinler, DNA mRNA, miRNA

2.3.2. Eksozomların Biyogenezi, Yapısı ve İçeriği

Ökaryötik hücreler, çeşitli besinleri hücre içine alarak, protein gibi makromolekülleri hücre dışına salgılayarak ya da sitokin ve kemokinler gibi sinyalleri alarak bulundukları çevreyle etkileşim halindedir. Her hücre, moleküllerin hücre içine alınması ve salgılanması için oldukça karmaşık bir membran ağına sahiptir [61, 62]. Bu karmaşık yapı sayesinde hücreler hem endositoz ile dış ortamdan makromolekülleri hücre içine

(44)

18 alabilmekte hem de ekzositoz yoluyla sentezlenen proteinleri ve karbonhidratları hücre dışına salgılayabilmektedir. Proteinlerin hücre dışına salgılanmasında farklı mekanizmalar kullanılabilir. Büyük biyomoleküllerin ekzositoz yoluyla hücre dışına salgılanması en yaygın mekanizmadır. Ayrıca, multiveziküler cisimciğin (MVB) plazma zarı ile birleşmesi sonucunda içeriğinin hücre dışına salımı da diğer ekzositoz mekanizmasını oluşturmaktadır [61]. Hücre dışına salınan bu küçük membran veziküller endositik kökene sahip yapılar oldukları için bu mekanizma aynı zamanda endozomal sisteme ait bir salgılama işlemidir. Endositik veziküller, geç endozom, erken endozom ve lizozom endozomal sistemde yer alan diğer yapılardır [63]. Endositik veziküller klatrin bağımlı ve klatrin bağımsız endositoz ile meydana gelir ve erken endozom ile birleşir. Geç endozom ise erken endozomun olgunlaşmasıyla meydana gelmektedir. Geç endozomdan MVB oluşumunda en önemli faktör geç endozomun plazma membranının içeri doğru bükülmesiyle tomurcuklanmasıdır [61]. Eksozomların biyogenezi de endozomal sistem içerisinde başlamaktadır [48, 64].

Eksozomlar herhangi bir hücresel organel içermeyen küçük bir sitozol oranına sahip, çift katlı lipit katmanıyla çevrilmiş endositik yollarla meydana gelmiş yapılardır [57].

Endositoz sonucu oluşan endositik veziküller erken endozomla birleşerek geç endozoma olgunlaşmaktadır. Bu olgunlaşma süresince geç endozoma ait hücre zarının lümen içine doğru kıvrılmasıyla intralüminal vezikül olarak adlandırılan çok sayıda küçük membran veziküller oluşmaktadır. İçerisinde çok sayıda intraluminal vezikül barındıran bu yapı MVB olarak adlandırılmaktadır. Son adımda MVB hücre plazması ile birleşerek boyutları 30-150 nm arasında değişen intraluminal vezikülleri eksozom olarak hücre dışına salgılamaktadır [65]. Ancak oluşan her MVB, içeriğini eksozom olarak dışarı salgılamamaktadır. MVB’nin plazma membranıyla birleşmek dışında izleyeceği farklı metabolik yollar da bulunmaktadır. Bu alternatif yollardan birisi MVB’lerin lizozomlarla birleşerek yapılarının parçalanması sonucu içeriklerinin hücreye geri dönüşümüdür. Diğer bir metabolik yol ise melanozomlar, azurofilik granülleri gibi özelleşmiş lizozom benzeri organellerin oluşumuna katkıda bulunmalarıdır [66].

Yapılan çalışmalar MVB’nin oluştuktan sonra sahip olduğu kolesterol seviyesine bağlı olarak izleyeceği metabolik yolları belirlediğini göstermiştir. Kolestrol seviyesi düşük olan MVB’ler lizozoma doğru hedeflenirken, sadece kolestrol seviyesi yüksek olan MVB’ler plazma membranı ile birleşerek içeriklerini eksozom olarak dışarı

(45)

19 salgılamaktadır [64, 66]. Endositik yollarla meydana gelen eksozomların biyogenezi Şekil 2.9’da gösterilmiştir.

Şekil 2.9. Eksozomların oluşum mekanizmaları [67].

ESCRT (Taşınım için Gerekli Endozomal Ayırma Kompleks Proteinleri) mekanizması MVB oluşumunda merkezi bir rol oynamaktadır [65]. ESCRT’ler 4 ana alt birimden (ESCRT-0,- I,-II,-III) ve yardımcı proteinlerden (AAA ATPase ve Vps4) oluşmaktadır [68]. Taşınım için Gerekli Endozomal Ayırma Kompleks Proteinleri-0, ubukitin proteinlerinin tanınmasında ve sıralanmasında görev almaktadır. ESCRT-I ve II plazma membranının lümen içerisine tomurcuklanmasını sağlarken, ESCRT-III vezikülün ayrılmasından sorumlu olmaktadır [69]. Birbirinden bağımsız yapılmış dört çalışmada HeLa ve HEK293 gibi çeşitli hücre hatlarında Hrs ve STAM proteinlerinin inhibisyonu sonucu eksozom salgısında azalma olduğu tespit edilmiştir. Çalışmalar ESCRT-0 kompleksinin bir alt birimi olan söz konusu bu proteinlerin eksozom salgılanmasında etkin bir rolü olduğunu göstermiştir [68].

Farklı hücrelerden salgılanan eksozomlarda yapılan proteomik analizler ESCRT-II ve ESCRT-III komplekslerine sahip alt birimlerin varlığını ortaya koymuştur. David ve ark. (2012), ESCRT-III kompleksiyle ilişkili bir protein olan ALIX’in endozomlarda

Referanslar

Benzer Belgeler

蒙活性以及嗅、味覺靈敏都有關,缺乏鋅會造成食慾不佳,當然也會影響情緒,牡蠣、 海鮮、蛋、肉類、全穀類和堅果類都是含鋅豐富的食物。

Deep Springs Technology şirketinde ve New York Üniversitesi’nde çalışan bir grup araştırmacı yeni bir kompozit malzeme (fiziksel ve kimyasal özellikleri birbirinden farklı

İbn Abdilberr, et-Temhîd limâ fi’l-Muvatta’ mine’l-meânî ve’l- esânîd (nşr.. nehyedilen niyâha türü ağlayışa delâlet ettiğini söyleyenler olduğu gibi, 64 aynı

Ekmeklik buğday melezlerinden elde edilen anter, kallus, albino bitkicik, yeşil bitkicik, haploid ve spontan bitki oranları ve sayıları..

The trajectory estimated by ORBSLAM 2, ORBSLAM 3 and DynaSLAM were obtained by running the algorithms on EuRoC and KITTI datasets.. This trajectory was compared

Buna göre tüm transplant hastalarý transplantasyon sonrasýnda sürekli yüksek doz immünosupresif tedavi protokolüne devam etmektedirler ancak buna raðmen çoðunluðunda 1 ila 4

Bu yüzden bölgeler arası ekonomik farklılıklar tarihsel anlamda etnik kimliklerin canlılığının korunmasını getirirken 1980’lerde yaşanan önemli ekonomik

Günümüzde savunma sanayi büyük önem taĢımaktadır. Sanayiye yatırım yapan ülkeler gerek askeri gerekse ekonomik açıdan önemli seviyelerde bulunmaktadırlar. Savunma