Girifl
Genifllemifl spektrumlu beta-laktamazlar, sefotaksim, seftazi-dim, seftriakson gibi oksiimino beta-laktamlara ve aztreonama direnç kazand›ran ve genetik flifresi plazmid üzerinde tafl›nan en-zimlerdir (1,2). ‹lk olarak 1983 y›l›nda Avrupa'da Klebsiella pne-umoniae kökenlerinde tan›mlanan bu enzimler, daha sonra Ente-robacteriaceae ailesinin di¤er üyelerinde de gösterilmifltir (3-6). Hibridizasyon deneyleri ile ESBL'lerin TEM-1, TEM-2 ve SHV-1 beta-laktamaz genlerinde meydana gelen basit nokta mutas-yonlar› sonucunda ortaya ç›kt›¤› saptanm›flt›r (2,7).
ESBL'ler, üçüncü kuflak sefalosporinleri ve aztreonam› hid-rolize eder ve beta-laktam antibiyotiklerle tedaviyi güçlefltirirler. ESBL'ler genellikle beta-laktamaz inhibitörleri ile hidrolize edi-lebilirler ve bu enzimler karbapenemlere (imipenem, merope-nem), sefamisinlere (sefoksitin, moksalaktam) ve temosiline et-kili de¤ildir (3,4,8-10). ESBL üreten bakteriler rutin duyarl›l›k deneylerinde sefotaksim, seftriakson, seftazidim ve/veya aztre-onama direnç görülmesi ile belirlenebilir. Ancak bazen ESBL oluflturan kökenlerle yap›lan duyarl›l›k deneylerinde bu antibiyo-tiklere direnç saptanamaz ve bu durum da klinikte tedavi baflar›-s›zl›klar›na yol açar (4,8,11) fiimdiye kadar ESBL varl›¤›n› belir-lemede çeflitli yöntemler önerilmifltir. Bunlardan bafll›calar› üç boyutlu test, çift diskli sinerji testi, dilüsyon yöntemleri, otoma-tize sistemler (Vitek) ve E testidir (11).
Bu çal›flmada Enterobacteriaceae üyesi 97 kökende ESBL üretiminin çift diskli sinerji ve üç boyutlu test yöntemleri kullan›-larak araflt›r›lmas› ve sonuçlar›n karfl›laflt›r›lmas› amaçlanm›flt›r.
Yöntemler
Çeflitli klinik örneklerden soyutlanan 51 Escherichia coli ve 46 K.pneumoniae kökeninde ESBL varl›¤› çift diskli sinerji testi ve üç boyutlu testle araflt›r›ld›. Çal›flmada beta-laktamaz negatif kontrol kökeni olarak E.coli ATCC 25922 kullan›ld›.
Disk difüzyon ve üç boyutlu yöntemde kullan›lacak bakteri inokülumlar› için daha önceden stoklanan kökenler canland›r›ld› ve bir gece EMB agar›nda (Oxoid) inkübe edildi. Disk difüzyon yöntemi için Brain-Heart Infusion Broth (Oxoid)'da 108 cfu/ml, üç boyutlu yöntem için 109-1010cfu/ml bakteri süspansiyonu ha-z›rland›.
Üç Boyutlu Yöntem: Haz›rlanan 108cfu/ml bakteri süspan-siyonundan Mueller-Hinton agar›na (Oxoid) yüzeyel ekim yap›l-d›. Daha sonra Petri pla¤›n›n ortas›na yak›n tarafta ve kullan›la-cak antibiyotik disklerinden 3 mm uzakta olakullan›la-cak flekilde besiye-ri daire fleklinde kesildi. Ard›ndan üç boyutlu yöntem için haz›r-lanan süspansiyondan (109-1010cfu/ml) steril otomatik pipetle 200 µl al›narak, kesilen besiyeri çizgisi dolduruldu. Her iki ino-külasyon yap›ld›ktan sonra seftazidim (30 µg), sefotaksim (30 µg) ve aztreonam (30 µg) (Oxoid) diskleri yerlefltirildi ve plak-lar 35°C'de 18-20 saat inkübe edildi. Aztreonam, seftazidim ve sefotaksime ait inhibisyon zonlar›n›n dairesel biçiminde bozul-ma, kesintiye u¤ramas› veya kökenin inoküle edildi¤i kesi çizgi-si yak›n›nda birbirinden ayr› kolonilerin üremeçizgi-si, antibiyoti¤in yo¤un inokülasyon bölgesinden geçerken inaktive edildi¤ini gös-terdi ve ESBL olumlulu¤u olarak de¤erlendirildi (4).
Çift Diskli Sinerji Testi: Bu test, disk difüzyon yönteminin standardlar›na uyularak Mueller-Hinton agar›nda (Oxoid) yap›l-d›. Merkeze amoksisilin-klavulanik asid (10+20 µg) diski yerlefl-tirilerek, çevreye merkezden merkeze uzakl›¤› 25 mm olacak fle-kilde aztreonam (30 µg), seftazidim (30 µg) ve sefotaksim (30 µg) diskleri konuldu. Kökenler 35°C'de 18-20 saat inkübe edil-dikten sonra sonuçlar de¤erlendirildi. Antibiyotiklere ait inhibis-yon zonlar›n›n klavulanik asid diskine do¤ru genifllemesi veya
Klimik Dergisi●Cilt 11, Say›:2 ●1998, s:59-60 59
Özet: Çeflitli klinik örneklerden soyutlanan 51 Escherichia coli ve 46 Klebsiella pneumoniae kökeninde genifllemifl spektrumlu be-ta-laktamazlar›n (extended spectrum beta-lactamases, ESBL) varl›¤› çift diskli sinerji ve üç boyutlu testle araflt›r›ld›. Çift diskli siner-ji testi ile ESBL olumlulu¤u E. coli ve K.pneumoniae kökenlerinde s›ras›yla %18, %43 bulunurken, üç boyutlu testle %25 ile %46 oran›nda saptand›. ‹statistiksel de¤erlendirmede her iki test aras›nda anlaml› bir fark bulunamad›.
Anahtar Sözcükler: Gram-negatif çomaklar, genifllemifl spektrumlu beta-laktamazlar, çift diskli sinerji testi, üç boyutlu test. Summary: Comparison of double-disk synergy and three dimensional tests in detection of extended spectrum beta-lactamases. Exis-tence of extended spectrum beta-lactamases (ESBL) in 51 of Escherichia coli and 46 Klebsiella pneumoniae strains isolated from various cli-nical specimens was investigated by double-disk synergy and three dimensional tests. A comparison of these methods reveal that there is no statistically significant difference between them. It was determined by double-disk synergy test that E.coli and K. pneumoniae strains produ-ce ESBL in ratios of 18% and 43%, respectively. In the case of three dimensional test, these ratios were found as 25% and 46%.
Key Words: Gram-negative rods, extended spectrum beta-lactamases, double-disk synergy test, three dimensional test.
(1) Ege Üniversitesi, Eczac›l›k Fakültesi, Farmasötik Mikrobiyoloji Anabilim Dal›, Bornova-‹zmir
(2) Ege Üniversitesi, T›p Fakültesi, Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dal›, Bornova-‹zmir
(3) Ege Üniversitesi, T›p Fakültesi, Klinik Mikrobiyoloji ve ‹nfeksiyon Hastal›klar› Anabilim Dal›, Bornova-‹zmir VIII. Türk Klinik Mikrobiyoloji ve ‹nfeksiyon Hastal›klar› Kongresi (6-10 Ekim 1997, Antalya)'nde bildirilmifltir.
Genifllemifl Spektrumlu Beta-Laktamazlar›n
Belirlenmesinde Çift Diskli Sinerji Testi ile
Üç Boyutlu Yöntemin Karfl›laflt›r›lmas›
iki inhibisyon zonu aras›ndaki bakteri üreyen alanda üremenin olmad›¤› bir bölgenin görülmesi ESBL olumlulu¤u olarak yo-rumland›.
Sonuçlar
Her iki yöntem ile K. pneumoniae ve E.coli kökenlerinde saptanan ESBL üretim oranlar› Tablo 1'de gösterilmifltir. Her iki yöntemin birbiriyle uyumu tutarl›l›k analizi testi ile yap›ld› (Tab-lo 2) ve istatistiksel olarak uyumlu bulundu.
‹rdeleme
Laboratuvarlarda yap›lan rutin duyarl›l›k deneylerinde ESBL varl›¤›n› gözlemlemek zordur. Ancak sefotaksim, seftazidim, seftriakson ve/veya aztreonama al›fl›lm›fl›n d›fl›nda direnç görül-mesi ESBL üretimi için uyar›c› olabilir (3,4,9,11). Bununla bera-ber, baz› ESBL-olumlu olan bakterilerle yap›lan rutin duyarl›l›k deneylerinde, bu kökenler yanl›fll›kla duyarl› olarak tan›mlanabi-lir ve bu durum da tedavi baflar›s›zl›klara yol açar. Bundan dola-y› ESBL varl›¤›n› belirlemede çeflitli yöntemler önerilmektedir. Bunlar, standard inokülumdan daha yüksek inokülumlar›n kulla-n›ld›¤› dilüsyon yöntemleri, çift diskli sinerji testi, üç boyutlu test, otomatize sistemler (Vitek) ve E testidir (4,11). Laboratuvar-larda en s›k kullan›lan test, çift diskli sinerji testidir. Ancak bu testin güvenirli¤ini azaltan baz› faktörler vard›r. Bu faktörler; ba-z› sefalosporinazlarla sinerjinin engellenmesi, klavulanik asidin tüm ESBL'leri inhibe edememesi, diskler aras› uzakl›¤›n test so-nucunu etkilemesi ve klavulanik asidde meydana gelebilecek po-tens kayb›n›n yanl›fl negatif sonuçlara yol açmas›d›r. Üç boyutlu yöntemde ise, hem beta-laktamaz substrat profili hem de antibi-yotik duyarl›l›¤› birlikte saptanabilir (4).
Bu çal›flmada, çift diskli sinerji testi ile 51 E.coli kökeninin %18'inde, üç boyutlu test ile %25'inde ESBL üretimi saptand›. Bu oranlar K. pneumoniae kökenlerinde ise s›ras›yla %43 ve %46 olarak bulundu. ‹statistiksel de¤erlendirmede çift diskli sinerji tes-ti ile üç boyutlu test aras›nda anlaml› bir fark bulunamad›.
Thomson ve arkadafllar› (4), ESBL-pozitif oldu¤u bilinen kökenlerle ilgili yapt›klar› çal›flmada, ESBL üretimini çift diskli sinerji testi ile %79, üç boyutlu test ile %93 oran›nda saptam›fl-lard›r ve sonuç olarak üç boyutlu testin ESBL'leri belirlemede daha h›zl› ve daha duyarl› bir yöntem oldu¤unu vurgulam›fllard›r. Derbentli ve arkadafllar› (9)'n›n yapt›¤› bir çal›flmada ise ESBL
üretimi, çift diskli sinerji testi ile %35, üç boyutlu test ile %43 olarak bulunmufltur. Sonuçlar de¤erlendirildi¤inde iki yöntem aras›nda ESBL üretimini saptama aç›s›ndan istatistiksel olarak anlaml› bir fark bulunmam›flt›r. Fakat araflt›r›c›lar daha fazla kö-kenle çal›fl›ld›¤› takdirde fark›n anlaml› olabilece¤ini belirtmifl-lerdir. Yine 1997 y›l›nda yap›lan bir baflka çal›flmada, 67 K.pne-umoniae kökeninin 10'unda ESBL olumlulu¤u saptanm›fl ve bu 10 kökenin sekizinde hem çift diskli sinerji testi, hem de üç bo-yutlu testle ESBL varl›¤› belirlenmifltir. Araflt›rmac›lar yapt›klar› çal›flman›n sonucunda ESBL üreten bakterilerin araflt›r›lmas›nda pratik uygulama kolayl›¤› nedeniyle çift diskli sinerji testinin gü-venle kullan›labilecek bir yöntem oldu¤unu da bildirmifllerdir (12).
Sunulan bu çal›flmada, ESBL aktivitesini belirlemede çift diskli sinerji testi ve üç boyutlu test istatistiksel olarak birbiriyle uyumlu bulunmufltur. Sonuç olarak her iki test de ESBL belirle-mede güvenle uygulanabilecek yöntemler olmas›na ra¤men, pra-tikte uygulama kolayl›¤› aç›s›ndan çift diskli sinerji testinin ter-cih edilebilece¤i yorumu yap›lm›flt›r.
Kaynaklar
1. Jacoby GA, Medeiros AA. More extended-spectrum β-lactamases. Antimicrob Agents Chemother 1991; 35: 1697-704
2. George JA, Sutton L. Properties of plasmids responsible for producti-on of extended-spectrum β-lactamases. Antimicrob Agents Chemot-her 1991; 35: 164-9
3. Büyükbaba Ö, Ayd›n D, An¤ Ö. ‹drar yolu infeksiyonu etkeni Gram-negatif çomaklarda genifllemifl spektrumlu β-laktamazlar›n çift disk sinerji yöntemi ile belirlenmesi. Klimik Derg 1996; 9: 27-30 4. Thomson KS, Sanders CC. Detection of extended-spectrum β
-lacta-mases in members of the family Enterobacteriaceae: comparison of the double disk and three dimensional tests. Antimicrob Agents Che-mother 1992; 36: 1877-82
5. Sirot DL, Goldstein FW, Soussy CJ, et al. Resistance to cefotaxime and seven other β-lactams in members of the family Enterobacteriace-ae: a 3 year survey in France. Antimicrob Agents Chemother 1992; 36: 1677-81
6. Papanicolaou GA,. Medeiros AA, Jacoby GA. Novel plasmid-medi-ated β-lactamase (MIR-I) conferring resistance to oxyimino- and a-met hoxy β-lactams in clinical isolates of K.pneumoniae. Antimicrob Agents Chemother 1990; 34:2200-9
7. Jacoby GA, Carreras I. Activities of β-lactam antibiotics against E.co-li strains producing extended-spectrum β-lactamases. Antimicrob Agents Chemother 1990; 34: 858-62
8. Eskitürk A, Korten V, Söyletir G. Akut bak›m gerektiren hastalarda geliflen infeksiyonlardan izole edilen Klebsiella türlerinde antibakteri-yel duyarl›l›k paternlerinin ve genifl spektrumlu beta-laktamaz s›kl›¤›-n›n araflt›r›lmas›. Ankem Derg 1996; 10: 14-8
9. Derbentli fi, Katranc› H, Nakibo¤lu Y. Gram negatif çomaklarda ge-nifllemifl spektrumlu beta-laktamazlar›n belirlenmesinde üç boyutlu yöntem ve çift disk sinerji yönteminin karfl›laflt›r›lmas›. Ankem Derg 1996; 10: 1-13
10. Livermore DM. β-lactamases in laboratory and clinical resistance. Clin Microbiol Rev 1995; 8:557-84
11. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests. 4th ed. Appro-ved Standard. NCCLS Document M2-A4. Villanova, Pa: NCCLS, 1990
12. Aky›ld›z R, Altunay H, Özsoy MF, Koçak N, Çavufllu fi, Yenen Ofi. Klebsiella pneumoniaesuflla-r›nda çift disk sinerji testi ve üç boyutlu test ile ESBL s›kl›¤›n›n araflt›r›lmas›. In: Tümbay E, ‹nci R, Hilmio¤lu Z, eds. 3. Antimik robik Kemoterapi Günleri: Klinik Laboratuvar Uygulamalar› ve Ye-nilikler (16-22 May›s 1997, Ku-fladas›) Konferans-Simpozyum Metinleri ve Serbest Bildiri Özet leri Kitab›. ‹stanbul: Türk Mikro-biyoloji Cemiyeti, 1997: 335
60 Klimik Dergisi●Cilt 11, Say›:2
Tablo 1. ‹ncelenen Bakterilerin Çift Diskli Sinerji Testi ve Üç Boyutlu Test ile Saptanan ESBL Üretim Oranlar›
Çift Diskli Sinerji Üç Boyutlu Test
Kökenler n (%) n (%)
E.coli (n=51) 9 (18) 13 (25)
K.pneumoniae (n=46) 20 (43) 21 (46)
Toplam (n=97) 29 (30) 34 (35)
Tablo 2. ESBL Belirlemede Kullan›lan Yöntemlerin Karfl›laflt›r›lmas› (Tutarl›l›k Analizi)
Gözlenen Sonuca Kappa Anlaml›l›k
Kökenler Testler Tutarl›l›k Ba¤l› De¤eri p
Tutarl›l›k
E.coli (n=51) 1-2 0.84 0.61 0.54 0.00003
K.pneumoniae (n=46) 1-2 0.93 0.50 0.86 0.000001
Toplam 1-2 0.88 0.56 0.74 0.0000001
