Klimik Dergisi • Cilt 17, Say›:3 • 2004, s:142-145 142
Girifl
Clostridium difficile Gram-pozitif, zorunlu anaerop, sporlu bir mikroorganizmad›r (1). Nozokomiyal bir ajan olmas› ve uygun olmayan antibiyotik kullan›mlar›n›n s›k görülmesi ne-deniyle, bu bakteri ile her y›l milyonlarca insan›n infekte olma-s›na yol açmaktad›r. Salg›nlar s›ras›nda yüzeyden, havadan, yiyeceklerden, uzun süreli tedavi ve bak›m yap›lan bölümlerden ve hastane personelinin ellerinden izole edilmifltir. Hastalar›n C. difficile ile çok kolay kontamine olabilece¤i bir yerde anti-biyotik tedavisi görmeleri nedeni ile hastane ortam›nda birinci s›rada gastrointestinal infeksiyon nedeni haline gelmifltir (2). Psödomembranöz kolitlerin %90-100’ünden, antibiyotikle ilifl-kili kolitlerin %60-75’inden, antibiyotikle iliflilifl-kili diyarelerin %11-33’ünden sorumludur (1). Ülkemizde yap›lan çeflitli ça-l›flmalarda nozokomiyal infeksiyöz gastroenterit etkenlerinin %3.2-18.4 aras›nda C. difficile oldu¤u saptanm›flt›r (3-7). Tok-sin A (enterotokTok-sin) ve tokTok-sin B (sitotokTok-sin) olmak üzere en az iki toksin üretir. Her ikisi de ayr› ayr› toksik özellikte olup, ay-r›ca birbiri ile sinerji gösterirler (8). Bu toksinleri üretmeyen sufllar klinik önemi olan hastal›k yapmazlar (9).
C. difficile infeksiyonunun tan›s›nda henüz standardize edilmifl tek bir tan› yöntemi yoktur. Ayr›ca sa¤l›kl› kiflilerde %0-11, hospitalize eriflkinlerde %10-20, çocuklarda %4-50 gi-bi asemptomatik tafl›y›c›l›k görülmesi, test sonuçlar›n›n yoru-munda dikkat edilmesini gerektirir (2, 10). The Society for He-althcare Epidemiology Association (SHEA) ve baz› otörler op-timal duyarl›l›k ve özgüllük elde etmek için d›flk› kültürü ile doku kültürü sitotoksin testinin birlikte yap›lmas›n› önermek-tedir. Ço¤u laboratuvarlarda ise maliyet yüksekli¤i ve zaman al›c› olmas› nedeni ile bu iki test yap›lmamaktad›r. Buna karfl›n, duyarl›l›¤› k›smen düflük de olsa, özgüllü¤ünün yüksek olmas›, maliyet ve zaman uygunlu¤u gibi sebeplerle ELISA testleri yayg›n kullan›m alan› bulmufltur. ELISA ve doku kültür sito-toksin testinin birlikte uygulanmas› ise duyarl›l›¤› %72’den %81’e ç›karmaktad›r (11).
C. difficile infeksiyonu tan›s›, klinik, biyokimyasal ve mik-robiyolojik yaklafl›m gerektirir (9, 11-14).
Klinik Tan›
Klasik semptom ve bulgular oldu¤unda C. difficile infeksi-yonu tan›s›n› koymak oldukça kolayd›r. Hastal›k bafll›ca afla¤›da-ki befl klinik formdan biri ile seyredebilir: [1] Asemptomatik tafl›y›c›l›k, [2] Psödomembrans›z kolit, [3] Psödomembranl› kolit (PMK), [4] Toksik megakolon, [5] Fülminan kolit.
Clostridium difficile ‹nfeksiyonunun Laboratuvar
Tan›s›nda Sorunlar
Nurittin Ardݍ
Gülhane Askeri T›p Akademisi, Haydarpafla E¤itim Hastanesi, Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Servisi, Haydarpafla-‹stanbul
Diyare ana semptomdur. Nozokomiyal diyarelerin önde gelen sebebi olup, hastaneyle iliflkili diyarelerin %20-45’inden C. difficile sorumludur (13). Kanl› diyare yayg›n de¤ildir, hatta görülmesi diyareye yol açan di¤er sebepleri akla getirmelidir. Diyarenin yan›nda kramp fleklinde kar›n a¤r›s›, anoreksi ve ba-zen hafif atefl de görülebilir (9).
‹ki yafl›ndan küçüklerin %25-60’›n›n, yenido¤anlar›n ise %64’ünün d›flk›s›nda C. difficile görülmektedir. Sa¤l›kl› yeni-do¤anlarda asemptomatik tafl›y›c›l›¤›n yüksek olmas›, bu po-pülasyonda patojenik etkisinin olmad›¤›n› düflündürmektedir. Enterosit membran reseptörlerini bu yafl grubunda henüz ol-gunlaflmam›fl olmas› bu görüflü desteklemektedir. Ayr›ca yafl ile azalan antitoksik mukozal bir mekanizman›n varl›¤› da düflünülmektedir (2).
C. difficile, PMK’ye neden olan en s›k etken olmakla bir-likte, Staphylococcus aureus, Clostridium perfiringens tip C ve di¤er Clostridium türleri de ayn› tabloyu meydana getirebil-mektedir (2).
Biyokimyasal Testler Rutin Biyokimyasal Testler
Lökositozun yan›nda, ciddi olgularda geliflen enteropatiye ba¤l› olarak dehidratasyon, protein kayb› sonucunda ortaya ç›kan hipoalbüminemi ve di¤er baz› elektrolit anomalileri görülebi-lir. Yine fekal lökositlerin saptanmas› C. difficile infeksiyonu-nu destekleyen nonspesifik bulgulard›r (8,9).
Gaz-Likid Kromatografisi
Bu anaerop bakteriler metabolizmalar› sonucu uçucu spe-sifik (Tablo 1) metabolitler olufltururlar. Gaz-likid kromatog-rafisi yöntemi ile, söz konusu metabolitler saptanarak, C. diffi-cile’nin kesin tan›mlay›c› idantifikasyonu yap›lmaktad›r. Ba-sit, h›zl› ve çok güvenilir diyagnostik bir testtir (15).
Radyolojik ‹ncelemeler
Abdominal radyografi ve bilgisayarl› tomografi C. difficile infeksiyon tan›s›nda yard›mc› olursa da, bu amaçla en çok ter-cih edilebilecek radyolojik tetkik endoskopidir (8). Abdominal radyogramda kolon ve çekumdaki dilatasyonlar›, incebarsaktaki hava-su seviyesini görmek olas›d›r. Bilgisayarl› tomografide ise kolondaki kal›nlaflmalar ve katlanmalar görülebilir. Ancak bunlar tamamen nonspesifik bulgulard›r (9). Endoskopik yön-temlerde ise kolon duvar›ndaki lezyonlar incelenir. Ancak tipik psödomembran formasyonu yoksa k›smen nonspesifiktir. Ma-liyeti, hasta için risk tafl›mas› ve di¤er tan› testlerinin olmas› nedeni ile daha çok özel durumlarda baflvurulmal›d›r. The American College of Gastroenterology Guidelines, endoskopiyi flu flartlarda önermektedir (11): [1] H›zl› tan› testlerine ihtiyaç
duyuluyor ve test sonuçlar› gecikecekse; [2] hasta ileuslu ve d›flk› örne¤i al›nam›yorsa, [3] endoskopik tan›y› gerektiren baflka bir hastal›k düflünülüyorsa.
Mikrobiyolojik ‹ncelemeler Mikroskopik ‹nceleme
Toksin testleri için yeterli örnek ald›ktan sonra buradan bir de Gram boyamas› yap›larak Gram-pozitif sporlu basiller ara-n›r. Ayr›ca buradan taze preparat haz›rlanarak faz kontrast mikroskobu ile yap›lan incelemelerde tipik sal›n›m hareketi yapan sporlu basiller görülebilir. Ancak özgüllü¤ü düflüktür (9,12).
Kültür
Normal bir gram d›flk›daki C. difficile say›s› 102kadard›r.
Bu say› 103-104/gr oldu¤unda kültürle tan› yönünden anlaml›
hale gelmektedir (2).
C. difficile izolasyonunda, George ve arkadafllar›n›n gelifl-tirdi¤i CCFA (cefoxitin-cycloserine fructose agar) seçkin besi-yeri olarak kullan›lmaktad›r. D›flk› örneklerinin direkt olarak inoküle edildi¤i ilk CCFA’n›n bilefliminde sikloserin (500 mg/lt), sefoksitin (16 mg/lt), fruktoz, nötral k›rm›z›s› indikatö-rü ve yumurta sar›s› vard›. Sikloserin ve sefoksitin
konsantras-Klimik Dergisi • Cilt 17, Say›:3 143
Tablo 1. C. difficile ve Di¤er Baz› Clostridium’lar›n Biyokimyasal Özellikleri*
C.botulinum tip A ve A p ib B iV + + S + - +/- - - - + + - - - proteolitik tip B ve F (f ic l s) C.sporogenes A ib B iv + + S - - + - - - + + - - -(+) (p v ic s) C.botulinum tip E ve A B (f l s) - + S + - +/- - + - - + - - -nonproteolitik tip B ve F C.botulinum tip C ve D a P B ( f v l s) - + S + - +(-) - - - - + - - -(+) C.difficile A ib b iv v ic + +(-) S/T + - - - - + +(-) - - - - (p c) C.innocum A B L (f s) - - T - - - - +(-) + + - - -C.clostridioforme A (F l s) - + S - -(+) + + + - + - - +/- -C.glycolicum A ib iV + + S - - +/- + - - -(+) - - - -(f p l s) C.fallax A B (L s) - + S - - + - - - + - - - -C.cadaveris A B (f p s) - + T - + - - - -C.putrific›m A ib B iv + + T - - - -(+) - - - -(f p ic l s) C.novyi tip C A p B (v) - - S - - - -C.carnis A f B l (s) - + S - - + - + - + - + +/-
-*6 no.’lu kaynaktan al›nm›flt›r
**Büyük harfler >10 µmol/ml, küçük harfler 0.2-10 µmol/ml (a: asetik asid, b: butirik asid, ib: izobutirik asid, p: propiyonik asid, v: valerik asid, iv: izovalerik asid, c: kaproik asid, ic: izokaproik asid, f: formik asid, l: laktik asid, s: süksinik asid)
***T=terminal, S=subterminal ****Fermantasyon testi
Tür Ya¤ asidi üretimi** ‹zobutirik asid üretimi Hareket Spor*** Toksin ‹ndol Maltoz**** Ksiloz**** Sukroz**** Mannitol**** Eskülin hid- rolizi Lipaz Aerotolerans Laktoz**** Lesitinaz
yonlar›n›n çok yüksek olmas›na ba¤l› olarak birçok C. diffici-le suflunun inhibe oldu¤unun anlafl›lmas› üzerine bu antimikro-biyal ajanlar›n konsantrasyonlar›n›n yar› dozlar›n› içeren mo-difikasyonlar› yap›lm›flt›r. CCEY (cycloserine-cefoxitine-egg yolk) agar gibi CCFA’n›n modifikasyonlar› gelifltirilerek kul-lan›ma girmifltir (12).
D›flk› örneklerinin ›s› veya alkolle iflleme tabi tutulduktan sonra CCFA’ya pasajlar›n›n yap›lmas› C. difficile izolasyon oran›n› art›rmaktad›r (16). C. difficile kolonileri ultraviyole (UV) ›fl›¤› alt›nda (366 nm dalga boyunda) CCFA üzerinde sar›-yeflil fluoresans verir. P-krezol, volatil ya¤ asidleri ve özellikle izo-kaproik asidlere ba¤l› olarak tipik at veya fil d›flk›s› kokusu vard›r. C. difficile kolonileri tipik olarak, gri, opak, 24-48 saatte nonhemolitiktir. Fakat baz› sufllar› alfa-hemoliz yapar. ‹nkü-basyondan 48-72 saat sonra sporülasyona ba¤l› olarak merkezi beyaz veya hafif gri olan ay›rt edici koloniler geliflebilir. Kül-türde üreyen koloniler lateks aglütinasyon, gaz kromatografi veya biyokimyasal yöntemlerle (Tablo 1) idantifiye edilir (12). Kültür duyarl› bir yöntem olmas›na karfl›n, kompleks oluflu, toksinojenik ve nontoksinojenik sufllar› ay›rt edememesi gibi nedenlerle k›smen merkezi laboratuvarlarda uygulan›r ve daha çok salg›n zamanlar›nda epidemiyolojik aç›dan önem kazan›r. Baz› hastanelerde nontoksinojenik sufllar›n oran› %20-25’i
bulmakta olup, bu sorun toksin testleri ile kombine edildi¤inde çözülebilmektedir. Ancak bu da ilave zaman ve maliyet anla-m› tafl›maktad›r (9,11).
Toksin Aramaya Yönelik Testler
Doku kültürü: D›flk› örneklerinde 10 pg’l›k sitotoksin sap-tayabilen doku kültürleri, toksinlerin varl›¤›n› araflt›rmada alt›n standard olarak kabul edilmektedir (2). Bu yöntemde, Hep2 (human epithelial) hücreleri, CHO (Chinese hamster ovary) hücreleri, insan embriyonik akci¤er fibroblast (MRC 5, WI-38) hücreleri, insan amniyon (FL) hücreleri ve Afrika yeflil maymun böbre¤i (Vero) hücreleri gibi hücreler kullan›lmaktad›r (17,18). Bu amaçla, s›v› d›flk› örnekleri santrifüje edildikten sonra elde edilen süpernatan, filtrelerden geçirilerek bakteriden ar›n-d›r›l›r. Elde edilen filtrattan bir miktar saydam hücre kültürü kaplar›na eklenir. 37°C’de 24-48 saat anaerop inkübasyondan sonra, ›fl›k mikroskobunda sitopatik etki (yuvarlaklaflma) aran›r. Normal d›flk› örnekleri çal›flmaya uygun olmad›¤›ndan rutin ifl-lemlerde en az on, hatta yüz kez dilüe edilmifl d›flk›lardan tok-sisite titreleri araflt›r›l›r (18). Nötralizan antikor (anti-C. sordellii antiserum) eklendi¤inde bu sitopatik etki ortadan kalkar (8,11). Doku kültürünün dezavantaj› uzun sürede (2-3 gün) sonuç al›nmas›, pahal› olmas›, standardizasyonun sa¤lanamam›fl ol-mas›, her laboratuvarda uygulanamamas› ve do¤rulama için re-ferans laboratuvarlar›na gereksinimi olmas›d›r. Bu yüzden pratik bir yöntem de¤ildir (8,19). Her ne kadar alt›n standard kabul edilse de, toksin B’nin proteazlarla parçalanmas› sonucunda yalanc› negatiflikler de görülebilmektedir (1).
‹mmünodiyagnostik Testler
ELISA: Sitotoksinlerin saptanmas›nda doku kültürlerinin yukar›da bahsedilen dezavantajlar› nedeni ile daha baflka test-lere gereksinim duyulmaktad›r. Bu amaçla ço¤unlukla daha h›zl›, k›smen ucuz ve özgüllü¤ü yüksek olan ELISA testleri tercih edilmektedir. ELISA ile ancak 100-1000 pg toksin A veya B saptanabilmektedir. Bu nedenle %10-20 oran›nda bir yalan-c› negatiflik söz konusudur (8). Ticari kitlerin bir k›sm› sadece toksin A antijenini saptamaya yöneliktir. C. difficile sufllar›n›n %1-2’si toksin A üretmedi¤inden dolay› toksin A ve B’yi bir-likte saptayan kitler tercih edilir (8, 9). Bunun yan› s›ra C. dif-ficile’nin 10 farkl› toksinotipi saptanm›fl olup (I-X), tip VIII ve X toksin A’ya spesifik testlerle saptanamaz (20). ELISA yön-temi ile üç d›flk› örne¤i incelenmesi tan› flans›n› sadece %5-10 artt›r›ken, maliyeti oldukça yükseltir. Bu nedenle hastal›¤›n tablosunu aç›klay›c› baflka sebep bulunamamas›na ra¤men,
di-Klimik Dergisi • Cilt 17, Say›:3 144
yarenin devam etmesi gibi durumlar d›fl›nda genelde tercih edilmez (8,9). fiekilli d›flk›larda %10 dolay›nda yalanc› pozitiflik gözlenebilece¤inden, sadece diyareli hasta d›flk›lar›nda çal›fl›l-mas› önerilmektedir (9).
Lateks aglütinasyon testi: H›zl›, basit ve ucuz bir testtir. Bu testlerin esas› toksin A’n›n saptanmas› ise de, tüm C. diffi-cile sufllar›nda bulunan glutamat dehidrogenaz da saptanabil-mektedir (9). Lateks aglütinasyon yöntemi uygulanacak d›flk› örne¤inin dondurulmamas› gerekmektedir (2). Di¤er testlere göre duyarl›l›k ve özgüllü¤ünün düflük olmas› nedeni ile yayg›n kullan›m alan› bulmam›flt›r (9).
‹mmünokromatografik testler: Yine toksin A’y› saptama temeline dayal› ve k›sa sürede sonuç al›nan tarama testleridir. Baz›lar› glutamat dehidrogenaz enzimini de saptar. Di¤er sito-toksin testlerine göre bunlar›n da duyarl›l›¤› daha düflüktür (%70-90.6). Tan› amaçl› olarak tek bafl›na kullan›lmas› öneril-mez (21,22).
Kromatografik ve lateks aglütinasyon testlerinin hücre kültürü sitotoksisite testlerine tek üstünlü¤ü ise, daha h›zl› ve ucuz olmas›, uygulama kolayl›¤› ve tek veya birden fazla hasta örne¤ini çal›flmak için uygunlu¤udur (8).
Moleküler Yöntemler
Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), toksin A veya B gen-lerini saptamada oldukça umut vaadetmektedir. Toksin A ve B genlerinin “nonrepeating” ve toksin B geninin “repeating” bölgelerine uygun çift primer seti kullan›ld›¤›nda toksin A+/B+, toksin A/B+ ve toksin A/B sufllar birbirinden ayr›la-bilmektedir (1,23). Maliyeti ve kompleks oluflu gibi nedenler-den dolay› rutin kullan›m için henüz erkendir (3).
Di¤er Testler
‹nflamatuar yan›t için belirleyici rolü olan laktoferrin, TNF-, IL-1ß, IL-6 ve IL-8 gibi sitokinlerin sal›n›m›n› C. diffi-cile’nin uyard›¤› ve bunlar›n bak›lmas›n›n C. difficile infeksi-yonu tan›s›nda ek bilgi sa¤layaca¤› belirtilmektedir (10,24,25).
Bunlar›n yan› s›ra karfl›t immün elektroforez, fluoresan an-tikor testleri gibi testler de kullan›lm›flt›r (26).
Tafl›y›c›lardan ay›rt edebilmek için sadece sulu ve son 36 saat içinde en az alt› kez sulu d›flk›lamas› olan hastalar›n d›fl-k›lar› kabul edilmelidir. Rutin d›flk› kaplar› uygundur. Laboratu-var incelemesi ilk 24 saatte +4°C’de, daha uzun süre bekleye-cekse -20°C’de bekletilmelidir (7,14).
Sonuçta, bu yöntemlerin hepsinde birtak›m avantaj ve de-zavantajlar vard›r. Tüm hastalar için ayn› tan› yöntemini kul-Tablo 2. C. difficile ‹nfeksiyonlar›nda Kullan›lan Testlerin Duyarl›l›k ve Özgüllükleri (5)
Test Duyarl›l›k (%) Özgüllük (%) Klinik Anlam›
Endoskopi 51 ~100 PMK için diagnostik
Kültür 89-100 84-99 Oldukça duyarl›, toksisite yönünden do¤rulanmal›
Doku kültürü sitotoksin testi 67-100 85-100 Klinikle uyumlu ise C. difficile diyaresi için diyagnostik ELISA (toksin testi) 63-99 75-100 Klinikle uyumlu ise C. difficile diyaresi için diyagnostik Lateks testi 58-92 80-96 H›zl›, duyarl›l›k ve özgüllü¤ü di¤er testlerden düflük
(C. difficile antijeni)
lanmak uygun olmayabilir. Sonuçlar›n yorumunda klinikle uyumu esas al›nmal›d›r. Bu amaçla the Infectious Diseases So-ciety of America ve the SoSo-ciety for Hospital Epidemiology of America önerisine göre C. difficile toksin tespitinde izlenecek yol flu flekildedir (8): [1] ‹leus olgular› d›fl›nda, sadece diyare-li d›flk›lar test edilmediyare-lidir. [2] Epidemiyolojik araflt›rmalar›n d›fl›nda tedavi sonras› takip yap›lmamal›d›r. [3] Sadece bir ya-fl›n üzerindeki kiflilerden örnek al›nmal›d›r. [4] Duyarl›l›¤› da-ha düflük olmakla birlikte ELISA testleri sitotoksin testlerine alternatif olarak kabul edilebilir özelliktedir. [5] Nötropenili, HIV ile infekte ve 65 yafl›n üzerindekiler d›fl›nda, sadece hos-pitalizasyondan üç gün sonra diyare geliflen hastalar toksin yö-nünden test edilmelidir (üç gün kural›).
Kaynaklar
1. Vanpoucke H, De Baere T, Claeys G, Vaneechoutte M,Verschra-egen G. Evaluation of six commercial assays for the rapid detecti-on of Clostridium difficile toxin and/or antigen in stool specimens. Clin Microbiol Infect 2001; 7: 55
2. Baylan O, Do¤anc› L, Gün H. Klinik ve mikrobiyolojik aç›dan Clostridium difficile. Sendrom 1998; 10: 71-6.
3. Büyükbaba Ö, Özkan E, Büget E. Uzun süreli antibiyotik tedavisi gören ishalli çocuklar›n d›flk›lar›nda Clostridium difficile’nin arafl-t›r›lmas›. Klimik Derg 1994; 7: 105-7
4. Altu¤lu ‹, Aydemir fi, Zeytino¤lu A, Erensoy S, Bilgiç A. Antibi-yotikle iliflkili nozokomiyal diyarelerde Clostridium difficile toksin a araflt›r›lmas›. ‹nfeks Derg 2001; 15: 495-7
5. Kocazeybek B. Özel bir hastanede akut gastrointestinal infeksiyon etkeni mikroorganizmalar›n prevalans›n›n araflt›r›lmas›. Türk Mik-robiyol Cemiy Derg 2001; 31: 69-72
6. Boral ÖB. Clostridium difficile infeksiyonu ön tan›l› hastalar›n d›fl-k› örneklerinde toksin A ve B’nin belirlenme s›kl›¤›. Türk Mikro-biyol Cemiy Derg 2002; 32: 220-4
7. Aygün G, Aslan M, Yaflar H, Altafl K. Hastanede yatarken geliflen ishal olgular›nda Clostridium difficile toksin A+B araflt›r›lmas›. Ankem Derg 2002; 16:82-4
8. Bartlett JG. Antibiotic-associated diarrhea. N Eng J Med 2002; 346: 334-9
9. Fry DE. Clostridium difficile infection. In: Moellering RC, ed. Emerging Pathogens: Implications for the Future. Montreal: Phar-maLibri Publishers,. 2000: 51-75
10. Schleupner MA, Garner DC, Sosnowski KM, et al. Concurrence of Clostridium difficile toxin A enzyme-linked immunosorbent assay, fecal lactoferrin assay, and clinical criteria with C. difficile cytoto-xin titer in two patient cohorts. J Clin Microbiol 1995; 33:1755-9 11. Thielman N. Antibiotic-associated colitis. In: Mandell GL,
Doug-las RC, Bennett JE, eds. Mandell, DougDoug-las, and Bennett’s
Princip-Klimik Dergisi • Cilt 17, Say›:3 145
les and Practice of Infectious Diseases. 5th ed. Philadelphia: Chur-cill Livingstone, 2000: 1111-26
12. Collee JG, Brown R, Poxton IR. Clostridia of wound infection. In: Collee JG, Fraser AG, Marmion BP, Simmons A, eds. Practical Medical Microbiology. 14th ed. Philadelphia: Churchill Livingsto-ne, 1996; 511-47
13. Alfa MJ, Du T, Beda G. Survey of incidence of Clostridium diffi-cile infection in Canadian hospitals and diagnostic approaches. J Clin Microbiol 1998; 36: 2076-80
14. Mülaz›mo¤lu L. Antibiyoti¤e ba¤l› ishal. Klimik Derg 1996; 9: 13-4 15. Nonhoff C, Struelens MJ, Serruys E. Evaluation of gas-liquid
chro-matography (GLC) for rapid detection of Clostridium difficile in fe-cal specimens. Acta Clin 1995; 50: 76-80
16. Buogo C, Burnens AP, Perr›n J, Nicolet J. Presence of Campylo-bacter spp. Clostridium difficile, C .perfringens and Salmonella in some litters of pupies and adult population of dogs. Schweizer Arch Tierheilkunde 1995; 137: 165-71
17. Sullivan NM, Pellet S, Wilkins TD. Purification and characterizati-on of toxins A and B of Clostridium difficile. Infect Immun 1982; 35: 1032-40
18. Lyerly DM, Howard CK, Wilkins TD. Clostridium difficile: it’s di-sease and toxins. Clin Microbiol Rev 1988; 1: 1-18
19. Manabe YC, Vinetz JM, Moore RD, Merz C, Charache P, Bartlett JG. Clostridium difficile colitis: an efficient clinical approach to di-agnosis. Ann Intern Med 1995; 123: 835-40
20. Johnson S, Sambol SP, Brazier JS, Delmée M, Avesani V, Merri-gan MM, Gerding DN. International typing study of toxin A-negative, toxin B-positive Clostridium difficile variants. J Clin Microbiol 2003; 41:1543-7
21. Fedorko DP, Engler HD, O’Shaughnessy EM, Williams EC, Reic-helderfer CJ, Smith WI. Evaluation of two rapid assays for detec-tion of Clostridium difficile Toxin A in stool specimens. J Clin Microbiol 1999; 37: 3044-7
22. Alfa MJ, Swan B, VanDekerkhove B, Pang P, Harding GK. The diagnosis of Clostridium difficile-associated diarrhea: comparison of Triage C. difficile panel, EIA for Tox A/B and cytotoxin assays. Diagn Microbiol Infect Dis 2002; 43: 257-63
23. Kato H, Kato N, Watanabe K, Iwai N, Nakamura H, Yamamoto T, Suzuki K, Kim SM, Chong Y, Wasito EB. Identification of toxin A-negative, toxin B-positive Clostridium difficile by PCR. J Clin Mic-robiol 1998; 36: 2178-82
24. Warny M, Keates AC, Keates S, et al. p38 MAP kinase activation by Clostridium difficile toxin A mediates monocyte necrosis, IL-8 production, and enteritis. J Clin Invest 2000; 105: 1147-56 25. Steiner TS, Flores CA, Pizarro TT, Guerrant RL. Fecal lactoferrin,
interleukin-1beta, and interleukin-8 are elevated in patients with severe Clostridium difficile colitis. Clin Diagn Lab Immunol 1997; 4: 719-22.
26. Knoop FC, Owens M, Crocker IC. Clostridium difficile: clinical disease and diagnosis. Clin Microbiol Rev 1993; 6: 251-65.
