1. GİRİŞ
İnsanların fizyolojik ve biyokimyasal özellikleri 24 saat boyunca değişim göstermekte ve biyolojik fonksiyonlardaki sirkadiyan ritimlerin yanısıra, çevresel tetikleyicilerin yoğunluğundaki değişimler birçok kronik hastalığın görülmesinde ve şiddetinde gece-gündüz farklılıkları oluşturmaktadır1, 2.
Sağlıklı bireylerde, kalp hızının ve kan basıncının gün içinde arttığı ve gece boyunca düştüğü gösterilmiş olup, yapılan çalışmalarda kan basıncı ve kalp hızındaki diurnal değişikliklerin nedenleri arasında hem eksternal uyarıların hem de endojen homeostatik kontrol mekanizmalarının rol oynadığı ortaya konulmuştur3, 4.
Kardiyovasküler sistemde başlıca kalp hızı, kalbin elektriksel aktivitesi, kan basıncı, sempatoadrenal aktivite / parasempatik tonüs değişiklikleri, renin-anjiotensin-aldosteron sistemi, kan parametreleri, koagülasyon ve periferik dolaşıma ait ritimlerin gözlendiği bilinmektedir5. Kardiyovasküler olaylardaki sirkadiyan değişiklikler aynı zamanda otonom sinir sistemi aktivitesindeki değişiklikleri de ifade eder6,7. Bu bağlamda iskemik hastalıklar, diabetes
mellitus ve inme gibi otonomik fonksiyonların bozulduğu bazı patolojik
durumlarda özellikle kalp hızı ve kan basıncı gibi kardiyovasküler komponentlere ilişkin sirkadiyan ritmin de değiştiğini veya ortadan kalktığını göstereren çalışmalar bulunmaktadır7, 8.
Konjestif kalp yetmezliği, koroner arter hastalığı ve hipertansiyon gibi birçok kalp-damar hastalığının ve diabetes mellitus’un ilerleyen dönemlerinde gözlenebilen bir klinik sendromdur. Konjestif kalp yetmezliği sendromunun, klinik yönden temel özellikleri arasında miyokard disfonksiyonu, egzersize karşı toleransın azalması, ventriküler aritmi insidansının artması ve ömrün kısalması sayılabilmektedir9. Kalp yetmezliğindeki hücresel ve moleküler değişiklikler miyositlerde veya miyosit olmayan hücrelerde ve hücrelerarası dokuda meydana gelebilmektedir. Miyositik gen ekspresyonundaki ve işlevindeki değişiklikler, kontraktil proteinlerin işlevi ve kompozisyonu, kalsiyum homeostazı ve sinyal ileti yolaklarında meydana gelen değişiklikler olmak üzere üç grup altında toplanabilir10.
Miyozin, ATP hidrolizi sonucu aktin ile etkileşerek güç ve hareket oluşturan bir mekanoenzimdir. Yapısal açıdan bakıldığında, bir miyozin ağır zincir (MAZ) ve ona nonkovalent bağlı iki hafif zincirden oluşur. MAZ üzerinde miyozinin hidrolitik ve motor fonksiyonunu sağlayan bir globuler katalitik kısım bulunmaktadır11. Kalpte α-MAZ ve β-MAZ izoformu olmak üzere iki β-MAZ izoformu bulunur12. αα-MAZ homodimerleri V1, ββ-MAZ homodimerleri V3 izoformunu oluşturmaktadır; bu homodimerler kardiyak miyozin olarak adlandırılmaktadır13.
Kalp dokusunun mekanik özelliklerinin V1 ve V3 izoformlarının ekspresyon düzeyi ile ilişkili olduğu bildirilmiştir. Örneğin primer olarak V1 izoformunu taşıyan kalp kaslarının, hem kısalma hızı14, 15, hem de kalsiyumla uyarılan miyofibriler ve aktomiyozin ATPaz aktiviteleri16, 17, 18, V3 izoformunu taşıyanlarla karşılaştırıldığında, daha yüksektir. Aksine V3 izoformunu taşıyan kalp kasları, daha fazla güç oluşturma potansiyeline sahiptir19, 20. α-MAZ gen ekspresyonunun sirkadiyan21 ve β-MAZ gen22 ekspresyonunun ise, diurnal ritim gösterdiği ve bunun kalp kontraktilitesinin gün içi ritminde rolü olabileceğini öne süren çalışmalar da bulunmaktadır.
İskelet ve kalp kasında düzenleyici hafif zincirin fosforilasyonunun, kontraksiyonu modüle ettiği düşünülmektedir23. Bu çalışmanın amacı i) miyozin hafif zincir (MHZ) ekspresyonlarının ve aktivasyonlarının olası gece-gündüz ritmisitesinin incelenmesi, ii) 2 farklı mekanizmayla pozitif inotropi oluşturan ajanların – β reseptör stimülasyonu, Na+/K+-ATPaz İnhibisyonu (sırasıyla, dobutamin ve ovabain) etkilerindeki olası gece ve gündüz ritminin incelenmesi ve iii) bu ajanların olası ritmik etkilerinin MHZ fosforilasyonlarına katkısını araştırmaktır.
2. GENEL BİLGİLER
2.1. Kalp Konraktilitesinin Moleküler temeli
Miyositler kalın ve ince miyoliflerdan oluşmaktadır. Kalın ve ince lifler Z çizgileri tarafından sınırlanmıştır. İki Z çizgisi arasında kalan bölgeye sarkomer adı verilir ve bu bölge kasılmanın işlevsel birimini oluşturur. Her bir sarkomer içinde kalın ve ince liflerin yerleşimi A, I ve M bantlarını oluşturur24 (Şekil-1).
Kardiyak miyositler sürekli bir kasılma-gevşeme siklusu gerçekleştirmektir24. Motor protein, kuvvet oluşumu (her bir çapraz köprü siklusu başına oluşan birim kuvvet) ve yer değiştirme hızı (kinetik) anlamında kontraktilitenin değişebileceği çerçeveyi tanımlar. Çapraz köprüdeki yapısal ve mekanik değişimler, ATP’nin ADP ve inorganik fosfata hidrolizini kapsayan eşzamanlı bir dizi kimyasal reaksiyona bağlıdır. Miyozinin aktine afinitesi, çapraz-köprü siklusu sırasında değişir25.
Şekil 1: Sarkomeri oluşturan elemanlar-26 numaralı kaynaktan alınarak Türkçeleştirilmiştir.
2.2. Kontraktil Proteinler
2.2.1.Kalın Lif
Kalın lif bir miyozin grubudur. Her bir miyozin molekülü iki ağır ve dört hafif zincirden oluşur. Her bir ağır zincir, küresel bir baş ve kuyruk bölgesinden oluşmaktadır. Hafif zincirler, ağır zincirlerin baş kısımlarına tutunmuşlardır. Aktin bağlanma ve ATPaz bölgeleri, baş kısmında bulunur ve kas kasılması sırasında, aktin lifleri ile çapraz köprülerin oluşturulmasına olanak sağlar24.
Miyozin (miyozin tip-2), yaklaşık 220 kDa’luk iki ağır zincir ve her biri yaklaşık 20 kDa olan bir çift hafif zincirden meydana gelmektedir. Ağır zincir alt üniteleri, hem motor, hem de lif oluşturma özelliklerini sağlamakta olup, her biri küresel (globular) N- ucu baş bölgesi ve uzun α-helikal kısım olmak üzere iki işlevsel kısıma ayrılabilir25.
Şekil 2: Kalp kontraktilitesinde görevli proteinler-27 ve 28 numaralı kaynaklardan alınarak Türkçeleştirilmiştir.
2.2.1.1. Kardiyak MAZ
İnsan kalbinde iki sarkomerik miyozin II geni eksprese edilmektedir. Bu genler α ve β-MAZ’ ı meydana getirirler29.
Gelişim sırasında ve patofizyolojik durumlarda, iki kardiyak MAZ izoformunun ekspresyonları doku spesifik olarak düzenlenir. Ekspresyonları aynı zamanda hormonal kontrol altındadır (özellikle tiroit hormonları)30, 31,32.
Tüm memeli türlerinde α-MAZ yaşam boyunca atriyumlarda eksprese edilir. Sıçan ve fare gibi küçük memelilerde doğumdan sonra ve erişkinlikte α-MAZ aynı zamanda ventriküllerdeki predominant izoformdur25.
β -MAZ, tüm memelilerin embriyonik- fetal ventriküllerinde ekprese edilir fakat küçük hayvan türlerinde doğumdan hemen sonra kaybolur. Tavşan, köpek, domuz gibi daha büyük hayvanlarda ve insanda β -MAZ erişkinlik boyunca, ventriküler predominant izoform olarak kalır25.
2.2.1.2. Kardiyak MHZ
MHZ’ler, esansiyel hafif zincirler ve düzenleyici hafif zincirler olmak üzere iki alt aileden oluşmaktadır25, 29.
Esansiyel hafif zincirin ‘esansiyel’ olarak adlandırılmasının nedeni ilk başlarda miyozinin hidrolitik aktivitesi için esansiyel olduğunun düşünülmesidir. Ancak daha sonra böyle olmadığı anlaşılmıştır ve alkali MHZ ve MHZ-1 gibi alternatif isimler önerilmiştir33, 34.
Düzenleyici hafif zincire ‘düzenleyici’ denmesinin nedeni ise omurgalı düz kasında ve kas olmayan hücrelerde kontraktil aktivitenin düzenleyici MHZ’nin fosforilasyonu ile sağlanmasına dayandırılmıştır. Bu protein için ise, daha sonra MHZ-2 ismi önerilmiştir35.
Kalpte MHZ-1 ve MHZ-2’nin atriyal ve ventriküler doku için karakteristik olan iki farklı tipi eksprese edilmektedir. Bunlar, esansiyel hafif zincir için sırasıyla atriyal ve venriküler olmak üzere AHZ-1 ve VHZ-1, düzenleyici hafif zincir içinse AHZ-2 ve VHZ-2 (2a ve 2b) dir25, 29.
MHZ-1 ve MHZ-2’nin moleküler ağırlıkları sırasıyla yaklaşık 22 ve 19 kDa civarındadır. Ancak MHZ-1, Sodyum Dodesil Sülfat (SDS) jel elektroforezinde kendine özgü N-terminali nedeniyle 27 kDa seviyesinde gözlenir25.
Atriyal MHZ-1 ekspresyonu, doku spesifiktir ve gelişimle düzenlenir. İnsan embriyosunda, hem kalpte (tüm kalp dokusunda) hem de iskelet kasında yüksek oranda eksprese edilirken, doğumdan sonraki düzeyi ventriküllerde belirlenebilir sınırların altındadır; ancak, atriyumlarda yaşam boyunca gözlenir29. Fizyolojik koşullarda geçerli olan bu durum, fallot tetralojisi gibi konjenital kalp hastalıklarının varlığında değişmektedir. Fallot tetralojisi olan çocuklarda, atriyumlarda VHZ-1’in36, venriküllerde ise AHZ’nin yüksek oranda eksprese edildiği gösterilmiştir37. Ayrıca, iskemik, dilate (genişlemiş) kardiyomiyopatili hastaların hipertrofik sol ventrikülünde AHZ-1’in eksprese edildiği gösterilmiştir38, 39, 40.
MHZ-1’in kalpteki fonksiyonu tam olarak aydınlatılamamış olmakla beraber, çapraz köprü kinetiğinin ve her bir çapraz köprü başına oluşan gerimin, MHZ-1 geninin değişen ekspresyonları tarafından modüle edildiği gösterilmiştir29.
MHZ-1 hem MAZ’a hem de aktinin C terminaline bağlanır 41, 42,43, 44,45. Böylelikle MHZ-1, MAZ ile aktini birbirine bağlar. MAZ/aktin bağlanmasının zayıflatılması, çapraz köprü kinetiğini hızlandırır ve aynı zamanda çapraz köprü başına oluşan gerimi artırır; böylelikle kontraktilite artar46.
Memeli kaslarında düzenleyici hafif zincir kalsiyum kalmoduline bağımlı MHZ kinaz tarafından fosforile edilirken, MHZ fosfataz tarafından defosforile edilir35. MHZ kinaz, VHZ-2’yi, N terminalindeki Ser-14, AHZ-2’yi ise Ser-21 ve Ser-22 bölgesinden fosforile eder. Yani, insan ventriküler MHZ-2 izoformu, monofosforile olurken, atriyal MHZ-2 izoformu, mono veya difosforile halde bulunabilir47. Ser-14 bölgesi, aynı zamanda, protein kinaz C tarafından
da fosforile edilebilmektedir48. Ayrıca, MHZ’nin protein kinaz A (PKA) tarafından fosforile edilebildiğini bildiren çalışmalar da bulunmaktadır49.
Düz kaslarda düzenleyici hafif zincirin fosforilasyonu kuvvet oluşumu için gereklidir ve oluşan kuvvetin derecesi fosforilasyonun düzeyi ile ilişkilidir50, 51. İskelet ve kalp kasında ise düzenleyici hafif zincirin fosforilasyonunun, kontraksiyonu modüle ettiği düşünülmektedir23.
MHZ-2 izoformlarının kalpteki işlevsel rolleri, henüz tam olarak aydınlatılamamıştır. Fizyolojik koşullarda, her bir kalp siklusu sırasında, MHZ kinazın aktivasyonu değişmediği için, sistol ve diyastol sırasında MHZ-2’nin fosforilasyon düzeyleri değişmez29. Ayrıca, adrenalinin MHZ-2’nin fosforilasyon düzeylerini değiştirmediği gösterilmiştir52. Son yıllarda yapılan çalışmalar, MHZ-2 fosforilasyonlarının, kalp kasında izometrik gerim oluşumunu % 20-30 artırdığını göstermiştir. Ayrıca, α-adrenerjik agonist uygulaması sonrası gelişen pozitif inotropiye, MHZ-2 fosforilasyonlarının katkısı olduğunu gösteren çalışmalar da bulunmaktadır53.
MHZ-2 protein düzeylerinin, dilate kardiyomiyopatide azaldığını ve bunun da kalp yetmezliğinin nedeni olduğuna dair çalışmalar bulunmakla beraber54, dilate veya iskemik kardiyomiyopatili hastalarda MHZ-2’nin değişmediğini gösteren çalışmalar da bulunmaktadır40,55.
2.2.2.İnce Lif
Bu lifler aktin, tropomiyozin ve troponin kompleksinden oluşmaktadır. Troponin kompleksi, troponin C, I ve T den meydana gelir. Hücre içi kalsiyumun kasılma sırasındaki her siklik artışı, troponin C ve I’da konformasyonel bir değişikliğe neden olarak, aktin ve miyozin arasındaki etkileşimi düzenler. Troponin T ise, troponin kompleksinin aktin-tropomiyozin omurgasına oturmasında rol oynar24.
2.3. Kontraktil Proteinlerin Etkileşimi
Kas gevşemesi sırasında, kalsiyum, troponin C ‘ye bağlı değildir ve aktinin aktif bölgesi, troponin I tarafından kapatılmıştır. Bu
durum, aktin-miyozin çapraz köprülerinin oluşmasına engel olur. Kas kasılması sırasında ise, kalsiyum, troponin C’ye bağlanır ve troponin kompleksinde konformasyonel değişiklik meydana gelir. Bu değişiklik, aktin üzerindeki aktif miyozin bağlanma bölgeleri üzerinde troponin I’nın inhibitör etkisini ortadan kaldırır. Böylelikle, miyozinin küresel baş bölgesi, aktin ile etkileşir. Kasılma için gerekli olan enerji, miyozine bağlı ATP’ den sağlanır. Miyozin başının hareketi, ince lifleri dolayısıyla Z bantlarını içeri doğru iter ve kasılma gerçekleşir. Kas kasıldığında, aktin-miyozin kompleksinden ADP salıverilir, aktin aktin-miyozinden ayrılır ve kas dinlenme durumuna döner24.
2.4. Konjestif Kalp Yetmezliği
Konjestif kalp yetmezliği, akciğer ve periferik dokularda sıvı birikimi nedeniyle konjesyona neden olan, kalbin pompalama fonksiyonundaki yetersizlik ile karakterize ve pek çok kardiyak hastalık sürecinin sonlanım noktasıdır 56.
Konjestif kalp yetmezliği, çeşitli semptomlar belirginleşmeden uzun zaman önce başlayan ilerleyici bir hastalıktır57. Konjestif kalp yetmezliğinin en sık rastlanan nedenleri arasında, iskemik kalp hastalıkları, hipertansiyon ve kapak hastalıkları yer almaktadır. Konjestif kalp yetmezliğinde görülen birincil bozukluk ise, kompansetuvar mekanizmaların aktivasyonuna neden olan- örneğin sempatik sinir sistemi aktivitesinde artış ve kontraktil fonksiyondaki bozulmadır57.
Kalp yetmezliği olan kişilerde, dolaşımdaki katekolamin konsantrasyonunun artmış olması, β reseptörlerin kronik olarak aktivasyonuna ve bu da, hücre içi Ca2+ tutulumunun (handling) değişimine, dolayısıyla, kontraktilitenin deprese olmasına neden olmaktadır57.
Konjestif kalp yetmezliğinin, sol ventrikül ve sağ ventrikül yetmezliği olmak üzere iki tipi bulunmaktadır.
2.4.1. Sol Ventrikül Yetmezliği
Etiyolojisine bakıldığında, başlıca dört neden ön plana çıkmaktadır:
1- Kalbin üzerindeki iş yükünün artması 2- Kalbin dolumunun sınırlanması 3- Miyosit kaybı
4- Azalmış miyokart kontraktilitesi
Kalp yetmezliği patofizyolojisinde hemodinamik, nörohumoral ve hücresel değişikliler rol oynar56.
Hemodinamik açıdan bakıldığında, kalp yetmezliği sistolik veya diyastolik fonksiyonun, bazen de her ikisinin kötüleşmesi ile ortaya çıkabilmektedir. Sistolik disfonksiyonda, kalp debisi (kardiyak output) azalır ve bu durumun düzeltilmesi için kalp üç kompansetuvar mekanizma geliştirir. İlk olarak, kalbe artmış venöz dönüş, sarkomerlerde artmış kontraksiyona neden olur ve atım hacmi (stroke
volume) artar. İkinci olarak, artmış olan katekolamin düzeyleri nedeniyle
kalp hızını artırarak kalp debisini artırır. Üçüncü olarak ise, kalp kası hipertrofiye uğrar. Eğer sistolik disfonksiyona neden olan ve altta yatan neden tedavi edilmezse, kalp yetmezliğe girer56.
Diyastolik disfonksiyon, ventrikülde gevşeme ve elastik çekilmede azalmaya veya sertlik artmasına neden olan durumlara bağlı olarak görülür. Hipertansiyon, sol ventrikül duvarında kalınlaşmaya neden olarak, bu üç parametrenin değişmesine ve dolayısıyla diyastolik disfonksiyona sebep olabilir56.
2.4.2. Sağ Ventrikül Yetmezliği
Sağ ventrikül yetmezliği, çeşitli nedenlere bağlı olarak gelişebilmektedir. Var olan sol ventrikül yetmezliği nedeniyle, sağ ventrikül üzerinde artmış olan arka yük, yetmezliğe neden olabilmektedir. Bunun dışında sağ ventrikül yetmezliği, pulmoner kapiler yatak harabiyeti ve pulmoner arterlerin hipoksiye bağlı vazokonstriksiyonu nedeniyle de ortaya çıkabilmektedir. Diğer taraftan, sağ ventrikül yetmezliği, inferiyor duvar miyokart infarktüsü sırasında gelişen sağ ventrikül iskemisi nedeniyle de meydana gelebilmektedir56.
2.4.3. Kalp Yetmezliğinin Temelinde Yatan Moleküler Mekanizmalar
Kalp yetmezliğinin temelinde yatan moleküler mekanizmalara bakıldığında, hücre içi Ca2+ tutulumundaki bozukluklar ve riyanodin reseptörlerinin disfonksiyonu dikkat çekmektedir. Sağlıklı bir kalpte, kardiyomiyositlerin kontraktil gücü, riyanodin reseptörleri aracılığıyla sarkoplazmik retikulumdan salıverilen kalsiyum akımının amplitüdüne bağlıdır. İntraselüler kalsiyum tutulumundaki değişiklikler, kalp yetmezliğindeki baskılanmış kontraktilite ve bozulmuş rezervde önemli role sahiptir. İnsan kalbinde, sistolik hücre içi kalsiyum amplitüdünde azalış, diyastolik hücre içi kalsiyum düzeylerinde artış ve diyastolik kalsiyum düzeylerinin azalışında yavaşlama meydana geldiği bildirilmiştir. Bunların yanı sıra, sarkoplazmik retikulumun kalsiyum içeriğinin azaldığı ve uyarı-kasılma çiftinin veriminin düştüğü bildirilmiştir57.
Yetmezlikli kalpte kalsiyum siklusunun bozulmasının, kalsiyum homeostazını sağlamakla görevli proteinlerin ekspresyonlarının ve fonksiyonlarının bozulması sonucu meydana geldiği gösterilmiştir. Örneğin, sarkoplazmik ve endoplazmik retikulum, Ca2+-ATPaz gen ekspresyonunun ve sarkoplazmik retikulum Ca2+ kanalının (RyR2) aşağı regülasyonu (down regulation), Na+-Ca2+ değiştiricisinin (exchanger) ekspresyonunun artmasının, kontraktilitenin bozulmasında rolü olduğu gösterilmiştir. Bunların dışında, kalsiyum tutulumunda görev alan proteinlerin ekspresyonları artmaksızın, işlevsel değişikliğe uğramasının da kalp yetmezliğinde rolü olduğu gösterilmiştir57.
Konjestif kalp yetmezliği, kronik hiperadrenerjik durumla karakterizedir. Adrenerjik reseptör aktivitesindeki sürekli artış, β reseptör ekspresyonunda ve kenetlenmesinde azalışa, β2 reseptör kenetlenmesinde düşüşe, inhibitör G proteininin (Gi) ekspresyonunda ve β reseptör kinaz ekspresyonlarında artışa, adenilat siklaz ekspresyonunda ve işlevinde azalışa neden olarak, β reseptör sinyal yolaklarında bozukluğa yol açar. Kalp yetmezliğinde gözlenen değişmiş β reseptör sinyalizasyonunun en önemli akışaşağı (downstream) etkileri, L-tipi kalsiyum kanallarının, Na+-Ca2+ değişitiricisinin ve kardiyak riyanodin reseptörlerinin hiperfosforilasyonu olarak gösterilmiştir57.
2.5. Konjestif Kalp Yetmezliği Tedavisi ve Pozitif İnotropik Ajanların Konjestif Kalp Yetmezliği Tedavisindeki Yeri
Konjestif kalp yetmezliği tedavisinde, vazodilatörler, anjiotensin dönüştürücü enzim (ADE) inhibitörleri ve aldosteron antagonistleri gibi ventrikül duvarındaki stresi azaltan veya renin-anjiotensin sistemini veya sempatik sinir sistemini inhibe eden (β adrenerjik antagonistler) ilaçlar patolojik ventriküler yeniden modellenmeyi (remodeling) azaltmaları, hastalığın ilerleyişini yavaşlatmaları ve sistolik disfoksiyondan kaynaklanan kalp yetmezliğinde mortaliteyi düşürmeleri nedeniyle kullanılmaktadır58.
Konjestif kalp yetmezliği tedavisindeki temel yaklaşımlar önyükün (preload) azaltılması, artyükün (afterload) azaltılması, inotropinin artırılmasıdır58.
2.5.1. Diüretikler
Konjestif kalp yetmezliğinde sodyum ve su tutulumuna bağlı olarak ekstraselüler sıvı hacmi artmıştır. Bunun bir sonucu olarak diyastol sonu hacim artar ve böylelikle de sol ventrikül atım hacmi korunur. Ancak, diyastol sonu hacmindeki bu artış, diyastol sonu dolum basıncında ve ventrikül boyutlarında artışa ve ventrikül duvarında oluşan stresin yükselmesine neden olur. Sonuç olarak, tüm bu değişiklikler pulmoner venöz konjesyona, periferal ödeme ve kalp debisinin artşına engel olur58.
Diüretikler, hücre dışı sıvı hacmini ve ventriküler dolum basıncını (ön yük) düşürürler. Kalp yetmezliği olan hastalarda, genellikle ön yükün düşürülmesi, beraberinde kalp debisinin düşüşünü getirmez; ancak, sürekli idrarla sodyum atılımı olan (natriürez) ve/veya hızlı damariçi hacim (intravascular volume) düşüşü olan hastalarda kalp debisinde azalma görülebilir. Böyle bir durumda, diüretik tedavisi, hacim azalışına bağlı olarak nörohumoral aktivasyonu artırabilir ve kalp yetmezliğinin ilerlemesine neden olabilir58.
Bu nedenlerden ötürü, asemptomatik sol ventrikül disfonksiyonu olan hastalarda, diüretiklerin dikkatli kullanılmaması ve hacim retansiyonu olan hastalarda ise hacmin düzeltilebileceği en düşük dozun kullanılması yoluna gidilmelidir58.
2.5.2. Aldosteron Antagonistleri
Konjestif kalp yetmezliğinin en belirgin özelliklerinden birisi, renin-anjiotensin-aldosteron sisteminin aktivasyonunun artmış olmasıdır. Kalp yetmezliği olan hastalarda, plazma aldosteron konsantrasyonlarının normal düzeyin 20 kat üzerine yükselebildiği gösterilmiştir58. Gerek anjiotensin II, gerekse aldosteron ADE inhibitörlerinin varlığında bile hücrelerarası ve kardiyak perivasküler fibrozu ve hücre dışı matriksi artırmaktır. Buna ek olarak, aldosteron, sodyumun renal retansiyonunu artırırken, potasyum ve magnezyum ise, daha yüksek oranda atılmasına ve baroreseptör disfonksiyonuna neden olur. Ayrıca, katekolaminlerin etkisini güçlendirir ve ventriküler aritmi oluşumu artırır59.
“Randomized Aldactone Evaluation Study (RALES, 1999)” çalışmasında, ciddi kalp yetmezliği ( sınıf III-IV) olan hastalar üzerinde, aldosteron antagonisti olan spironolaktonun baskılayıcı dozunun (25 mg/gün) etkileri incelenmiştir. Bu çalışmanın sonuçlarına göre, spironolaktonun 24 ay boyunca üçlü tedaviyle birlikte uygulanması sonucu, işlevsel gelişme sağlandığı, hastane yatışının düştüğü ve hayatta kalımın % 30 arttığı gösterilmiştir60. Bir diğer aldosteron antagonisti olan eplerenonun, miyokart infarktüsü ve kalp yetmezliği öyküsü olan hastalarda total mortalite oranını, kardiyovasküler mortaliteyi ve ani kardiyak ölümü ve kalp yetmezliğine bağlı hastane yatışını azalttığı gösterilmiştir (EPHESUS study- Eplerenone neurohormonal Efficacy and Survival Study, 2003)61.
2.5.3. Vazodilatörler
Nitrovazodilatörler, kalp yetmezliği tedavisinde uzun yıllardır kullanılmakta olan ilaçlardır. Bu ilaçlar, nitrik oksit (NO) açığa çıkararak ve çözünebilir (soluble) guanilat siklazı aktive ederek, damar düz kasında gevşeme oluştururlar58.
Kronik kalp yetmezliği olan hastalarda, izosorbit dinitratın egzersiz kapasitesini geliştirmede ve semptomları azaltmada plaseboya göre daha etkili olduğu gösterilmiştir58.
Hidralazin, pulmoner ve sistemik damar direncini düşürerek sağ ve sol ventrikülün arka yükünü azaltır. Böylelikle, atım
hacmi artar ve ventriküler sistolik duvar stresi azalır. Bunun dışında arka yükü azaltıcı etkisinin dışında, hidralazinin orta derecede direkt pozitif inotropik etkisi de bulunmaktadır. Hidralazin aynı zamanda renal damar direncini düşürür ve renal kan akımını, diğer ADE inhibitörleri dışındaki birçok vazodilatörden daha fazla artırır. Bu nedenle, hidralazin, ADE inhibitörlerini tolere edemeyen, renal disfonksiyonu ve kalp yetmezliği olan hastalarda yararlı olabilir58.
2.5.4. Natriüretik Peptitler
Natriüretik peptitler, [atriyal natriüretik peptit(ANP), beyin natriüretik peptit(BNP), ve C-tipi natriüretik peptit] potent natriüretik, diüretik ve vazodilatör etkileri olan, bir endojen nörohormon ailesidir58. BNP gerime bağlı olarak kardiyak miyositlerden salgılanır58 ve BNP’nin dolaşımdaki düzeyleri, kalp yetmezliğinin derecesi ile ilişkilidir58, 62. Kalp yetmezliğinin oluşumunda, BNP, vazodilatasyon, natriürez ve diürez oluşturarak anjiotensin ve noradrenalinin etkilerine ters etkiler meydana getirir58.
Nesiritit, BNP’nin rekombinant formudur. Yapılan klinik çalışmalarda, nesiritit ile tedavi edilen hastalarda, hemodinamik ve klinik gelişme olduğu bildirilmiştir62. Ayrıca nesiritidin, dobutaminden daha az aritmojenik olduğunu gösteren bir klinik çalışma da bulunmaktadır63
2.5.5. Renin-Anjiotensin Sistemini İnhibe Eden İlaçlar
Renin-anjiotensin sistemi, kalp yetmezliğinin patofizyolojisinde önemli role sahiptir. Anjiotensinojen, böbrek kaynaklı bir molekül olan renin tarafından, anjiotensin I’e dönüştürülürken, anjiotensin I, ADE tarafından, güçlü bir arteriyel vazokonstriktör ve sodyum-su tutulumu oluşturan bir mediyatör olan anjiotensin II’ ye dönüştürülür. Bu etkilerinin yanı sıra, anjiotensin II, nöral katekolamin salıverilmesini potansiyalize eder; adrenal medulladan katekolamin salgılanmasını artırır; aritmojeniktir; vasküler hiperplaziyi ve patolojik miyokardiyal hipertrofiyi tetikler ve miyosit ölümünü stimüle eder. Bu anlamda kalp yetmezliğinde anjiotensin II’nin etkilerinin antagonize edilmesi önemlidir58.
2.5.5.1.ADE İnhibitörleri
ADE inhibitörleri, anjiotensin II ve aldosteron yapımını baskılar; sempatik sinir sistemi aktivitesini düşürür ve diüretiklerin kalp yetmezliğindeki etkilerini potansiyalize eder. ADE inhibitörlerinin, kalp krizi veya kronik gelişimli ventriküler sistolik disfonksiyonu (kalp yetmezliği semptomları olan ya da olmayan) olan hastalarda mortalite ve morbiditeyi azalttığı gösterilmiştir (ilgili klinik çalışmalar-SAVE, TRACE, AIRE, CONSENSUS, VHEFT, SOLVD). Buna ek olarak, bu grup ilaçlar, asemptomatik hastalarda semptomlarının gelişmesini önlemiş ya da geciktirmiştir59.
ADE inhibitörleri ile uzun dönem tedavi sırasında, anjiotensin II düzeyleri alternatif yolakların (örn: kimaz) devreye girmesi nedeniyle fizyolojik olarak anlamlı seviyelere ulaşabilmektedir58, 62. Bu nedenle anjiotensinin etkilerinin reseptör düzeyinde bloke edilmesi gündeme gelmiştir.
2.5.5.2. Anjiotensin Reseptör Blokerleri
Anjiotensinin, kalp yetmezliğindeki zararlı etkileri de dahil olmak üzere, bilinen pek çok klinik etkisi, AT1 reseptörleri aracılığı ile oluşur. Kardiyovasküler sistemde varlığı gösterilen AT2 reseptörleri ise, uyarıldıklarında AT1 reseptörlerinin oluşturduğu etkilere ters etkiler oluşturur58.
Anjiotensin reseptör antagonistleri, ADE inhibitörlerinin yan etkileri nedeniyle kullanılamadığı durumlarda tercih edilebilen ajanlardır64. Akut miyokart infarktüsü nedeniyle, sol ventrikül disfonksiyonu olan ve/veya kalp yetmezliği gelişen 14.703 hastanın değerlendirildiği “Valsartan In Acute MyocArdial INfarction Trial (VALIANT, 2003)” isimli çalışmada, anjiotensin reseptör antagonisti valsartanın, ADE inhibitörü kaptopril ile tedavi kadar etkin olduğu gösterilmiştir. Benzer şekilde, “Evaluation of Losartan in the Elderly (ELITE II, 2000)”, “Optimal Trial in myocardial infarction with the angiotensin II antagonist Losartan (OPTIMAAL, 1999)”, “ValHeFT (2001)” çalışmalarında mortalitede kaptopril ile losartan arasında anlamlı bir fark gösterilmemiştir65, 66, 67, 68, 69.
Plasebo kontrollü randomize “Candesartan cilexitil in Heart failure Reduction in Mortality and morbidity (CHARM-alternative, 2003)” çalışmasında, anjiotensin reseptör antagonisti kandesartanın, kalp yetmezliğine bağlı hastane yatışını veya kardiyovasküler nedenlere bağlı ölümleri, sol ventikül disfonksiyonu olan hastalarda, plaseboya göre düşürdüğü gösterilmiştir70,71.
2.5.6. β- Adrenerjik Reseptör Antagonistleri
β-adrenerjik reseptör antagonistlerinin, konjestif kalp yetmezliği olan hastalarda, klinik sonuçları nasıl etkilediği henüz tam olarak aydınlatılamamış olmakla beraber, ani kardiyak ölüm insidansını kötücül ventriküler aritmileri azaltarak düşürdüğü düşünülmektedir58.
β-reseptör antagonistlerinin, sınıf II-III (hafif ve orta) kalp yetmezliği olan hastalarda, hayatta kalım üzerine yararlı etkileri olduğu gösterilmiştir72, 73, 74, 75,76. Bu yararlı etki, β1 reseptöre selektif metoprolol ve bisoprolol gibi ajanlarda olduğu kadar, selektif olmayan β adrenerjik reseptör antagonisti olan karvedilol için de, benzer şekilde gösterilmiştir. Karvediolol ve metoprolol aynı zamanda sınıf IV kalp yetmezliği olan hastalarda, hastane yatışını azaltmıştır77, 78. β2 reseptörlere daha selektif olan busindololün ise, hayatta kalıma yararlı bir etkisi olmadığı gösterilmiştir79.
2.5.7. Pozitif İnotropik Ajanlar
İnotropik ajanlar, kalp kontraktilitesini çoğunlukla hücre içi siklikAMP (sAMP) düzeylerini artırarak ve dolayısıyla, sarkoplazmik retikulumdan kalsiyum salıverilmesini indükleyerek artırır. Adenilat siklazın, β reseptörlerin uyarılması sonucu (örneğin dobutamin) veya sAMP’nin yıkımından sorumlu olan fosfodiesteraz III’ün selektif inhibisyonu, (örneğin, milrinon) sAMP artışına neden olur. Bunların dışında, pimobendan gibi, hem fosfodiesteraz inhibisyonu, hem de miyokardiyal liflerin kalsiyuma duyarlılığını artırarak, pozitif inotropi oluşturan ilaçlar da bulunmaktadır80.
Şekil 3: Pozitif İnotropik Mekanizmalar - 81 numaralı kaynaktan alınarak Türkçeleştirilmiştir.
2.5.7.1. β Reseptör Aktivasyonu
Memelilerde β1, β2 ve β3 olmak üzere üç adet β reseptör alt tipi tanımlanmıştır82. Her iki (β1, β2) alt tip de Gs-proteini aracılıklı olarak hücre içi sAMP düzeylerini artırarak, gerek in vitro, gerekse in vivo pozitif inotropik ve kronotropik etki oluşturur58. β1 ve β2 alt tiplerinin yanı sıra, β3 alt tipinin etkilerinin de, Gs aracılıklı olduğu bildirilmiştir. Her ne kadar her 3 reseptör alt tipi de, Gs aracılıklı ise de, bu reseptörlerin hücre içi sinyal ileti yolaklarının ve subselüler yerleşimlerinin farklılık gösterdiği bildirilmiştir58. Diğer taraftan, β3 reseptör agonistlerinin, insan ventriküler kasında Gi aracılıklı negatif inotropik etki oluşturduğu bildirilmiştir83
İnsan kalbinde β1 ve β2 bulunmakla beraber β1 alt tipinin predominant olduğu ve β1 / β2 oranının atriyumlarda % 70 / % 30 ve ventriküllerde, % 80 / % 20 olduğu bilinmektedir82. β3 reseptörlerin en yoğun olarak bulundukları bölgeler ise, beyaz ve kahverengi adipoz dokudur58. Ancak, β3 reseptörlere ait etkilerin ve β3 reseptör mRNA’ sının insan, kobay ve köpek kalbinde ve kardiomiyositlerinde bulunduğu, çeşitli araştırma grupları tarafından bildirilmiştir84.
Kardiyomiyositlerde, β reseptör stimülasyonu sonucu, pozitif inotropi, kronotropi, dromotropi ve miyosit büyümesi ve ölümünü kapsayan çeşitli biyolojik cevaplar gözlenir85. Atriyumlarda, hem β1, hem de β2 reseptörlerin uyarılması, kasılma gücünde maksimum artışa neden olur (in vitro izole doku). Diğer yandan, kalp hızını artırır (in vivo, sağlıklı deneklerde)82. Ventriküllerde ise, sadece β1 reseptörlerin uyarımı kasılma gücünde maksimum bir artışa neden olurken, β2 reseptörlerin uyarımı submaksimal artış sağlar82.
β1 reseptörlerin stimülasyonu sonrasında, adenilat siklaz stimülasyonu ve sAMP bağımlı protein kinaz aktivasyonu aracılığıyla gerçekleşen voltaja bağımlı kalsiyum kanal fosforilasyonu, bu kanalların açık kalış süresini uzatarak, hücre içi kalsiyum düzeylerinin artışına neden olur ve böylelikle sarkoplazmik retikulumdaki riyanodin reseptörlerini stimüle olmasına neden olarak, kontraksiyon için kalsiyum sunumunun artmasına neden olur. β1 reseptörlere bir agonistin bağlanması sonucu, Gs proteini stimüle olur ve guanozin difosfat (GDP) bağlı α ünitesi ayrlır ve GDP, guanozin trifosfat (GTP) ile yer değiştirir. αs-GTP kompleksi adenilat siklaza bağlanarak bu enzimi aktive eder. Aktive olan adenilat siklaz ATP’den sAMP sentezlenmesini sağlar ve PKA’yı aktive eder. PKA ise çeşitli hücresel yapıları fosforile ederek aktive olmalarını sağlar85.
Sarkoplazmik retikulum membranında bulunan ve Ca2+ ATPaz fonksiyonu ile ilişkili pentamerik bir protein olan fosfolambanın katkı sağladığı diğer fosforilasyon reaksiyonları da β2 reseptörlerince düzenlenmektedir. Fosfolamban fosforile olduğunda, sarkoplazmik kalsiyum pompasının üzerindeki inhibisyonu kaldırararak sitoplazmadaki kalsiyum düzeyinin düşmesine ve böylelikle sarkomerin gevşeme hızının artmasına (lusitropik etki) neden olur. Sarkoplazmik retikulumda sekestre edilen kalsiyum ise, daha sonraki kontraksiyonlarda kullanılır. β2 reseptörlerin agonist ile uyarımı sonucu, Gi veya Gq proteinleri aktive olur. Gi proteini aktive olduğunda, adenilat siklazı inhibe ederken, Gq proteini aktive olduğunda, fosfolipaz C’yi aktive eder. Fosfolipaz C ise, fosfotidilinozitol bifosfattan DAG ve inozitoltrifosfat oluşmasını sağlar. İnozitoltrifosfat, sarkoplazmik retikulumdaki inozitoltrifosfat reseptörlerine bağlanır ve sarkoplazmik retikulumdan sitoplazmaya kalsiyum salıverilmesine aracılık eder. Kalsiyum, kalmoduline bağlanarak sarkolemmadaki kalsiyum pompasını ve birçok kalmodulin bağımlı protein kinazları aktive eder. Bu sinyal ileti yolağı, fosfolambanın, Na+/Ca2+ değiştiricisinin ve ventriküler MHZ-2’nin, fosforilasyonuna neden olur. DAG ve kalmodulin birlikte, protein kinaz C’yi aktive ederler. Bu yolak da mitokondriyal ATP-aracılıklı K+ kanallarının ve MHZ-2’nin fosforilasyonuna aracılık eder85.
Dobutamin, β1 ve β2 adrenerjik reseptörleri uyararak, adenilat siklazın yukarı regülasyonuna (upregulation) neden olur ve böylelikle hücre içi kalsiyum konsantrasyonu artar. Kalpte, izoproterenolle karşılaştırıldığında, daha önemli inotropik ve kronotropik etkiler oluşturur. Düşük doz dobutamin, arka yükte (afterload) düşüşe neden olan hafif bir arteriyel vazodilatasyon oluştururken, daha yüksek dozlar, vazokonstriksiyona neden olur. Genel anlamda, ters etkilerine bakıldığında, kan basıncında artış veya azalış, kalp hızında artış, atriyal fibrilasyonlu hastalarda ventriküler cevap hızında artış ve miyokardın oksijen gereksiniminde artış sayılabilir86.
Dobutamin, sistolik disfonksiyonu ve kalp yetmezliği olan hastaların tedavisinde kullanılmaktadır. Ciddi klinik dekompansasyonunu olan hastalarda, dobutaminin birkaç gün sürekli infüzyonu, sıkça rastlanan bir uygulama olmakla beraber, daha uzun süreli uygulamalarda gelişen farmakolojik tolerans, etkinliği sınırlandırabilmektedir. Dobutaminin kan basıncı üzerine etkileri değişkendir ve bu ajanın, kalp debisi ve damar tonüsü üzerine olan göreceli etkilerine bağlıdır. Dobutaminin en belirgin yan etkileri, taşikardi ve aritmidir58.
Dobutamin ve nesiritidin proaritmik ve taşikardik etkilerini karşılaştırmak üzere akut kalp yetmezliği sendromu olan hastalardan 24 saat Holter kaydı alınan bir klinik çalışmanın (PRECEDENT çalışması, 2002) sonuçları, dobutaminin ortalama ventriküler taşikardi olaylarını, tekrarlanan ventriküler atımları, erken (prematür) ventriküler atımları ve kalp hızını artırdığını ancak, nesiritidin ventriküler ektopik atımları azalttığını ya da etkilemediğini göstermiştir87.
Dobutaminin kronik intravenöz infüzyonunun denendiği prospektif randomize kontrollü çalışmalar bulunmamaktadır. Ancak, “Flolan International Randomized Survival Trial (FIRST, 1999)” dan elde edilen verilerin retrospektif analizlerine dayanılarak randomizasyon zamanında kesintisiz dobutamin infüzyonunun 6 aylık mortalite oranında 2 kat artışa neden olduğu sonucuna varılmıştır88.
Dobutaminin kısa dönem infüzyonu ile ilgili geniş çaplı, prospektif randomize kontrollü çalışma bulunmamaktadır. Ancak küçük çaptaki çalışmalarda kısa dönem dobutamin infüzyonunun hemodinamik ve semptomatik yararlar sağladığı bildirilmiştir86.
Kronik dobutamin tedavisi, sıçanlarda miyozin ATPaz aktivitesini artırmaktdır89. Yine kronik dobutamin tedavisi, gerek kontrol gerekse miyokart infaktı oluşturulan konjestif kalp yetmezliği olan ve olmayan sıçanlarda miyozin ATPaz aktivitesini artırmıştır90. Geenen ve ark. (1997) yaptıkları bir çalışmada, aralıklı dobutamin uygulamasının (aralıklı beta reseptör stimülasyonunun) ve/veya kalp hızı artışının MAZ ekspresyonunun kalıbında değişime katkıda bulunduğu bildirilmiştir91.
Sıçan torasik aortunun, dobutamine cevaplılığının zamansal varyasyon gösterdiği ve bu ritmin endotel varlığı tarafından modifiye edildiği bildirilmiştir92.
2.5.7.2. Na+/K+-ATPaz İnhibisyonu
Na+/K+-ATPaz, sodyum pompası veya sodyum potasyum pompası olarak da adlandırılan ve tüm memeli hücrelerinin plazma membranında, iyon taşıyıcı olarak işlev gören bir transmembran enzimdir. Na+/K+-ATPaz’ın aktivasyonu ile, her bir seferde üç sodyum iyonu hücre dışına taşınırken, iki potasyum iyonu hücre içine alınır ve taşınma sırasında 1 ATP molekülü kullanılır. Yani bu pompa, hücre içi potasyum düzeyinin yüksek, sodyum düzeyinin ise düşük tutulmasını sağlar93.
Şekil 4: Na+/K+-ATPaz ile hücre içi iyon dengesinin kontrolü-94 numaralı kaynaktan alınarak Türkçeleştirilmiştir.
Na+/K+-ATPaz, iki alt üniteden oluşmaktadır. Bunlardan ilki, ATP ve ovabain için bağlanma bölgelerini taşıyan ve iyon bağımlı katalitik α altünitesi, ikincisi ise, α altünitesinin aktivitesini ve konformasyonel stabilitesini düzenleyen β altünitesidir. Bu alt ünitenin, enzimin sodyum ve potasyuma afinitesinin modülasyonunda rolü olabileceği düşünülmektedir. γ alt ünitesi olarak isimlendrilen üçüncü bir küçük polipeptit daha bulunmuştur. Bu polipeptit, dokuya özgü olarak αβ
dimerine bağlı bulunmaktadır ve Na+/K+-ATPaz için, işlevsel bir önemi olmasa da, düzenleyici rol oynadığı düşünülmektedir93.
Günümüzde bilindiği kadarıyla memelilerde, α alt ünitesini kodlayan 4 gen (α1-α4), β alt ünitesini kodlamakla görevli üç gen (β1-β3) bulunmaktadır95.
Na+/K+-ATPaz’ın tüm α ve β izoformları, sinir sisteminde eksprese edilmektedir. Bu izoformlardan α1, özellikle böbrekte yüksek oranda eksprese edilirken, α2 iskelet kasında, beyinde ve kalpte, α3 ise, en çok beyinde bulunmakla beraber kalpte de bulunmaktadır93.
Na+/K+-ATPaz aktivitesi, ATP’ye bağımlı olmasının yanı sıra, fosforilasyon durumu, endojen ovabain benzeri maddeler, dopamin gibi inhibitör veya noradrenalin gibi stimülatör nörotransmitterler, reaktif oksijen türleri gibi oksidatif stres ve membran yöresindeki iyonik dağılımlar tarafından düzenlenmektedir96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103.
Na+/K+-ATPaz’ın özellikle kardiyovasküler, nörolojik, renal ve metabolik hastalıkların patolojisinde rolü olduğu, en genel ifadeyle bu gibi patolojilerde, Na+/K+-ATPaz’ın aşağı regüle olduğu bildirilmiştir93.
“Sodyum pompası gecikme” teorisine göre tüm kardiyak glikozitler sarkolemmal Na+/K+-ATPaz’a spesifik olarak bağlanır ve bu enzimi inhibe eder. Glikozit enzime bağlanıp, inhibe ettiğinde, hücre içi sodyum artar ve bu artış Na+/Ca2+ değiştokuş sistemi aracılığı ile hücre içi serbest kalsiyum konsantrasyonunun artmasına neden olur. Sarkoplazmik retikulumun kalsiyum alımındaki artış ise, pozitif inotropinin oluşmasına neden olur. Sarkoplazmik retikulumun depolama kapasitesini aşan durumlarda ise, sitoplazmik kalsiyum düzeylerinde artış nedeniyle, aritmojenik etkiler başlar104.
Ovabain, hipotalamus ve adrenal bezden salıverilen steroid yapıda bir hormondur105. Ovabain ve diğer kalp glikozitlerinin Na+/K+-ATPaz’ı inhibe ettikleri bilinmektedir. Bu anlamda, ovabain Na+/K+-ATPaz’ı inhibe ederek, gerek sodyum homeostazının sağlanmasında rol oynayarak, gerekse damar, kalp ve tübüler geri emilim üzerine direkt etkiler oluşturarak hipertansiyon ve diğer kardiyovasküler bozuklukların patojenezinde etkili olur 106.
Na+/K+-ATPaz’ın tüm α izoformları, pek çok türde ovabainin düşük konsantrasyonları ile inhibe olur. Sıçan ve fare α1 izoformunun, ovabaine göreceli duyarlılığından, α alt ünitesinin ilk hücre dışı bölgesindeki iki amino asit sorumludur. Ovabaine duyarlı bir izoform olan fare α2 izoformu, 111. konumda lösin ve 122. konumda asparajin taşırken, ovabaine düşük afinitesi olan α1 izoformu, bu pozisyonlarda arjinin ve aspartik asit taşır107. Ovabainle indüklenen pozitif inotropide, α2 izoformu rol oynar ve kardiyak kontraktilitenin düzenlenmesinde, bu izoform önemli role sahiptir 108.
Amino asit dizilerinde yapılan değişiklikler sonucu, ovabaine duyarlı α1 ve ovabaine dirençli α2 izoform taşıyan farelerde yapılan çalışmalarda, duyarlı α1 izoformunun da, ovabainin düşük konsantrasyonları ile inhibe olduğu ve kalp kontraksiyonunda α2 izoformunun inhibisyonu ile gözlenene oranla, daha fazla arttığı bildirilmiştir109.
Yapılan araştırmalar sonucu, memelilerde kardiyak glikozit benzeri bileşiklerin endojen olarak bulunduğu ve bu bileşiklerin yükselen düzeylerinin kan basıncında artış ve konjestif kalp yetmezliği gelişimi ile ilişkili olduğu gösterilmiştir110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121. Normal koşullarda, çok düşük seviyelerde olan endojen ovabain düzeyleri, egzersiz, ACTH uygulaması, yüksek tuz alımı gibi stresi artıran koşullarda artmaktadır111, 122, 113, 116, 121, 123, 124, 125. Günlük ACTH uygulaması sonrası doğal tip (wild type) (α1R/R, α2S/S) farelerde, ikinci günden itibaren, kan basıncında artış gözlenirken (5. gün platoya ulaşmaktadır), α2 dirençli izoform taşıyan farelerde (α1R/R, α2R/R) kan basıncında bu artış gözlenmez. α1S/S ve α2R/R izoform taşıyan farelerde de, kan basıncı, ACTH uygulaması ile artış göstermektedir126.
İnsanlarda ise, gerek α1, gerekse α2 izoformları ovabaine duyarlıdır127.
Yetmezlikli insan kalbi, ovabaine, normal kalpten daha duyarlıdır. Shamraj ve ark. (1993) tarafından gerçekleştirilen bir çalışmada, bu etkinin en azından bir kısmının, Na+/K+-ATPaz konsantrasyonundaki düşüşten kaynaklanıyor olabileceği bildirilmiştir128.
5 haftalık ovabain tedavisi sonrası, Wistar sıçanlarda hipertansiyon gelişmiş olup miyokardiyal hipertrofi gözlenmemiştir. Sol ventrikül sistolik basıncı, maksimum pozitif ve negatif dp/dt artmıştır. Ayrıca MAZ protein ekspresyonu artmaksızın, miyozin ATPaz
aktivitesinde artış olmuştur. Na+/K+ ATPaz’ın iki α izoformunun (α1 ve α2) ekspresyonlarının da arttığı belirlenmiştir129.
Sprague-Dawley sıçanlar kullanılarak gerçekleştirilen bir başka çalışmada ise, ovabain ile 4 haftalık tedavi sonrası, sistolik kan basıncında anlamlı bir artış olmaksızın, sol ventrikül hipertrofisi, miyokardın ultra yapısında hasar ve hücre dışı matrikste yeniden yapılanma (remodeling) gözlendiği, kardiyak sistolik ve diyastolik performansın bozulduğu gösterilmiştir. Aynı zamanda, kardiyak β-MAZ mRNA’sı yukarı regüle olurken, α-MAZ mRNA’sının ise, aşağı regüle olduğu, 4. haftadan sonra ise, ortalama sistolik kan basıncının artmaya başladığı ve 6. haftadan sonra kontrole göre anlamlı olarak yüksek düzeylere ulaştığı, kalbin yapısı ve işlevinin kötüleştiği bildirilmişir106.
2.5.7.3. Fosfodiestaraz İnhibisyonu
Fosfodiesteraza ilişkin ilk ipuçları, 1800’lü yılların sonlarında astmalı bir hastanın, boş mideye bir fincan kahve içiminden sonra soluk vermede rahatlatıcı olduğunu bildirmesi ile elde edilmeye başlanmıştır. Kafeine bağlı bu etkinin mekanizması, o yıllarda bilinmese de, kafeinin nonselektif olarak fosfodiesterazı inhibe ettiği daha sonra gösterilmiştir. Böylece, teofilin gibi kafein analogları solunum yolu hastalıklarında kullanılmaya başlanmıştır. 1958 yılında Sunderland ve Rall isimli iki araştırmacı, karaciğer ekstraktlarında yaptıkları çalışmada ilk olarak belirlenen ve ısıya dayanıklı bir nükleotit olan sAMP’ yi, ikincil ulak olarak tanımlamışlardır. Bu çalışmadan 5 yıl sonra ikinci bir hücre içi ikincil ulak olan siklikGuanozin Monofosfat (sGMP) sıçan idrarında tanımlanmıştır. Aynı çalışmada, fosfodiesteraz, sAMP’yi inaktive eden enzim olarak gösterilmiştir. Yine bu çalışmada, magnezyum iyonlarının bu enzimi aktive ettiği, kafeinin ise aksine inhibe ettiği gösterilmiştir130.
Günümüzde, en az 60 farklı türü tanımlanmış, 11 fosfodiesteraz ailesi bilinmektedir. Bunların her birinin substrat spesifitesi, kinetik özellikleri ve doku dağılımları farklılık göstermektedir. Fosfodiesteraz enzimleri ikincil ulak olarak hücrede görev alan siklik nükleotitler nedeniyle, tüm hücresel fonksiyonların düzenlenmesinde rol oynar. Fosfodiesteraz enzimleri, sAMP ve sGMP’deki fosfodiester bağını hidroliz eder ve inhibisyonu halinde substratı olan siklik nükleotidin hücre içi konsantrasyonunda artış gözlenir131.
Fosfodiesteraz 3 (FDE3) sAMP’ye yüksek afinite göstermekle beraber sGMP’yi de hidroliz edebilmektedir. Gerek damar, gerekse solunum yollarında, yüksek oranda eksprese edilmesi nedeniyle, kardiyovasküler hastalıklar ve astma için, önemli bir terapötik hedef olarak tanımlanmıştır. Yapılan çalışmalarda, FDE3 inhibitörlerinin vasküler solunum yolu düz kaslarını gevşettiği, trombosit agregasyonunu inhibe ettiği ve lipolizi indüklediği gösterilmişse de, kronik kalp hastalıklarının tedavisinde, pozitif inotropik ajan olarak kullanımları ile ilgili çelişkili sonuçlar bulunmaktadır130. Milrinon gibi bazı FDE3 inhibitörleri, kalp yetmezliğinin tedavisinde kullanılmak üzere geliştirilmiştir. Ancak, milrinonla kronik tedavi sonucu mortalite riskinde artış bildirilmiştir132. Milrinon halen kalp yetmezliğinin akut tedavisinde kullanılmaktadır130.
2.5.7.4. Kalsiyuma Duyarlığın Artırılması
Bu gruba ait ajanlar, troponin-C’nin kalsiyuma afinitesini artırarak, troponin-C’nin kalsiyumla indüklenen konformasyonunu direkt olarak stabilize ederek veya troponin-C’den sonraki moleküllere etki ederek yetmezlikli kalpte doz bağımlı olarak kalsiyum duyarlığını artırırlar. Bu grup ilaçlar arasında levosimendan, pimobendan, senazodan, EMD-53998 ve enantiyomeri ED-57033 bulunmaktadır. Ancak, örneğin pimobendan, EMD-53998 ve senazodan gibi bazı ilaçlar, tedavi dozlarında fosfodiesteraz inhibisyonu da yaparlar ki, bu da, hücre içi kalsiyum düzeylerini artırarak, zararlı etkilerin ortaya çıkmasına neden olur. Bunun aksine, levosimendan yalnızca yüksek dozlarda fosfodiesterazı inhibe eder80.
2.6. Kardiyovasküler Sistemin Kronobiyolojisi ve Konjestif Kalp Yetmezliğinin Kronopatolojisi
2.6.1. Kronobiyolojinin Temel Kavramları
Organizmaya özgü tüm biyolojik fonksiyonların ve işlevlerinin zamana göre organize oldukları bilinmektedir. Bir günden kısa ritimler olabildiği gibi, günlük, aylık ve yıllık gibi ritim profilleri de bulunmaktadır133.
Milisaniyeden 20 saate kadar değişen periyotlara sahip ritimler, ultradiyan ritimler olarak adlandırılırken, günlük ritimlere
sirkadiyan ritimler denilmektedir. Bir hafta, bir ay ya da bir yıl kadar uzun periyotları olan ritimlere ise infradiyan ritimler adı verilmektedir133.
Biyolojik ritimler özgün olarak tanımlanmış karakteristikleri olan olaylardır: Bu bağlamda biyolojik ritimlerin dört temel karakteristiği bulunmaktadır. Bunlar; frekans, yerleşim parametresi, amplitüt ve mezor (bazal ortalama)’ dur133.
Periyot, tekrarlanan olaylar arasındaki zamanı ifade eder. Frekans ise, bir zaman biriminde oluşan siklus sayısı veya biyolojik ritmin tekrarlama sıklığı olarak tanımlanmaktadır133.
Yerleşim parametresi, belirli bir periyodisite içinde tepe-doruk ve çukur değerlerin ortaya çıkma zamanıdır133.
Amplitüd, tekrarlanabilen ritmik değişiklikler için öngörülen düzey farkı veya genlik olarak tanımlanmaktadır. Bir ritmin genliği ya da büyüklüğü endojen ve ekzojen faktörlerden etkilenme yatkınlığını belirler. Küçük genlik ritimlere, sağlıklı bireylerin vücut sıcaklığı, kan basıncı ve kalp hızı örnek olarak verilebilir. Öte yandan, plazma kortizolü, adrenalin ve lenfosit sayısı büyük genlikli ritimlerdir ve endojen veya çevresel faktörlerden daha fazla etkilenmektedir133.
2.6.2. Kardiyovasküler Sistemin Kronobiyolojisi
İnsanlarda ve birçok memeli türünde, gerek kardiyovasküler gerekse organizmanın bütünlüğünde var olan ritimlerin oluşumu çevresel tetikleyicilere bağlıdır. Bu çevresel tetikleyicileri şu şekilde özetlemek mümkündür:
1- Sırt üstü yatış (supin) ve doğrulma postürüne ilişkin erken aydınlık (sabah) periyodu değişiklikleri,
2- Fiziksel sabah eforu,
3- Diurnal aktivitenin başlamasıyla oluşan, iş başlangıcı ve diğer aktivitelere ilişkin ani mental ve emosyonel
yüklenme133.
Kardiyovasküler sistemde başlıca kalp hızı, kalbin elektriksel aktivitesi, kan basıncı, sempatoadrenal aktivite/parasempatik
tonüs değişiklikleri, renin-anjiotensin-aldosteron sistemi, kan parametreleri, koagülasyon ve periferik dolaşıma ilişkin ritimler gözlenmektedir5.
2.6.2.1. Kalp Hızı ile İlgili Ritimler:
Sağlıklı bireylerde, kalp hızının ve kan basıncının gün içinde arttığı ve gece boyunca düştüğü bilinmektedir. Yapılan çalışmalarda kan basıncı ve kalp hızındaki diurnal değişikliklerin nedenlerinin çok karmaşık olduğu ve bu değişikliklerde hem eksternal uyarıların hem de endojen homeostatik kontrol mekanizmalarının rol oynadığı ortaya konulmuştur3, 4. Gece vardiyasında çalışanlarda ise gündüz kalıbının tersi görülür, egzersiz ise kalp hızı ritimlerinde dalgalanma (fluctuation) meydana getirir133.
2.6.2.2. Kan Basıncı ile İlgili Ritimler:
Gerek normotansif ve gerekse esansiyel hipertansiyonu olan kişilerde, kan basıncı uyanmadan önce başlayan ancak uyanma ile artan, gün boyu yüksek seyreden ve akşam saatlerinde, takiben uyku periyodunda düşen bir trend izler133. Sistolik ve diyastolik kan basınçları gerek normotansif gerekse birçok hipertansif kişide 06:00-öğlesaati periyodunda %10-25 oranında yükselir134.
Normotansif ve esansiyel hipertansiyonu olan kişilerde görülen uyku periyodundaki kan basıncı çukur değerleri ACTH salgılanmasıyla da uyumlu profil göstermektedir133.
Otonom sinir sistemi, opioit sitem, hipotalamus-hipofiz-adrenal aksı, renin-anjiotensin-aldosteron sistemi ve vazoaktif peptitlerin ritimlerinin bozulduğu klinik durumlarda kan basıncının güniçi ritminin bozulduğu gösterilmiştir133.
Kardiyovasküler olaylardaki sirkadiyan varyasyon otonom sinir sistemi aktivitesindeki farkı da gösterir ki6, 7, iskemik hastalıklar,
diabetes mellitus ve inme gibi otonomik fonksiyonların bozulduğu bazı
patolojik durumlarda özellikle kalp hızı ve kan basıncı gibi kardiyovasküler bileşenlere ilişkin sirkadiyan ritmin de değiştiği veya ortadan kalktığı gösterilmiştir7, 8.
Çalışan kişilerde kalp krizinin haftanın diğer günleriyle karşılaştırıldığında pazartesi günleri %33 daha sık yaşandığı, bu artışın ise emeklilerde, yaşlı kişilerde (olasılıkla emekli) ve bilinen bir kalp hastalığı olan kişilerde gözlenmediği bildirilmiştir. Kalp krizinin sirkadiyan ritmi ile ilgili yapılan en geniş kapsamlı çalışma tüm dünyada yapılan toplam 29 araştırmada yer alan 83.929 hastayı kapsar. Bu çalışmaya göre, kalp krizi riski sabah 06:00 dan öğle saatine kadar olan periyotta % 40 daha yüksek bulunmuştur. Benzer olarak, 19 farklı çalışmada yer alan 19.390 ani kardiyak ölüm vakasının meta analizi sonucunda, riskin aynı zaman periyodunda % 29 daha yüksek olduğu bulunmuştur134.
2.6.2.3. Kalbin Elektriksel Aktivitesi ile İlgili Ritimler:
Sinüs düğümü işlevi, QT interval süresi ve R-T dalgaları voltaj değerleri gibi kalbin elektrofizyolojisine ilişkin sirkadiyan ritimleri bildiren çalışmalar bulunmaktadır133.
2.6.2.4. Sempatoadrenal/Parasempatik Tonüs Denge Değişiklikleri ile İlgili Ritimler:
Plazma ve idrar katekolamin (adrenalin ve noradrenalin) düzeylerinde uykudan kalkışla başlayan yükselme gün boyu pik seviyesinde kalır, akşam saatleriyle beraber azalıp, uyku döneminde çukur yapar. Parasempatik tonüs ise, sempatik sistemin aksine, gündüz düşer, gece ise artar133.
2.6.2.5. Renin-Anjiotensin-Aldosteron Sistemine İlişkin Ritimler:
Sirkadiyan aktivite periyodunun başlangıcında plazma renin, anjiotensin ve aldosteron düzeyleri yüksektir ve gün boyu zamana bağımlı değişiklikler göstermektedir133.
2.6.2.6. Kan Parametreleri ve Koagülasyona İlişkin Ritimler:
Kanın vizkozitesi, hemoglobin, hematokrit ve adrenalin veya ADP ile indüklenen trombosit agregasyonu gündüz saatlerinde yüksek, gece ise düşük seyreder133.
2.6.2.7. Periferik Dolaşıma İlişkin Ritimler:
Renal kan akımı gece düşüktür. Aksine bacak, serebral ve gastrointestinal damar yataklarında kan akımı gece yüksektir. Ön kol akımında α-adrenerjik reseptörlerin vazokonstriktör yanıt verirlikleri de sabah saatlerinde daha yüksektir133.
2.6.3. Konjestif Kalp Yetmezliğinin Kronopatolojisi
Kardiyovasküler hastalıklar yüzyılı aşkın süredir gelişmiş ülkelerdeki ölüm nedenleri arasında ilk sırada yer almaktadır. Literatürde kardiyovasküler hastalıkların ritmik bir paterni olduğuna dair birçok bulgu bulunmaktadır. Örneğin, kardiyovasküler ölümlere, iklimsel farkın diğer bölgelere göre daha az belirgin olduğu Los Angeles’ta bile aralık ve ocak aylarında, yaz mevsimine oranla % 33 daha sık rastlandığı bildirilmiştir. Gerek kardiyovasküler ve gerekse diğer nedenlere bağlı ölümlerin ayın son gününden bir sonraki ayın ilk gününe kadar % 15 arttığı belirlenmiştir134.
Bilindiği gibi kalp dokusunun mekanik özellikleri α ağır zincir homodimeri olan olan V1 ve β ağır zincir homodimeri olan V3’ün ekspresyon düzeyleri ile yakından ilişkilidir. Örneğin, primer olarak V1 izoformu taşıyan kalp kaslarının hem kasılma hızı14, 15, hem de kalsiyumla uyarılan miyofibriler ve aktomiyozin ATPaz aktiviteleri16, 17, 18 V3 taşıyanlardan daha yüksektir. Aksine V3 izoformu daha fazla güç oluşturma potansiyeline sahiptir19, 20. Yapılan çalışmalarda α-MAZ gen ekspresyonunun sirkadiyan21ve β-MAZ gen22 ekspresyonunun ise diurnal ritim gösterdiği ve kalp kontraktilitesinin güniçi ritminde rolü olabileceği bildirilmiştir. Young ve ark. (2001) Wistar sıçanlar kullanarak yaptıkları bu çalışmada, kardiyak performansın ve karanlık periyodun ortasında (18 HALO) anlamlı olarak yüksek olduğunu ve β-MAZ mRNA düzeylerinin karanlık periyodda artmış olduğunu göstermişlerdir22. Yazın aktif olan hamsterlarda (summer-active hamster), fosforile olabilen myozin hafif zincirin (MHZ-2) in vivo fosforilasyon düzeylerinin, kış uykusu sırasında daha düşük olduğu gösterilmiştir135
Hipertansiyon ve koroner kalp hastalıkları konjestif kalp yetmezliğinin gelişiminde en yaygın risk faktörleri arasında yer almaktadır. Yapılan çalışmalarda, kan basıncının sirkadiyan ritminin konjestif kalp yetmezliği olan hastalarda bozulmuş olduğu136, 137, 138, 139
bildirilmiş olmakla beraber, bunun tersini bildiren çalışmalar da bulunmaktadır140.
Akut miyokart infarktüsü sonrası konjestif kalp yetmezliği gelişme riskinin infarktın oluşma zamanına bağlı olarak değiştiği gösterilmiştir. Bu çalışmada, konjestif kalp yetmezliği ile sonuçlanan infarkt oluşum oranının sabah 06:00 ve 11:59 saatleri arasında en düşük olduğu bildirilmiştir141.
Plazma noradrenalin düzeylerinin sağlıklı kişilerde diurnal değişim gösterdiği bilinmektedir. Bleske ve ark. nın 1999 yılında yaptıkları çalışmada kalp yetmezliği olan hastalarda da sağlıklı kişilerle benzer olarak plazma noradrenalin düzeylerinin diurnal varyasyon gösterdiği, gün boyunca bu düzeylerin en yüksek seviyede, gece ise en düşük seviyede olduğu gösterilmiştir142. Ayrıca konjestif kalp yetmezliği olan hastalarda adrenalin ve noradrenalin atılımının fizyolojik sirkadiyan ritminin bozulduğu bildirilmiştir142.
İlerlemiş konjestif kalp yetmezliği olan hastalarda plazma ANP konsantrasyonları, daha az ilerlemiş konjestif kalp yetmezliği olan hastalara oranla yüksek bulunmuştur144. Ayrıca, ANP düzeylerindeki diurnal değişimin konjestif kalp yetmezliği olan hastalarda ortadan kalktığı gösterilmiştir144, 136.
Konjestif kalp yetmezliği olan hastalarda plazma aldosteron ve plazma renin aktivitesinin diurnal ritmi incelendiğinde 8 hastadan 7’sinde plazma aldosteron düzeyinin normal bireylerle benzer diurnal ritme sahip olduğu (sabah - en yüksek seviye, gece - en düşük seviye) ancak plazma renin aktivitesinin diurnal ritminin bir vaka dışında belirsiz olduğu bildirilmiştir145. Aynı araştırmacıların yaptıkları bir başka çalışmada ise konjestif kalp yetmezliği olan hastalarda aldosteronun diurnal ritminin kontrolünde adrenokortikotropik hormonun önemli role sahip olduğu gösterilmiştir146.
Allegra ve ark.nın (2001) yaptığı bir çalışmada, konjestif kalp yetmezliği olan hastaların acil servise başvuru sıklıklarının yıl, hafta ve gün içindeki dağılımlarını değerlendirilmiştir. Bu çalışmanın sonucuna göre, konjestif kalp yetmezliği olan hastalar kış aylarında (en sık aralık ayında) acil servise daha yüksek oranda başvurmuşlardır. Ayrıca, pazartesi günleri haftanın diğer günleriyle karşılaştırıldığında daha sık
başvuru olduğu ve gün içinde sabah saat 08:00’dan sonra ciddi bir artış olduğu ve bunun öğleden sonra ise azaldığı gösterilmiştir147.
Kardiyak glikozitlerden olan strofantin ve korglikonun koroner kalp hastası kişilere uygulanması sonrası, hemodinamik değişikliklerin strofantin için sabah, korglikon için ise, öğleden sonra uygulandığında belirgin olduğu gösterilmiştir148. Ayrıca, digoksinin sağlıklı bireylerde ve konjestif kalp yetmezliği olan hastalarda gece uykusu sırasında diyastolik kan basıncını anlamlı olarak düşürdüğü gösterilmiştir149, 150. Ancak, sistolik kan basıncı konjestif kalp yetmezliği olan hastalarda, gece uykusu sırasında artarken150, sağlıklı bireylerde artış gözlenmemiştir149
3. GEREÇ ve YÖNTEM 3.1. Gereçler
3.1.1. Kullanılan Deney Hayvanları
Deneylerde, 250-300 g ağırlığında Wistar sıçanlar kullanılmıştır. Deney hayvanları, 12 saat aydınlık 12 saat karanlık olacak şekilde senkronize edilmiştir (07:00-19:00), gündüz deneyleri aydınlık periyodun orta noktası olan 6 HALO’ da gerçekleştirilmiştir. Gece deneyleri için, deney hayvanları ters senkronize edilmiştir ve deneyler karanlık periyodun orta noktası olan 18 HALO’ da gerçekleştirilmiştir. Hayvanlar pellet halinde standart sıçan yemi ile beslenmiş ve musluk suyu verilmiştir.
3.1.2. Kullanılan Kimyasal Maddeler
Biyoesey çalışması
Ovabain oktahidrat (Sigma) Dobutamin HCl (Tocris) Protein miktar tayini Bisinkoninik asit (Sigma) Sığır serum albumini (Sigma) Bakır sülfat
Western Blot Analizi Tris-HCl (BIORAD) Gliserol
SDS (Sodyum Dodesil Sülfat) (BIORAD) Bromofenol mavisi (Sigma)
Dithiothreitol (DTT)
%30 Akrilamid/Bis (BIORAD) Amonyum persülfat (Amresco)
Tetrametil Etilen Daimin (TEMED) (Amresco) Metanol (Carlo Erba)
Nitroselüloz membran (BIORAD) Yağsız süt tozu (Pınar)
ECL (Amersham) X-Ray Film (AGFA)
Sabitleyici (Fixer) (KODAK)
3.1.3. Kullanılan Cihazlar
Hassas terazi (Shimadzu)
Mikropipet (Eppendorff Research) Vortex (Firlabo)
Ultrasonik homojenizatör (SONICS) Soğutmalı Santrifüj (NÜVE)
Su banyosu (NÜVE)
Plak okuyucu (Molecular Devices-Versamax Tunable Microplate Reader-Seri no: Bn02636)
Çalkalayıcı (IKA)
Elektroforez cihazı (BIO-RAD Mini-PROTEAN) Blotlama cihazı (BIORAD)
Güç kaynağı (BIORAD PowerPac UNIVERSAL) Langendorff cihazı (MAY LS06-Seri no:3006-005) MP 35 veri kayıt sistemi (Biopac systems,INC) Sirkülatör (MAY WBC 3044V3) 3.1.4 Kullanılan Tamponlar Krebs-Henseleit Çözeltisi NaCl 118,0 mM KCl 4,5 mM KH2PO4 4,4 mM MgSO4 1,2 mM NaHCO3 25 mM CaCl2 1,4 mM Glukoz 11 mM Homojenizasyon Tamponu TRIS-HCl 50mM NaCl 400mM EGTA 2mM EDTA 1mM DTT 1mM
Roche® proteaz kokteyli 0.5 tablet/50ml NaF 1mM Örnek Tamponu 1 M TRIS-HCl 2.25 ml/10 ml Gliserol 5 ml/10 ml SDS 0.5 g/10 ml Bromofenol mavisi 5 mg/10 ml 1 M DTT 2.5 ml/10 ml Elektroforez Tamponu 10X Yürütme Tamponu Tris Baz 250mM Glisin 2 M SDS % 0.1
pH= 8.3 ayarlanıp deney günü 1:10 oranında seyretilmiştir.
Transblot Tamponu
10X Yürütme tamponu 1X Metanol % 20 distile su (dH2O)
pH= 8.3 ayarlanmıştır.
Membran Yıkama Çözeltisi
Tris-buffer Saline (TBS)
Tris Baz 25 mM
NaCl 37 mM
Bloklama Çözeltisi Yağsız süt tozu 5 g TBS-T 100 ml Jel Kompozisyonu Üst Jel: Akrilamit % 10 Tris tamponu (pH 8.8) 62mM SDS % 0.1 dH2O Amonyum persülfat % 0.08 TEMED 5-6 μl Alt Jel: Akrilamit (% 30) 3,3 ml/10 ml Tris tamponu (1,5 M) (pH 6.8) 2,5 ml/10 ml SDS (% 10) 0,1 ml/10 ml dH2O 4 ml/10 ml Amonyum persülfat (% 10) 0,05 ml/10 ml TEMED 0,004 ml/10 ml
3.2. Yöntem
3.2.1. Kalpte İnotropik Aktiviteye + İnotropik Etkili Ajanların Etkilerinin Değerlendirilmesi
Deneyler 250-300 g ağırlığında Wistar albino sıçanlar kullanılarak gerçeleştirilmiştir. Deney hayvanları 50 mg/kg tiyopental sodyum ile intraperitoneal olarak anesteziye edildikten sonra toraks hızlı bir şekilde açılarak kalp çıkartılmış ve buzlu Krebs-Henseleit çözeltisinin içerisine alınmıştır. Daha sonra izole kalp, yine hızlı bir şekilde sabit akışlı Langendorff cihazına aorttan asılarak retrograd olarak Krebs-Henseleit çözeltisi ile perfüze edilmiş (9 ± 0,5 ml) ve sol ventrikül basıncı kalbin sol ventrikülüne yerleştirilen bir lateks balon yardımıyla ölçülmüştür. Sol ventrikül diyastolik basıncı 5-10 mmHg basınca ayarlanmıştır.
Deneyler 6 HALO ve 18 HALO olmak üzere günün 2 farklı saatinde gerçekleştirilmiştir. HALO= Hours After Lights On.
Deneyler sırasında perfüzyon basıncı ve sol ventrikül sistolik ve diyastolik basıncı eş zamanlı olarak veri kayıt sistemi (MP 35 Biopac Systems,INC) yardımıyla kaydedilmiştir. Sol ventrikül gelişen basıncı (LVDP; left ventricular developed pressure); ventriküler sistolik basınç-ventriküler diyastolik basınç formülü ile hesaplamıştır. Deney sonunda kalp hızı, +dP/dt (kontraksiyon hızını ifade etmektedir, inotropizm indeksi olarak kullanılmaktadır)151 ve –dP/dt (gevşeme indeksi olarak kullanılmaktadır)151 hesaplanmıştır.
20 dakika dengelenme periyodundan sonra, izole kalpler her bir deney grubu için, , Krebs-Henseleit çözeltisi içerisinde ovabain için 10-7,10-6,10-5 ve 10-4 M konsantrasyonda, dobutamin için 10-6,10-5 ve 10-4 M konsantrasyonda olacak şekilde hazırlanmış olan pozitif inotropik ajanlar ile 10 dakika perfüze edildikten sonra perfüzyon kesilmiş ve kalp Langendorff cihazından çıkarılmalarını takiben, ventriküller basınç uygulanarak ezilmiş ve çabuk bir şekilde sıvı azot içerisinde havan eli vasıtasıyla toz edilmiştir. Örnekler, –800 C’de protein ekspresyonu ve aktivasyonu deneylerine kadar saklanmıştır.
3.2.2. Protein Ekspresyon ve Aktivasyonlarının Belirlenmesi
Protein ekspresyon ve aktivasyonlarının belirlenmesinde Western Blot tekniği kullanılmıştır. Dokular, ultrasonikatörle homojenize edildikten sonra, bisinkoninik asit yöntemine göre, spektrofotometrik olarak total protein miktar tayini yapılmıştır.
3.2.2.1. Doku Homojenizasyonu ve Protein Miktar Tayini
100-150 mg toz edilmiş doku örneği üzerine, homojenizasyon tamponu eklenmiştir. Daha sonra dokular, ultrasonik homojenizatörde 20 saniye süreyle ve 2 kez homojenize edilmiştir. 2 siklus arasında 10 saniye bekleme süresi uygulamıştır. Tüm homojenizasyon işlemi boyunca buz üzerinde çalışılmıştır. Daha sonra homojenize edilmiş doku bulunan Eppendorflar 40C 10.000 g’de 10 dakika santrifüj edilmiştir. Santrifüj işleminden sonra süpernatantlar, farklı Eppendorflara paylaştırılmış ve Western Blot analizinin yapılacağı güne dek –800 C’de saklanmıştır.
Protein miktar tayininde bisinkoninik asit yöntemi kullanılmıştır. 1/20 oranında dilüe edilen doku homojenatları, her bir kuyucuğa 10 μl olacak şekilde 3’er kez yüklenmiş ve sonrasında üzerlerine 200 μl bisinkoninik asit / % 4 bakır sülfat karışımı eklenmiştir. Plak, 370 C’de 30 dakika su banyosunda bekletildikten sonra, 562 nm’de spektrofotmetrede okutulmuştur. Standartlara karşı okunan değerlerden hareketle protein miktarları (μg/μl) hesaplanmıştır.
3.2.2.2. Western Blot Analizi
Örnekler, 5X (5:1 = örnek / örnek tamponu (h/h)) örnek tamponu kullanılarak, yüklenecek herbir örnek için eşit hacim içerisinde eşit miktar protein olacak şekilde hazırlanmıştır. Eppendorflar içerisinde hazırlanan örnekler 5 dakika kaynar suda bekletildikten sonra buz üzerine alınmıştır.
Örnekler, hazırlanmış olan % 10’luk SDS poliakrilamit jellere herbir doku örneğinden total protein miktarı eşit olacak şekilde yüklenmiştir. Örnekler, proteinlerin molekül ağırlıklarının farklı oluş esasına göre (120 volt) ayrılmaları sağlanacak şekilde, jel üzerinde elektroforezle yürütülmüştür.
Daha sonraki aşamada, proteinlerin jel üzerindeki sürüklenmesi, bantlar halinde ve molekül ağırlıklarına göre ayrılma prensibine dayalı olarak tamamlanmış ve ıslak transfer ile nitroselüloz membrana aktarılmıştır. Özetle, 2 cam arasından çıkarılan jeller, daha önceden +4o C’de soğutulan ve geniş bir kaba alınan transfer tamponunun içerisine alınmıştır. Blotlama kasetlerinin üzerine transfer tamponu ile ıslatılmış pedler yerleştirildikten sonra, önce distile su daha sonra aynı tamponla ıslatılmış olan nitroselüloz membran yerleştirilmiş ve son olarak jel ve jelin üzerine ıslatılmış ped yerleştirilerek kaset kapatılmıştır. Kasetler tankın içerisine yerleştirildikten sonra 110 mA’lik akım uygulaması ile 1,5 saat süreyle blotlama yapılmıştır. Transferin ve yüklemenin başarısı Ponceau S boyası uygulanarak test edilmiştir. Membranlar Ponceau S boyasından arındırıldıktan sonra, % 5’lik yağsız süt tozu (TBS-T içerisinde) çözeltisi ile, 1 saat oda ısısında çalkalayıcı üzerinde bloklama işlemine tabi tutulmuş ve membranlar 3 kere 10 dakika TBS-T ile yıkanmıştır. Fosfoprotein tayini yapılan gruplarda, bloklama çözeltisi olarak % 3’lük sığır serum albumini (TBS-T içerisinde) çözeltisi kullanılmıştır. Gerek homojenizasyon, gerekse inkübasyon aşamalarında fosfataz inhibitörü olarak NaF ilave edilmiştir.
Bloklama sonrası yıkama aşamasından sonra, membranlar o deney grubu için kullanılan bloklama çözeltisi içerisinde hazırlanan primer antikor ile muamele edilmiş ve yine 3 kere 10 dakika TBS-T ile yıkanmıştır.
Son olarak, membranlar uygun sekonder antikor ile muamele edildikten sonra, TBS-T ile yıkanmış ve görüntüleme aşamasına geçilmiştir.
Görüntüleme için, membranlar kurumamasına dikkat edilerek 5 dakika boyunca ECL (amersham) görüntüleme solüsyonu ile muamele edildikten sonra ince transparan film tabakası ile kaplanmış ve daha sonra, karanlık ortamda üzerine röntgen filmi kapatılarak kemiluminesans ışıması ile film üzerinde ilgili proteine ait bantların meydana gelmesi sağlanmıştır. Film önce geliştirici (developer) daha sonra sabitleyici (fixer) solüsyonlarla, daha sonra ise, distile suyla muamele edilmiştir.
Elde edilen filmler, tarayıcı vasıtası ile bilgisayar ortamına aktarılarak, proteine ait bantların optik dansiteleri hesaplanmış (Scion Image) ve deney grupları arasındaki fark belirlenerek karşılaştırılmıştır.
Tablo 1. MHZ, p-MHZ ve Pan aktin ekspresyonlarının belirlenmesi için uygulanan Western Blot Protokolu Prote in Jel Elektroforez T ran sfer
Bloklama Primer Antikor Se
konde r Antikor Görünt üle m e MHZ-1 % 10 120 Volt 110 mA 1.5 saat % 5 Süt tozu MHZ-1 mouse monoclonal IgG 1/ 500 Novus Biologicals (ab-679) goat anti mouse HRP-Congugated 1/1000 (Santa Cruz) (sc-2005) ECL (Amersham) MHZ-2 % 10 120 Volt 110 mA 1.5 saat % 5 Süt tozu MHZ-2 goat polyclonal IgG 1/ 500 (Santa Cruz) (sc-9449) donkey antigoat HRP-Congugated 1/1000 (Santa Cruz) (sc-2020) ECL (Amersham) p-MHZ % 10 120 Volt 110 mA 1.5 saat % 3 sığır serum albumini p-MHZ rabbit polyclonal IgG 1/ 500 (Santa Cruz) (sc12896R) goat anti rabbit HRP-Congugated 1/1000 (Santa Cruz) (sc-2004) ECL (Amersham) Aktin % 10 120 Volt 110 mA 1.5 saat % 5 Süt tozu Pan Aktin mouse monoclonal IgG 1/ 5000 (NeoMarkers) MS-1295-P goat anti mouse HRP-Congugated 1/1000 (Santa Cruz) (sc-2005) ECL (Amersham)
MHZ: Miyozin Hafif Zincir p-MHZ: fosfoMHZ
3.2.3. İstatistiksel Analiz
Tüm gruplarda elde edilen sol ventrikül gelişen basınç değerleri, +dP/dt, -dP/dt ve kalp hızı parametreleri, Δ değer (İlaç Uygulaması Öncesi Ölçülen Bazal Değer-İlaç Uygulaması Sonrası Ölçülen Değer) olarak hesaplanarak, ortalama ± ortalamaların standart hatası şeklinde ifade edilmiştir.
Bazal sol ventrikül basınç değerleri arasındaki fark tek yönlü varyans (ANOVA) testi ile karşılaştırılmıştır. Gündüz ve gece gruplarının Δ sol ventrikül gelişen basınç değerleri, Δ +dP/dt, Δ -dP/dt, Δ kalp hızı değerleri ve protein ekspresyon düzeyleri ortalamalar arası farkın t testi kullanılarak karşılaştırılmıştır. P<0,05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir. İlaçların konsantrasyon-Δ sol ventrikül gelişen basınç ilişkisi nonlineer regresyon ile değerlendirilmiştir.
