GİRİŞ
Lipazlar suda çözünmeyen trigliseritleri, di ve mono-açilgliseridle-re, serbest yağ asitlerine ve gliserole hidrolizini katalizleyen enzimlerdir [1,2]. Lipazlar, enzim sınıflandırmasında hidrolazlar (E.C.3), ester bağla-rını parçalayanlar (E.C.3. 1), karboksilik ester hidrolazlar (E.C.3.1.1) ve triaçilgliserol lipazlar (E.C.3.1.1.3) içinde yer almaktadırlar [3]. Lipazlar; geniş spektrumdaki substratları kullanabilme kabiliyetleri [4], lipit bile-şenlerinin sentezinde veya hidrolizinde yüksek regio ve enantiyoselektivif aktiviteye sahip olmaları ve bunlara ek olarak geniş ortam şartları altında stabil kalabilmeleri nedeniyle önemlidirler [5].
Lipazlar, hem sulu hem de susuz solvent sistemlerinde aktivite gös-terdikleri için [6,7], endüstride ve tıp alanında önemli bir yere sahiptirler [8]. Bu enzimlerin lipid içeren atık suların enzimatik degradasyonu, or-ganik sentez, deterjan formülasyonu, biyosürfektanların sentezi, oleo-kimyasal endüstri, süt endüstrisi, agrooleo-kimyasal endüstri, kağıt yapımı, besin, kozmetik, kimyasal analiz ve ilaç prosesinde umut verici uygula-ma alanları bulunuygula-maktadır. Lipaz teknolojisindeki gelişmelerle birlikte yeni bileşiklerin sentezi için de bu enzimlerin kullanımları hızla artmak-tadır [9,10]. Mikrobiyal lipazların, biyosensör olarak kullanılmaları ise yeni bir alan olarak ümit vaat etmektedir [11].
Lipazlar hayvan, bitki ve mikroorganizma kökenli olabilirler [12,13]. Doğada yaygın olarak bulunmalarına rağmen [14,15] sadece mikrobiyal lipazlar ticari öneme sahiptirler [16]. Ticari olarak kulanılabilen lipazlar, genellikle mikroorganizmalardaki geniş çeşitlilikteki ekstraselüler lipaz-lardır [10]. Mikroorganizmalar, substrat spesifitesi, reaksiyon hızı, termal stabilitesi, optimum pH’sı vb çeşitliliklere sahip geniş spektrumda lipaz üretirler [17]. Mikrobiyal lipazların yüksek biyoteknolojik potansiyelleri; organik solventlerde stabil olmaları, kofaktöre gereksinim duymamaları, geniş substrat spesifitesine sahip olmaları ve yüksek enantiyoselektivite göstermelerinden kaynaklanmaktadır [18].
Lipaz üreten mikroorganizmalar; bakteri, maya ve küflerdir [10]. Biyoteknolojik uygulamalarda ve organik kimyada en çok tercih edilen lipazlar bakteriyel ve fungal orjinli olanlardır [6].
Lipaz üreten mikroorganizmalar, endüstriyel atıklar [19,20], bitkisel yağ işleme fabrikaları, süt ürünleri [21,22], yağlarla kontamine olmuş topraklar başta olmak üzere değişik topraklar [12,23,24], yağ içeren tohumlar [25], çürümüş gıdalar [19], kompost yığınları [26], kömür madenleri [27] sıcak su kaynakları [28-30] gibi çeşitli habitatlarda bu-lunabilmektedirler. Süt yağı ve zeytinyağı gibi lipitler, lipaz üretimini uyarmaları nedeniyle [31,32] lipaz aktivitesi gösteren mikroorganizma-lar için iyi bir habitattır. Dolayısıyla bu mikroorganizmamikroorganizma-ların izole edile-bileceği uygun bir vasat niteliği taşır. Lipazlar genel olarak, bir organik
Toprak ve Süt Kökenli Gram Pozitif Bakterilerde Lipaz Üretimi
Nurdan SARAÇ1 Rukiye BORAN2 Gülten ÖKMEN2 Aysel UĞUR2*
1Muğla Üniversitesi, Sağlık Hizmetleri Meslek Yüksekokulu, Tıbbi Laboratuar Programı, 48700, Marmaris/Muğla, TÜRKİYE 2Muğla Üniversitesi, Fen Edebiyat Fakültesi, Biyoloji Bölümü, 48170, Kötekli/ Muğla, TÜRKİYE
Sorumlu Yazar Geliş Tarihi: 14 Mayıs 2008
e-posta: ayselugur@hotmail.com Kabul Tarihi: 26 Ağustos 2008 Özet
Bu çalışmada; zeytin bahçeleri ve zeytinyağı fabrikası civarındaki topraklardan, çiğ ve pastörize süt örneklerinden Tributyrin Agar besiyeri kullanılarak, lipolitik aktiviteye sahip bakteriler izole edilmiştir. Bu izolatların Gram reaksiyonları belirlenerek Gram pozitif özellik gösterenler lipaz aktiviteleri belirlenmek üzere seçilmiş ve identifi ye edilmiştir.
Toprak örneklerinden elde edilen 20 izolatın 14’ünün düzensiz, sporsuz, hareketsiz Gram pozitif basil olduğu, 3’ünün Bacillus, 2’sinin Staphylococcus ve 1’inin Micrococcus cinsine ait türler olduğu; süt örneklerinden elde edilen 18 izolatın 7’sinin düzensiz, sporsuz, hareketsiz Gram pozitif basil olduğu, 7’sinin Staphylococcus, 2’sinin Bacillus, 1’inin Listeria ve 1’inin Streptococcus cinsine ait olduğu belirlenmiştir.
Suşların lipolitik aktiviteleri, Tributyrin Agar besiyerinde zon oluşturmalarının yanı sıra Rhodamine B Agar besiyeri kullanılarak hem görünür hem de UV ışık altında kalitatif olarak belirlenmiştir. Ardından p-nitrophenyl-palmitat’ın substrat olarak kullanıldığı spektrofotometrik yöntemle suşların tamamının lipaz aktiviteleri kantitatif olarak belirlenmiştir. Topraktan izole edilen 9 suş lipaz aktivitesi göstermezken, 11 suşun lipaz aktivitesinin 2 U/ml ile 581. 5 U/ml arasında olduğu tespit edilmiştir. Bu suşların içinde en yüksek lipaz aktivitesinin Staphylococcus sp. NS 02-1’e ait olduğu görülmüştür. Sütten izole edilen suşların ise 7’si lipaz aktivitesi göstermezken, 11 suşun lipaz aktivitesinin 1.6 U/ml ile 564.6 U/ml arasında olduğu saptanmıştır. Bu suşlar içerisinde en yüksek aktivitenin Staphylococcus sp. RB 07-2’ye ait olduğu görülmüştür.
Anahtar Kelimeler: Lipaz, bakteri, süt, toprak.
Bu çalışma; 23-27 Haziran 2008 tarihleri arasında Trabzon’da düzenlenen 19. Ulusal Biyoloji Kongresi’nde Sözlü Bildiri olarak sunulmuştur.
The Lipase Production of The Gram Positive Bacteria From Soil and Milk Origin
Abstract
The bacteria used in this study, with lipolytic activity, were isolated from the soils, collected from around the olive orchards and olive oil factory, and from raw and pasteurized milk, using Tributyrin Agar media. The Gram reactions of the isolates were determined and the gram positive isolates were selected and identifi ed to determine the lipase activity.
In addition the Tributyrin Agar media, the lipolytic activity of the strains were determined under visible and U.V. light using Rhodamine-B Agar media. The quantitative lipase activity of all gram positive bacteria were determined with the spectrophotometric method using p- nitrophenyl- palmitate as a substrate. In 9 isolates from soils did not show lipase activity. The lipase activity of the other isolates were determined between 2 U/ml and 581.5 U/ml. The maximum lipase activity showed in Staphylococcus sp. NS 02-1. In 7 isolates from milk did not show lipase activity. The lipase activity of the other isolates were determined between 1.6 U/ml and 564.6 U/ml. The maximum lipase activity showed in Staphylococcus sp. RB 07-2.
Key words: Lipase, bacteria, milk, soil.
azot kaynağı varlığında ve yağlar, yağ asitleri, gliserol veya tweenler gibi lipidik karbon kaynağının bulunması halinde üre-tilmektedirler [6].
Son yıllarda, artan teknoloji ile birlikte enzimlere olan ilgi yoğun bir artış göstermektedir. Bu enzimler içerisinde lipazlar yukarıda bahsedilen geniş kullanım alanları nedeniyle endüstri-yel uygulamalar açısından önemli bir enzim grubudur. Bakteri-lerden özellikle Gram negatiflerle ilgili çok sayıda lipaz çalış-ması mevcuttur. Gram negatif bakterilerden Pseudomonas cinsi bakteriler iyi lipaz üreticisi olarak bilinirler. Gram pozitif bak-terilerin özellikle Bacillus ve Staphylococcus cinsi bakteriler ile ilgili lipaz çalışmaları bilinmektedir. Bu çalışmada özellikle süt ve toprak kökenli Gram pozitif bakterilerde lipaz üretiminin araştırılması amaçlanmıştır.
Bu çalışmada, lipaz üretimine sahip Gram pozitif bakterilerin izolasyonu için zeytinyağıyla kontamine olmuş toprak ile çiğ ve pastörize süt kaynakları seçilmiştir. Elde edilen izolatlar tanım-lanmış, kalitatif ve kantitatif lipaz aktiviteleri belirlenmiştir.
MATERYAL VE YÖNTEM
Lipolitik aktivite gösteren Gram pozitif bakterilerin izolasyonu
Bu çalışmada, 5 çiğ süt ve 11 UHT ile pastörize edilmiş süt örneği kullanılmıştır. Bu süt örnekleri Ocak- Mart 2007 tarih-leri arasında Muğla’dan toplanmış ve steril 200 ml’ lik şişelere alınmıştır. Laboratuvara getirilen süt örnekleri +4 ºC’ de buzdo-labında muhafaza edilmiştir. Lipolitik bakterilerin izolasyonu amacıyla + 4 ºC’ de bekletilen 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 12, 14 günlük çiğ süt örnekleri; 4, 5, 8, 9, 14, 15, 17, 19, 22 günlük pastörize süt örnekleri ve toprak örnekleri tüp dilüsyon yöntemi kullanı-larak dilüe edilmiştir. Dilüsyonlardan 0.1 ml alınarak Tribut-yrin Agar besiyerine yayma ekim tekniği ile inokülasyonlar yapılmıştır. Plaklar 30 ºC’ de 3-5 gün inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sürecinde etrafında şeffaf zon oluşan kolonilerin lipolitik aktivitesi pozitif olarak değerlendirilmiş [33] ve bu koloniler alınarak saflık kontrolleri yapıldıktan sonra %20’lik gliserolde -20 ºC’ de muhafaza edilmiştir.
İzolatların kalitatif lipolitik aktiviteleri ayrıca %2.5 zey-tinyağı ilave edilerek hazırlanan Rhodamine B Agar Besiye-ri kullanılarak da belirlenmiştir. Bu besiyeBesiye-rine izolatlar çizgi ekim yapıldıktan sonra plaklar 30 ºC’ de 48 saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon süresi sonunda besiyerinde görünür ışıkta kırmızı renkli koloni oluşturan ve U.V. transilluminatörde (UVP, LMS-203 model) 365 nm’ de, kolonilerin etrafında tu-runcu haleler oluşturan izolatların lipolitik aktivitesi teyit edil-miştir [13,17,23,34,35].
İzolatların Gram boyanma özelliklerinin belirlenmesi İzolatların saf kültürlerinden Nutrient Agar besiyerine inokülas-yon yapılarak 30 ºC’ de 24 saat inkübe edilmiştir. İnkübasyon sonun-da bu petrilerdeki kolonilerden örnekler alınarak Gram boyamaları yapılmış ve mikroskop altında incelenmiştir.
Lipolitik aktivite gösteren Gram pozitif izolatların identifi kasyonu
Gram boyama sonucu Gram pozitif olduğu belirlenen izo-latlar ile çalışmaya devam edilmiştir. Bu izoizo-latlar için katalaz ve oksidaz testleri yapılmıştır. Ayrıca Gram pozitif basillerin
identifikasyonu için bu testlere ilaveten spor boyama ve hare-ket testi, Gram pozitif koklara ise koagülaz testi ve novobiocin duyarlılık testi, RB 02- 2 izolatına hemoliz testi yapılmıştır.
Kantitatif ekstraselüler lipaz aktivitesinin belirlenmesi İzolatların ekstraselüler lipaz aktiviteleri, p-nitrofenil palmitat’ın (pNPP, Sigma N2752) substrat olarak kullanıldığı spektrofotometrik yöntemle 410 nm dalga boyunda ölçüm yapıla-rak belirlenmiştir. Bu ölçüm temel olayapıla-rak p-nitrofenil esterlerinin enzimatik hidrolizi sonucunda meydana gelen p-nitrofenol’ün 410 nm’de kolorimetrik olarak tespit edilmesine dayanmaktadır [36].
Lipolitik aktivitesi belirlenen izolatlar Nutrient Broth (NB)’da 30 ºC’ de 27 saat inkübe edilmiştir. İnkübasyon sü-resinin belirlenmesinde izolatların en yüksek lipaz aktivitesi gösterdiği zaman dilimi olan geç logaritmik faz seçilmiştir. İn-kübasyondan sonra kültürler 10000 rpm’ de 10 dk +4 ºC’ de soğutmalı santrifüjde (Thermo-IEC) santrifüj edilerek süper-natant elde edilmiştir. Süpersüper-natant ekstraselüler enzim kaynağı olarak kullanılmış ve lipaz aktivitesi spektrofotometrik olarak belirlenmiştir. Substrat solüsyonu iki ayrı solüsyonun hazır-lanıp karıştırılması ile elde edilmiştir. 1. solüsyon için 30 mg
pNPP (Sigma) 10 ml izopropil alkol (Merck)’de çözülmüştür.
2. solüsyon için de 0.1 g Arabic Gum (Merck), 0.4 ml Triton X-100 ve 90 ml Tris-HCl (50 mM, pH 8.0) kullanılmıştır. Elde edilen solüsyonlar karıştırılmıştır. Solüsyon 2 saat stabil kala-bildiği için [37] kullanım öncesinde taze olarak hazırlanmış-tır. Substrat solüsyonundan 9 ml alınarak 1 ml süpernatant ile karıştırılmış ve 30 ºC’ de 30 dakika 130 rpm’ de çalkalamalı inkübatörde inkübe edilmiştir.
İnkübasyon periyodu sonunda ekstraselüler lipaz aktivitesi spektrofotometrik olarak 410 nm dalga boyunda ölçülmüştür. Bir lipaz ünitesi (U), dakikada 1 μmol p-nitrofenol açığa çıka-ran enzim miktarı olarak tanımlanmıştır.
BULGULAR
Kasım- Mart 2007 tarihleri arasında zeytinden yağ elde etme döneminde zeytinyağı fabrikalarının civarında prinaların bulun-durulduğu topraklar ile zeytinlerin toplandığı dönemdeki zeytin-lik altı topraklarından 12 toprak örneği toplanmıştır. Araştırmada, toprak örneklerinden hazırlanan 10-3- 10-5 arası dilüsyonlardan Tributyrin Agar besiyerine inokülasyonlar yapılmış ve inkübasyon sürecinde şeffaf zon gösteren 99 adet koloni izole edilmiş ve saflık kontrolleri yapılmıştır.
Araştırmada ayrıca bozulmakta olan çiğ süt ve UHT ile pas-törize edilmiş süt örneklerinden, bakteriyel üremenin görülme-ye başlandığı günden itibaren 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 12, 14 günlük çiğ süt örneklerinden ve 4, 5, 8, 9, 14, 15, 17, 19, 22 günlük pastörize süt örneklerinden hazırlanan 10-3-10-7 arası dilüsyon-lardan Tributyrin Agar besiyerine inokülasyonlar yapılmış in-kübasyon sürecinde şeffaf zon gösteren 103 koloni seçilmiş ve saflık kontrolleri yapılmıştır.
İzolatların kalitatif lipolitik aktivitelerinin belirlenmesinde ayrıca Rhodamine- B Agar besiyeri kullanılmıştır ve koloni-lerin bu besiyerinde 365 nm altındaki ışımaları gözlenmiştir. Toprak örneklerinden Tributyrin Agar besiyerinden izole edilen 99 ve süt örneklerinden yine aynı besiyerinden izole edilen 103 bakterinin lipolitik aktiviteleri Rhodamine-B Agar besiyerinde de pozitif olarak belirlenmiştir.
Çizelge 3. İzolatların lipaz aktiviteleri Toprak İzolatları Lipaz (U/ml) Süt İzolatları Lipaz (U/ml) NS 01-7 - RB 02-1 2.2 NS 01-8 - RB 04-1 7.8 NS 01-12 - RB 05-1 1.6 NS 01-13 - RB 06-4 5.2 NS 01-14 - RB 06-6 -NS 02-1 581.5 RB 06-9 -NS 02-7 7.00 RB 06-11 4.00 NS02-8 53.00 RB 06-12 -NS 02-11 - RB 06-16 6.2 NS 02-16 21.3 RB 07-11 24.3 NS 02-18 2.00 RB 02-2 4.5 NS 02-25 3.3 RB 02-17 15.00 NS 05-5 7.66 RB 02-19 -NS 05-8 13.3 RB 02-20 164.3 NS 05-10 - RB 02-21 -NS 06-4 3.00 RB 02-22 -NS 06-5 - RB 06-17 -NS 08-2 21.00 RB 07-2 564.6 NS-P-02B-6 27.7 NS-P-02C-1 Çizelge 1. To prak izolatlar Õn Õn kökenleri, m orfolojileri ve ç eú itli biyo ki m yasal özellikleri Kodu Kö ke ni Morfoloji Katalaz Ok si da z Spor Harek et Koagülaz NV30 Cins NS 01-7 Zeytinlik alt Õ Streptobasil + - - - NT NT * NS 01-8 Zeytinlik alt Õ Düz basil + - - - NT NT * NS 01-12 Zey tinlik alt Õ Streptobasil + - - - NT NT * NS 01-13 Zey tinlik alt Õ Düz basil + + - - NT NT * NS 01-14 Zey tinlik alt Õ Streptobasil + - - - NT NT * NS 02-1 Prinal Õ toprak Stafilokok + - NT NT - Dirençli Staphyloc occus NS 02-7 Prinal Õ toprak Streptobasil + - - - NT NT * NS02-8 Prinal Õ toprak Streptobasil + - - - NT NT * NS 02-11 Prinal Õ toprak Düz basil + - - - NT NT * NS 02-16 Prinal Õ toprak Kok + - NT NT - Duyarl Õ Micrococcus NS 02-18 Prinal Õ toprak Düz basil + - - - NT NT * NS 02-25 Prinal Õ toprak Streptobasil + - - - NT NT * NS 05-5 Zeytinlik alt Õ Streptobasil + - - - NT NT * NS 05-8 Zeytinlik alt Õ Düz basil + - + NT NT NT Bacillus NS 05-10 Zey tinlik alt Õ Düz basil + - - - NT NT * NS 06-4 Zeytinlik alt Õ Düz basil + + + NT NT NT Bacillus NS 06-5 Zeytinlik alt Õ Streptobasil + - - - NT NT * NS 08-2 Karasulu toprak Düz basil + - + NT NT Bacillus NS-P-02B-6 Prinal Õ toprak Kok + - NT NT - Dirençli Staphyloc occus NS-P-02C-1 Prinal Õ toprak Kokobasil + + - - NT NT * NV30: novobi yo sin duy arl Õl Õk tes
ti; *: düzensiz, sporsuz, hareketsiz
Gra m pozitif basil; (+ ): pozitif; (-): n egatif; NT: Test e dil m edi Çizelge 2. Sü t izolatlar Õn Õn kökenleri, m orfolojileri ve çe úitli bi yoki myasal özellikle ri Kodu Kö ke ni Morfoloji Katalaz Ok sida z Sp or Harek et K oagülaz NV30 He m oliz Cins RB 02-1 7 günlü k çi ÷ süt Düz basil + - - - NT NT NT * RB 04-1 2 günlü k çi ÷ süt Düz basil + - - + NT NT NT Listeria RB 05-1 22 günl ük UHT süt Düz basil + - - - NT NT NT * RB 06-4 4 günlü k çi ÷ süt Düz basil + - - - NT NT NT * RB 06-6 4 günlü k çi ÷ süt Düz basil + - - - NT NT NT * RB 06-9 5 günlü k çi ÷ süt Düz basil + - - - NT NT NT * RB 06-11 5 günlü k çi ÷ süt Düz basil + - - - NT NT NT * RB 06-12 4 günlü k çi ÷ süt Düz basil + - - - NT NT NT * RB 06-16 4 günlü k çi ÷ süt Düz basil + - + NT NT NT NT Bacillus RB 07-11 17 günl ük UHT süt Düz basil + - + NT NT NT NT Bacillus RB 02-2 7 günlü k çi ÷ süt Kok - - NT NT NT NT Alf a he m ol iz Streptococcus RB 02-17 4 günlü k çi ÷ süt Kok + + NT NT + Duyarl Õ NT Staphyloc occus RB 02-19 4 günlü k çi ÷ süt Stafilokok + - NT NT - Duy arl Õ NT Staphyloc occus RB 02-20 3 günlü k çi ÷ süt Kok + + NT NT - Duyarl Õ NT Staphyloc occus RB 02-21 3 günlü k çi ÷ süt Kok + + NT NT - Duyarl Õ NT Staphyloc occus RB 02-22 3 günlü k çi ÷ süt Kok + + NT NT - Duyarl Õ NT Staphyloc occus RB 06-17 4 günlü k çi ÷ süt Kok + - NT NT + Duyarl Õ NT Staphyloc occus RB 07-2 15 günl ük UHT süt Kok + - NT NT - Dirençli NT Staphyloc occus NV30: novob iy osin duy arl Õl Õk te
sti; *: düzensiz, sporsuz, hareketsiz
Gra m pozitif basil; (+ ): pozitif; (-): n egatif; NT: Test e dil m edi
Tributyrin Agar ve Rhodamine-B Agar besiyerlerinde li-politik aktivite gösteren bakterilere gram boyama yapılmış ve gram boyamanın sonucunda toprak kökenli izolatların 20 tane-sinin (% 20.2), süt kökenli izolatların ise 18 tanetane-sinin (% 17.5) Gram pozitif oldukları belirlenmiştir. Çalışmaya Gram pozitif bakterilerle devam edilmiştir. Tüm izolatlara katalaz ve oksidaz testleri yapılmıştır. Daha sonra basillere spor boyama ve hare-ket testleri, koklara ise koagülaz testi ve novobiosin duyarlılık testi yapılmıştır. Süt izolatlarından katalaz negatif reaksiyon veren RB 02-2 izolatına bu testlere ilave olarak hemoliz testi yapılmıştır.
İzolatların identifikasyonu sonucunda toprak izolatları-nın 14’ünün düzensiz, sporsuz, hareketsiz Gram pozitif basil, 3’ünün Bacillus, 2’sinin Staphylococcus ve 1’inin Micrococcus cinsine ait olduğu; süt izolatlarının ise 7’sinin düzensiz, spor-suz, hareketsiz Gram pozitif basil, 7’sinin Staphylococcus, 2’si-nin Bacillus, 1’i2’si-nin Listeria ve 1’i2’si-nin Streptococcus cinsine ait olduğu belirlenmiştir. İzolatların kökenleri, morfolojileri ve çe-şitli biyokimyasal özellikleri Tablo 1 ve 2’de gösterilmektedir. İzolatların ekstraselüler lipaz aktiviteleri pNPP’ın substrat olarak kullanıldığı spektrofotometrik yöntemle 410 nm dalga boyunda ölçüm yapılarak belirlenmiştir. Toprak izolatlarının li-paz aktiviteleri 2 U/ml ile 581. 5 U/ml arasında ölçülmüş ve en yüksek lipaz aktivitesi Staphylococcus sp. NS 02-1’de belirlen-miştir. Süt izolatlarının lipaz aktiviteleri ise 1.6 U/ml ile 564.6 U/ml arasında ölçülmüş ve en yüksek aktivitesi Staphylococcus sp. RB 07-2’de belirlenmiştir. Kalitatif olarak lipolitik aktivite-leri belirlenmesine rağmen toprak izolatlarının 9 tanesinde (% 45), süt izolatlarının ise 7 tanesinde (% 39) lipaz aktivitesi gö-rülmemiştir (Tablo 3 ve 4).
TARTIŞMA VE SONUÇ
Bu çalışmada zeytinyağı ile kontamine olmuş çeşitli top-rak örnekleri ile çiğ ve UHT süt örneklerinden lipaz aktivitesi gösteren Gram pozitif bakteriler izole edilmiştir. Bakteriyel li-pazların üretiminde, karbon kaynağı olarak yağ ya da herhangi bir lipidik substratın (yağ asidi esterleri, yağ asitleri, gliserol) varlığının lipaz üretimini stimüle ettiği bilinmektedir [6]. Bu iki kaynağın lipaz üretiminde izolasyon için seçilmiş olması her iki ortamda da mevcut olan trigliseritlerin bu stimülan niteliğinden kaynaklanmaktadır. Lipaz üreten mikroorganizmaların yağlar-la kontamine olmuş toprakyağlar-larda [12,23,24] ve süt ürünlerinde [21,22] yaygın olarak bulundukları belirtilmektedir. Bu neden-le bu çalışmada izolasyon için zeytinyağı ineden-le kontamine olmuş toprak ve süt tercih edilmiştir.
Toprak ve süt örneklerinden Tributyrin Agar besiyerine inokülasyonlar yapılmış ve inkübasyonu sürecinde etrafında şeffaf zon oluşturan koloniler izole edilmiştir. Tributyrin Agar besiyerinin içeriğinde % 1 oranında tributyrin bulunmaktadır. Tributyrinin bakteriler tarafından degredasyonu sonucunda et-rafında şeffaf zon oluşturan kolonilerin lipolitik aktiviteleri po-zitif olarak kabul edilmektedir. Birçok çalışmada kalitatif lipaz aktivitesinin belirlenmesi amacıyla Tributyrin Agar yaygın bir kullanıma sahiptir [35,38-41]. Ancak lipaz aktivitesi özellikle yüksek karbon zinciri uzunluğuna sahip yağ asitlerine spesi-fiktir [42-44]. Kısa zincirli yağ asitleri ise esterazlar tarafından hidrolize edilmektedirler [45]. Bu bilgiler ışığında 4 C’lu yağ asidi zincirine sahip olan tributyrinin lipaz aktivitesinden ziyade
esteraz aktivitesini gösteren bir substrat olduğu görülmektedir. Bu çalışmada Tributyrin agar besiyerinde toprak örneklerinden 99 ve süt örneklerinden 103 bakteri izole edilmiştir.
Tributyrinin lipaz aktivitesinden ziyade esteraz aktivitesini gösteren bir substrat olması nedeniyle lipolitik aktivitenin belir-lenmesinde ayrıca Rhodamine-B Agar besiyeri kullanılmıştır. Bu besiyerinin içeriğinde % 2.5 oranında zeytinyağı ve Rho-damine B (Merck, 1.07599) boyası (1mg/ml) bulunmaktadır. Besiyerinin içeriğinde yer alan Rhodamine, serbest yağ asitle-riyle floresan bir kompleks oluşturmaktadır. Böylece lipolitik aktiviteye sahip bakteri kolonileri U.V. ışık altında floresan haleler göstermektedir [13,17,23,34,35]. Tributyrin Agar be-siyerinde lipolitik aktivitesi pozitif olarak belirlenen izolatlar Rhodamine- B Agar besiyerine ekilmiş ve inkübasyon sonun-da tüm izolatların U.V. ışık altınsonun-da turuncu ışımalar yaptıkları gözlenmiştir.
Çalışmada, çeşitli biyokimyasal testlerle izolatlar identifiye edilmiştir [46]. Bu testlerin sonucunda toprak izolatlarının 6 ta-nesi, süt izolatlarının 11 tanesi cins düzeyinde tanımlanmıştır. Diğer izolatların ise düzensiz, sporsuz, hareketsiz Gram pozitif basil grubunda yer aldıkları belirlenmiştir.
Tributyrin ve Rhodamine-B Agar besiyerlerinde lipolitik aktiviteleri pozitif olarak belirlenen Gram pozitif bakterilerin ekstraselüler lipaz aktiviteleri pNPP’ın substrat olarak kullanıl-dığı spektrofotometrik yöntemle belirlenmiştir. Bu ölçüm temel olarak p-nitrofenol esterlerinin enzimatik hidrolizi sonucunda meydana gelen p-nitrofenol’ ün 410 nm’de kolorimetrik olarak tespit edilmesine dayanmaktadır [35,36].
Toprak izolatlarının 9 tanesi lipaz aktivitesi göstermezken 11 tanesinin lipaz aktivitesi 2 U/ml ile 581. 5 U/ml arasında bulunmuştur. Toprak izolatları içerisinde en yüksek lipaz akti-vitesi Koagülaz Negatif Staphylococcus sp. NS 02-1’de görül-müştür. Bu bakterinin zeytinyağı fabrikası civarındaki prinayla karışmış topraklardan izole edilmiş olması dikkat çekicidir.
Süt izolatlarının ise 7 tanesinde lipaz aktivitesi görülmez-ken 11 tanesinin lipaz aktivitelerinin 1.6 U/ml ile 564.6 U/ml arasında değiştiği görülmüştür. Süt izolatları içerisinde en yük-sek lipaz aktivitesi Koagülaz Negatif Staphylococcus sp. RB 07-2 suşunda görülmüştür. Bu bakteri 15 günlük UHT ile pas-törize edilmiş süt örneğinden izole edilmiştir.
Toprak ve süt kökenli izolatların kantitatif lipaz aktivitele-rine bakıldığında toprak izolatlarının 9, süt izolatlarının 7 ta-nesinde lipaz aktivitesi görülmemiştir. Bu izolatlar Tributyrin ve Rhodamine- B Agar besiyerlerinde lipolitik aktivite göster-melerine rağmen spektrofotometrik yöntemle lipaz aktivitesi belirlenmemiştir.
Toprak ve süt izolatlarının lipaz aktiviteleri incelendiğin-de her iki kökenincelendiğin-de incelendiğin-de en yüksek lipaz aktivitesinin koagülaz negatif Staphylococcus sp.’de olduğu görülmektedir ve her iki izolatın lipaz aktiviteleri birbirine yakın değer göstermektedir.
Staphylococcus xylosus ile ilgili bir çalışmada 20 saatlik
inkü-basyon sonunda lipaz aktivitesi 25-30 U/ml olarak belirlenmiş-tir [47]. Staphylococus simulans ile yapılan diğer bir çalışmada 25 saatlik inkübasyon sonunda lipaz aktivitesi 50 U/ml olarak ölçülmüştür [48]. Yine Staphylococcus aureus ile yapılan bir çalışmada 30 saatlik inkübasyon sonundaki enzim aktivitesi 30 U/ml olarak belirlenmiştir [49]. Çalışmamızda ise NS 02- 1 ve
RB 07- 2 izolatlarının 27 saatlik inkübasyon sonundaki lipaz aktiviteleri 581.5 U/ml ve 564.6 U/ml olarak ölçülmüştür.
DÜZELTME
Bu çalışma, 19. Ulusal Biyoloji Kongresi’nde Sözlü Bildiri olarak sunulmuştur. Ancak Bildiri Özeti Kitabı’nda kitabın ba-sımından sonra fark edilen bir yazım yanlışlığı bulunmaktadır. Bildiri kitabında yer alan: “Topraktan izole edilen 9 suş lipaz aktivitesi göstermezken, 11 suşun lipaz aktivitesinin 0.02 U/ml ile 5.815 U/ml arasında olduğu tespit edilmiştir” ifadesi “Top-raktan izole edilen 9 suş lipaz aktivitesi göstermezken, 11 suşun lipaz aktivitesinin 2 U/ml ile 581.5 U/ml arasında olduğu tespit edilmiştir” şeklinde ve “Sütten izole edilen suşların ise 7’si li-paz aktivitesi göstermezken, 11 suşun lili-paz aktivitesinin 0.016 U/ml ile 5.646 U/ml arasında olduğu saptanmıştır” ifadesi “Süt-ten izole edilen suşların ise 7’si lipaz aktivitesi göstermezken, 11 suşun lipaz aktivitesinin 1.6 U/ml ile 564.6 U/ml arasında olduğu saptanmıştır” şeklinde düzeltilmiştir.
KAYNAKLAR
[1] Kojima Y, Kobayashi M, Shimizu S., 2003. A Novel Lipase from Pseudomonas fl uorescens HU380: Gene Cloning, Overproduction, Renaturation- Activation, Two- Step Purifi cation, and Characterization. Journal of Bioscience and Bioengineering, 96 (3): 242-249.
[2] Angkawidjaja C, Kanaya S., 2006. Family I.3 lipase: bacterial lipases secreted by the type I secretion system. Cellular and Molecular Life Sciences, 63: 2804–2817. [3] Anonim. Enzyme Nomenclature, Nomenclature
committee of the international union of biochemistry and molecular biology (NC-IUBMB), California, 1992. [4] Pandey A, Benjamin S, Soccol CR, Nigam P, Krieger
N, Soccol UT., 1999. The realm of microbial lipases in biotechnology. Biotechnology and Applied Biochemistry, 29: 119- 131.
[5] Karadzic I, Masui A, Zivkovic LI, Fujiwara N 2006., Purifi cation and Characterization of an Alkaline Lipase from Pseudomonas aeruginosa Isolated from Putrid Mineral Cutting Oil as Component of Metalworking Fluid. Journal of Bioscience and Bioengineering, 102 (2): 82- 89.
[6] Gupta R, Gupta N, Rathi P., 2004. Bacterial lipases: an overview of production, purifi cation and biochemical properties. Applied Microbiology and Biotechnology, 64: 763- 781.
[7] Nie K, Xie F, Wang F, Tan T., 2006. Lipase catalyzed methanolysis to produce biodiesel: Optimization of the biodiesel production. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 43 (1- 4): 142- 147.
[8] Bjokling F, Godtfredsen SE, Kirk O., 1991. The future impact of industrial lipases. Trends in Biotechnology, 9: 360- 363.
[9] Ghosh PK, Saxena RK, Gupta R, Yadav RP, Davidson S., 1996. Microbial lipases: production and applications. Science Progress, 79 (2): 119- 157.
[10] Sharma R, Chisti Y, Banerjee UC., 2001. Production, purifi cation, characterization, and applications of lipases. Biotechnology Advances, 19: 627- 662.
[11] Vakhlu J, Kour A., 2006. Yeast lipases: enzyme purifi cation, biochemical properties and gene cloning. Electronic Journal of Biotechnology, 9 (1).
[12] Gao XG, Cao SG, Zhang KC., 2000. Production, properties and application to nonaqueous enzymatic catalysis of lipase from a newly isolated Pseudomonas strain. Enzyme and Microbial Technology, 27: 74- 82. [13] Kojima Y, Shimizu S., 2003. Purifi cation and
Characterization of the Lipase from Pseudomonas
fl uorescens HU380. J. Bioscience and Bioengineering, 96
(3): 219-226.
[14] Klibanov AM., 1997. Why are enzymes less active in organic solvents than in water? Trends in Biotechnology, 15: 97–101.
[15] Klibanov AM., 2001. Improving enzymes by using them in organic solvents, Nature, 409: 241–246.
[16] Saxena RK, Sheoran A, Giri B, Davidson WS., 2003. Purifi cation strategies for microbial lipases. Journal of Microbiological Methods, 52: 1-18.
[17] Lee SY, Rhee JS., 1993. Production and partial purifi cation of a lipase from Pseudomonas putida 3SK. Enzyme and Microbial Technology, 15: 617- 623.
[18] Jaeger K-E, Reetz MT., 1998. Microbial lipases form versatile tools for biotechnology. TIBTECH, 16: 396- 403.
[19] Sztajer H, Maliszewska I, Wieczorek J., 1988. Production of exogenous lipase by bacteria, fungi and actinomycetes. Enzyme and Microbial Technology, 10: 492- 497. [20] Gombert AK, Pinto AL, Castilho LR, Freire DMG., 1999.
Lipase production by Penicillium restrictum in solid-state fermentation using babassu oil cake as substrate. Process Biochemistry, 35: 85–90
[21] Abdou AM., 2003. Purifi cation and partial characterization of psychrotrophic Serratia marcescens lipase.Journal of Dairy Science, 86: 127– 132.
[22] Kim KR, Kwon DY, Yoon SH, Kim WY, Kim KH., 2004. Purifi cation, refolding and characterization of recombinant Pseudomonas fl uorescens lipase. Protein Expression & Purifi cation, 39 (1): 124-129.
[23] Haba E, Bresko O, Ferrer C, Marqués A, Busquets M, Manresa A., 2000. Isolation of lipase-secreting bacteria by deploying selective substrate. Enzyme and Microbial Technology, 26: 40–44.
[24] Jinwal UK, Roy U, Chowdhury AR, Bhaduri AP, Roy PK., 2003. Purifi cation and Characterization of an Alkaline Lipase from a Newly Isolate Pseudomonas
mendocina PK-12CS and Chemoselective Hydrolysis of
Fatty Acid Ester. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 11: 1041- 1046.
[25] Köse Ö, Tüter M, Aksoy HA., 2002. Immobilized Candida
antarctica lipase-catalyzed alcoholysis of cotton seed oil
in a solvent-free medium. Bioresource Technology, 83: 125– 129.
[26] Tsai S-H, Liu C-P, Yang S-S., 2007. Microbial conversion of food wastes for biofertilizer production with
thermophilic lipolytic microbes. Renewable Energy, 32: 904–915.
[27] Wang Y, Srivastava KC, Shen GJ, Wang HY., 1995. Thermostable alkaline lipase from a newly isolated thermophilic Bacillus strain, A30- 1 (ATCC 53841). Journal of Fermentation and Bioengineering, 79: 433- 438.
[28] Sharma R, Soni S, Vohra R, Gupta L, Gupta J., 2002. Purifi cation and characterization of a thermostable alkaline lipase from a new thermophilic Bacillus sp. RSJ-1. Process Biochemistry, 37: 1075-1084.
[29] Castro-Ochoa LD, Rodríguez-Gómez C, Valerio-Alfaro G, Ros RO., 2005. Screening, purifi cation and characterization of the thermoalkalophilic lipase produced by Bacillus thermoleovorans CCR11. Enzyme and Microbial Technology, 37: 648–654.
[30] Li H, Zhang X., 2005. Characterization of thermostable lipase from thermophilic Geobacillus sp. TW1. Protein Expression and Purifi cation, 42: 153– 159.
[31] Stead D., 1986. Microbial lipases: their characteristic, role in food spoilage and industrial uses. Journal of Dairy Research, 53: 481- 505.
[32] Aires-Barros MR, Taipa MA, Cabral JMS. 1994. Isolation and purifi cation of lipases. In: Lipases: Their structure, biochemistry, and application (ed. Wooley P, Petersen S), pp, 243–270. Cambridge University Press, Cambridge, UK.
[33] Meghwanshi GK, Agarwal L, Dutt K, Saxena RK., 2006. Characterization of 1,3-regiospecifi c lipases from new
Pseudomonas and Bacillus isolates. Journal of Molecular
Catalysis B: Enzymatic, 40: 127–131.
[34] Kouker G, Jaeger KE, 1987. Specifi c and sensitive plate assay for bacterial lipases. Applied and Environmental Microbiology, 53(1) : 211–213.
[35] Litthauer D, Ginster A, Skein EVE, 2002. Pseudomonas
luteola lipase: A new member of the 320-residue Pseudomonas lipase family. Enzyme and Microbial
Technology, 30: 209- 215.
[36] Winkler UK, Stuckmann M., 1979. Glycogen, hyaluronate, and some other polysaccharides greatly enhance the formation of exolipase by Serratia marcescens. Journal of Bacteriology, 138: 663–670.
[37] Savitha J, Srividya S, Jagat R, Payal P, Priyanki S, Rashmi GW, Roshini KT, Shantala YM., 2007. Identifi cation of potential fungal strain(s) for the production of inducible, extracellular and alkalophilic lipase. African Journal of Biotechnology, 6 (5), 564–568.
[38] Braun P, Balzer G, Fehlhaber K., 2001. Activity of bacterial lipases at chilling temperatures. Food Microbiology, 18: 211- 215.
[39] Kanwar L, Gogoi BK, Goswami P., 2002. Production of a
Pseudomonas lipase in n-alkane substrate and its isolation
using an improved ammonium sulfate precipitation technique. Bioresource Technology, 84: 207–211. [40] Kiran GS, Shanmughapriya S, Jayalakshmi J, Selvin J,
Gandhimathi R, Sivaramakrishnan S, Arunkumar M, Thangavelu T, Natarajaseenivasan K., 2008. Optimization of extracellular psychrophilic alkaline lipase produced
by marine Pseudomonas sp. (MSI057). Bioprocess and Biosystems Engineering, In Press.
[41] Côté A, Shareck F., 2008. Cloning, purifi cation and characterization of two lipases from Streptomyces
coelicolor A3 (2). Enzyme and Microbial Technology, In
Press.
[42] Fojan P, Jonson PH, Peterson MTN, Peterson SB, 2000. What distinguishes an esterase from a lipase: a novel structural approach. Biochimie, 82: 1033- 1041.
[43] Bornscheuer UT., 2002. Microbial carboxyl esterases: classifi cation, properties and application in biocatalysis. FEMS Microbiology Reviews, 26: 73–81.
[44] Dröge MJ. 2004. Selection of novel lipases and esterases for enantioselective biocatalysis. Ridderprint BV (Ridderkerk, The Netherlands).
[45] Pleiss J, Fischer M, Schmid RD., 1998. Anatomy of lipase binding sites: the scissile fatty acid binding site. Chemistry and Physics of Lipids, 93: 67- 80.
[46] Sneath PHA, Mair NS, Sharpe ME, Holt JG. (Eds)., 1986. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, Vol 2, pp. 999-1507. Williams and Wilkins, Baltimore, Maryland, USA.
[47] Mosbah H, Sayari A, Mejdoub H, Dhouib H, Gargouri Y., 2005. Biochemical and molecular characterization of
Staphylococcus xylosus lipase. Biochimica et Biophysica
Acta, 1723, 282– 291.
[48] Sayari A, Agrebi N, Jaoua S, Gargouri Y., 2001. Biochemical and molecular characterization of
Staphylococcus simulans lipase. Biochimie, 83:
863−871.
[49] Horchani H, Mosbah H, Salem NB, Gargouri Y, Sayari A., 2008. Biochemical and molecular characterization of a thermoactive, alkaline and detergent-stable lipase from a newly isolated Staphylococcus aureus strain. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, In Press.
