*Deniz Suyu Kökenli Koliformlarda
S›n›f 1 ve S›n›f 2 Integron Gen Kasetleri ve
Antibiyotik Direncinin Karakterizasyonu
Class 1 and Class 2 Integron Gene Cassettes and
Characterization of Antibiotic Resistance in Coliforms of
Sea Water Origin
Feyza Çolako¤lu1, Osman Birol Özgümüfl1,2, Cemal Sandall›1, Elif Çelik Sevim1, fiengül Alpay Karao¤lu1
Rize Üniversitesi 1
Fen-Edebiyat Fakültesi, Biyoloji Bölümü, Mikrobiyoloji ve Moleküler Biyoloji Araflt›rma Laboratuvar›,
2T›p Fakültesi, T›bbi Mikrobiyoloji Anabilim Dal›, Rize
*Bu çal›flma XIX. Ulusal Biyoloji Kongresi’nde (23-27 Haziran 2008 Trabzon) poster olarak sunulmufltur.
ÖZET
Amaç: Bu çal›flmada Karadeniz’in do¤u sahilinden izole edilen 43 koliform bakterideki antibiyotik direncinin moleküler karakterizasyonu amaçland›.
Gereç ve Yöntem: Sufllar›n disk difüzyon metoduyla çeflitli antibiyotiklere dirençleri tarand›. Ampisiline dirençli sufllarda TEM tipi β-laktamaz geni, s›n›f 1 ve s›n›f 2 integron gen kasetleri ve tetrasikline dirençli sufllarda tetrasiklin direnç determinantlar› polimeraz zincir reaksiyonu ile araflt›r›ld›. Plazmid transformasyon deneyleri ›s› flok metoduyla yap›ld›.
Bulgular: On yedi (%39.5) suflun bir veya daha fazla say›da antibiyoti¤e dirençli oldu¤u bulundu. Bir ampisiline dirençli Escherichia coli’nin TEM-1 tip β-laktamaz geni içerdi¤i ve tetrasikline dirençli sufllar aras›nda tet(B) geninin yayg›n oldu¤u tespit edildi. Bir E. coli suflu 2.0-kb s›n›f 1 integron, di¤er bir E. coli suflunun ise 2.2-kb s›n›f 2 integron tafl›d›¤› ve DNA dizi analizi ile s›n›f 1 ve s›n›f 2 integronlar›n s›ras›yla blaOXA-30 – aadA1 ve dfrA1-sat2-aadA gen kasetlerini içerdi¤i gösterildi. Ampisiline, tetrasikline ve streptomisine karfl› dirençlerin transfer edilebilir özellikler oldu¤u bulundu.
Sonuç: Deniz ortam›nda, antibiyotiklere dirençli koliformlar›n bulunmas› halk ve çevre sa¤l›¤› aç›s›ndan risk tafl›yabilir ve bu çal›flma, deniz suyundan izole edilmifl koliformlarda s›n›f 1 ve s›n›f 2 integronlar›n gösterildi¤i ilk çal›flma olmas› aç›s›ndan önemlidir.
Anahtar Kelimeler: Deniz suyu, koliform bakteriler, s›n›f 1 ve s›n›f 2 integronlar.
G‹R‹fi
Klinik ortamlar olmamalar›na ra¤men, okyanus sular›nda, sahillerde, nehirlerde, yüzey sular› ve çökeltilerinde, göllerde ve içme sular›nda anti-biyotiklere karfl› dirençli bakteriler tespit edil-mifltir (1). ‹nsan t›bb› ve veterinerlikte antibiyo-tiklerin yo¤un kullan›mlar›, bakteriler üzerinde seçici bir bask› oluflturmakta ve bu bask›n›n an-tibiyotik direncinin ortaya ç›kmas›na ve yay›l-mas›na neden oldu¤una inan›lmaktad›r (2). Çevre kökenli direnç genlerinin takibinde tetra-sikline karfl› direnç oran›n›n anahtar role sahip olmas›, özellikle veterinerlikte ve ziraatta bu antibiyoti¤in s›k kullan›m›ndan kaynaklanmak-tad›r. Ak›lc› olmayan reçeteler, uygunsuz kulla-n›m ve antibiyotik art›klar›n›n çevreye kar›flma-s›ndan dolay› antibiyotiklere karfl› hem çevresel hem de klinik kökenli bakterilerdeki artan di-rencin, toplum sa¤l›¤›n› tehdit eden t›bbi sorun-lar osorun-larak karfl›m›za ç›kt›¤› bilinmektedir (3). Antibiyotik direnç genleri, direnç (R) plazmid-leri, transpozonlar ve integronlar›n horizontal transferleri vas›tas›yla aktar›l›r ve kazan›l›r (4).
Beta-laktamlar›n klinik kullan›ma girmesinin en önemli sonuçlar›ndan biri de plazmid arac›l›
β-laktamazlar›n yay›lmas›d›r. Plazmid arac›l› β-laktamazlardan en s›k bulunan› TEM-1’dir. TEM-1 geni (blaTEM-1) Tn3 transpozonuyla
tafl›-n›r ve Enterobacteriaceae ailesi üyelerinin % 20-60’›na yay›lm›fl durumda oldu¤u rapor edil-mektedir (5).
‹ntegronlar; tetrasiklinler, trimetoprim, aminog-likozidler, kloramfenikol ve hatta β-laktamlar gibi antibiyotiklere karfl› direnç kodlayan gen kasetlerini tafl›yabilme veya entegre edebilme yeteneklerine sahiptirler. S›n›f 1 integronlar Tn21 gibi transpozonlar üzerinde tespit edilmifl-lerdir ve prototip say›l›rlar (6). S›n›f 1 integro-nun yap›s›nda bir 5'- ve 3'- korunmufl segment (5'-CS ve 3'-CS) ve bir de de¤iflken bölge vard›r (7,8). 5'-korunmufl segment intI geni (integraz) ve insert olan gen/genlerin ekspresyonu için kullan›lan bir promotor bölgeden oluflur (7). 3'-korunmufl segment defektif kuaterner amonyum direnç geni qacE∆1 ve sülfonamidlere direnç
SUMMARY
Objective: The aim of this study was molecular characterization of the antibiotic resistance in 43 coliforms isolated from the east coastal zone of Black Sea, Turkey.
Materials and Methods: All strains were screened for resistance to certain antibiotics by disk diffusion method. TEM-type β-lactamase gene in ampicillin-resistant strains, class 1 and class 2 integron gene cassettes and tetracycline resistance determinants in tetracycline-resistant strains were investigated by polymerase chain reaction. Plasmid transformation experiments were performed by heat shock method.
Results: We found that 17 (39.5%) strains were resistant to one or more antibiotics. One ampicillin-resistant Escherichia coli strain harbored a TEM-1 type β-lactamase gene. tet(B) gene was common among tetracycline-resistant strains. One E. coli strain carried a 2.0-kb class 1 integron, and one E. coli carried a 2.2-kb class 2 integron. DNA sequencing results demonstrated that class 1 and class 2 integrons contained blaOXA-30-aadA1 and dfrA1-sat2-aadA gene cassette arrays, respectively. Resistance to ampicillin, tetracycline or streptomycin was transferable traits.
Conclusion: We are of the opinion that there are antibiotic resistance determinants in coliforms of human origin in marine environment, carrying a risk for public and environmental health. To our knowledge, this is the first report for class 1 and class 2 integrons in coliform bacteria isolated from sea water in Turkey.
sa¤layan sulI geni içerir. ‹ki korunmufl bölge aras›nda bulunan de¤iflken bölge antibiyotik di-renç gen kasetlerinin girmesi için rekombinas-yon yeridir. Bu yüzden rekombinasrekombinas-yon meka-nizmas›na kat›lan ve 59-baz çifti (bç) eleman olarak bilinen attC geni içerir. S›n›f 2 integron-lar ise Tn7’de bulunmufl olup, dihidrofolat re-düktaz gen kaseti içermektedir (7,9) ve s›ras›yla trimetoprime, streptotrisine ve streptomi-sin/spektinomisine direnç sa¤layan dfrA1, sat2 ve aadA1 gibi üç klasik gen kasetleri tafl›makta-d›r (10). S›n›f 1 ve s›n›f 2 integronlar›n, g›dalar-dan, sulama kanallar›ndan ve nehirlerden izole edilen koliform bakterilerde tafl›nabildi¤i rapor edilmifltir (4,11-14). Ancak, fiziksel özellikleri bak›m›ndan hayatta kalabilmenin zor oldu¤u or-tamlar olarak bilinen deniz ve okyanuslar›n in-san kaynakl› kirlenmeye maruz kalm›fl sular›n-dan izole edilen koliform bakterilerdeki antibi-yotik direnç durumu ve moleküler mekanizma-lar› ile ilgili detayl› çal›flmalara rastlanmam›flt›r. Bu çal›flmada, Do¤u Karadeniz’in insan kay-nakl› kirlenmeye maruz kalm›fl k›y›lar›ndan izole edilmifl koliform bakterilerdeki antibiyotik di-rencinin moleküler analizleri yap›ld›. Bunun ya-n›nda, integron gen kaset içerikleri tarand› ve bu genetik yap›lar›n moleküler yap›lar› ayd›nlat›ld›.
GEREÇ VE YÖNTEM
Koliform bakteriler. Rize ili sahilinde dokuz istasyondan Kas›m 2000 ile A¤ustos 2001 ara-s›nda 10 ay boyunca ayda bir kere deniz suyu örne¤i topland›. Deniz suyu örnekleri Lactose Peptone Water (Oxoid, ‹ngiltere) besiyerine eki-lerek fakültatif anaerop üreme takip edildi. ‹zo-le edi‹zo-len fakültatif anaerop gram-negatif koli-formlar, Rize Üniversitesi’nin Mikrobiyoloji ve Moleküler Biyoloji Araflt›rma Laboratuvar› Bakteri Koleksiyonu’nda %20 gliserol
ortam›n-da -35°C’de, yap›lmas› planlanan çal›flmalar için stokland›. Çal›flma yap›laca¤› zaman, bak-teriler Nutrient agar (Merck, Almanya) besiye-rinde canland›r›ld› ve biyokimyasal reaksiyon-lar›na göre tür seviyesinde tan›mlamalar› ve do¤rulamalar› yap›ld› (15).
Antimikrobik duyarl›l›k ve çift disk sinerji (ÇDS) testleri. Koliform bakteriler ve transfor-mantlar›n antimikrobik duyarl›l›k testleri "Cli-nical and Laboratory Standards Institute (CLSI)"rehberindeki standart disk difüzyon me-toduyla yap›ld›. Sonuçlar, ayn› rehberdeki stan-dart zon çap› ölçütleriyle mukayese edilerek yo-rumland› (16). Duyarl›l›k testlerinde ampisilin (10 µg), gentamisin (10 µg), amikasin (30 µg), netilmisin (10 µg), kanamisin (30 µg), strepto-misin (10 µg), tetrasiklin (30 µg), kloramfenikol (30 µg), nalidiksik asit (30 µg), sulfametoksazol (100 µg) ve trimetoprim (5 µg) standart antibi-yotik diskleri (Oxoid, ‹ngiltere) kullan›ld›. Sul-fametoksazol (100 µg) diskinin inhibisyon zon çaplar›n›n de¤erlendirilmesi Blahna ve arkadafl-lar›n›n (17) çal›flmas›nda belirtilen referans de-¤ere (R ≤12 mm) göre yap›ld›. Escherichia coli ATCC 25922 suflu kalite kontrol suflu olarak kullan›ld›.
Sufllardaki genifllemifl spektrumlu β-laktamaz (GSBL) enzimi varl›¤›na, ÇDS testi ile standart disk difüzyon metodu kullan›larak, Mueller-Hinton agar (Merck, Almanya) besiyeride bak›l-d› (16,18). Seftazidim antibiyotik diski (30 µg) (Oxoid, ‹ngiltere) etraf›ndaki inhibisyon zonu-nun amoksisilin-klavulanik asit diski (20 µg/10 µg) (Oxoid, ‹ngiltere) taraf›ndan art›r›lmas› muhtemel GSBL varl›¤›n› gösterdi. Dr. George A. Jacoby (Lahey Clinic, Massachusetts, USA) taraf›ndan hediye edilen Escherichia coli J53-2 (SHV-3 tip GSBL enzimi kodlayan pUD18 plazmidi içeriyor) suflu, ÇDS testlerinde GSBL pozitif kontrol olarak kullan›ld›.
Plazmid izolasyonu ve transformasyon deneyi. Toplam plazmid DNA’lar› alkalen ekstraksiyon metodu ile antibiyotiklere dirençli sufllardan izole edildi ve kompetan E. coli JM101 (RecA-)
hücrelerine ›s› floku metoduyla aktar›ld› (19,20). Transformantlar 50 µg/ml ampisilin (Fisher Sci-entific, ABD) içeren Luria-Bertani (LB) agar (%1 tripton, %0.5 sodyum klorür, %0.5 maya özütü, %1.5 agar; pH 7.4) besiyerinde seçildi. Seçici besiyerinde üreyen transformantlar›n, 50 µg/ml ampisilin (Fisher Scientific, New Jersey, ABD) içeren LB s›v› besiyerine tekrar ekimleri yap›ld›. Üreyen bakterilerden tekrar plazmid DNA’lar› saflaflt›r›larak 0.5 µg/ml etidiyum bro-mür (Sigma-Aldrich, Missouri, ABD) içeren %0.7’lik agaroz jelde yürütüldü ve UV transil-lüminatöründe incelendi.
Antibiyotik direnç genleri ve integronlar için polimeraz zincir reaksiyonu (PZR). Koli-formlar ve transformant sufllar 3 ml LB s›v› be-siyerine ekildiler ve 37°C’de 20 saat çalkalana-rak enkübe edildiler. S›v› bakteri kültürünün 1.5 ml’si mikro-santrifügasyonla çöktürüldü. Sü-pernatant at›ld›ktan sonra çökelti 500 µl steril deiyonize su ile yeniden çözüldü. Hücreler daha sonra 10 dk kaynat›larak parçaland›. Tekrar mikro-santrifügasyonla çöktürüldü ve süperna-tant›n 1 µl’si tüm PZR deneylerinde kal›p DNA kayna¤› olarak kullan›ld›. Tüm PZR reaksiyon-lar›nda MBI Fermentas’›n (Vilnius, Litvanya) Taq polimeraz enzimi, nükleotidler ve tamponlar› kullan›ld›. Is› döngüleri Mastercycler Personal thermal cycler (Eppendorf, ABD)’da yap›ld›. Ampisiline dirençli sufllarda TEM-tipi β-lakta-maz genleri, Arlet ve Philippon’un (21) tarif et-ti¤i gen içi OT1/OT2 primerleri (Tablo 1), reak-siyon kar›fl›m› ve döngü parametreleri kullan›la-rak araflt›r›ld›. Tetrasikline dirençli sufllarda tet(A), tet(B) ve tet(C) genleri Tablo 1’de göste-rilen primer çiftleri kullan›larak tarand›.
Ampli-fikasyonlar›n reaksiyon kompozisyonlar› ve döngü parametreleri Aarestrup ve arkadafllar›n›n (22) tariflerine göre yap›ld›. Tablo 1’de listele-nen integron spesifik primerler (5’-CS/3’-CS ve hep51/hep74), antibiyotiklere dirençli sufllarda-ki s›n›f 1 ve s›n›f 2 integronlar›n de¤iflken böl-gelerini ço¤alt›lmak için kullan›ld›. Reaksiyon kompozisyonlar› ve döngü parametreleri s›n›f 1 integronlar için Lévesque ve arkadafllar›n›n (8), s›n›f 2 integronlar için White ve arkadafllar›n›n (23) tariflerine göre yap›ld›. Amplifikasyon ürünleri daha sonra 0.5 µg/mL etidiyum bromür (Sigma-Aldrich, ABD) içeren %1’lik agaroz jel-de yürütüldü ve UV ›fl›¤› alt›nda incelendi. DNA dizi analizi ve biyoinformatik. ‹ntegron-lar›n de¤iflken bölgelerinin PZR ürünleri QI-AQuick®
Purification Kits (QIAgen, ‹ngiltere) kullan›larak agaroz jelden saflaflt›r›ld›lar ve pGEM-T Easy vector (Promega, ABD) plazmi-dine üretici firman›n önerileri do¤rultusunda klonland›lar. Elde edilen rekombinant plazmid-ler, sekans analizi için Macrogen Enstitüsüne (Seul, Kore) gönderildi. pGEM-T plazmid vek-törünün DNA dizisine komplementer iki üniver-sal primer (SP6/T7 promotor primerler) kullan›-larak klonlanm›fl fragmanlar›n DNA dizileri belir-lendi. Tablo 1’de DNA dizisi verilen OT3/OT4 primerleri ile Arlet ve arkadafllar›n›n (24) tarif et-ti¤i reaksiyon kar›fl›m› ve döngü parametreleri kullan›larak TEM-tipi β-laktamaz genlerinin ta-mam› ço¤alt›ld›. Saflaflt›r›l›p temizlenen ampli-konlar OT3/OT4 primerleri ile birlikte DNA dizi-lerinin belirlenmesi için Macrogen Enstitüsüne (Seul, Kore) gönderildiler. Elde edilen nükleotid dizileri ve varsay›lan proteininin amino asit dizi-lerinin http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST sitesindeki BLAST (The Basic Local Align-ment Search Tool) analizi ve http://www.ebi. ac.uk/clustalw/ sitesindeki ClustalW (Multiple Sequence Alignment) programlar› kullan›larak
GenBank veritaban›ndaki di¤er nükleotid dizi-leri ve proteindizi-lerinin amino asit dizidizi-leriyle kar-fl›laflt›r›larak biyoinformatik analizleri yap›ld›. Nükleotid dizisi girifl numaras›. Bu çal›flmada tespit edilen s›n›f 1 integron ve s›n›f 2 integron-lar›n nükleotid dizileri EMBL ve GenBank veri-taban›nda depoland›lar ve s›ras›yla EF543148 ve EF543147 girifl numaralar› al›nd›.
BULGULAR
Deniz suyu örneklerinden 39 Escherichia coli, iki Enterobacter cloacae, bir Klebsiella pne-umoniae ve bir Citrobacter koseri olmak üzere 43 koliform bakteri izole edildi. K›rk üç koli-form suflunun 17’si test edilen 10 antibiyoti¤in en az bir veya daha fazlas›na dirençli bulundu. Geri kalan bakteriler (%60.5) bütün antibiyotik-lere hassas olarak tespit edildi.
‹zole edilen 43 koliformdaki antimikrobik di-renç s›kl›¤› fiekil 1’de gösterilmektedir. En yük-sek direnç insidans› tetrasikline (%23.2) karfl› olmakla birlikte, bunu ampisilin (%20), sulfa-metoksazol (%11.6), streptomisin (%9.3) ve kloramfenikol (%4.6) takip etti. En düflük
di-renç oran› trimetoprime (%2.3) karfl› saptand›. Nalidiksik aside ve streptomisin hariç di¤er aminoglikozidlere (gentamisin, kanamisin ve amikasin) direnç tespit edilmedi. Antibiyotik renci tafl›yan deniz izolatlar›n›n antibiyotik di-renç fenotipleri ise Tablo 2’de görülmektedir. TEM-tipi β-laktamaz geni (blaTEM), 11
ampisili-ne dirençli E. coli sufllar› ve Citrobacter koseri suflunda arand›. Enterobacter ve Klebsiella cins-leri ampisiline do¤al dirençli olduklar›ndan bu sufllarda direnç genlerine bak›lmad›. E. coli sufl-lar›ndan bir tanesinde (E. coli FD3) PZR ile 504 bç TEM-tipi β-laktamaz geni (blaTEM) tespit edildi
(fiekil 2). DNA dizi analizi genin blaTEM-1
ol-du¤unu gösterdi. BLAST analizi genin varsay›-lan amino asit translasyonunun GenBank’ta de-polanm›fl di¤er blaTEM-1 genlerinin amino asit
translasyonu ile %100 benzerlik gösterdi¤ini saptad›. Polimeraz zincir reaksiyonu ile blaTEM
geni tespit edilmeyen di¤er ampisiline dirençli sufllarda ÇDS testi negatif bulundu ve sufllar›n GSBL üretmedi¤i anlafl›ld›.
Sufllarda tet(B) geninin yayg›n oldu¤u belirlen-di. Tetrasikline dirençli 10 suflun yedisi tet(B) geni aç›s›ndan PZR ile pozitif saptand› (375 bç Tablo 1. PZR deneylerinde kullan›lan oligonükleotid primerler
Primer Hedef Nükleotid dizisi Amplikon (bç) Kaynak
OT-1 5’- TTGGGTGCACGAGTGGGTTA -3’ OT-2 5’- TAATTGTTGCCGGGAAGCTA -3’ OT-3 5'- ATGAGTATTCAACATTTCCG -3 OT-4 5'- CAATGCTTAATCAGTGAGG -3' tet(A)-1 5’- GTAATTCTGAGCACTGTCGC -3’ tet(A)-2 5’- CTGCCTGGACAACATTGCTT -3’ tet(B)-1 5’- CTCAGTATTCCAAGCCTTTG -3’ tet(B)-2 5’- ACTCCCCTGAGCTTGAGGGG -3’ tet(C)-1 5’- GGTTGAAGGCTCTCAAGGGC -3’ tet(C)-2 5’- CCTCTTGCGGGAATCGTCC -3’ 5’-CS S›n›f 1 integron 5’- GGCATCCAAGCAGCAAG -3’
3’-CS de¤iflken bölge 5’- AAGCAGACTTGACCTGA -3’
hep51 S›n›f 2 integron 5’- GATGCCATCGCAAGTACGAG -3’
hep74 de¤iflken bölge 5’- CGGGATCCCGGACGGATGCACGATTTGTA -3’
blaTEM(gen içi)
blaTEM(tam gen)
tet(A) geni tet(B) geni tet(C) geni 504 857 917 375 506 21 24 22 22 22 8 23
ürün) (fiekil 2). tet(A) veya tet(C) arac›l› tetra-siklin direnci tespit edilmedi. Transformasyon deneyi ile iki E. coli suflunda aktar›labilir antibi-yotik direnci gösterildi. Bu sufllar antibiantibi-yotik di-renç paternlerinin (AMP-TE ve AMP-TE-S) ta-mam›n› transformasyon deneyinde hassas bir E.
coli K-12 sufluna aktard› (Tablo 2). Polimeraz zincir reaksiyonu ile transformantlarda da tet(B) geni ve blaTEM-1genleri tespit edildi. Bu
sonuç-lar direnç fenotiplerinin plazmid arac›l› genetik özellikler oldu¤unu göstermektedir.
Tablo 2. Karadeniz’den izole edilen antibiyotiklere dirençli koliform bakterilerin fenotipik ve genotipik karakterizasyonlar›.
Sufl Tür Direnç fenotipia
Transformant fenotipi tet tipib
TEM-tipi genc,d
Gen kaset s›ras›
FD1 E. coli AMP
FD3 E. coli AMP, TE AMP TE tet(B) blaTEM-1
FD6 E. coli AMP, TE tet(B)
FD7 E. coli TE tet(B)
FD8b E. coli AMP, TE, C, SMZ (–)
FD8bA E. coli AMP, TE, C, S, SMZ (–) blaOXA-30–aadA1
FD12 E. coli AMP
FD13a E. coli AMP, TE, S AMP TE S tet(B)
FD18 E. coli TE tet(B)
FD19 E. coli AMP, TE, TMP, S, SMZ tet(B) dfrA1–sat2–aadA
FD29 K. pneumoniae AMP
FD39 E. coli SMZ
FD44 E. cloacae AMP
FD45 C. koseri AMP
FD51 E. coli SMZ
FD52a E. coli TE tet(B)
FD54 E. coli TE, S (–)
a
AMP: ampisilin; TE: tetrasiklin; C: kloramfenikol; S: streptomisin; TMP: trimetoprim; SMZ: sulfametoksazol.
b
(–), tet(A), tet(B) ve tet(C) yok.
c
Transformantta da TEM-spesifik PZR pozitif.
d
Yaln›zca E. coli ve Citrobacter koseri sufllar›nda bak›ld›.
Test edilen antibiyotikler
fiekil 1. Deniz suyundan izole edilmifl 43 koliformda antimikrobiyallere direncin toplam s›kl›¤›.
fiekil 2. ‹ntegronlar ve direnç genlerinin PZR analizi. S›ra M: 100 bp DNA Ladder (Promega, ABD); S›ra 1: s›n›f 1 integron (E. coli FD8bA); S›ra 2: s›n›f 2 integron (E. coli FD19); S›ra 3: tet(B) amplikon; S›ra 4: blaTEM-1amplikon (E. coli FD3).
Birer E. coli sufllar›nda s›n›f 1 (E. coli FD8bA) ve s›n›f 2 (E. coli FD19) integron saptand› (fie-kil 2). 2013-bç’lik s›n›f 1 integronun (GenBank girifl numaras› EF543148) iki gen kaseti tafl›d›¤› (fiekil 3) ve DNA dizi analizine göre ilki
blaOXA-30gen kaseti olup, ampisiline ve 1. kuflak
sefalosporinlere direnç sa¤layan genifl-spekt-rumlu bir b-laktamaz kodlad›¤› bulundu. Bu ge-nin yan›ndaki bölgede bir aadA1 gen kaseti bu-lundu¤u ve aminoglikozid 3’-(9)-O-adeniltrans-feraz enzimi kodlad›¤› anlafl›ld›. Bu enzim streptomisin/spektinomisine direnç sa¤lamakta-d›r. Bu integronun kaset s›ras› (blaOXA-30
-aa-dA1)önceden rapor edilmifl klinik veya g›da ori-jinli Shigella flexneri (GenBank girifl numarala-r› DQ923619 ve AY574195) ve Salmonella en-terica serovar Typhimurium’da (GenBank girifl numaralar› DQ861642 ve AY534545) tespit edi-lenlerle %100 benzerlik göstermektedir.
Tespit etti¤imiz 2224 bç-s›n›f 2 integron (Gen-Bank girifl numaras› EF543147) ise üç gen ka-seti tafl›maktad›r (fiekil 3). DNA dizi analizine göre ilki dfrA1 geni olup, dihidrofolatredüktaz enzimi kodlamaktad›r ve trimetoprime direnç sa¤lamaktad›r. ‹kincisi sat2 genidir ve streptot-risin asetiltransferaz enzimi kodlamaktad›r ve
streptotrisin antibiyoti¤ine direnç sa¤lamakta-d›r. Üçüncü gen kaseti aadA genidir ve aminog-likozid adeniltransferaz A enzimi kodlamaktad›r ve streptomisin/spektinomisine direnç sa¤la-maktad›r. Bu integronun kaset s›ras› (dfrA1-sat2-aadA) önceden rapor edilmifl klinik orijinli Shigella türü (GenBank girifl numaralar› AY639870 ve AY140652) ve Vibrio cholerae’da (GenBank girifl numaras› AB199789) tespit edi-lenlerle %100 benzerlik göstermektedir.
TARTIfiMA
Ülkemizde, toplum ve hastane kökenli koliform bakterilerde yüksek düzey antibiyotik direnci ile ilgili raporlar mevcuttur (25,26). At›k sular, la¤›m, dereler ve içme sular› gibi sucul çevre-lerdeki bakterilerde de insan t›bb› ve veteriner-likte kullan›lan baz› antibiyotiklere karfl› direnç rapor edilmesine ra¤men, moleküler mekaniz-malar› ve ekolojileri üzerine sistematik çal›flma-lar bulunmamaktad›r. Ayr›ca, deniz ekosiste-mindeki fekal orijinli bakterilerde ortaya ç›kan antibiyotik direnci üzerine s›n›rl› say›da çal›flma bulunmaktad›r. Özgümüfl ve arkadafllar› (27) bu çal›flman›n yap›ld›¤› bölgede halk›n kulland›¤› fiekil 3. Çal›flmada tespit edilen s›n›f 1 (GenBank girifl numaras› EF543148) (A) ve s›n›f 2 (GenBank girifl numaras› EF543147) (B) integronlara sokulmufl gen kaset s›ralar›n›n flematik gösterimi. Siyah yuvarlaklar 59-bç elamanlar›, beyaz yu-varlaklar ise attI bölgelerini temsil etmektedir.
içme sular›ndan (musluk ve p›nar sular›) izole ettikleri ço¤ul antibiyotik dirençli fekal koli-formlardaki antibiyotik direncinin, hareketli ge-netik elemanlar olan konjugatif R plazmidleri, transpozonlar ve integronlar taraf›ndan tafl›nd›-¤›n› tespit etmifllerdir. Ayn› araflt›rmac›lar böl-gedeki nehir sular›ndan izole edilen Enterobac-teriaceae ailesi üyesi koliform bakterilerde s›n›f 1 ve s›n›f 2 integronlar›n yan›nda, ço¤ul antibi-yotik dirençli birçok suflun bu direnci hareketli genetik elemanlar vas›tas›yla yayabilece¤ini göstermifllerdir (14). Bu bilgiler ›fl›¤›nda mev-cut çal›flma, integron veya benzer genetik yap›-lar vas›tas›yla antibiyotiklere dirençli bakterile-rin nehir, dere veya di¤er su ak›mlar› vas›tas›yla denizlere ulaflarak, rekreasyon amaçl› kullan›lan veya hayvansal besin kayna¤› olan deniz eko-sistemlerine de direnç genlerini yayabilece¤i ih-timalini araflt›rmaktad›r. Deniz ortam›n›n oligot-ropik flartlar›nda k›y›sal bölgeler besin niteli¤in-deki maddelerce zengin at›k sular›n ve ak›mla-r›n girdileri nedeniyle besleyici maddeler aç›-s›ndan zengindir. E. coli Ayr›ca, Karadeniz’in tuzluluk derecesi (yaklafl›k 18.5 ppt) ise olduk-ça azd›r (28). Böyle ortamlar bakteri populas-yonlar›n›n hayatta kalabilme flanslar› aç›s›nda pratikte uygun çevrelerdir.
Enterik bakterilerdeki plazmid arac›l› enzimler aras›nda en s›k rastlan›lan›n TEM-1 oldu¤u ra-por edilmektedir (29,30). Bu enzime ampisiline dirençli klinik E. coli kökenlerinin yaklafl›k %50’sinde rastlanmaktad›r (31,32). A s›n›f β-laktamaz enzimi olan TEM-1 tip β-β-laktamaz, s›kl›kla nokta mutasyonlar›na maruz kalarak substrat aral›¤›n› geniflletmektedir (33). Ülke-mizdeki sa¤l›kl› insanlar›n ba¤›rsak floralar›n-dan izole edilen E. coli’lerde de gösterilmifltir (34). Bu çal›flmada TEM-1 tip β-laktamaz, sahil sular›ndan izole edilen bir koliformda tespit edildi ve bu bulgunun yörede yaflayan halk›n
sa¤l›¤› aç›s›ndan bir tehdit oluflturabilece¤ini düflündürdü. Çal›flmam›zda, GSBL-negatif sufl-lar›n büyük olas›l›kla kromozomal β-laktamaz-lar› vas›tas›yla ampisiline direnç sa¤lad›¤› kan›-s›na var›ld›. Genellikle büyük miktarlarda Am-pC tip β-laktamaz üretimi, suflu ampisiline ve 1. kuflak sefalosporinlere dirençli hale getirebil-mektedir (35). Ülkemizde yap›lan son çal›flma-larda GSBL’nin Türkiye’deki hastane izolat› Gram-negatif bakterilerde önemli bir sorun ola-rak karfl›m›za ç›kt›¤› rapor edilmektedir (36). Yo¤un antibiyotik bask›s› alt›nda bu genin mu-tasyonlar vas›tas›yla kolayca evrimleflerek substrat aral›¤›n› geniflletmesi mümkün olabilir. Bunu kan›tlayabilmek için çevre kökenli bakte-rilerin ve içerdikleri direnç genlerinin molekü-ler epidemiyolojimolekü-lerinin izlenmesi ve konuyla ilgili farkl› disiplinlerin çal›flmalar›na veritaban› oluflturacak bilgilerin sistematik bir biçimde yo-rumlanmas› gerekti¤ine inanmaktay›z. Özellikle sucul ortamlardaki antibiyotik art›klar›n›n ve metabolitlerinin miktarlar› ve ekosistemdeki bakteri populasyonlar› üzerindeki etkilerinin ay-d›nlat›lmas› gerekmektedir. Çevre bakterilerin-deki direnç evriminin moleküler mekanizmala-r›yla ilgili s›n›rl› say›da çal›flma bulunmaktad›r. Song ve arkadafllar› (37) derin denizin yaklafl›k on bin y›ll›k so¤uk katman sedimanlar›n›n me-tagenomik kitapl›klar›nda TEM-tipi β-laktamaz geni belirlediklerini rapor etmifllerdir. Araflt›r›-c›lar, "antibiyotik direnç genlerinin b-laktamlar gibi antibiyotiklerin modern klinik kullan›mla-r›na cevap olarak evrimleflti¤i" hipotezine karfl› ç›kmaktad›rlar. Yani, bakterilerdeki β-laktam direncinin modern antibiyotik ça¤›ndan önce ortaya ç›km›fl olabilece¤i hipotezini önermekte-dirler. Ancak, biz bu hipotezin do¤rulanmas›n›n karasal ve sucul ekosistemlerdeki bakteriyal po-pulasyonlarda yap›lacak daha kapsaml› ve çeflit-li moleküler çal›flmalarla desteklenmesi
gerekti-¤ine inanmaktay›z. Deniz bakterilerinde ortaya ç›kan antibiyotik direncinin insanlar ve ekosis-tem üzerine olan etkilerini ayd›nlatmak için ol-gunun moleküler biyolojik ve evrimsel meka-nizmalar›n›n ayd›nlat›lmas›na ve bu konularda daha fazla bilgiye ihtiyaç oldu¤unu düflünmek-teyiz. Önceki bir çal›flmam›zda bu bölgedeki iç-me sular›ndan izole edilen fekal koliformlarda
blaTEM-1 gen tafl›y›c›l›¤› tespit edilmifltir (38).
fiafl›rt›c› bir biçimde, bu bakterilerin baz›lar›nda
blaTEM-1gen varl›¤› gösterilmesine ra¤men,
izo-elektrik fokuslama tekni¤i kullan›ld›¤›nda bak-terilerde fenotipik olarak TEM-1 enzim üretimi do¤rulanmam›flt›r. Sonuçlar, muhtemelen bakteri-lerin kullanmaya gerek duymad›¤› çevrelerde ba-z› genlerini eksprese etmedi¤ini ima etmektedir. Brezilya’daki üç plajdan izole edilen enterobak-terilerde yüksek düzeyde antibiyotik direncine rastlanm›flt›r. Direnç s›kl›¤› ampisilin için %14, sulfametoksazol için %12, tetrasiklin için %9 ve kloramfenikol için %1 olarak belirlenmifltir (39). Direnç oranlar› bizim çal›flmam›zdakiler-den daha azd›r. Çal›flmam›zdaki antibiyotiklere duyarl› sufllar›n, vahfli veya evcil hayvan ba¤›r-sa¤› kökenli olma ihtimalleri yüksektir. Çünkü sucul ortamlardan izole edilen ço¤ul antibiyotik dirençli koliform bakterilerin insan ba¤›rsa¤› kaynakl› olma ihtimalinin çok yüksek oldu¤u rapor edilmifltir (40). Buna ra¤men, solar ültra-viyolenin do¤al sular›n dekontaminasyonunda önemli katk›s›n›n oldu¤u da bilinmektedir (41). Tetrasiklin grubu antibiyotikler insan enfeksi-yonlar›n›n tedavisinde ve profilaksisinde kulla-n›lmaktad›r. Ayr›ca, veterinerlikte ve kültür ba-l›kç›l›¤›ndaki bakteri enfeksiyonlar›n›n kontro-lünde de tercih edilen gruplardand›r. Enterobac-teriaceae ailesi üyelerinde farkl› birçok tet geni belirlenmifltir. Bu grup bakterilerde en s›k rast-lanan tet genleri tet(A) ile tet(E) aras›ndaki
s›-n›flard›r (42). Guardabassi ve arkadafllar› (43) tet(A) ve tet(B) genleri taraf›ndan sa¤lanan tet-rasikline direnç mekanizmalar›n›n, sucul ve kli-nik orijinli Acinetobacter baumannii sufllar›nda yayg›n oldu¤unu rapor etmifllerdir. Özgümüfl ve arkadafllar› (27) ise Rize yöresindeki halk›n kul-land›¤› içme sular›ndan izole ettikleri E. coli sufllar›nda da tet(A) ve tet(B) genlerinin yayg›n oldu¤unu belirlemifllerdir. Mevcut çal›flmada ise ayn› bölgedeki deniz suyundan izole edilen tet-rasikline dirençli koliformlarda yayg›n genin sadece tet(B) oldu¤u saptand›. Tetrasiklin, oksi-tetrasiklin ve kloroksi-tetrasikline karfl› direnç sa¤la-yan tet(A) genine nazaran tet(B) geninin ek ola-rak doksisikline karfl› da direnç sa¤lad›¤› bilin-mektedir (44). Di¤er tetrasikline dirençli sufllar (tet(A) veya tet(B) tespit edilmeyen) alternatif tet genlerinden (örne¤in; tet(D) ve tet(E) veya eflüks mekanizmalar› kodlayan di¤er genler) kaynaklanan dirence sahip olabilirler. Entero-bacteriaceae ailesi üyelerinde farkl› tet genleri vas›tas›yla sa¤lanan di¤er bir direnç mekanizma-s› olarak "ribozomal korunma" da gösterilmifltir (45). Bulgular›m›z›n bölgedeki bal›k çiftlikleri ve kültür bal›kç›l›¤›ndaki bal›k hastal›klar› uz-manlar› ve halk sa¤l›¤› takipçileri taraf›ndan de-¤erlendirilmesinin yararl› olaca¤› kan›s›nday›z. ‹ntegron gen kasetleri tafl›yan deniz kökenli sufl-lar›n tespit edilmesinin epidemiyolojik olarak ilginç ve kayda de¤er bir bulgu oldu¤una inan-maktay›z. Ayr›ca, içme sular›ndan izole edilen E. coli sufllar› üzerinde yap›lm›fl önceki çal›fl-mam›zda, dfrA1-aadA1 (GenBank girifl numa-ralar› DQ875875 ve DQ875876) ve dfrA17-aa-dA5 (GenBank girifl numaras› DQ875874) gen kasetleri tafl›yan s›n›f 1 integronlar gösterilmifl-tir (27). Di¤er taraftan, Özgümüfl ve arkadafllar› (46) ayn› bölgedeki hastane enfeksiyonlar›ndan izole edilmifl Pseudomonas aeroginosa suflla-r›nda s›n›f 1 integronlara entegre olmufl yeni
an-tibiyotik direnç geni kasetleri tespit etmifllerdir. Çevre veya klinik ortamlarda direnç genlerinin bakteriler aras›nda sürekli paylafl›ld›¤› ve genler aras›ndaki genetik rekombinasyonun yeni direnç genlerini ortaya ç›kard›¤› kan›s›nday›z. Ülkemiz-deki benzer çal›flmalar, antibiyotiklere direncin evrimi ve hareketli antibiyotik direnç determi-nantlar›n›n moleküler epidemiyolojisi gibi konu-lar›n yeni oldu¤unu göstermektedir. Bu genetik yap›lar› tafl›yan elemanlar›n, toplum ve hastane kökenli bakterilerin klinik ortamlar›n›n izlenme-si, g›dalar, içme sular›, y›kanma ve rekreasyon amaçl› kullan›lan su rezervleri gibi çevresel or-tamlar›n›n takibi, antibiyotiklerin kontrollü kulla-n›m› ve bu antibiyotiklerin çevreye kar›flmalar›-n›n kontrolü için sürveyans çal›flmalar› gerekti¤i-ni önermekteyiz. Patojen bakteriler aras›nda anti-biyotik direncinin yay›lmas› en önemli toplum sa¤l›¤› problemlerinden biridir. Bu çal›flmadaki duyarl› sufllar›n dirençli olanlardan daha fazla ol-mas› antibiyotik direncinin deniz kökenli bakteri-lerdeki boyutunun korku verici olmad›¤›n› dü-flündürmektedir. Fakat do¤al sucul çevrelerde ya-flayan, antibiyotiklere dirençli patojenlerin veya kommensal bakterilerin, antibiyotiklere duyarl› olanlar›na nazaran her zaman daha fazla seçici avantaja sahip oldu¤u unutulmamal›d›r.
Bu çal›flmada rapor edilen integron gen kaset yap›lar›n›n dünya genelinde di¤er çal›flmalarda-ki klinik orijinli bakterilerde de gösterilmifl ol-mas›, belki de, "farkl› çevre kökenli mikroorga-nizmalar aras›nda ortak bir genetik havuzun na-s›l paylafl›ld›¤›n›" göstermektedir.
‹letiflim / Correspondence Osman Birol Özgümüfl
Rize Üniversitesi, T›p Fakültesi, T›bbi Mikrobiyoloji Anabilim Dal›
‹slampafla Mahallesi 53100 Rize Tel: 0464 212 3009 – 12 Dahili: 3202 Faks: 0464 212 3015
e-mail: osman.ozgumus@rize.edu.tr
Kaynaklar
1. Mezrioui N, Baleux B. Resistance patterns of Esche-richia coli strains isolated from domestic sewage befo-re and after tbefo-reatment in both aerobic lagoon and acti-vated sludge. Water Res 1994; 28:2399-406.
2. Young HK. Antimicrobial resistance spread in aquatic environment. Antimicrob Agents Chemother 1993; 31:627–35.
3. Davis J, Amabile-Cuevas CF. The rise of antibiotic re-sistance. In: Amabile-Cuevas CF, ed. Multiple Drug Resistant Bacteria. Wiltshire: Horizon Scientific Press, 2003: 1–7.
4. Leverstein van Hall MA, Box ATA, Blok HEM, Pa-auw A, Fluit AC, Verhoef J. Evidence of extensive in-terspecies transfer of integron-mediated antimicrobial resistance genes among multidrug resistant Enterobac-teriaceae in a clinical setting. J Infect Dis 2001; 186:49-56.
5. Matthew M. Plasmid-mediated β-lactamases of gram-negative bacteria: properties and distribution. J Anti-microb Chemother 1979; 5:349-58.
6. Grinsted J, Cruz F, Schmitt R. The Tn21 subgroup of bacterial transposable elements. Plasmid 1990; 24:163–89.
7. Stokes HW, Hall RM. A novel family of potentially mobile DNA elements encoding site-specific gene-in-tegration functions: integrons. Mol Microbiol 1989; 3:1669–83.
8. Lévesque C, Piche L, Larose C, Roy PH. PCR map-ping of integrons reveals several novel combinations of resistance genes. Antimicrob Agents Chemother 1995; 39:185-91.
9. Fling ME, Richards C. The nucleotide sequence of the trimethoprim-resistant dihydrofolate reductase gene harbored by Tn7. Nucleic Acids Res 1983; 11:5147–58.
10. Hansson K, Sundström L, Pelletier A, Roy PH. IntI2 integron integrase in Tn7. J Bacteriol 2002; 184:1712-21. 11. Sunde M. Prevalence and characterization of class 1
and class 2 integrons in Escherichia coli isolated from meat and meat products of Norwegian origin. J Anti-microb Chemother 2005; 56:1019-24.
12. Roe MT, Vega E, Pillai SD. Antimicrobial resistance markers of class 1 and class 2 integron bearing Esche-richia coli from irrigation water and sediments. Emerg Infect Dis 2003; 9:822-6.
13. Mukherjee S, Chakraborty R. Incidence of class 1 in-tegrons in multiple antibiotic-resistant gram-negative copiotrophic bacteria from the river Torsa in India. Res Microbiol 2006; 157:220-6.
14. Özgümüfl OB, Sandalli C, Sevim A, Celik-Sevim E, Nuket S. Class 1 and class 2 integrons and plasmid mediated antibiotic resistance in coliforms isolated from ten rivers in northern Turkey. J Microbiol 2009; 47:19-27.
15. Brenner DJ. Facultatively anaerobic gram-negative rods. In: Krieg NR, Holt JG, eds. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Baltimore:Williams and Wil-kins, 1986: 408-516.
16. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. 19th informational supplement, M100-S19.
Wayne: CLSI, 2009.
17. Blahna MT, Zalewski CA, Reuer J, Kahlmeter G, Fox-man B, Marrs CF. The role of horizontal gene transfer in the spread of trimethoprim-sulfamethoxazole resis-tance among uropathogenic Escherichia coli in Europe and Canada. J Antimicrob Chemother 2006; 57:666-72. 18. Jarlier V, Nicolas MH, Fournier G, Philippon A.
Ex-tended broad-spectrum β-lactamases conferring trans-ferable resistance to newer β-lactam agents in Entero-bacteriaceae: hospital prevalence and susceptibility patterns. Rev Infect Dis 1988; 10:867-78.
19. Kado CI, Liu ST. Rapid procedure for detection and isolation of large and small plasmids. J Bacteriol 1981; 145:1365–73.
20. Ausubel FM, Brient R, Kingston RE, et al. Short Pro-tocols in Molecular Biology. 2nded. New York:John
Willey and Sons, 1995.
21. Arlet G, Philippon A. Construction by polymerase chain reaction and use of intragenic DNA probes for three main types of transferable β-lactamases (TEM, SHV, CARB). FEMS Microbiol Lett 1991; 82:19-26. 22. Aarestrup FM, Lertworapreecha M, Evans MC, et al.
Antimicrobial susceptibility and occurrence of resis-tance genes among Salmonella enterica serovar Wel-tevreden from different countries. J Antimicrob Che-mother 2003; 52:715–8.
23. White PA, McIver CJ, Rawlinson WD. Integrons and gene cassettes in the Enterobacteriaceae. Antimicrob Agents Chemother 2001; 45:2658-61.
24. Arlet G, Brami G, Décrè D, et al. Molecular characte-rization by PCR-restriction fragment length polymorp-hism of TEM β-lactamases. FEMS Microbiol Lett 1995; 134:203-8.
25. Usluer G, Bafl›büyük N, Çolak H, Akflit F. Antimicro-bial sensitivity of some gram-negative bacterial strains causing hospital or community-acquired infections. Mikrobiyol Bul 1993; 27:221-7.
26. Özyurt M, Haznedaro¤lu T, Sahiner F, et al. Antimic-robial resistance profiles of community-acquired uro-pathogenic Escherichia coli isolates during 2004-2006 in a training hospital in ‹stanbul. Mikrobiyol Bul 2008; 42:231-43.
27. Özgümüfl OB, Çelik-Sevim E, Alpay-Karaoglu, S, Sandall› C, Sevim A. Molecular characterization of an-tibiotic resistant Escherichia coli strains isolated from tap and spring waters in a coastal region in Turkey. J Microbiol 2007; 45:379-87.
28. Sivri N, Kose E, Feyzioglu AM. Modeling the effects of industrial discharged waters to Degirmendere River (South Eastern Black Sea). J Sci Ind Res 2006; 65:632–8.
29. Bush K, Jacoby GA. Nomenclature of TEM β-lacta-mases. J Antimicrob Chemother 1997; 39:1-3. 30. Sirot D, Recule C, Chaibi EB, et al. Complex mutant
of TEM-1 β-lactamase with mutations encountered in both IRT-4 and extended spectrum TEM-15, produced by an Escherichia coli clinical isolate. Antimicrob A-gents Chemother 1997; 41:1322-5.
31. Sanders CC, Sanders WE. β-lactam resistance in gram negative bacteria: global trends and clinical impact. Clin Infect Dis 1992; 15:824-39.
32. Özgümüfl OB, Tosun ‹, Ayd›n F, K›l›ç, AO. Non-conju-gative plasmids encoding TEM-type β-lactamase in clinical isolates of Escherichia coli. ‹nfek Derg 2002; 16:329–3.
33. Medeiros AA. Evolution and dissemination of β-lacta-mases accelerated by generations of β-lactams. Clin Infect Dis 1997; 24 (suppl 1): S19-45.
34. Özgümüfl OB, Tosun ‹, Ayd›n F, K›l›ç AO, Ertürk M. Carriage of mobilizable plasmid-mediated β-lactamase gene in ampicillin-resistant Escherichia coli strains with origin of normal fecal flora. Turk J Med Sci 2006; 36:307–14.
35. Livermore DM. β-Lactamases in laboratory and clini-cal resistance. Clin Microbiol Rev 1995; 8:557-84. 36. Gür D, Gülay Z, Ar›kan AÖ, et al. Resistance to newer
ß-lactams and related ESBL types in gram-negative nosocomial isolates in Turkish hospitals: results of the multicentre HITIT study. Mikrobiyol Bul 2008; 42:537-44.
37. Song JS, Jeon JH, Lee JH, et al. Molecular characteriza-tion of TEM-type β-lactamase identified in cold-seep sediments of Edison Seamont (South of Lihir Island, Papua New Guinea). J Microbiol 2005; 43:172-8. 38. Alpay-Karaoglu S, Özgümüfl OB, Sevim E, Kolayli F,
Sevim A, Yeflilgil P. Investigation of antibiotic resis-tance profile and TEM-type β-lactamase gene carriage of ampicillin-resistant Escherichia coli strains isolated from drinking water. Ann Microbiol 2007; 57:281-8.
39. Cardonha AMS, Viera RHSF, Rogrigues DP, Macrae A, Peirano G, Teophilo GND. Fecal pollution in water from storm sewer and adjacent seashores in Natal, Rio Grande do Norte, Brazil. Int Microbiol 2004; 7:231-8. 40. Kasper CW, Burgess JL, Knight IT, Colwell RR.
Anti-biotic resistance indexing of Escherichia coli to iden-tify sources of fecal contamination in water. Can J Microbiol 1990; 36:891–4.
41. Grigsby P, Calkins J. The inactivation of a natural po-pulation of coliform bacteria by sunlight. Photochem Photobiol 1980; 31:291-4.
42. Chopra I, Roberts M. Tetracycline antibiotics: mode of action, applications, molecular biology, and epidemi-ology of bacterial resistance. Microbiol Mol Biol Rev 2001; 65:232–60.
43. Guardabassi L, Dijkshoorn L, Collard JM, Olsen JE, Dalsgaard A. Distribution and in-vitro transfer of tet-racycline resistance determinants in clinical and aqu-atic Acinetobacter strains. J Med Microbiol 2000; 49:929–36.
44. Dang H, Zhang X, Song L, Chang Y, Yang G. Molecu-lar determination of oxytetracycline-resistant bacteria and their resistance genes from mariculture environ-ments of China. J Appl Microbiol 2007; 103:2580–92. 45. Taylor DE, Chau A. Tetracycline resistance mediated
by ribosomal protection. Antimicrob Agents Chemot-her 1996; 40:1–5.
46. Özgümüfl OB, Caylan R, Tosun I, Sandalli C, Aydin K, Koksal I. Molecular epidemiology of clinical Pseudo-monas aeruginosa isolates carrying the IMP-1 metal-lo-β-lactamase gene in a university hospital in Turkey. Microb Drug Resist 2007; 13:191-8.
