T.C.
GAZĠOSMANPAġA ÜNĠVERSĠTESĠ
Bilimsel AraĢtırma Projeleri KomisyonuSonuç Raporu
Proje No:2011/88 Projenin BaĢlığı
OBEZĠTE OLUġTURULAN RATLARDA TESTESTERON VE MELATONĠNĠN TESTĠS ÜZERĠNDEKĠ ETKĠSĠNĠN DEĞERLENDĠRĠLMESĠ
Proje Yöneticisi
Yrd. Doç. Dr. Doğan ATILGAN Birimi
Üroloji
AraĢtırmacılar ve Birimleri
Doç. Dr. Bekir Süha PARLAKTAġ Üroloji Anabilim Dalı
Doç. Dr. Nihat ULUOCAK Üroloji Anabilim Dalı
Doç. Dr. Fikret ERDEMĠR Üroloji Anabilim Dalı
AraĢ. Gör. Dr. ġahin KILIÇ Üroloji Anabilim Dalı
Doç. Dr. Hüseyin ÖZYURT Tıbbi Biyokimya Anabilim Dalı
Doç. Dr. RaĢid Doğan KÖSEOĞLU Tıbbi Patoloji Anabilim Dalı
T.C.
GAZĠOSMANPAġA ÜNĠVERSĠTESĠ
Bilimsel AraĢtırma Projeleri KomisyonuSonuç Raporu
Proje No:2011/88 Projenin BaĢlığı
OBEZĠTE OLUġTURULAN RATLARDA TESTESTERON VE MELATONĠNĠN TESTĠS ÜZERĠNDEKĠ ETKĠSĠNĠN DEĞERLENDĠRĠLMESĠ
Proje Yöneticisi
Yrd. Doç. Dr. Doğan ATILGAN Birimi
Üroloji
AraĢtırmacılar ve Birimleri
Doç. Dr. Bekir Süha PARLAKTAġ Üroloji Anabilim Dalı
Doç. Dr. Nihat ULUOCAK Üroloji Anabilim Dalı
Doç. Dr. Fikret ERDEMĠR Üroloji Anabilim Dalı
AraĢ. Gör. Dr. ġahin KILIÇ Üroloji Anabilim Dalı
Doç. Dr. Hüseyin ÖZYURT Tıbbi Biyokimya Anabilim Dalı
Doç. Dr. RaĢid Doğan KÖSEOĞLU Tıbbi Patoloji Anabilim Dalı
Amaç: Bu çalışmada sıçan testislerinde, obezite ile indüklenen oksidatif hasara karşı kilo kaybı ve melatoninin antioksidan etkilerinin değerlendirilmesi amaçlandı.
Materyal ve Yöntem: Wistar albino cinsi 28 adet erkek sıçan; Kontrol grubu (Grup 1), Obezite grubu (Grup 2), Obezite + melatonin (MLT) grubu (Grup 3) ve Kilo kaybettirilen grup (Grup 4) olmak üzere 7' şerli 4 gruba ayrıldı. Bütün sıçanlar çalışmanın başlangıcında ve sonunda tartıldı. Tüm sıçanlara bilateral orşiektomi uygulandı ve vena cava inferior (VCI) yoluyla her sıçandan yaklaşık olarak 5 cc kan örneği alındı. Testiküler dokularda ve serum örneklerinde süperoksit dismutaz (SOD), malondialdehit (MDA) ve protein karbonil (PC) biyokimyasal analizleri yapıldı. Spermatogenez testis dokularında Johnsen Skorlama Sistemi ile değerlendirildi.
Bulgular: Her bir grup için sıçan başı ortalama ağırlık artışı sırasıyla 12,3 gr / sıçan, 68,6 gr / sıçan, 71,4 gr / sıçan ve72,9 gr / sıçan olarak değerlendirildi. Dört haftalık normal diyet sonrası sıçan başı ortalama kilo kaybı (Grup 4) 28,2 gr / sıçan olarak hesaplandı. Sham grubu ile kıyaslandığında, testis dokusu ve serum MDA, PC ve SOD aktivitesi düzeyleri obezite grubunda artış gösterdi (p <0,05). Kilo kaybı ve melatonin tedavisi ile testiküler doku ve serumda MDA, PC ve SOD düzeyleri anlamlı olarak düzelme gösterdi (p < 0,05). Ortalama Johnsen skoru açısından gruplar arasında anlamlı bir fark saptanmadı (p = 0,727).
TartıĢma: Bu çalışmanın sonuçları göstermiştir ki; deneysel oluşturulan obezite oksidatif strese sebep olur ve hem melatonin hem de kilo kaybı sıçan testislerinde OS' yi azaltır.
Anahtar kelimeler: Obezite, Oksidatif stres, Testis, Melatonin, Kilo kaybı * Bu çalışma Gaziosmanpaşa Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Komisyonu tarafından desteklenmiştir. (Proje No: 2011/88)
Aim: The aim of this study was to evaluate the antioxidant effects of weight loss and melatonin on the obesity induced oxidative damage in rat testes.
Materials and Methods: 28 male Wistar albino rats were randomly divided into 4 groups each consisting of 7 rats. Control group (Group 1), Obesity group (Group 2), Obesity+melatonin (MLT) group (Group 3). weight loss group (Group 4). All of the rats were weighed at the beginning and at the end of the study. Bilateral orchiectomy was performed and approximately 5 cc blood samples were obtained from the vena cava inferior (VCI) of all the rats. Biochemical analysis of superoxide dismutase (SOD), malondialdehyde (MDA) and protein carbonyl (PC) were performed in the testicular tissues and serum. Spermatogenesis was evaluated with Johnsen Scoring System in testicular tissues.
Results: Mean weight gains were 12,3 gr/rat, 68,6 gr/rat, 71,4 gr/rat and 72,9 gr/rat for each group respectively. Mean weight loss after 4 weeks of normal diet was 28,2 gr/rat in Group 4 (weight-loss) rats. The testicular tissue and serum levels of MDA, PC and SOD activity were increased in the obesity group in comparison to sham-operated group (p< 0.05). Weight-loss and melatonin treatment ameliorated MDA, PC and SOD levels in testicular tissue and serum significantly (p < 0.05). There was no significant difference between groups in terms of mean Johnsen score (p= 0,727).
Conclusion: The results of this study showed that; experimentally created obesity caused oxidative stress and both melatonin and weight loss reduced OS in rat testes.
Key words: Obesity, Oxidative stres, Testis, Melatonin, Weight-loss
Sayfa ÖZET i ABSTRACT ii ĠÇĠNDEKĠLER iii KISALTMALAR iv TABLOLAR v 1. GĠRĠġ 1 2. GENEL BĠLGĠLER 3
2. 1. Obezitenin Tanımı ve Sınıflandırılması 3
2. 2. Obezite Tipleri 3
2. 3. Obezite ve Sperm Bozuklukları 3
3. MATERYAL VE YÖNTEM 5
3. 1. Biyokimyasal analizler 6
3. 2. Doku süperoksit dismutaz (SOD) aktivitesi tayini 6 3. 3. Malondialdehit (MDA) düzeyinin belirlenmesi 7
3. 4. Doku protein karbonil tayini (PC) 7
3. 5. Histopatolojik inceleme 7 3. 6. İstatistiksel analiz 8 4. BULGULAR 9 5. TARTIġMA 12 6. KAYNAKLAR 15 KISALTMALAR
BMI : vücut kitle indeksi DNA : deoksiribonükleik asit GSH-Px : glutatyon peroksidaz i.p. : intraperitoneal MDA : malondialdehit MLT : melatonin
NBT : nitroblue tetrazolium NOS : nitrik oksit sentaz OS : oksidatif stres PC : protein karbonil ROS : reaktif oksijen türleri SOD : süperoksit dismutaz TBA : tiyobarbitürik asit
T/E : testosteron/östradiol oranı VCI : vena kava inferior WHO : Dünya Sağlık Örgütü
Sayfa Tablo 1. Modifiye Johnsen skorlaması için histolojik kriterler 6 Tablo 2. Çalışmanın başlangıcında ve sonunda sıçanlar ağırlıkları 9 Tablo 3. Doku MDA, PC seviyeleri ve SOD aktiviteleri 10 Tablo 4.Tüm grupların serum SOD, MDA ve PC düzeyleri 11 Tablo 5. Johnsen skorları ve istatistiksel analiz sonuçları 11
1. GĠRĠġ
Obezite adipoz dokuda aşırı yağ birikimidir ve her iki cinsiyeti ve yaş grubunu etkileyen dünyadaki en önemli sağlık sorunlarından biridir (Kopelman, 2000). WHO‟ ya (Dünya Sağlık Örgütü) göre fazla kiloluluk ve obezite; diyabet, kardiyovasküler hastalıklar, kanser, bazı reprodüktif ve metabolik bozukluklar da dahil olmak üzere bir dizi kronik hastalıklar için major risk faktörleridir. Fazla kiloluluk ve obezite önceleri sadece yüksek gelirli ülkelerde bir sorun olarak kabul edilirken, artık özellikle kentsel yerleşkeler olmak üzere düşük ve orta gelirli ülkelerde dramatik olarak artış göstermektedir (WHO, 2000).
Artmış BMI (vücut kitle indeksi) ile semen kalitesinde bozulma (Hammiche ve ark., 2012), azalmış sperm konsantrasyonu (Sekhavat ve Moein 2010; Jensen ve ark., 2004; Paasch ve ark., 2010; Sermondade ve ark., 2012), azalmış normal-motil sperm sayısı ve artmış DNA (deoksiribonükleik asit) fragmantasyon indeksi (Evenson ve ark., 1999; Chavarro ve ark., 2010) arasındaki ilişki son zamanlarda birçok çalışmada gösterilmiştir. Bu sonuçların aksine, obezite ile sperm konsantrasyonu, motilitesi veya morfolojisi arasında hiçbir ilişkinin olmadığını iddia eden diğer bazı çalışmalar da vardır (Aggerholm ve ark., 2008; Duits ve ark., 2010; McDonald ve ark., 2010). Obezite ve erkek infertilitesi arasındaki ilişkiyi tanımlayan mekanizmalar hala yeterince açıklayıcı değildir. Artmış DNA fragmantasyonu, oksidatif stres (OS) (Kodamave ark., 1997) ve hormonal dengesizlik (Egwurugwu ve ark., 2011; Fejes ve ark., 2006), obezite ile ilişkili sperm anormalliklerinin olası mekanizmaları olarak öne sürülmüştür.
Oksidatif hasar, yerel ve uzak dokularda tahribata yol açan karmaşık bir fenomendir. Reaktif oksijen türlerinin (ROS) ve/veya serbest radikallerin vücuttaki doğal antioksidan savunma mekanizmalarını aşan aşırı üretimi olduğunda oksidatif hasar gelişir. OS hücre zarlarında değişikliklere yol açarak, dokularda geri döndürülemez hücresel hasara neden olan önemli yıkıcı etkiler yapabilir. Sonuç olarak oksidatif hasar, sırasıyla lipid peroksidasyonu ve protein oksidasyonu son ürünleri olan malondialdehit (MDA) ve protein karbonilin (PC) doku düzeylerinde artışa neden olur (Migdal ve Serres, 2011). Birçok çalışmada obezitenin OS' ye ve doku hasarına yol açtığı gösterilmiştir (Sikka, 2001; Erdemir ve ark., 2012). Epifiz bezinin ana sekretuvar ürünü olan melatonin (MLT) (N-asetil-5-metoksitriptamin), biyolojik saatin düzenleyicisidir ve güçlü bir antioksidan aktiviteye sahiptir (Tan, 1993). Melatoninin OS ve lipid peroksidasyonunu azaltan koruyucu rolü çeşitli deneysel modellerde rapor edilmiştir. Biz bu çalışmada kilo kaybının antioksidan etkilerini, sıçan testislerinde obezitenin neden olduğu oksidatif hasara karşı güçlü bir antioksidan ajan olarak bilinen melatonin ile karşılatırarak göstermek istedik.
2. GENEL BĠLGĠLER
2. 1. Obezitenin Tanımı ve Sınıflandırılması
Dünya Sağlık Örgütü (WHO) tarafından obezitenin tanımı şu şekilde yapılmıştır: “Sağlığı bozacak ölçüde yağ dokularında anormal veya aşırı miktarda yağ birikmesidir”. Diğer bir deyimle obezite vücut yağ oranının artması ve davranış, endokrin ve metabolik değişikliklerle karakterize kompleks, multifaktöryel bir hastalıktır. Obezite özelliklerine göre birkaç farklı şekilde sınıflandırılabilir (Kandemir, 2000). Bunlar: 1. Yağ dokusunun dağılımı ve anatomik özelliklerine göre,
2. Obezitenin başlama yaşına göre,
3. Etyolojide rol oynayan faktörlere göre olarak ayrılabilir.
2. 2. Obezite Tipleri
Yapılan çalışmalarda vücuttaki yağ birikiminin vücudun farklı iki bölgesinde olduğu gösterilmiştir. Daha sonraları obezite komplikasyonlarının ortaya çıkması ile vücutta yağ dağılımı arasında bir ilişki olduğu bulunmuştur. İlk kez 1940‟larda Jean Vaque obezitede vücudun üst kısmında yağ toplanmasnın daha zararlı etkileri olduğunu ve yine ilk kez „Mascuine tip‟‟ (Erkek tipi) yağlanmanın, yani göbek çevresinde yağ toplanmasının diabetes mellitus, ateroskleroz, gut ve ürat taşlarına yol açtığına dikkat çekmiştir (Vague, 1956).
Çeşitli çalışmaların sonuçları, kilolu erkeklerde anormal semen parametrelerinin oranının arttığını ve erkek partnerinin obez olduğu çiftlerde subfertilite riskinin arttığını işaret etmektedirler. Dolayısıyla obezite, infertilitenin erkek faktörü insidansıyla daha yakından ilişkilidir. Erkek infertilitesinde obezitenin etkisi için hesaba katılabilecek çeşitli mekanizmalar; uyku apne sendromu, hormonal profildeki değişiklikler (yüksek östrojen düzeyleri ile birlikte azalmış inhibin B ve androjen düzeyleri), semen parametrelerini etkileyen skrotal ısı artışlarıdır (De Plessis ve ark, 2010). İnfertilite nedeniyle değerlendirilen çiftlerin %30-50„sinde bozulmuş sperm üretimi veya kalitesine rastlanılmaktadır. Bu erkeklerin, azoospermik ya da oligoospermik semen analiz sonuçları olabildiği gibi sperm fonksiyonlarında kalitatif defektlerde olabilmektedir. Spermatogenezin bozulmasının hormonal faktörlere bağlı olabileceği ve bununla ilişkili olarak bazı olgularda düzeltilebilir hormonal bozukluklar tespit edildiği bilinmektedir. Non-obstruktif azoospermik hastaların tipik hormon profili artmış FSH seviyesiyle birlikte normal yada düşük testosteron seviyesidir. Ciddi erkek infertilitesi gösteren oligoospermik ve azoospermik hastaların bir bölümünde testosteron düzeyleri normal ve düşük seviyeler gösterirken östradiol seviyesinde artış ve fertil populasyona göre testosteron/ östradiol oranında düşüklükte bulunabilir. Testosteron spermatogenezin normal gelişiminde gerekli olduğu için düşük testosteron ve yüksek estradiol seviyesi kombinasyonunun spermatogenezi bozucu etki gösterebileceği bildirilmektedir (Raman ve ark, 2002).
3. MATERYAL VE YÖNTEM
Yerel etik kurul izni alındıktan sonra çalışmada, ortalama 5,5-6 aylık toplam 28 erkek Wistar albino cinsi sıçan kullanılmıştır. Deney hayvanları çalışma boyunca 12 saat aydınlıkta, 12 saat karanlıkta 18-22 °C' de muhafaza edildi. Tüm cerrahi işlemler steril şartlarda, xylazine ve ketamin anestezisi altında yapıldı ve tüm ratlar deneysel prosedürlerden sonra sakrifiye edildi.
Sıçanlar her biri 7 sıçandan oluşan dört gruba ayrıldı. Grup 1' e (sham - kontrol grubu, n = 7) biyokimyasal ve histolojik değerlendirmede bazal değerleri belirlemek için bir sham operasyonu uygulandı. Bilateral orşiektomi orta hat insizyon ile yapıldı. Grup 2 (obezite grubu, n = 7) obezite ile indüklenen oksidatif hasarı oluşturmak için tasarlandı ve bu grup 8 hafta boyunca yüksek kalori ve yağ içeren diyet ile beslendi. Sekiz hafta sonra bilateral orşiektomi yapıldı. Grup 3 (Obezite+MLT grubu, n = 7) obez ratlarda antioksidan parametreler üzerine melatoninin etkisini belirlemek amacıyla tasarlandı ve bu grup ta aynı dönem için yüksek kalori ve yağ içeren diyet ile beslendi. Deneyin 8. haftasında cerrahi prosedürden önceki 30 dk içinde tek bir doz melatonin (50 mg / kg, ip) uygulandı ve bilateral orkiektomi yapıldı. Grup 4 (kilo kaybı grubu, n = 7) obez ratlarda oksidatif parametreler üzerine kilo kaybının etkilerini göstermek için tasarlandı ve bu grup, yüksek kalori ve yağ içeren diyet ile başladıktan 8 hafta sonra, 4 haftalık bir ek süre için standart pelet diyet ile beslendi. Oniki hafta sonra bilateral orşiektomi yapıldı.
Bütün sıçanlar çalışmanın başlangıcında ve sonunda tartıldı ve veriler kaydedildi. Her sıçan için testisler % 10'luk formaldehit solüsyonunda tespit edildi ve biyokimyasal çalışmalar için -70 º C'de muhafaza edildi. Vena cava inferior (VCI) yoluyla her sıçandan yaklaşık olarak 5 cc kan örneği alındı. Testiküler dokularda ve serum örneklerinde süperoksit dismutaz (SOD), malondialdehit (MDA) ve protein karbonil (PC) biyokimyasal analizleri yapıldı. Spermatogenez testis dokularında Johnsen Skorlama Sistemi ile değerlendirildi (Tablo 1).
Tablo 1: Modifiye Johnsen skorlaması için histolojik kriterler
• (Skor -10) Tam spermatogenez
• (Skor - 9) Hafif bozulmuş spermatogenez, çok sayıda geç spermatid • (Skor - 8) Tübülde beşten az spermatozoa, az sayıda geç spermatid • (Skor -7) Spermatozoa yok, geç spermatid yok, çok sayıda erken spermatid • (Skor - 6) Spermatozoa yok, geç spermatid yok, birkaç erken spermatid • (Skor - 5) Spermatozoa ya da spermatid yok, çok sayıda spermatosit • (Skor - 4) Spermatozoa ya da spermatid yok, birkaç spermatosit • (Skor - 3) Sadece spermatogonium var
• (Skor - 2) Germinal hücre yok, sadece Sertoli hücreleri var • (Skor - 1) Hiç seminifer epitel yok
3. 1. Biyokimyasal analizler
Testis dokuları 0.50 ml/l Triton x-100 içeren tris–HCl tampon (50 mM, pH 7.4) içinde beşli hacimler halinde homojenize edildi. Homojenizasyon işlemi (homogenizer: IKA Ultra-Turrax t 25 Basic, Germany) 4 °C de, 13,000 rpm'de 2 dakika için gerçekleştirildi. Homojenat, süpernatant (üstte kalan kısım) ve ayıklanan numuneler hazırlandı ve Sigma (St. Louis, ABD) marka ticari kimyasal madde kullanılarak sonuçlar elde edildi. Örneklerdeki protein ölçümleri başka bir bölümde açıklanan yönteme göre yapıldı.
3. 2. Doku süperoksit dismutaz (SOD) aktivitesi tayini
Total (Cu-Zn, Mn) SOD (EC 1.15.1.1) aktivitesi; prensibi süperoksit jeneratör yardımıyla, ksantin-ksantin oksidaz sistemi tarafından nitroblue tetrazolyum (NBT) azaltma inhibisyonuna dayanan, Sun ve ark. (1988) çalışmalarındaki yönteme göre tayin edildi. Aktivite, 1.0 ml kloroform-etanol karışımına (5/3, v / v) aynı hacimde numune ilave edildikten sonra santrifüj edilmesiyle oluşan süpernatantın etanol fazında değerlendirildi. Bir ünite SOD, NBT redüksiyon oranında % 50 inhibisyonuna neden olan miktar olarak tanımlandı ve SOD aktivitesi, testis dokusu için U / mg protein olarak ifade edildi.
3. 3. Malondialdehit (MDA) düzeyinin belirlenmesi
Doku tiyobarbitürik asit reaktif madde düzeyi, 90-100 ° C' de tiobarbitürik asit (TBA) ile reaksiyona dayanan bir yöntem ile belirlendi (Esterbaur ve Cheeseman, 1990). TBA test reaksiyonu, 2-3 pH ve 90 ° C' de 15 dakika süreyle yapıldı. Reaksiyonda MDA veya MDA benzeri maddeler ve TBA, maksimum 532 nm absorpsiyonda pembe bir pigment üreten tepki gösterdi. Örnek, proteinleri çökeltmek için soğuk % 10 (w / v) trikloroasetik asitin ikili hacimleri halinde karıştırıldı. Çökelti santrifüj ile pelet haline getirildi ve süpernatantın bir alikotu, kaynayan su banyosunda 10 dk boyunca eşit hacimli 0.67% (w/v) TBA ile reaksiyona sokuldu. Soğutulduktan sonra absorbans 532 nm'de okundu. Sonuçlar testis dokusu için, standart solüsyon (1, 1, 3, 3-tetramethoxypropane) ile ede edilen ölçümlerle hazırlanmış standart grafiklere göre, nmol / g yaş doku olarak ifade edildi.
3. 4. Doku protein karbonil tayini (PC)
Karbonil içeriği, temeli 2,4-dinitrofenilhidrazone oluşturmak üzere karbonil grubu ile 2,4-dinitrofenilhidrazin arasındaki reaksiyona dayanan spektrofotometrik (Cintra 10 E, Austria) ölçümle belirlendi (Levin ve ark., 1990). Sonuçlar testis dokusu için nmol / ml olarak verildi.
3. 5. Histopatolojik inceleme
Testisler% 10'luk formaldehit solüsyonunda tespit edildi. Dokular parafine gömme için işlendi ve 5 mikron kalınlığında kesitler hematoksilen eozin ile boyandı. Kesitler; genel mimari, spermatogenez, seminifer tübül bazal membranı ve Leydig hücre hiperplazisi varlığı ya da yokluğu açısından analiz edildi. Seminifer tübüller Johnsen skorlama sistemine göre derecelendirildi. Her testis için yirmi tubuler kesit değerlendirildi ve ortalama Johnsen skoru hesaplandı. Normal ortalama Johnsen skoru 9.39 üzeri skor olarak kabul edildi.
3. 6. Ġstatistiksel analiz
Gruplar arasındaki biyokimyasal ve histopatolojik parametreler Kruskall-Wallis testi kullanılarak karşılaştırıldı. Kruskall-Wallis testi sonuçları anlamlı olduğunda, eşleştirilmiş karşılaştırmalarda Bonferroni düzeltilmiş Mann-Whitney U testi kullanıldı. Sürekli değişkenler ortalama ± standart sapma ve aralık (min-max değerleri) olarak sunuldu. P-değeri <0.05 anlamlı olarak kabul edildi. Analizler ticari bir yazılım (IBM SPSS Statistics 20, SPSS Inc., Bir IBM Co, Somers, NY) kullanılarak yapıldı.
4. BULGULAR
Çalışmanın başlangıcında ve sonunda sıçanların ağırlıkları Tablo 2' de de sunulduğu gibi; yüksek kalorili 8 hafta diyet sonrası her bir grup için ortalama ağırlık artışları sırasıyla 12.3 gr / sıçan, 68,6 gr / sıçan, 71,4 gr / sıçan ve 72,9 gr / sıçan olarak tespit edildi ve Grup 4' ün ek olarak 4 hafta normal pelet diyet sonrası ortalama kilo kaybı 28,2 gr / sıçan olarak gözlendi.
Tablo 2: ÇalıĢmanın baĢlangıcında ve sonunda sıçanlar ağırlıkları Grup BaĢlangıç
ağırlığı (gr/rat)
Yüksek kalorili 8 hafta diyet sonrası
ağırlık (gr/rat) Ek olarak 4 hafta normal diyet sonrası ağırlık (gr/rat) Fark (gr/rat) Kontrol 311,4 323,7 --- +12,3 Obezite 314,3 382,9 --- +68.6 Obezite +MLT 320 391,4 --- +71,4 Kilo kaybı grubu 315,7 388,6 360,4 +72.9 (-28,2)*
* Kilo kaybı sonrası ortalama fark
Tüm grupların testiküler doku MDA, SOD ve PC sonuçları ve analiz değerleri Tablo 3' te de sunulduğu gibi; sham grubu ile kıyaslandığında testiküler doku MDA ve PC düzeyleri obezite grubunda artmıştır (p< 0.05) ve kilo kaybı ve melatonin tedavisi testiküler doku MDA ve PC düzeylerini anlamlı bir şekilde düzeltmiştir (p < 0.05). Ayrıca obezite grubunda artan SOD aktivitesinin kilo kaybı ve melatonin tedavisi ile azaldığı görülmüştür (p <0.05).
Tablo 3: Doku MDA, PC seviyeleri ve SOD aktiviteleri Grup 1 (n=7) Grup 2 (n=7) Grup 3 (n=7) Grup 4 (n=7) p SOD (U/mg protein) 0.008±0.002 (0.006-0.011) 0.035±0.009 (0.018-0.044) a 0.014±0.007 (0.007-0.026) b 0.014±0.002 (0.011-0.016) b 0.001 MDA (nmol/g yaĢ doku) 20.10±11.69 (9.31-40.2) 42.36±12.28 (28.46-61.52) a 23.65±6.46 (15.27-32.64) b 21.05±15.33 (12.28-51.88)b 0.017 Protein karbonil (nmol/mg prot) 2.90±0.70 (1.69-3.84) 4.59±0.78 (3.49-5.48) a 3.66±0.84 (2.68-4.89)b 3.55±0.95 (2.16-4.78)b 0.038
Veriler ortalama ± standart sapma ve aralıkta (min-max) gösterildi.
a: Grup 1' e göre istatistiksel anlamlı fark. b: Grup 2 ' ye göre istatistiksel anlamlı fark.
Tablo 4' te tüm grupların serum MDA, SOD ve PC değerleri sunulmuştur. Sham grubu ile kıyaslandığında serum MDA ve PC düzeyleri obezite grubunda artmış olarak görüldü (p< 0.05). Kilo kaybı ve melatonin tedavisi serum MDA ve PC düzeylerini anlamlı bir şekilde düzeltmiştir (p< 0.05). Testiküler doku düzeylerindekine benzer olarak, obezite grubunda serum SOD aktivitesi artmıştır ve kilo kaybı ile melatonin tedavisi grubunda ise SOD aktivitesinin azaldığı görülmüştür (p <0.05).
Tablo 4: Tüm grupların serum SOD, MDA ve PC düzeyleri Group 1 (n=7) Group 2 (n=7) Group 3 (n=7) Group 4 (n=7) p SOD (U/mg protein) 1.93±1.71 (0.22-5.1) 5.72±1.59 (3.52-7.51) a 1.81±0.18 (1.63-2.11) b 1.84±0.68 (1.22-3.14) b 0.006 MDA (µmol/L) 4.06±0.58 (3.43-5.01) 8.68±1.16 (6.45-9.87) a 4.59±1.92 (3.07-8.29) b 4.73±1.71 (3.22-8.08) b 0.006 Protein karbonil (nmol/ml) 1403.6±397.4 (1073.5-2109.8) 2358.2±190.1 (2071.6-2597.1) a 1688.4±204.6 (1453.1-2053.1) b 1826.9±317.7 (1389.8-2214.6)b 0.003
Veriler ortalama ± standart sapma ve aralıkta (min-max) gösterildi.
a
: Grup 1' e göre istatistiksel anlamlı fark. b: Grup 2 ' ye göre istatistiksel anlamlı fark..
Testiküler dokuların histopatolojik incelemesinde, ortalama Johnsen skoru açısından tüm gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı fark görülmedi (Tablo 5). Ancak melatoninin tedavisi ve kilo kaybının, obezite grubuna kıyasla ortalama Johnsen skorunda hafif iyileşmeye neden olduğu izlendi.
Tablo 5: Johnsen skorları ve istatistiksel analiz sonuçları Group 1 (n=7) Group 2 (n=7) Group 3 (n=7) Group 4 (n=7) p Johnsen Skor 9.05±0.37 (8.7-9.6) 8.68±0.89 (7.4-9.6) 8.83±0.37 (8.3-9.2) 9.1±0.39 (8.6-9.7) 0.727
5. TARTIġMA
Obezite dünya çapında yaygın hastalık haline gelmiş önemli bir sağlık sorunu olarak kabul edilmektedir. Çeşitli sistemik hastalıklar ile obezite ilişkisi iyi bilinmesine rağmen, obezite ve erkek üreme bozuklukları arasındaki ilişki belirsizdir. Bu ilişkiyi netleştirmek için son yıllarda birçok çalışma yapılmıştır (Sermondade ve ark., 2012; Qin ve ark., 2007).
Obezite nedeniyle gelişen sistemik OS hem deneysel hem de klinik çalışmalarda gösterilmiştir. Enflamatuar sitokinlerin önemli bir kaynağı olan makrofajların infiltrasyonunun adipoz dokuda ROS üretiminin ana nedeni olduğunu belirtilmektedir (Weisberg ve ark., 2003) (Xu ve ark., 2003). Furukawa ve ark. (2004) diyabetik olmayan insan deneklerde yağ birikimi ile sistemik OS belirteçlerinin yakından ilişkili olduğunu ve birikmiş yağ dokuda OS artışının, adipositokinlerin disregüle üretimi ve adipoz dokuda ROS üretiminin seçici artışına neden olduğunu gösterdi. Bundan dolayı, birikmiş yağ dokudan periferik kana artmış ROS sekresyonu, obezitedeki sistemik OS' nin nedeni olabilir.
Mitokondriyal sitokrom oksidaz, nikotinamid adenin dinükleotid fosfat oksidaz, ksantin oksidaz, lipooxygenase, siklooksijenaz, hemeoxygenase, sitokrom P-450 enzimleri, nitrik oksit sentaz (NOS) ve diğer çeşitli oksidaz enzimleri tarafından üretilen ROS, sperm kapasitasyonunu ve akrozom reaksiyonu gibi normal üreme fonksiyonları için gerekli olsada, yüksek konsantrasyonlarda yan etkilere yol açar (Aitken ve ark., 2004; Allamaneni ve ark., 2004; Agarwal ve Saleh, 2004). Çoklu doymamış yağlar bakımından zengin membranları nedeniyle, spermatid ve olgun spermatozoalar ROS' a oldukça duyarlıdır (Agarwal ve ark., 1994). Bu yüzden, OS durumlarında artmış ROS düzeylerine bağlı olarak sperm hareketliliği ve morfoloji bozulabilir, sperm ölümü meydana gelebilir (Zalata ve ark., 2004). Membran lipid peroksidasyonu, ROS-bağlı doku hasarını en güvenilir göstergelerinden biri olan MDA gibi reaktif karbonil bileşikleri oluşturabilir (Esterbaur ve Cheeseman, 1990). Buna ek olarak; protein yapıların oksidatif hasarı veya amino asitlerin direkt oksidasyonu sonucu olan PC düzeyi, DNA fragmentasyonu göstergesi olarak kabul edilir (Levine ve ark., 1990). Bu
çalışmada; sistemik dolaşımda ve testis dokularında obezitenin indüklediği ROS seviyelerindeki artış ve yüksek vücut ağırlıkları ile gösterilen, yüksek yağlı diyetin obeziteyi teşvik etmede etkili olduğunu gözlemledik. Antioksidan enzim düzeyleri ROS' u telafi etmek için yükseldi ve bu durum artmış ROS seviyelerinin dolaylı bir göstergesi oldu. Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında obez ratların kan ve testis dokularında artmış SOD, PC ve MDA düzeyleri, obezitenin serum ve testis dokusunda ortaya çıkmış sistemik OS oluşturduğunu göstermiştir.
Çalışmada ortalama Johnsen skorlar açısından obezite, obezite+ MLT ve kilo kaybı grupları arasında istatistiksel olarak anlamlı fark saptanmadı. Ancak obezite grubuna göre kıyaslandığında, obezite+MLT ve kilo kaybı gruplarında ortalama Johnsen skorları kontrol grubuna daha yakın olarak izlendi. Bu verilere göre obezite grubunda görülen Johnsen skorunda bozulmanın, sperm hücrelerinin çarpık membran yapısı ve OS nedeniyle artmış DNA fragmantasyonu sonucu olabileceği iddia edilebilir.
Antioksidan özelliklerine bağlı olarak MLT, ROS' u temizlemede antioksidan enzimlere yardımcı olur. Bunun bir sonucu olarak obezite+MLT grubunda SOD, MDA ve PC düzeyleri sham grubuna yakın bir seviyeye gerilemiştir. Bu veriler melatoninin, OS' ye bağlı nöromediyatör göçünü azalttığı ve inflamasyon üzerinde yararlı etkileri olduğu görüşünü ortaya çıkarabilir.
Literatürde obeziteye bağlı sperm parametrelerinde bozulma ve OS üzerine, kilo kaybetmenin yaralı etkilerini gösteren sınırlı sayıda çalışma vardır. Dandona ve ark. (2001) çalışmalarında lipid peroksidasyonunun kilit dizinlerinin (TBARS, 9-Hode, ve 13-Hode) yanı sıra, bu dizinlere bağlı proteinler ve amino asitlerde (karbonile proteinler, o-tirosin, ve m-tirozin) oksidatif hasarın normal bireylere göre obezlerde anlamlı olarak daha yüksek olduğunu, önemli diyet kısıtlaması ve kilo kaybı sonrası bu hasarın anlamlı şekilde gerilediğini göstermiştir. Yine aynı çalışmada günlük 1000 kalorilik diyet sonrası, diyet kısıtlaması ve kilo kaybı ile birlikte ROS seviyelerinde belirgin azalma olduğu, bu etkinin diyetin 1. haftasında ortaya çıktığı ve 4 hafta üzerinde devam ettiği görüldü. Ek olarak Mohn ve ark. (2005) prepubertal dönemde ciddi derecede obez çocuklarda, diyet kısıtlaması ve kilo kaybı ile tamamen geriye
dönebilen, yüksek düzeyde değişmiş oksidan / antioksidan durum olduğunu bildirmişlerdir. Hakonsen ve ark. (2011) bir kohort çalışmasında kilo kaybını takiben, değişmiş androjen profilinin gelişme eğiliminde olduğunu ve semen kalitesinde iyileşme sağlandığını işaret etmişlerdir. Biz bu çalışmamızda; obezite grubu ile kıyaslandığında kilo kaybı grubunda SOD, MDA ve PC düzeylerinin anlamlı derecede azaldığını, kontrol grubu, kilo kaybı grubu ve melatonin tedavisi alan grup arasında anlamlı fark olmadığını gördük.
Sonuç olarak, obezite hem testis dokusu hem de sistemik dolaşımda OS' ye neden olmaktadır, ancak sperm morfolojisi üzerine anlamlı etkisi saptanmamıştır. Tek doz güçlü bir antioksidan ajan olan MLT enjeksiyonu ve kilo kaybı ile OS parametrelerinde düşme, sperm morfolojisinde ise biraz düzelme saptanmıştır.
6. KAYNAKLAR
1. Kopelman, PG., 2000. Obesity as a medical problem. Nature, (404, 635-43.)
2. WHO -2000. World Health Organization Part I: The problem of overweight and obesity. World Health Organization. Obesity: preventing and managing the global epidemic Geneva: WHO Technical Report Series, 894.
3. Hammiche, F. , Laven, JS. , Twigt, JM. , Boellaard, WP., Steegers, EA., Steegers-Theunissen RP., 2012. Body mass index and central adiposity are associated with sperm quality in men of subfertile couples. Hum Reprod, 27 (8, 2365-72. )
4. Sekhavat, L., Moein, MR., 2010. The effect of male body mass index on sperm parameters. Aging Male, (13, 155–8.)
5. Jensen, TK., Andersson, AM., Jorgensen, N., Andersen, AG., Carlsen, E., Petersen, JH., Skakkebaek, NE., 2004. Body mass index in relation to semen quality and reproductive hormones among 1,558 Danish men. Fertil Steril, (82,863–70.)
6. Paasch, U., Grunewald, S., Kratzsch, J., Glander, HJ., 2010. Obesity and age affect male fertility potential. Fertil Steril, ( 94, 2898–901.)
7. Sermondade, N., Faure, C., Fezeu, L., Le´vy, R., Czernichow, S., 2012. Obesity-Fertility Collaborative Group. Obesity and increased risk for oligozoospermia and azoospermia. Arch Intern Med, ( 172, 440–2.)
8. Evenson, DP., Jost, LK., Marshall, D., Zinaman, MJ., Clegg, E., Purvis, K., de Angelis, P., Claussen, OP., 1999. Utility of the sperm chromatin structure assay as a diagnostic and prognostic tool in the human fertility clinic. Hum Reprod, 14 (4,1039-49.)
9. Chavarro, JE., Toth, TL., Wright, DL., Meeker, JD., Hauser, R., 2010. Body mass index in relation to semen quality, sperm DNA integrity, and serum reproductive hormone levels among men attending an infertility clinic. Fertil Steril, (93, 2222– 31.)
10. Aggerholm, AS., Thulstrup, AM., Toft, G., Ramlau-Hansen, CH., Bonde, JP., 2008. Is overweight a risk factor for reduced semen quality and altered serum sex hormone profile? Fertil Steril, (90,619–26.)
11. Duits, FH., van Wely, M., van der Veen, F., Gianotten, J., 2010. Healthy overweight male partners of subfertile couples should not worry about their semen quality. Fertil Steril, (94, 1356–9.)
12. McDonald, AA., Herbison, GP., Showell, M., Farquhar, CM., 2010. The impact of body mass index on semen parameters and reproductive hormones in human males: a systematic review with meta-analysis. Hum Reprod, (16, 293–31.)
13. Kodama, H., Yamaguchi, R., Fukuda, J., Kasai, H., Tanaka, T., 1997. Increased oxidative deoxyribonucleic acid damage in the spermatozoa of infertile male patients. Fertil Steril, (68, 519–24.)
14. Egwurugwu, JN., Nwafor, A., Chike, CP., Ufearo, CS., Uchefuna, RC., Iwuji, SC., Okwara, JE., Alawu, EA., 2011. The relationship between body mass index, semen and sex hormones in adult male. Niger J Physiol Sci, (26, 29–34)
15. Fejes, I., Koloszar, S., Zavaczki, Z., Daru, J., Szollosi, J., Pal, A., 2006. Effect of body weight on testosterone/estradiol ratio in oligozoospermic patients. Arch Androl, (52, 97–102.)
16. Migdal, C., Serres, M., 2011. Reactive oxygen species and oxidative stress. Med Sci, (27, 405-12.)
17. Sikka, SC., 2001. Relative impact of oxidative stress on male reproductive function. Curr Med Chem.; 8:851–62.
18. Erdemir, F., Atilgan, D., Markoc, F., Boztepe, O., Suha-Parlaktas, B., Sahin, S., 2012. The effect of diet induced obesity on testicular tissue and serum oxidative stress parameters. Actas Urol Esp, (36, 153-9.)
19. Kandemir D. Obezitenin Sınıflandırması ve Klinik Özellikleri. Katkı Pediatri Dergisi. 2000; 21 (4); 500-506.
20. Vague J: The degree of masculine differentitation of obesities. A factor determining preposition to diabetes, atherosclerosis, gout and uric calculous disease. Am J Clin Nutr 4:20-34,1956.
21. The effect of obesity on sperm disorders and male infertility, Du Plessis SS, Cabler S, McAlister DA, Sabanegh E, Agarwal A. Nat Rev Urol. 2010 Mar;7(3):153-61. Epub 2010 Feb 16.
22. Aromatase Inhibitors For Male Infertility J. D. Raman, P. N. Schlegel . The Journal of Urology 2002;167:624-6291
23. Tan, D.X., 1993. Melatonin: a potent, endogenous hydroxyl radical scavenger. Endocr J., (1, 57–60.)
24. Sun, Y., Oberley, LW., Ying, L., 1988. A simple method for clinical assay of superoxide dismutase. Clin Chem, (34,497–500.)
25. Esterbaur, H., Cheeseman, KH., 1990. Determination of aldehydic lipid peroxidation products: malonaldehyde and 4-hyroxynonenal. In: Packer L, Glazer AN (eds) Methods in enzimology, V 186, oxygen radicals in biological systems. Academic Press, NewYork, (407–21.)
26. Levin, RL., Garland, D., Oliver, CN., Amici, A., Climent, I., Lenz, AG., 1990 Determination of carbonyl content in oxidatively modified proteins. In: Packer L, Glazer AN (eds) Methods in enzimology V 186, oxygen radicals in biological systems. Academic Press, New york., (464–78.)
27. Sermondade, N., Faure, C., Fezeu, L., Shayeb, AG., Bonde, JP., Jensen, TK. et al., 2012. BMI in relation to sperm count: an updated systematic review and collaborative meta-analysis. Hum Reprod Update, (10,1093/050 )
28. Qin, DD., Yuan, W., Zhou, WJ., Cui, YQ., Wu, JQ., Gao, ES., 2007. Do reproductive hormones explain the association between body mass index and semen quality? Asian J Androl, (9, 827–34.)
29. Weisberg, SP., McCann, D., Desai, M., Rosenbaum, M., Leibel, RL., Ferrante, AW Jr., 2003. Obesity is associated with macrophage accumulation in adipose tissue. J. Clin. Invest, (112, 1796–808. )
30. Xu, H., Barnes, GT., Yang, Q., Tan, G., Yang, D., Chou, CJ., Sole, J., Nichols, A., Ross, JS., Tartaglia, LA., Chen, H., 2003. Chronic inflammation in fat plays a crucial role in the development of obesity-related insulin resistance. J Clin Invest, (112,1821-30.)
31. Furukawa, S., Fujita, T., Shimabukuro, M., Iwaki, M., Yamada, Y., Nakajima, Y., Nakayama, O., Makishima, M., Matsuda, M., Shimomura, I., 2004. Increased oxidative stress in obesity and its impact on metabolic syndrome. J Clin Invest, (114,1752-61.)
32. Aitken, RJ., Ryan, AL., Baker, MA., McLaughlin, EA., 2004. Redox activity associated with the maturation and capacitation of mammalian spermatozoa. Free Radic Biol Med, (36,994–1010.)
33. Allamaneni, SS., Naughton, CK., Sharma, RK., Thomas, AJ Jr., Agarwal A., 2004. Increased seminal reactive oxygen species levels in patients with varicoceles correlate with varicocele grade but not with testis size. Fertil Steril, (82,1684–6.) 34. Agarwal, A., Saleh, RA., 2004. Role of oxidants in male infertility: rationale,
significance, and treatment. Urol Clin North Am., (29,817–27.)
35. Agarwa,l A., Hamamah, S., Shekarriz M., 1994. Reactive oxygen species and fertilizing capacity of spermatozoa. Contracept Fertil Sex,( 22,327–30.)
36. Zalata, AA., Ahmed AH., Allamaneni, SS., Comhaire, FH., Agarwal, A., 2004. Relationship between acrosin activity of human spermatozoa and oxidative stress. Asian J Androl., (6,313–8.)
37. Dandona, P., Mohanty, P., Ghanim, H., Aljada, A., Browne, R., Hamouda, W., Prabhala, A., Afzal, A., Garg, R., 2001. The suppressive effect of dietary restriction and weight loss in the obese on the generation of reactive oxygen species by leukocytes, lipid peroxidation, and protein carbonylation. J Clin Endocrinol Metab., (86,355-62.)
38. Mohn, A., Catino, M., Capanna, R., Giannini, C., Marcovecchio, M., Chiarelli, F., 2005. Increased oxidative stress in prepubertal severely obese children: effect of a dietary restriction-weight loss program. J Clin Endocrinol Metab., (90,2653-8.) 39. Håkonsen, LB., Thulstrup, AM., Aggerholm, AS., Olsen, J., Bonde, JP., Andersen,
CY., Bungum, M., Ernst, EH., Hansen, ML., Ernst, EH., Ramlau-Hansen, CH., 2011. Does weight loss improve semen quality and reproductive hormones? Results from a cohort of severely obese men. Reprod Health, (17,8- 24.)
