Flora 2007;12(1):22-25 22
B
ildiğiniz gibi, ülkemiz 2006 yılına kuş gribi ha-berleri ile girdi; bir yıldan beri yazılı ve görsel ba-sında bu konu ele alınmakta, Dünya Sağlık Örgütü (DSÖ)’nün pandemi tehlikesini vurgulayan açıkla-malarına dikkatler çekilmekte idi. Ancak, Uzak Do-ğu Asya ülkelerinden sonra ilk kez insan olgularının ülkemizden, Avrupa’nın hemen yanı başından bildi-rilmesi üzerine, Batı dünyası artık kapılarına dayan-mış olan bu önemli sorunla daha yakından ilgilenme-ye başladı. Aslında Türkiilgilenme-ye pandemi tehlikesi konu-sunda hazırlıksız değildi; 14-16 Temmuz 2005 tarih-lerinde Sağlık Bakanlığı önderliğinde uzmanlar top-lanmış ve Ulusal Pandemi Hazırlık Planı kaleme alın-mıştı. Ekim 2005 döneminde Kızıksa-Balıkesir’de kanatlılarda H5N1 virüsünün saptanması ile konu-nun ülkemiz için de gerçek bir tehlike arz ettiği anla-şıldı ve nihayet Ocak 2006’nın ilk günlerinde Doğu-beyazıt-Ağrı’da ilk insan olguları saptandı. Bugün için Ankara’daki Ulusal İnfluenza Merkezi’ne göre DSÖ laboratuvarlarında sadece 12’si doğrulanmış olmasına rağmen, ülkemizde toplam 21 insan olgu-su saptanmış ve bunlardan dördü kaybedilmiştir. Bu yazıda, insanda kuş gribinin virolojik tanısı ve ülke-mizin bu konuda ikinci ulusal referans laboratuvarıolan İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp Fakültesi, Vi-roloji ve Temel İmmünoloji Bilim Dalının çalışmaları özetlenmiştir.
VİROLOJİK ÖZELLİKLER
Yirmibirinci yüzyılın ilk kuş gribi etkeni olarak ka-yıtlara geçen H5N1 subtipinin virolojik tanısına de-ğinmeden önce, genel anlamıyla influenza virüsleri-nin antijenik yapısını hatırlamakta yarar vardır. A, B ve C olarak belirtilen üç tipi bulunan influenza virüs-leri Orthomyxoviridae ailesinin üyevirüs-leridir. Pandemi-lere yol açma özelliğine sahip A tipinin genomu se-kiz adet tek zincirli RNA molekülünden meydana ge-lir; virüs partikülünün yüzeyinde, lipid tabakasına gö-mülü halde bulunan ve farklı RNA’larca sentezlenen hemaglutinin (HA veya H) ve nöraminidaz (NA veya N) majör yüzey antijenleri yer alır; ayrıca farklı bir RNA segmenti tarafından kodlanan iki matriks pro-teininden (M1 ve M2) M2’nin ekstraselüler bölgesi de virüs partikülünün yüzeyinde bulunur.
Yapısal olmayan geni oluşturan bir diğer RNA molekülü, NS-1 ve nükleer eksport protein (NEP)’ini kodlar; geriye kalan dört RNA’nın ise PB1, PB2 ve PA polimerazlarının yanı sıra nükleoprotein (NP)’in sentezini üstlendikleri bilinmektedir[1]. İnfluenza A suşlarının, majör yüzey glikoproteinleri olan HA ve NA’nın antijenik özelliklerine bakılarak serolojik ola-rak birbirlerinden ayrılan çok sayıda subtipi söz ko-nusudur; nitekim günümüzde tanımlanmış olan 16 HA ve 9 NA’nın farklı kombinasyonları uyarınca yüzlerce subtipin oluşabileceği kabul edilmektedir.
İnsanlarda Kuş Gribi Tanısı
Selim BADUR** İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp Fakültesi, Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Viroloji ve Temel İmmünoloji Bilim Dalı, İSTANBUL
Diagnosis of Avian Influenza in Human Key Words: Diagnosis, Avian influenza, H5N1 Anahtar Kelimeler: Tanı, Avian influenza, H5N1
On altı HA molekülünün tamamına kanatlılarda rast-lanırken, 20. yüzyılın başından beri insanlarda sade-ce H1, H2 ve H3 ile N1 ve N2 tiplerine ait suşlarla epidemiler bildirilmiştir. Bu nedenle H5N1, H9N2 veya H7N7 gibi kanatlılara ait olan ve ender olarak insanlarda saptanan subtiplerin “kuş gribi etkenleri” şeklinde tanımlanmaları uygun görülmüştür. Kısaca özetlemeye çalıştığım influenza A’nın virolojik özel-likleri konusunu virülans ile ilgili önemli bir noktaya değinerek bitirmek uygun olacaktır. Bugün için ka-natlıların influenza virüslerini:
1. Yüksek oranda patojen olanlar [highly patho-genic avian influenza (HPAI)],
2. Düşük düzeyde patojen olanlar [low pathoge-nic avian influenza (LPAI)], şeklinde iki grupta topla-mak mümkündür[2].
Genel anlamda H5 ve H7 suşlarında gözlenen HPAI özelliğine bağlı olarak bu tip suşlar kanatlılar-da sistemik letal infeksiyonlara yol açarak infekte kuşların en fazla bir hafta içinde ölmelerine neden olur; LPAI tipi suşlar ise sadece solunum ve sindirim sistemlerinde çoğaldıkları kanatlılarda hafif ya da asemptomatik infeksiyonlardan sorumludur. İşte bir influenza suşunun yukarıda belirtilen patojenitesini belirleyen ayrım, yüzey glikoproteinlerinden HA’nın yapısal özellikleri ile ilgilidir; virüsün replikasyonu için, HA prekürsör molekülünün (HA0) konak prote-azlarınca HA1 ve HA2 olarak tanımlanan iki parça-ya ayrılması gerekmektedir; LPAI tipi suşlarda, söz konusu ayrılma bölgesinde tek bir arjinin molekülü yer alır ve sadece belirli organlarda bu bölgedeki kı-rılma gerçekleşir; buna karşılık, HPAI tipi suşlar bir-çok organda bulunan übikitizan proteazlarca parça-lanma özelliğine sahiptir ve bu suşların HA’larının kırılma noktasında bir dizi farklı aminoasit yer alır. Sonuçta influenza suşlarının HA bölgesindeki kırıl-manın ve o bölgedeki aminoasitlerin özellikleri, hem doku tropizmini hem de suşların virülansını belirle-yen faktör olarak karşımıza çıkar[3].
Kuş gribinin laboratuvar tanısına geçmeden, et-kenlerde gözlenen mutasyonların önemini de vurgu-lamak gerekir; patojenite ile ilgili olarak yukarıda de-ğindiğim HA’nın kırılma bölgesine ait özelliklerinin (o bölgede tek ya da çok sayıda bazik aminoasidin bulunması) yanı sıra virüsün polimeraz proteini olan PB2’nin 627. bölgesindeki aminoasidinin ve nihayet NS1 proteininin 92. bölgesinde yer alan aminoasi-din yapıları mutasyonlarla değişebilmekte ve bu ge-lişme daha farklı nitelikli suşların ortaya çıkmasına neden olmaktadır[4].
VİROLOJİK TANI
Bu bölümde, konumuz olan kuş gribi etkenleri-nin ve özellikle H5N1 suşlarının laboratuvar tanısı ele alınacaktır. Genel anlamda tüm influenza virüsle-rinin virolojik tanıları benzerlik gösterse de, olası bir pandemi etkeni olarak kabul edilen H5N1 suşlarına yaklaşım bazı farklılıklar arz eder. Örneğin; insan inf-luenza suşları söz konusu olduğunda ve özellikle sür-veyans programlarının uygulanmasında, direkt anti-jen araştırmasının yararı bilinmektedir; bu amaçla özellikle hasta başında uygulanacak hızlı testlerin (immünfloresan veya immünkromatografik yöntem-ler gibi) ve özellikle influenza A ve B tipyöntem-lerini ayıra-bilen kitlerin yaygın olarak kullanıldıklarını biliyo-ruz[5]. Ancak söz konusu olan H5N1 suşları ise, bu tür testlerin yeterli duyarlılığa sahip olmadıkları kabul edilmektedir[6]. Bu nedenle günümüzde kuş gribi ta-nısı için önerilmeyen hızlı testlerin yakın bir gelecek-te H5N1 suşları için de standardize edilmeleri söz konusudur; nitekim “World of Health Biotech Co., Ltd.” kuruluşunca üretilen ve H5-HA antijenini sap-tamaya yönelik ELISA ve immünkromatografik kit-ler ülkemizde de tanıtılmaya başlanmış olup, adı ge-çen ürünlerin duyarlılık ve özgüllükleri deneme aşa-masındadır.
Elbette tüm influenza subtipleri için geçerli olan etkeni hücre kültürlerinde üreterek izole etme yakla-şımı H5N1 suşları için de mümkündür; bu amaçla boğaz ya da burun sürüntüleri/yıkantı suları ile çalışı-labileceği belirtilmekte ise de, nazofarengeal aspiras-yon sıvısı veya nazofarengeal sürüntü örneklerinin kullanımı izolasyon olasılığını artırmaktadır[7]. Alına-cak örnekler, antibiyotik ve antimikotikler içeren ste-ril transport besiyerlerinde laboratuvara ulaştırılmalı-dır. Bu arada kuş gribi yönünden incelenmesi ama-cıyla gönderilen muayene maddelerinin etkeni ime olasılıkları göz önüne alınarak, belirli kurallar çer-çevesinde dikkatli biçimde manipüle edilmeleri zorun-ludur. Örneklerin hazırlanması aşamasında laboratu-var çalışanları fiziksel önlemleri almalı; eldiven, mas-ke, gözlük kullanımı zorunlu olmalı, çalışma sırasında aerosol ve damlacıkların çevreye yayılmasını engelle-mek için asgari koşullar sağlanmalıdır. H5N1 suşları-nın MDCK ya da LLC-MK2 hücrelerinde üretilme iş-lemi de ayrıca özel çalışma koşulları gerektirir; böyle bir yaklaşım söz konusu olduğunda üçüncü düzey bi-yogüvenlik koşullarının (BSL3) sağlanması şarttır. Henüz tüm dünyada az sayıda merkezde uygulanan bu yöntem, izolatların spesifik sitopatik etkiye sahip olmamaları nedeniyle son aşamada monoklonal anti-korlar ile yapılacak immünfloresan yönteminin ve
ni-Flora 2007;12(1):22-25 23
hayet subtipe özgü moleküler tekniklerin kullanımını gerektirir. Bu konuda son olarak, insanlardan alınan örnekler ile kanatlılara ait örneklerin kesinlikle aynı laboratuvarlarda işlem görmemeleri gerektiğinin öne-mini vurgulamak gerekir.
Klasik tanı yöntemlerinden serolojik testler ile H5N1 spesifik antikorlarının araştırılması mümkün-dür. Ancak ister referans teknik olarak kabul edilen mikronötralizasyon testleri olsun, ister hemagluti-nasyon inhibisyon ya da ELISA uygulamaları olsun, bu tür indirekt tanı yaklaşımları henüz H5N1 olgula-rını saptamada yeterince standardize edilmemişler-dir; H5N1 suşlarına karşı aşı eldesi çalışmalarında da sorun yaratan “yeterli immünojeniteye sahip olma-ma” özelliği, klasik serolojik yöntemler ile spesifik H5N1 antikorlarının araştırılmasını da yetersiz kıl-maktadır[8].
Bu durumda, şu an için elimizde bulunan en ge-çerli tanı yöntemi, moleküler biyoloji uygulamaları-dır. Revers transkriptaz-polimeraz zincir reaksiyonu (“Real-time-PCR” ile karıştırılmaması için RevT-PCR olarak kısaltılması uygun olacaktır) uygulamasının du-yarlı ve özgül sonuçlar verdiği Asya ülkelerindeki H5N1 salgınları sırasında belirlenmiştir[9]. Elbette, özellikle “in-house” olarak tanımlanan ve hazır kitler yerine çeşitli primer ve problar sağlanarak gerçekleş-tirilen PCR uygulamalarında, kontaminasyona bağlı yalancı pozitiflik ya da nükleik asit ekstraksiyonu, c.DNA eldesi gibi aşamalarda oluşacak bir hata so-nucu yalancı negatiflik riskleri bulunmaktadır. Ancak bu olumsuzluklar, deneyin her aşamasında devreye sokulacak kontroller ile denetim altına alınabilir. “in-house” RevT-PCR uygulaması için gerekli HA ve NA bölgelerine özgü primer dizilerine DSÖ’nün raporla-rından ulaşmak mümkün olup, jelde nihai ürün ola-rak HA gen ürünü 219 bp, NA gen ürünü 616 bp’lik bölgelerde bantlar oluşturmaktadır[10]. Bu arada ül-kemizde de pazarlanmaya başlayan ve birçoğu “real-time-PCR (RT-PCR)” esasına dayanan hazır ticari kitlerin de varlığına değinmek uygun olacaktır. Nite-kim LightCycler sistemine adapte edilmiş olan ve inf-luenza H5 genini saptama özelliğindeki LightMix ki-ti (TIB MOLBIOL, Berlin, Almanya); ABI PRISM, ROTOR-Gene ve LightCycler sistemlerine adapte edilebilen RobosGene Bird Flu (H5N1) kiti (Robosc-reen GmbH, Leipzig, Almanya); yine LightCycler sistemine uygun influenza/H5 LC-RT-PCR kiti (Qi-agen Diagnostic-Arthus, Hamburg, Almanya); dene-yin son aşamasında biotin-streptavidin sisteminin kullanımı ile sonuçların ELISA plaklarında saptandı-ğı RevT-PCR esasına dayanan FluAVision kiti (DNA Technology A/S, Aarhus, Danimarka); sadece
pri-merler ve kontrolleri içeren ve jelde HA ve NA bant-larını aynı anda görme olanağı sağlayan VEREavf-H5N1 avian influenza virüs VEREavf-H5N1 kiti (Veredus Lab. Private Lmt., Singapur); veterinerlikte kullanımı söz konusu olan, H5 ve H7 RNA’larını saptamak için hazırlanmış “influcheck avian virüs” kiti (EuroClone, Pero, İtalya) ve “avian a screening and H5N1 typing FRT RG” kiti (Sacace Biotechnologies Srl, Caserta, İtalya) ülkemizde tanıtımı yapılan ve kuş gribi ile ilgi-li moleküler biyoloji esasına dayanan tanı kitleridir.
Bugün için H5N1 tanısını gerçekleştiren labora-tuvarların sayısı tüm dünyada az sayıda bulunmakta-dır; ancak BSL3 güvenlik koşullarının sağlanmasını gerektiren ve etkenin üretilmesini amaçlayan hücre kültürü laboratuvarları dışında, ülkelerin sağlık otori-telerince belirlenecek ve moleküler tanı için dona-nımlı merkezlerde BSL2 koşullarının sağlanmasının yeterli olacağı bilinmektedir.
H5N1 TANISINDA
İSTANBUL TIP FAKÜLTESİ DENEYİMİ Kuş gribinin laboratuvar tanısı konusunu, İstan-bul Üniversitesi İstanİstan-bul Tıp Fakültesi, Viroloji ve Temel İmmünoloji Bilim Dalı, İnfluenza Laboratuva-rındaki çalışmaları özetleyerek bitirmek istiyorum. Adı geçen merkez, 2003-2004 sezonunda başladı-ğı influenza suşlarının üretimi ve tiplendirimi çalış-malarını başarıyla sürdürmektedir[11]. Elde edilen bulguların DSÖ tarafından doğrulanmasını takiben, Eylül 2005 döneminde adı geçen merkez, DSÖ de-netçileri tarafından ziyaret edilerek akredite edilmiş ve olası kuş gribi sorunu karşısında H5N1 tanısı için reaktif bazında destek almıştır. Laboratuvarımıza H5N1 açısından incelenmek üzere ilk örnekler 4 Ocak 2006 tarihinde ulaştırılmış olup, bu tarihten başlayarak halen gönderilmekte olan muayene maddelerinin çalışılmasına devam edilmektedir. De-neylerde Paris-Pastör Enstitüsü kuruluşunun Solu-num Virüsleri Moleküler Genetik Ünitesi (Institut Pasteur-Unité Génétique Moléculaire des Virus Res-piratoires, Paris, Fransa)’ne ait teknik ve reaktifler kullanılmaktadır. Uyguladığımız algoritme gelince: Laboratuvarımıza ulaştırılan örneklerden ilk aşama-da RNA ekstraksiyonu (High Pure PCR Template Preparation Kit-Roche Diagnostic GmbH, Mannhe-im, Almanya) gerçekleştirilmekte ve c.DNA hazır-lanmasını takiben influenza A matriks geni ve H5 genine ait RevT-PCR çalışması yapılmakta; H5 po-zitifliği saptandığında N1 gen varlığı araştırılmakta-dır. İnfluenza A pozitifliğine rağmen, H5 inceleme-si negatif sonuçlanır ise, diğer subtiplerin (H3, H1,...) araştırılmasına geçilmektedir. Bugüne kadar
Flora 2007;12(1):22-25 24
Flora 2007;12(1):22-25 25
İnsanlarda Kuş Gribi Tanısı Badur S.
364 şüpheli olgu örneği ve Pendik Veteriner Araş-tırma Enstitüsünde H5 varlığı saptanan kanatlı ör-neklerine ait N1 incelemeleri laboratuvarımızda ya-pılmıştır. Ayrıca iki adet insanda, üç adet kanatlılar-da belirlenmiş olan H5N1 örneklerinde ABI sistemi ile mutasyon incelemeleri yapılmış; tüm örneklerde PB2 bölgesinde E627K ve M2 bölgesinde I28V ve I42T değişimi gibi yüksek patojeniteyi işaret eden mutasyonlar belirlenirken; HA bölgesinde S227N, I9M, N313S, Q396L, S361T gibi anlamlı sonuçla-ra yol açmayan mutasyonlar saptanmıştır. İncele-nen tüm örnekler oseltamivir ve amantadine duyar-lı bulunmuştur. Dizi analizlerinin değerlendirilme sü-reci devam etmektedir.
Sonuç olarak, kuş gribinin virolojik tanısı için eli-mizde çeşitli olanakların bulunduğunu; ancak söz ko-nusu testlerin uygulanmasında standardizasyon çalış-malarına özen gösterilmesi gerektiğini belirtmek uy-gun olacaktır.
KAYNAKLAR
1. Lewis DB. Avian flu to human influenza. Annu Rev Med 2006;57:139-54.
2. Horimoto T, Kawaoka Y. Influenza: Lessons from past pandemics, warning from current incidents. Nat Rev Microbiol 2005;3:591-600.
3. Horimoto T, Kawaoka Y. Reverse genetics provides di-rect evidence for a correlation of hemagglutinin cleavabi-lity and virulance of an avian influenza A virus. J Virol 1994;68:3120-8.
4. Webster RG, Lipatov AS, Hoffmann E. Influenza virus pathogenicity. In: Digard P, Nash AA, Randall RE (eds). Molecular Pathogenesis of Virus Infections. Cambridge: Cambridge University Press, 2005:159-78.
5. Nicholson KG, Wood JM, Zambon M. Influenza. Lancet 2003;362:1733-45.
6. Peiris JS, Yu WC, Leung CW, et al. Re-emergence of fa-tal human influenza A subtype H5N1 disease. Lancet 2004;363:617-9.
7. De Jong M, Hien TT. Avian influenza A (H5N1). J Clin Virol 2006;35:2-13.
8. Rowe T, Abernathy RA, Hu-Primmer J, et al. Detection of antibody to avian influenza A (H5N1) virus in human serum by using a combination of serologic assay. J Clin Microbiol 1999;37:937-43.
9. Chotpitayasunondh T, Ungchusak K, Hanshaoworakul W, et al. Human disease from influenza A (H5N1) Tha-iland, 2004. Emerg Infect Dis 2005;11:201-9. 10. WHO. Recommended laboratory tests to identify avian
influenza A virus in specimens from humans. Geneva. June 2005.
11. Önal A, Aslan S, Bozkaya E, Badur S. Ülkemizde 2003-2004 ve 2003-2004-2005 yıllarında grip sürveyansı ve izole edilen influenza suşlarının tiplendirimi. Klimik Derg 2006;19:3-9.
Yazışma Adresi: Prof. Dr. Selim BADUR
İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp Fakültesi
Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Viroloji ve Temel İmmünoloji Bilim Dalı
34390 Çapa-İSTANBUL e-mail: selimbadur@hotmail.com
