Gen Polimorfizm Analizinde LightCycler Floresan
PCR Tekni¤inin Kullan›lmas›: Myeloid Lösemili
Çocuk ve Yetiflkin Hastalarda MTHFR C677T Gen
Polimorfizm Da¤›l›m›n›n Belirlenmesi
THE APPLICATION OF THE LIGHTCYCLER FLUORESECENCE PCR IN
POLYMORPHISM ANALYSIS: INVESTIGATION OF THE MTHFR C677T
POLYMORPHISM IN CHILDHOOD AND ADULT PATIENTS WITH MYELOID LEUKEMIA
Dr. U¤ur DEL‹GEZER, Dr. Ebru E. AKIfiIK, Dr. Nejat DALAY ‹stanbul Üniversitesi Onkoloji Enstitüsü Temel Onkoloji AbD
ÖZET
Metilentetrahidrofolat redüktaz (MTHFR) enzimi folat metabolizmas›nda anahtar rol oynar. MTHFR geni normal popülasyonda yayg›n olarak görülen iki polimofizme sahiptir. Bunlardan 677. nükleotid pozisyonunda gerçekle-flen ve daha yayg›n olarak görülen C677T polimorfizmi enzim aktivitesinin azalmas›na yol açar. Bu polimorfizm kardiyovasküler hastal›klar, yeni do¤anlarda nöral tüp bozukluklar› ve kanser riski ile iliflkili bulunmufltur. Çal›fl-mam›zda, MTHFR C677T polimorfizmi myeloid lösemili çocuk ve yetiflkin hastalarda ve sa¤l›kl› kontrol grubun-da incelenerek, lösemi riskine olan etkisi istatistiksel olarak de¤erlendirildi. Polimorfizm analizi, LightCycler siste-minde “erime e¤risi analizi” yöntemi ile gerçeklefltirildi. Bulgular›m›z, çocuk hasta grubunda heterozigot genotip s›kl›¤›n›n (%39), yetiflkin grupta ise hem heterozigot (% 41), hem de homozigot varyant genotip (%5) s›kl›klar›n›n, kontrol grubuna göre (heterozigotlar % 45, homozigot varyantlar % 11) daha düflük oldu¤unu gösterdi. Ancak farklar istatistiksel olarak anlaml› bulunmad› (p>0.05). Çal›flmam›z, LightCycler ile yap›lan erime e¤risi analizinin polimorfizm tayini için uygun bir metot oldu¤unu, ve istatistiksel olarak anlaml› bulunmamas›na ra¤men MTHFR C677T polimorfizmine ait heterozigot ve/veya homozigot varyant genotiplerin lösemi hastalar›nda daha seyrek ol-du¤unu göstermektedir. Bu bulgular MTHFR polimorfizminin lösemi patogenezinde rol oynayabilece¤ine iflaret et-mektedir.
Anahtar Kelimeler: MTHFR C677T polimorfizmi, myeloid lösemi, LightCycler floresan PCR SUMMARY
The metylene tetrahydrofolate reductase (MTHFR) enzyme plays a key role in the folate metabolism The MTHFR gene displays two common genetic polymorphisms. Of these, the C677T polymorphism reduces the enzyme ac-tivity and has been implicated in cardiovascular diseases, neural tube defects in newborns and cancer risk. In the present study, we analysed the asociation of the common MTHFR C677T polymorphism with leukemia risk in children and adults patients with myeloid leukemia in a case-control study. The analysis was performed in LightCycler flouoresecence PCR with melting curve analysis. In children, the frequency of the heterozygote ge-notype (677CT, 39 %), in adult patients the frequency of the both heterozygote (41 %) and homozygote variant genotypes (677TT, 5 %) were found lower than those in the control group (heterozygote 45 %, homozygote vari-ant 11 %). However, the differences were statistically not significvari-ant (p>0.05). Our results, although statistically not significant, indicate, consistently with literature, that the heterozygote and/or homozygote variant genotypes are less frequent in leukemia patients. These findings suggest a role for the MTHFR polymorphism for leukemia carcinogenesis.
G‹R‹fi
Gen polimorfizmleri (“single nucleotide poly-morphisms”), genomik DNA’n›n bir popülasyo-nun normal bireyleri aras›nda farkl›l›k gösterdi¤i tek baz-çifti de¤ifliklikleridir.(1)Gen
polimorfizm-leri popülasyonda yayg›n görülür, etnik ve co¤rafi farkl›l›klar gösterirler. Bir çok durumda, hücre me-tabolizmas› için önemli olan yolaklarda (DNA ta-miri, hücre döngüsü kontrolü, sinyal iletimi vb.) rol alan genlerin kritik pozisyonlar›nda yer al›rlar. Baz› durumda genin kodlad›¤› proteinin fonksiyo-nu ya da enzim aktivitesi bu de¤iflikliklerden önemli ölçüde etkilenebilir. Hücre metabolizmas› için kritik önem tafl›yan proteinlerin fonksiyonun bozulmas› çeflitli hastal›klara yol açmakta veya baz› hastal›klar için riski art›rmaktad›r. Tek-baz de¤iflimleri ile iliflkili olarak ortaya ç›kan hastal›k-lara örnek ohastal›k-larak trombofili verilebilir.
Bir çok gen polimorfizmi, kanser riski ile iliflki-lendirilmifltir; MTHFR buna örnek olarak verilebi-lecek polimorfik genlerden biridir. MTHFR geni, folat metabolizmas›nda görev almaktad›r. Folat molekülünün primer fonksiyonu, DNA metilasyo-nu ve DNA sentez reaksiyonlar›nda metil grubu tafl›y›c›l›¤›d›r. MTHFR geni, 5,10-metilentetrahid-rofolat molekülünü (5,10-metilen THF) geri dönü-flümsüz olarak 5-metiltetrahidrofolata (5-metil THF) dönüfltüren enzimi kodlar. 5-metil-THF se-rum folat›n›n primer formudur ve homosistein mo-lekülünün metiyonine dönüfltürülmesinde metil grubu vericisi olarak görev yapar. Metiyonin S-adenosilmethiyonine (SAM) dönüfltürülür. SAM ise DNA üzerinde sitozin bazlar›n›n›n metilasyo-nunda kullan›l›r. 5-metil THF eksikli¤i DNA hipo-metilasyonu ile sonuçlan›r. 5,10-metilen THF for-munda ise, folat, DNA sentezi s›ras›nda urasil bazlar›na metil grubu vererek timine dönüflmeleri-ni sa¤lamaktad›r.
MTHFR geninin 677. nükleotid pozisyonunda C→T baz dönüflümüyle ortaya ç›kan polimorfizm (C677T, ala→val) enzim aktivitesini önemli ölçü-de azaltmaktad›r.2 Bu polimorfizm ile iliflkili ola-rak enzim aktivitesinin azalmas›, 5,10-metilen THF miktarlar›n›n artmas› ile sonuçlanmakta, ve serum homosistein miktar› artmaktad›r.(3,4)Artm›fl
serum homosistein düzeyleri kardiyovasküler has-tal›klar(5,6) ve yeni do¤an bebeklerde nöral tüp
bozukluklar› için(7,8)önemli bir risk faktörünü
tefl-kil etmektedir. Kardiyovasküler hastal›klar ve nö-ral tüp bozukluklar› için risk oluflturmas› d›fl›nda, MTHFR gen polimorfizmi kanser riskini de etkiler.
MTHFR ile kanser riski aras›ndaki iliflki son y›llar-da en yo¤un araflt›r›lan konulary›llar-dan biridir.(9-16)
Bulgular, MTHFR polimorfizminin kanser riski üzerine olan etkisinin farkl›l›klar gösterdi¤ini orta-ya koymufltur. Kolon kanseri ve lenfoblastik löse-mide MTHFR polimorfizmlerinin riski azalt›c› et-kisi bildirilmifltir.(17-22)Kolon kanserinde, bu
etki-nin besin yoluyla yeterli miktarda folik asit al›n›-m›nda söz konusu oldu¤u gösterilmifltir.(17,20)
Be-sin yoluyla düflük oranda folik asit alan kiflilerde, polimorfizmin kolon kanseri riskini art›rd›¤› bildi-rilmifltir.(17,19,23)Bunun d›fl›nda, bir çok kanser
ti-pinde MTHFR polimorfizmleri ile kanser risk ara-s›ndaki iliflkiyi araflt›ran çal›flmalarda çeliflkili so-nuçlar yay›nlanm›flt›r.(24)
Polimorfizm analizi, geleneksel olarak polime-raz zincir reaksiyonu-ba¤lant›l› restriksiyon frag-ment polimorfizmi (PCR-RFLP) yöntemi ile yap›l-maktad›r. Bu yöntem, polimorfizmi ortaya ç›karan baz de¤ifliminin bir restriksiyon enzimi için yeni bir kesim yeri ortaya ç›karmas› veya mevcut olan bir kesim yerini ortadan kald›rmas›na ba¤l› olarak, polimeraz zincir reaksiyonu ile ço¤alt›lan frag-mentin enzim kesimi sonucunda normal durum ile polimorfik allel aras›nda uzunluk farkl›klar›n›n (veya polimorfizminin) izlenmesi esas›na dayan›r. Yöntem, birden fazla ara aflama içermesi, baz› restriksiyon enzimleri ile ilgili sorunlar›n ortaya ç›kmas› gibi dezavantajlara sahiptir. Son zaman-larda, floresan maddelerle iflaretli problar kullan›-larak, polimeraz zincir reaksiyonunda DNA amp-lifikasyonunun floresan ölçümü sayesinde efl-za-manl› olarak izlenebildi¤i polimeraz zincir reaksi-yonu yöntemleri (“real-time fluorescence PCR”) s›kça kullan›lmaktad›r. Çal›flmam›zda uygulad›¤›-m›z LightCycler floresan PCR yöntemi nükleik asit miktar›n›n kantitatif analizine olanak sa¤lamas› yan›nda bilinen mutasyonlar›n (veya polimorfizm-lerin) analizini de gerçeklefltirebilmektedir.(25,26)
Bu çal›flmada myeloid lösemili çocuk ve yetiflkin hastalar ilecsa¤l›kl› kontrollerde MTHFR C677T polimorfizminin da¤›l›m› LightCycler PCR yönte-mi ile incelenyönte-mifltir.
GEREÇ ve YÖNTEM Çal›flma Grubu
Çal›flma grubumuz myeloid lösemili çocuk (n=43, 23 erkek, 20 k›z; ortalama yafl 9.9±5.1) ve yetiflkin hastalardan (n=118; 52 erkek, 66 kad›n; ortalama yafl 42±15.8) oluflmufltur. Çocuk hastala-r›n 23’ü akut myeloid kösemi (AML), 20’si kronik
myeloid lösemi (KML) hastas›d›r. Yetiflkin hastalar-dan 43’ü AML, 75’i KML hastas›d›r. Kontrol gru-bu, sa¤l›kl› kiflilerden oluflturulmufltur (n=96; 48 erkek, 48 kad›n; ortalama yafl 37.5±11.2).
LightCycler Floresan PCR Yöntemi ile Polimorfizm Analizi
LightCycler floresan PCR yöntemi (Roche, Mannheim, Almanya) al›fl›lm›fl polimeraz zincir reaksiyonunu floresan ölçüm sistemi ile kombine ederek, DNA amplifikasyonunun efl-zamanl› iz-lenmesini sa¤lamaktad›r. Bu yöntemde, normal PCR’da kullan›lan primerlere ek olarak, floresan iflaretli iki prob kullan›lm›flt›r. Problardan bir tane-si, polimorfizm içeren bölgeye spesifik dizayn edi-lirken, di¤eri hemen bunun yak›n›nda (1 baz çifti uzakl›kta) yerlefltirilmifltir. Bu yöntemde genotip-lerin ay›rt edilmesi “erime e¤risi analizi” (“melting curve analysis”) ile gerçeklefltirilmektedir. Bunun için, PCR’da DNA amplifikasyonun tamamlanma-s›ndan sonra, s›cakl›k çok yavafl bir flekilde yük-seltilerek her bir örnek için erime e¤risi oluflturul-mufltur. S›cakl›k yükseltilmesi s›ras›nda normal di-zi ile polimorfizm içeren didi-zinin ay›r›m› gerçek-leflmektedir. Polimorfizm içeren dizi ile floresan iflaretli prob aras›nda oluflan dupleks yanl›fl bir efl-leflme (“mismatch”) içerdi¤inden, normal dizi ile prob aras›nda oluflan duplekse oranla daha az sta-bildir. Bu durum, polimorfizm içeren dupleksin daha düflük bir erime noktas›na (“melting point”) sahip olmas›na ve dolay›s›yla s›cakl›k yükseltilme-si s›ras›nda daha düflük bir s›cakl›kta ayr›flmas›na yol açmaktad›r. Matematiksel bir dönüflüm kulla-n›larak erime e¤rilerinden floresan de¤erinin ne-gatif türevinin s›cakl›¤a göre de¤iflimini veren pro-filler elde edilmekte ve de¤iflik allellere ait farkl› erime s›cakl›klar› gösteren tepeler izlenmektedir.
Çal›flmam›zda polimorfizm analizi için perife-rik lenfositlerden proteinaz K/izopropanol yönte-mi ile elde edilen genoyönte-mik DNA ve Nakamura ve ark.(27) taraf›ndan dizayn edilen floresan-iflaretli
problar kullan›ld›. Primer dizileri do¤ru TGGCAGGTTACCCCAAAGG-3’ ve ters yönde
5’-TGATGCCCATGT CGGTGC-3’ fleklindedir (IDT, Coralville, ABD). Problardan biri 3’ ucunda flores-cein (Flu) ile iflaretli iken, di¤eri 5’ ucunda LC-640 ile iflaretlenmifltir. Prob dizileri 5’-TGAGGCT-GACCTGAAGCACTTGAAGGAGAA GGTGTCT-3’-Flu ve 5’-LC-640-CGGGAGCCGATTTCAT-CAT-3’-PHO (TIB Molbiol, Berlin, Almanya) flek-lindedir. Hibridizasyon kar›fl›m› (Taq polimeraz, reaksiyon tamponu, nükleotid kar›fl›m›), MgCl2, primerler, problar ve genomik DNA toplam 20 µl hacimde kar›flt›r›larak kapillerlere aktar›ld›. PCR koflullar› daha önce tan›mland›¤› gibi gerçekleflti-r i l d i .(28) Amplifikasyonun tamamlanmas›ndan
sonra, s›cakl›¤›n saniyede 0.2°C art›r›larak 40°C’den 85°C’ye yükseltilmesiyle erime e¤rileri oluflturuldu. Floresan/s›cakl›k negatif türevinin s›-cakl›¤a göre çizilmesiyle de, erime e¤rileri, erime tepelerine dönüfltürüldü. Pozitif kontroller PCR-RFLP yöntemi ile elde edildi.(29)
‹statistiksel Analizler
‹statistiksel analizler SPSS (11.5) istatistik ana-liz program› kullan›larak gerçeklefltirildi. Allel ve genotip frekanslar› Ki-kare testi ile karfl›laflt›r›ld›. p=0.05 de¤erleri anlaml› olarak kabul edildi.
BULGULAR
MTHFR geninin genotiplemesi hasta ve kont-rollerden al›nan örneklerde yukar›da aç›kland›¤› gibi gerçeklefltirildi. Allel ve genotip frekanslar› hesaplanarak Tablo I’de özetlendi. fiekil 1’de gö-rülen üç farkl› e¤ri, MTHFR C677T polimorfizmi-ne ait üç farkl› genotipi temsil etmektedir. Normal olarak hasta ve kontrollerden al›nan her bir örnek sadece bir e¤ri gösterir. Ancak genotiplerin kolay-ca karfl›laflt›r›labilmeleri aç›s›ndan üç farkl› geno-tip üç farkl› e¤ri halinde ayn› flekil üzerinde göste-rilmifltir. Homozigot normal genotipe (677CC) sa-hip bireylere ait e¤ri, en yüksek erime s›cakl›¤›na (63°C) sahip olan tepe ile karakterize iken, homo-zigot varyant genotipe (677TT) sahip bireyler, iki polimorfik allele sahip olduklar›ndan, normal
ge-Tablo 1. Lösemi Hastalar›nda ve Kontrollerde MTHFR C677T Allel ve Genotip S›kl›klar›
n 677CC 677CT 677TT T frekans›
Kontrol grubu 96 42 (% 44) 43 (% 45) 11(% 11) 0.330
Çocuk myeloid lösemi 43 21 (% 49) 17 (% 39) 5 (% 12) 0.315 Yetiflkin myeloid lösemi 118 64 (% 54) 48 (% 41) 6 (% 5) 0.255
notipe göre daha düflük bir (55°C) erime s›cakl›¤›-na sahip tepe ile karakterizedirler. Heterozigot ge-notipe (677CT) ait örnekler ise bir normal dizi ve bir polimorfik allele sahip olmalar› nedeniyle her iki tepeyi de gösteren bir e¤ri ile ay›rt edilirler.
Kontrol grubunda varyant allelin (677T) fre-kans› % 33 olarak belirlendi. Bu oran myeloid lö-semili çocuklarda % 32, yetiflkinlerde ise % 26 olarak bulundu. Yetiflkin hastalarda önemli bir fark göze çarpmakla birlikte bu fark istatistiksel olarak anlaml› bulunmad› (p>0.05).
Genotip s›kl›klar› kontrol ve hasta gruplar› ara-s›nda karfl›laflt›r›ld›¤›nda, homozigot normal geno-tip (677CC) s›kl›¤›n›n çocuk (%49) ve yetiflkin (%54) lösemi hasta gruplar›nda kontrol grubuna göre (%44) artt›¤›n› izlendi. Bu art›fl yetiflkin löse-mili hastalarda daha belirgin durumdayd›. Normal genotip s›kl›¤›n›n artmas›, heterozigot (677CT) ve/veya homozigot varyant (677TT) genotip s›kl›k-lar›n›n hasta gruplar›nda azalmas›n› gerektirmek-tedir. Gerçekten, myeloid lösemili çocuk hasta grubunda sadece heterozigot genotipin s›kl›¤› aza-l›rken, yetiflkin hasta grubunda her iki genotipin s›kl›¤› da kontrollere göre daha düflük
bulunmufl-tur. Homozigot varyant genotip s›kl›¤›ndaki azal-ma (% 6 oran›nda) daha belirgin durumdad›r. An-cak kontrol ve hasta gruplar› aras›nda, MTHFR C677T polimorfizmine ait genotipleri aras›ndaki fark istatistiksel olarak anlaml› bulunmam›flt›r (p>0.05).
TARTIfiMA
Çal›flmam›z, normal bireylerde daha yayg›n olan MTHFR C677T polimorfizminin da¤›l›m›n› myeloid lösemili çocuk ve yetiflkin hastalarda be-lirlemeyi hedeflemiflti. Polimorfizm analizi Light Cycler PCR yöntemi ile gerçeklefltirildi. Bu yönte-min geleneksel PCR-RFLP yönteyönte-mine göre, geno-tiplerin kolay ve do¤ru analiz edilmesi, çabuk so-nuç al›nmas› gibi avantajlar› bulunmaktad›r. Yön-tem h›zl› ve duyarl› olmas› nedeniyle klinik kulla-n›m ve genifl-çapl› araflt›rmalar için uygun gözük-mektedir.(26)
Bulgular çocuk hasta grubunda heterozigot ge-notip (677CT) s›kl›¤›n›n, yetiflkin hasta grubunda ise heterozigot ve homozigot varyant (677TT) ge-notip s›kl›klar›n›n kontrol grubuna göre daha dü-S›cakl›k (°C)
677CT 677CC 677TT
fiekil. LightCycler PCR’da MTHFR C677T gen polimorfizm analizi. fiekilde görülen üç farkl› e¤ri, MTHFR C677T polimorfizmine ait üç farkl› genotipi temsil etmektedir. Genotiplerin kolayca karfl›laflt›r›labilmeleri için üç farkl› genotip üç farkl› e¤ri halinde ayn› flekil üzerinde gösterilmifl olmas›na ra¤men, her bir bireye ait örnek sadece bir e¤ri gösterir. Homozigot normal genotipe (677CC) sahip bireyler, en yüksek erime s›cakl›¤›na (63°C) sahip olan tepe ile karakterize olan e¤riyi gösterirler. Buna karfl›n, homozigot varyant genotipe (677TT) sahip bireyler, iki polimorfik allele sahip olduklar›ndan, normal genotipe göre daha düflük bir (55°C) erime s›cakl›¤›na sahip tepe ile karakterizedirler. Heterozigot genotip (677CT) örnekler ise normal ve polimorfik allel içermeleri nedeniyle her iki tepeye sahip bir e¤ri fleklinde ortaya ç›karlar.
flük oldu¤unu göstermifltir. Bu sonuçlar literatür bulgular› ile ayn› do¤rultudad›r. Wiemels ve arka-dafllar›(29)akut myeloid lösemili çocuk hastalarda
homozigot varyant genotip s›kl›¤›nda kontrol gru-buna göre anlaml› olmayan bir azalma bulurken, bizim çal›flmam›zda heterozigot genotipin s›kl›-¤›nda bir azalma belirlenmifltir. Yetiflkin hasta gru-bunda ise her iki varyant genotipin s›kl›¤›nda göz-lenen azalma, Skibola ve arkadafllar›n›n(21)AML’
li yetiflkin hastalarda elde ettikleri bulgularla uyum göstermektedir.
Çal›flmam›zda ve di¤er gruplar taraf›ndan ya-y›nlanan çal›flmalarda elde edilen sonuçlar C677T polimorfizminin myeloid lösemide daha seyrek oldu¤unu göstermekle birlikte iliflki istatis-tiksel olarak anlaml› bulunmam›flt›r. Buna karfl›n akut lenfoid lösemili hastalarda homozigot var-yant genotipe (677TT) ait risk azalt›c› yönde bir etki bildirilmifltir(21,22,30), bu bulgular
do¤rultu-sunda, MTHFR’nin sadece lenfoid lösemide risk azalt›c› bir etkisinin olabilece¤i sonucuna var›l-m›flt›r. Ancak, 2003 y›l›nda yay›nlad›¤›m›z bir ça-l›flmada(28) akut lenfoid lösemili yetiflkin hasta
grubunda 677TT homozigot varyant genotip kont-rol grubuna göre daha az bulunmas›na ra¤men aradaki fark istatistiksel olarak anlaml› bulunma-m›flt›r. ‹talya’da yap›lan ve yeni yay›nlanan bir baflka çal›flma(31)da homozigot varyant genotipin
akut lenfoid lösemide risk azalt›c› etkisini do¤ru-lamamaktad›r. MTHFR C677T polimorfizminin lösemi riski ile iliflkisi hakk›ndaki bu çeliflkili so-nuçlar›n etnik ve co¤rafi de¤iflikliklere ba¤l› oldu-¤u düflünülmektedir.
KAYNAKLAR
1. Mannsmann U, Herzig M. The use of SNP profiles as clinical markers. IMBI, University of Heidelberg. h t t p : / / w w w . b i o m e t r i e . u n i - h e i d e l b e r g . d e / m i t a r b e-iter/MansmannUlrich
2. Frosst P, Blom HJ, Milos R, Goyette P, Sheppard CA, Matthews RG, Boers GJ, den Heijer M, Kluijtmans LA, van den Heuvel LP, et al et al. Candidate genetic risk factor for vascular disease: a common mutation in methylenetetrahydrofolate reductase. Nature Gen 1995;10:111-113.
3. Jacques PF, Bostom AG, Williams RR, Ellison RC, Eck-feldt JH, Rosenberg IH, Selhub J, Rozen R. Relation between folate status, a common mutation in methyle-netetrahydrofolate reductase, and plasma homocyste-ine concentrations. Circulation 1996;93:7-9. 4. Kauwell GP, Wilsky CE, Cerda JJ, Herrlinger-Garcia K,
Hutson AD, Theriaque DW, Boddie A, Rampersaud GC, Bailey LB. Methylenetetrahydrofolate reductase
mutation (677C—>T) negatively influences plasma homocysteine response to marginal folate intake in el-derly women. Metabolism 2000;49:1440-1443. 5. Kluijtmans LA, Kastelein JJ, Lindemans J, Boers GH,
Heil SG, Bruschke AV, Jukema JW, van den Heuvel LP, Trijbels FJ, Boerma GJ, Verheugt FW, Willems F, Blom HJ. Thermolabile methylenetetrahydrofolate re-ductase in coronary artery disease. Circulation 1997;96:2573-2577.
6. Kang SS, Wong PW, Bock HG, Horwitz A, Grix A. In-termediate hyperhomocysteinemia resulting from compound heterozygosity of methylenetetrahydrofo-late reductase mutations. Am J Hum Genet 1999;48: 546-551.
7. van der Put NM, Gabreels F, Stevens EM, Smeitink JA, Trijbels FJ, Eskes TK, van den Heuvel LP, Blom HJ. A second common mutation in the methylenetetrahyd-rofolate reductase gene: an additional risk factor for neural-tube defects? Am J Hum Genet 1998;62:1044-1051.
8. Weitkamp LR, Tackels DC, Hunter AG, Holmes LB, Schwartz CE. Heterozygote advantage of the MTHFR gene in patients with neural-tube defect and their rela-tives. Lancet. 1998;351:1554-1555.
9. Piyathilake CJ, Macaluso M, Johanning GL, Whiteside M, Heimburger DC, Giuliano A. Methylenetetrahydro-folate reductase (MTHFR) polymorphism increases the risk of cervical intraepithelial neoplasia. Anticancer Res 2000;20:1751-1757.
10. Kimura F, Franke KH, Steinhoff C, Golka K, Roemer HC, Anastasiadis AG, Schulz WA. Methyl group meta-bolism gene polymorphisms and susceptibility to pros-tatic carcinoma. Prostate 2000 1;45:225-231. 11. Gershoni-Baruch R, Dagan E, Israeli D, Kasinetz L,
Ka-douri E, Friedman E. Association of the C677T poly-morphism in the MTHFR gene with breast and/or ova-rian cancer risk in Jewish women. Eur J Cancer 2000; 36:2313-2316.
12. Song C, Xing D, Tan W, Wei Q, Lin D. Methylenetet-rahydrofolate reductase polymorphisms increase risk of esophageal squamous cell carcinoma in a Chinese population. Cancer Res 2001;61:3272-3275. 13. Shen H, Spitz MR, Wang LE, Hong WK, Wei Q.
Poly-morphisms of methylene-tetrahydrofolate reductase and risk of lung cancer: a case-control study. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2001;10:397-401. 14. Gonzalez Ordonez AJ, Fernandez Carreira JM,
Fer-nandez Alvarez CR, Martin L, Sanchez Garcia J, Medi-na Rodriguez JM, Alvarez MV, Coto E. Normal frequ-encies of the C677T genotypes on the methylenetet-rahydrofolate reductase (MTHFR) gene among lymphoproliferative disorders but not in multiple mye-loma. Leuk Lymphoma 2000;39:607-612.
15. Semenza JC, Delfino RJ, Ziogas A, Anton-Culver H. Breast cancer risk and methylenetetrahydrofolate re-ductase polymorphism. Breast Cancer Res Treat 2003; 77:217-223.
16. Lambropoulos AF, Agorastos T, Foka ZJ, Chrisafi S, Constantinidis TC, Bontis J, Kotsis A. Methylenetet-rahydrofolate reductase polymorphism C677T is not associated to the risk of cervical dysplasia. Cancer Lett. 2003;191:187-191.
17. Chen J, Giovannucci E, Kelsey, Rimm EB, Stampfer MJ, Colditz GA, Spiegelman D, Willett WC, Hunter DJ. A methylenetetrahydrofolate reductase polymop-hism and the risk of colorectal cancer. Cancer Res 1996;56: 4862-4864.
18. Ma J, Stampfer MJ, Christensen B, Giovannucci E, Hunter DJ, Chen J, Willett WC, Selhub J, Hennekens CH, Gravel R, Rozen R. A polymorphism of the met-hionine synthase gene: association with plasma folate, vitamin B12, homocyst(e)ine, and colorectal cancer risk. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 1999;8:825-829.
19. Ulrich CM, Kampman E, Bigler J, Schwartz SM, Chen C, Bostick R, Fosdick L, Beresford SA, Yasui Y, Potter JD. Colorectal adenomas and the C677T MTHFR poly-morphism: evidence for gene-environment interacti-on? Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 1999; 8:659-668.
20. Chen J, Giovannucci EL, Hunter DJ. MTHFR poly-morphism, methylene-replete diets and the risk of co-lorectal carcinoma and adenoma among U.S. men and women: an example of gene-environment interac-tions in colorectal tumorigenesis. J Nutr 1999;129 (2S Suppl.): 560S-564S.
21. Skibola CF, Smith MT, Kane E, Roman E, Rollinson S, Cartwright RA, Morgan G. Polymorphisms in the methylenetetrahydrofolate reductase gene are associ-ated with susceptibility to acute leukemia in adults. Proc Natl Acad Sci USA 1999;96:12810-12815. 22. Franco RF, Simoes BP, Tone LG, Gabellini SM, Zago
MA, Falcao RP. The methylenetetrahydrofolate reduc-tase C677T gene polymorphism decreases the risk of chidhood acute lymphocytic leukemia. British J Ha-ematol 2001;115:616-618.
23. Levine AJ, Siegmund KD, Ervin CM, Diep A, Lee ER, Frankl HD, Haile RW. The methylenetetrahydrofolate reductase 677C—>T polymorphism and distal
colo-rectal adenoma risk. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2000;9:657-663.
24. Bailey LB. Folate, methyl-related nutrients, alcohol, and the MTHFR 677C—>T polymorphism affect can-cer risk: intake recommendations. J Nutr 2003;133(11 Suppl 1):3748S-3753S.
25. Bernard PS, Ajioka RS, Kushner JP, et al. Homogeneous multiplex genotyping of hemochromatosis mutations with fluorescent hybridization probes. Am J Pathol 1998;153:1055-1061.
26. Hiratsuka M, Narahara K, Kishikawa Y, et al. A simul-taneous LightCycler detection assay for five genetic polymorphisms influencing drug sensitivity. Clin Bioc-hem 2002; 35:35-40.
27. Nakamura S, Aoshima T, Ikeda M, et al. Simultaneous detection of methylenetetrahydrofolate reductase gene polymorphisms, C677T and A1298C, by melting cur-ve analysis with LightCycler. Anal Biochem 2002; 306:40-43.
28. Deligezer U, Akisik E, Dalay N. Genotyping of the MTHFR gene polymorphism, C677T in patients with leukemia by melting curve analysis. Mol Diagn. 2003;7 (3-4):181-185.
29. Wiemels JL, Smith RN, Taylor GM, Eden OB, Alexan-der FE, Greaves MF. Methylenetetrahydrofolate reduc-tase (MTHFR) polymorphisms and risk of molecularly defined subtypes of childhood acute leukemia. Proc NatL Acad Sci USA 2001;98:4004-4009.
30. Gemmati D, Ongaro A, Scapoli GL, Della Porta M, Tognazzo S, Serino ML, Di Bona E, Rodeghiero F, Gil-li G, Reverberi R, Caruso A, Pasello M, Pellati A, De Mattei M. Common gene polymorphisms in the meta-bolic folate and methylation pathway and the risk of acute lymphoblastic leukemia and non-Hodgkin’s lymphoma in adults. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2004; 13:787-794.
31. Chiusolo P, Reddiconto G, Cimino G, Sica S, Fiorini A, Farina G, Vitale A, Sora F, Laurenti L, Bartolozzi F, Fa-zi P, Mandelli F, Leone G. Methylenetetrahydrofolate reductase genotypes do not play a role in acute lymphoblastic leukemia pathogenesis in the Italian po-pulation. Haematologica 2004;89:139-144.
