İnsan Plasental Glutatyon S-Transferazının İzolasyonu, Kinetik Özellikleri ve Bazı İlaçlarla in vitro Etkileşimi = Human Placental Glutathione-S-Transferase : Isolation, Kinetic Properties and in vitro Interactions with Several Drugs

İnsan Plasental Glutatyon S-Transferazının İzolasyonu, Kinetik Özellikleri ve Bazı

İlaçlarla

in vitro

Etkileşimi *

Human Placental Glutathione-S-Transferase : Isolation, Kinetic Properties and in vitro Interactions with

Several Drugs

V.Kenan ÇELİK **, Ferah ARMUTCU ***, Ahmet AKER ****

* XIV. Ulusal Biyokimya Kongresi’nde poster olarak sunulmuştur

** Yrd.Doç.Dr., Cumhurıyet Üniversitesi Tıp Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı, Sivas *** Uz. Dr., Kara Elmas ÜniversitesiTıp Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı, Zonguldak **** Prof.Dr., Cumhurıyet Üniversitesi Tıp Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı, Sivas

ÖZET

Plasental glutatyon-S-transferaz (GST-π) enzimi myiadında doğum yapmış olgunun plasentasından glutatyon agaroz affinite kolonu kullanılarak izole edildi. GST-π 2628 µmol/mg dk spesifik aktivite ve % 0,5 verimle saflaştırıldı. Enzimin substratı olan glutatyon ( GSH ) için Km değeri 2 mM, Vmax değeri 11.1 U/mg dk ; kloro-2,4-dinitrobenzen ( CDNB ) için Km değeri 0,55mM, Vmax değeri 35.0 U/mg dk olarak bulundu. İlaç etkileşimi çalışmalarında, prematüre doğumların önlenmesinde kullanılan Pre-Par _{(Ritodrin HCL) ve} antibakteriyel etkili Ampisid _{(Ampisilin) , enzim aktivitesini in} vitro olarak % 50-55 oranında inhibe ettiği gözlendi. Antiemetik olarak kullanılan Metpamid _{(Metoclopramid) enzim aktivitesini} %80-85 oranında inhibe ederken, klinik kullanımı oldukca yaygın olan, ağrı kesici ve ateş düşürücü etkili Novaljin (Metamizol), enzim aktivitesini % 70-80 oranında inhibe etti.Yine anti-bakteriyel etkileri olan Iesef _{(Ceftriaxon) ve} Sultasid _{(Sultamisilin)’in ise enzim aktivitesini %10-15} oranında inhibe ettiği gözlendi. Bu bulgular bu tür ilaçların hamilelerde çok titiz ve dikkatli bir seçimle kullanılması gereğini ortaya koymaktadır.

Anahtar kelimeler: Plasental GST, ilaç etkileşimleri

SUMMARY

Placental GST-π was isolated from full-term placenta by glutathione affinity column. GST was obtained with 0,5 % yield and had a specific activity of 2628 units per milligram protein. Km and Vmax values for glutathione (GSH) and chloro-2,4-dinitrobenzen (CDNB) as substrates were 2mM, 11,1 U/mg min and 0,55 mM, 35,0 U/mg min respectively. It was observed that GST activity was decreased 50-55% by Pre-Par (Ritodrine HCL) used to prevent the premature birth. Metpamid _{(Metoclopramid), an antiemetic, inhibited the} enzyme activity 80-85%. Novalgine _{(Metamizole), known as} an analgesic and antipyretic, is also inhibited enzyme activity 70-80%. In addition to these drugs Sultacide _{(Sultamisilin)} and Iesef _{(Ceftriaxon) which have an antibacterial effect} inhibited the enzyme activity 10-20%. These results suggested that these drugs must be used carefully in pregnant women.

Key words: Placental GST, drug actions

C. Ü. Tıp Fakültesi Dergisi 25(4):187 – 192, 2003

GİRİŞ

Glutatyon-s-transferazlar (GST,EC:2.5.1.18),

karsinojen ve mutajenleri içeren çeşitli hidrofobik ve

elektrofilik substratların glutatyonun (GSH), tiol (SH)

grubu ile konjugasyonunu sağlayan çok işlevli bir enzim

grubudur(1). GST detoksifikasyon (zehirsizleştirme)

görevini, GSH’ın SH grubu ile ilgili bileşiklerin elektrofilik

bölgelerini nötralize ederek yapar. Oluşan suda çözünür

ürün merkaptürik asittir ve vücuttan idrarla atılır(2,4).

Farklı GST formları çeşitli kaynaklardan

saflaştırılmış ve karakterize edilmiştir. Homo ve

heterodimerik iki alt birimden oluşan GST’ler, yapısal

immünolojik özellikleri ve substrat özgüllükleri temel

alınarak insan dokularında

α (asidik), µ (nötral), π

(bazik) ve mikrozomal olmak üzere 4 gruba ayrılmıştır

(5,6).

Rat plasental formunun (GST-P), kimyasal

hepatokarsinogenezde preneoplastik ve neoplastik

lezyonlar için bir marker olabileceği gösterilmiştir (7,8).

GST’nin insan plasental formu (GST-π) İmmünolojik

olarak GST-P’ye çok benzer olduğu gözlenmiş, aynı

zamanda kolon, uterus, serviks ve böbrek gibi

dokularda preneoplastik lezyonlar için bir marker

olabileceği de öne sürülmüştür(9,11).

Son 20 yıl süresince plasenta içerisinde

ksenobiyotiklerin biyotransformas-yonunun nasıl

gerçekleştiği üzerine bir takım kabul edilebilir teoriler

geliştirilmiştir: Bir metabolik bariyerin yabancı yapıları

fetusa ulaşmadan engellediği ya da toksik metabolitler

için basit bir enzim sistemi bulunduğu düşünülmektedir.

Bu sistem içerisinde P-450 enzim grubu ve diğer

monooksijenazlar yanında GST yer almaktadır(12).

Dolayısıyla GST’lerin çeşitli özellikleri ve özgüllüğünün

saptanması büyük önem taşımaktadır. Bu çalışmada

klinik kullanımı yaygın olan ilaçlar (Analjezik, antipretik,

antimikrobiyal vb.) ile GST’nin in vitro etkileşiminin

incelenmesi amaçlanmıştır.

GEREÇ ve YÖNTEM

GSH, Glutatyon agaroz, Kloro-2,4-dinitrobenzen

(CDNB) Sigma firmasından sağlandı. Pre-Par ( Ampül,

50 mg/ml RitodrinHCl ), Metpamid (Ampül,10mg

Metoclopramide HCl), Novalgin (Ampül, 1g

Dpyrone,Metamizole), Ampisid( Flakon, 1g Na

Ampisilin), Sultasid (Flakon, 1g Sultamisilin) ve

IESEF(Flakon, 1g Ceftriaxone disodium) değişik ticari

firmalardan sağlandı. Diğer kimyasallar (tampon vs.)

analitik saflıkta olup Sigma kalitesindedir.

Miadında doğum yapmış olgudan alınan plasenta

buzlu serum fizyolojik (4°C) ile yıkandı. Amniyotik zar ve

bağ dokusundan arındırılan plasenta küçük (1-2cm

₎

parçalara bölündü. Serum fizyolojik ile yıkanan parçalar,

gr yaş doku(622 gr) başına 3 ml (toplam 1866 ml) 1mM

EDTA, 2mM β-Merkaptoetanol içeren 10 mM potasyum

fosfat pH=7.0 tamponunda (tampon A) bıçaklı

homojenizatör (Huzur) kullanılarak (en yüksek devirde 1

dk.) homojenize edildi. homojenatta aktivite ve protein

tayini (Hitachi 911 otoanalizörde) yapıldı. Homojenat

14000Χ g’ de 4°c’ de 1 saat santrifüj edildi. Süpernatant

pamuklu bezden geçirilerek lipidli kısımlar uzaklaştırıldı.

Süpernatanda aktiviteve protein tayinleri (Coomassie

brillant blue) yöntemi ile yapıldı. 200 ml süpernatant,

tampon A ile dengelenmiş Glutatyon agaroz kolonuna

15 ml/saat’lik akış hızı ile uygulandı. 50 mM KCl içeren

tampon A ile kolona bağlanmayan proteinler

uzaklaştıldı. Kolon 5 mM GSH içeren 50mM Tris/HCl

pH=9.6 (tampon B) tamponu ile yıkandı, aktivite

gösteren kısımlar toplandı(13). Seçilen ilaçlar ile enzimin

doza bağımlı olarak etkileri ve kinetik özellikleri

incelendi.

Aktivite tayini: 50

µl 0,2 M sodyum fosfat

pH=6,5 tamponu, 50 µl 20mM GSH 50 µl 20mM CDNB,

50

µl enzim ekstresi ve hacim 1 ml’ye distile su ile

tamamlandı. 340 nm’de 30°C de köre karşı

absorbanslardaki artış alınarak aktiviteleri hesaplandı.

Bir ünite enzim aktivitesi, 30°C de 1 dakikada 1µmol

ürün oluşumunu katalizleyen enzim miktarıdır. Protein

tayini Coomassie brillant blue yöntemine göre

yapıldı(14,15).

BULGULAR

Kinetik çalışmada enzimin substratlarından biri

olan GSH için CDNB derişimi (1mM) sabit tutularak Km

ve Vmax değerleri saptandı. CDNB için de GSH derişimi

(1mM) sabit tutularak Km ve Vmax değerleri saptandı.

ilaç etkileşim çalışmalarında, Ampisid, Pre-Par,

Novalgin ve Metpamid, doza bağımlı olarak sırasıyla

enzimi %45-50, %50-55,%70-80 ve %80-85 oranında

inhibe etti(şekil 1-4). IESEF ve Sultasid ise enzim

aktivitesini %10-20 oranında inhibe ettiği gözlenmiştir.

0.00 40.00 80.00 120.00 160.00 Ampisid deriþimi (mg/ml) 40.00 60.00 80.00 100.00 % G S T A ktivite si ( m m ol/m gd k)

Şekil 1:GST-Ampisid inhibisyon grafiği.

0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 Pre-Par deriþimi (mg/ml) 40.00 60.00 80.00 100.00 % G ST Ak tiv ite si ( m m ol /m gd k)

Şekil 2:GST-Pre-Par inhibisyon grafiği.

0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 Novalgin deriþimi (mg/ml) 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 % G S T A ktiv ite si ( m m ol/m gd k)

Şekil 3:GST-Novaljin inhibisyon grafiği.

0.00 200.00 400.00 600.00 800.00 1000.00 Metpamid deriþimi (mg/ml) 0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 % G ST Akti vites i (mm ol/ m gdk)

Şekil 4:GST-Metpamid inhibisyon grafiği.

TARTIŞMA VE SONUÇ

Bu çalışmada insan plasental

glutatyon-s-transferaz enzimi (GST-π), glutatyon agaroz kolonu

kullanılarak izole edildi, kinetik özellikleri ve saflaştırma

verileri tablo 1 ve 2’de gösterildi. CDNB’nin sabit

derişiminde (1mM) Km 2 mM, Vmax 11.1(U/mg dk) iken

GSH’ın sabit derişiminde (1mM) Km 0.55 mM, Vmax

35.0 U/mg dk olarak bulundu. Bu değer, diğer

araştırmacılar tarafından bulunan değerlere oldukça

yakındır(5). İlaç etkileşim çalışmalarında ilaçların enzim

aktivitesini azalttığı saptandı. Ampisid ve Pre-Par

%45-55 oranında, Novalgin ve Metpamid %70-85 oranında

enzim aktivitesini azaltmıştır. Bu bulgular plasenta

içerisinde ksenobiyotiklerin metabolize edilmeden de

biyotransformasyona uğratılabileceği ve plasentada

biyotransformasyon basamağında GST’lerin de yer aldığı

görüşünü desteklemektedir (12).

Tablo 1: İnsan plasental GST’sinin saflaştırma basamakları.

Saflaştırma basamağı Hacim (ml) Toplam Protein (g) toplam aktivite Ünite x103 Özgül aktivite (U/mg ) Saflık derecesi Verim % Homojenat 1866 16.79 2744 163.4 - 100 Süpernatant 1200 9.60 4055 422.4 2,58 57 Affinite kromotografi ∗ 200 0.09 236.5 2628.0 16,00 0.5 ∗ Glutatyon agaroz

Tablo 2: İnsan GST-π’sinin GSH ve CDNB için Km ve Vmax

değerleri:

Substrat GSH(CDNB=1mM) CDNB(GSH=1mM)

Km(mM) 2 0.55

Vmax(U/mg) 11.1 35.0

GST’ler, ksenobiyotikler ve elektrofilik bileşiklerin

toksik etkilerini ortadan kaldıran, hücrelerdeki

makromoleküllerin (DNA, RNA, Protein) alkillenmelerini

engelleyen önemli bir enzim grubudur(16,17). Ancak

ksenobiyotiklere ve bunların olumsuz etkilerine karşı

eşsiz bir savunma mekanizması sağlayan GST’ler,

kanserle mücadelede büyük bir engel

oluşturmaktadır(18). Gerçekten, günümüzde antikanser

ilaçlarla kanserin sağaltımında çalışmalar yapan

araştırmacıların karşılaştıkları en büyük sorunlardan biri,

kanserli doku ya da hücrelerle bu kimyasallara karşı

oluşturulan dirençtir ve bunda en önemli rolü GST’ler

üstlenmiş gözükmektedir(19-21). Özellikle son 10 yılda

yapılan çalışmalarda birçok kanser ( mesane, akciğer,

göğüs, beyin ) türünde GST’ lerin önemli bir savunma

bariyeri oluşturduğu ortaya konmuştur (22-24).

Yaptığımız çalışma, in vitro koşullarda

gerçekleştirilmiştir. İlaçların inhibisyon etkisi in vivo

koşullarda çok daha farklı ya da güçlü olabilir. Çünkü

ilaçların yalnız kendilerinin değil, metabolitlerinin etkileri

de olaya katılacaktır. Dolayısıyle, özellikle cenin için çok

daha ciddi boyutlarda sorunlarla karşılaşılabilinir.

GST’lerin aktivitelerindeki azalma detoksifikasyon

mekanizmasını da zayıflatacağı için cenin de savunmasız

bırakılacaktır. Bunun boyutlarının ne olacağı

kestirilemez.

Sonuç olarak, klinik kullanımı yaygın olan

analjezik ve antipiretik (Novalgin) ile antimikrobiyal

ajanların (Ampisid, IESEF, Sultasid) yanında prematüre

doğumların önlenmesinde (Pre-Par vb.) kullanılacak

ilaçlar için seçici ve dikkatli olmak ceninin sağlıklı

gelişimine olumlu yönde katkıda bulunacaktır.

KAYNAKLAR

1. Ketterer, B.: Detoxication reactions of glutathione and glutathione transferases. Xenobiotica. 1986;16 (10-11): 957-973,

2. Vermeulen, N.P.E.: Analysis of mercapturic acids as a to-ol in biotransformation, biomonitoring and toxicto-ological

studies. “Glutathione-S-transferases and Drug Resistan-ce” Taylor and Francis London 1990 : 1,141-153,. 3. Snel, C.A.W. Zhao, Y. Mulder, G.J. Pang, K.S.: Methods

for the quantitation of bromosulfophthalein and its glu-tathione conjugate in biological fluids. Anal. Biochem 1993 ; 212: 28-34.

4. Zhao, Y. Snel. C.A.W. Mulder, G.J. and Pang, K.S.: Loca-lization of glutathione conjugation activities toword bro-mosulfophthalein in perfused rat Liver: Studies with the multiple indicator dilution technique. Drug Metab. Dispos. 1993 ; 21: 1070-1078.

5. Mannervik,B.Guthenberg,C.:Glutathionetransferase (Human placenta).Methods in Enzymology. 1981 ; 77 (28):231-235.

6. Mannervik,B. Awasthi Y.C. Board, P.G et al.:

Nomenculature for human glutathione transferases. Biochem J 1992 ; 282: 305-308,

7. Sato, K. Kitahara, A. Satoh, K. Ishikawa, T. Tatematsu, M. Ito, N.: The placental form of glutathione S - transferase as a new marker protein for preneoplasia in rat chemical hepatocarcinogenesis. Jpn J. Cancer Res 1984 ;75:199-202..

8. Tatematsu, M.Mera,Y. Ito, N. Satoh, K. Sato, K.: Relative merits of immunohistochemical demonstration of placsntal A,B and C forms of glutathione S-transferase and histochemical demonstration of γ-glutamyl transferase as markers of altared foci during liver carcinogenesis in rats. Carcinogenesis. 1985 ; 6: 1621-1626.

9. Kodate,C. Fukushı,A. Narıta,T. Kuda,H. Soma,Y.and Sato, K.: Human placental form of glutathione-S-transferase (GST-p) as a new ımmunohıs tochemical marker for hu-man colonic carcinoma. Jpn. J. Cancer Res. 1986 ; 77: 226-229,

10. Shiratori, Y. Soma, Y. Maruyama, H. Sato, S. Takano, A and Sato, K.: Immunohistochemical detection of the planceltal form of glutathione-S-transferase in dysplastic and neoplastic human uterine cervix lesions. Cancer re-search. 1987; 47: 6808-6809.

11. Harrison,DJ.Khatbanda ,R. Bishop,D. McLelland ,LI. Hayes, JD.:GlutathioneS-transferases in human renal carcinoma demonstrated by immunohistochemistry. Carcinogenesis. 1989 ;10:1257-1260.

12. Pasanen,M.Pelkonen,O.:Xenobiotic and steroid metabolizing monooksigenases catalysed by cytochrome P450 and glutathione S-transferase conjugations in human placenta and their relationships to maternal cigarette smoking. Placenta 1990 ;11:75-85.

13. Ahmed,H. Douglas,EW. Richars, RF. Shivendra,VS. Rheem,DM. Gregg,TN. Yogesh,CA.and Alexander,K.: Primary and secondary structural analyses of glutathione S-transferase π from human placenta. Archives of Biochemistry and Biophysics. 1990 ; 278: 398-408. 14. Warholm, M. Guthenberg, C. Bohr. C.V. and Mannervik,

B.:Glutathione transferases from human Liver. Methods In Enzymology 1985 ;113: 499-504.

15. Scopes, R.K.: Methods for measuring protein concentrati-on. Protein Purification Principles and Pratice. Caph. 1982 ;8.(5). 242-243.

16. Jakoby, W.B.: Reactions of glutathione transferases: A pattern for the enzymes of detoxication. “Glutathione-S-transferases and Drug resistance” Taylor and Francis London 1990 ;1: 87-96.

17. Ketlerer, B. Tan, K.H. Meyer, D.J. and Coles, B.: Glutathi-one transferases: A possible role in the detaxication of DNA and lipid hydroperoxides. “Glutathione-S-transfera-ses and Drug resistance” Taylor and Francis. London 1990 ;3: 149-164.

18. Bladeren, P.S.V. Scheffer, A.G. Vos, R.M.E. Bruggemen, I.M. and Temmink, J.H.M.: The interaction of allyl and benzyl ısothiocyanate and rat liver glutathione-s-tarnsfe-rasese. Glutathione-s-transferases and Drug resistance. Taylor and Francis, London 1990 ;3: 235-238.

19. Wolf, C.R. Lewis, A.D. Carmichael, J. Ansell, J. Adams, D.J. Hickson, I.J. Harris, A. Balkwill, F.R. Griffin, D.B. and Hayes J.D. : Glutathione-S-transfrase expression in nor-mal and tumour cells resistant to cytotoxis drugs. “Glu-tathione-S-transferases and Drug resistance” Taylor and Francis London 1990 ;3: 199-212.

20. Clapper, M.L. Buller, A.L. Smith, T.M. and Tew, K.D.: Glutathione s-transferases in alkylating agent resistant cells. Glutathione S-transferases and Drug resistance. Taylor and Francis, London 1990 ;3: 213-224.

21. Harris, A.L.: Mechanısms of anticancer drug resistance. Glutathione-S-transferases and Drug resistance Taylor and Francis, London 1990 ;2: 283-293.

22. Gsur, A. Haidinger, G. Hollaus, P. At all. ; Genetic Polymorphisms of CYP1A1 and GSTM1 and Lung Cancer Risk. Anticancer Research 2001.;21:2237-2242.

23. Aktaş, D. Ozen, H. Atsu, N. Tekin, A. Sozen, S. Tunçbilek, E. : Glutathione S-transferase M1 gene polymorphism in bladder cancer patients: a marker for

invasive bladder cancer?. Cancer Genetics and Cytogenetics. 2001 : 125: 1-4.

24. J. De Roos, A. Rotman, N. And at all. : Genetic Polymorphisms in GSTM1, -P1, -T1 and CYP2E1 and the risk of Adult Brain Tumors. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 2003.: 12:14-22.

Yazışma Adresi : Dr. V. Kenan ÇELİK