Başlık: SAKız KOYUNLARıNDA EIA TEKNİ(;İ İLE SERLMDA PROGESTERON DÜZEYLERİNıN TAYİNİYazar(lar):SULU, Nesrin;ÖZSAR, Semin;GÜVEN, BülentCilt: 35 Sayı: 2.3 DOI: 10.1501/Vetfak_0000001172 Yayın Tarihi: 1988 PDF

SAKız KOYUNLARıNDA EIA TEKNİ(;İ İLE SERLMDA PROGESTERON DÜZEYLERİNıN TAYİNİ

Nesrin Sulu i Semİn Özsar2 Bülent Güven3

Determination of Progcsterone leı'ch in hlood sera in Sakız slıcep h~' use of E1A.

Summary. Modi/ıed microtitratioıı plate EIA technique ıms app-lied for progesterone determination iıı bload serum of Sakız sheep. The sensitivity of test ıvas found to be

ı.

25 pg /well. Intm and ilıterassay mefficient of variation ıvas7. i

%

(ll1d

ı

2. 3 /~, respectively. The level o{progesterone ıms found O. 37 ~i-O.

\o

ng /ml during oestrus. Progeste-rone lel'els started to increase in the following luteal period. In luteal period the level ol progesteronc ıvas betıveen

ı.

5-12.7 ng /ml. During rhe 15 th to 20 rh day afrer inseminarioıı, progesterone levels of pre-gnant shcep ıvas 4.64

+

3.07 ng /ml. Iıı Sakız sheep the length of oesrms cycle ıvas fOUlıd to be abour 16.31- 1.28 days and the pre-gııaney period ıra.\' 150 ::L

ı. ı

7 days.

Özet. Sakız koyunlan kan serumundu progesteron tayini modifiye

mikrotitrasyon plak enzymeimmUllOassay (EfA) tekniği ile yapıldı. Kul-lamlan deneyin hassasıj"eti delik başma

ı.

25 pg. deney içi ve deneyler arası varyasyon katsayısı sırasıyla 7.

ı %

ve

ı

2.3

%

olarak bulundu. Östrus slrasl/1da progesterol/ mik tan O. 37 -~: O. 10 ng/ml olarak bu-lul/du. Bunu izleyen luteal el'red(' progesterOlI mik tan artmaya başladı. Luteal evre sırasmda progesteron mik tan

ı

.5-.12.7 ng /ml arasmd.ıydı. Gebe kalaıı hayvanlarda tohumlamadmı soııraki

ı

5-20 günler arasmdaki

prog('steroıı miktan 4.64 ı:: 3.07 ng /ml olarak bulundu. Sakız

koyun-larmda ortalama siklus uzımlu/tu

ı

6.3:

ı.

28 gün ve gebelik süresi

150. 04 -I~ 1. 17gün olarak tespit edildi.

1 Doç. Dr., A.O. Veleriner Fakültesi, Fizyoioji Anabilim Dalı, Ankara.

2 Doç. Dr., TAEK Lalahan Hayvan Sa!ılığı Nükleer Araştırma Enstitüsü, Lala-han, Ankara.

3 Dr., TAEK Lalahan Hayvan Sağlığı Nükleer Araştırma Enstitüsü, Lalahan, Ankara.

210 _{N. SULU - S. ÖZSAR - B. GÜVEN}

Giriş

Türkiye hayvancılığında koyun yetiştiriciliğinin önemli bir yeri

vardır. Memleketimizde bilhassa koyunculuk için elverişli mer'aların

bolluğu yetiştiricilik için geniş olanaklar sağlamaktadır (2, 21).

Hayvan ıslahı ve yetiştiricilikte en önemli verim özelliklerinden

bi-ri döl vebi-rimidir. İyi bir döl veriminin elde edilebilmesi için, bunu

et-kileyen yaş, ırk, beslenme, barınak olanakları, mevsim, dinlenme

za-manı (post partum) ve bir takım paraZiter ve enfeksiyöz hastalıklar

gibi faktörlerin kontrol altında tutulması gerekmektedir (28). Tüm bu

faktörlerin etkilerinin kontrolu, hayvanların dölerme özellikleri ile

fizyolojik mekanizmalarının bilinmesiyle yakından ilişkilidir

(ıo,

16).

Gelişmiş ülkelerde hayvancılık alanında bilimsel çalışmaların

çoğun-luğunun dölerme ile ilgili olması bunun önemini vurgulaınaktadır

(L, ll, 13).

Dişi hayvanların üreme aktiviteleri ile ilgili östrus siklusu ve

ge-belik döneminin harmonal mekanizması üzerinde bir çok türde

çalışıl-mıştır (1, 3, 5). Progesteron hormonunun süt ve plazmadaki

düzey-lerinin tayini co rp us luteum'un fonksiyonel aktivitesini gösteren ve

dolayısıyla gebeliğin erken teşhisine olanak sağlayan geçerli bir

para-metre olarak değerlendirilmektedir (ll, 13). Progesteron hormonunun

süt ve plazma düzeylerinin tayininde genellikle, İnce Tabaka

Kroma-tografisi, Gas Kromatografisi, Yüksek Performanslı Likit

Kromatog-rafi, Radioimmunoassay, Enzymeimmunoassay teknikleri

kullanıl-maktadır (5,

ıo,

14, 16, 20). RIA ve EIA'nın hormon tayinlerinde

veteriner hekimlik ve hayvancılık alanına sokulmasıyla önemli

çalış-malar yapılabilmesi mümkün olmuştur. EIA (9, 18) kolaylığı ve

eko-nomik olması nedeniyle hormon analizlerinde güvenle kullanılan

tek-nikierden biri durumuna gelmiştir (l4, 20).

Bu çalışmada, et ve süt verimi ile yavru verimi çok yüksek, iri

yapılı ve büyük kuyruklu olan Sakız koyunlarında, ovaryum

aktivi-tesinin gözlenmesi ve erken gebelik teşhisinde EIA tekniği kullanılarak

progesteron hormon düzeylerinin saptanması ve bu bulguların Sakız

koyunu ve diğer koyun ırkıarında yapılabilecek ilerki çalışmalara temel teşkil etmesi amaçlanmıştır.

Materyal ve Metot

Materyal:

çalışmamızda, Çanakkale Tarım İşletmesinde yetiştirilen 2-3

bes-lenme ve sağlık kontrolu altında tutulan hayvanlardan, Haziran ayı

sonunda başlıyarak aşıma kadar ve tohumlandıktan sonraki 20. güne

kadar haftada 3 kere vena jugularis'ten kan alındı. Bu kanlar 2000

rpm'de

Lo

dakika santrifüje edildi. Serumlar plastik tüplere alınarak

- 20 cC'de derin dondurueuda test yapılıncaya kadar saklandı (15).

Abdominal muhafazalı koç kullanarak, bu koyunlarda sabah akşam

kızgınlık taraması yapıldı. Kızgın olduğu saptanan koyunlar

sağ-lıklı koç kullanarak i2 saat ara ilc iki kez tohumlandı. Tüm hayvanlar

bu şekilde taranarak ve aşım yaptırılarak tohumlama tarihleri saptandı

ve doğuma kadar takip edildi. Progesteron horınonu ile teşhis edilen

erken gebelik oranı doğum ile kontrol edildi.

Metot:

Serum numunelerinde progesteron miktarı mikrotitrasyon plak

enzymeimmunoassay tekniği (9, 14, 20) kullanılarak saptandı.

Horse-radish peroxidase ile işaretli progesteron ve anti-progesteron-IgG,

Lalahan Hayvan Sağlığı Nükleer Araştırma Enstitüsü Fizyoloji

la-boratuv'arında elde edildi (7).

Anti-progesteron IgG ile kaplanan (7, 20) mikrotitrasyon plağına,

daha önce 50 kere sulandırılan (40 iJ.1 serum

-+-

2 ml fosfat tampon)

serum paralelolarak konuldu. Mikrotitrasyon plağın deliklerinin bir

bölümüne de üçlü paralelolmak olmak üzere ve 12.5-200 ng

ımı

sı-ımları içerisindeki standart solusyonlarından 100 tJ.I pipetlendi. Daha

sonra bütün plağa i2 kanaılı pipetör ile 50 t.LIenzim işaretli progesteron

ilave edildi. Bu işlemden hemen sonra plak, 37 °C'lik ortamda iki saat

inkübe edildi. Bu süre sonunda, bağlı ve serbest kısımların ayrılması

amacıyla (7, 14, 20)

%

O. 05'lik tween - 80 içeren yıkama solusyonu

ile plak beş kez yıkandı. Bu işlem otomatik plak yıkayıcısı kullanılarak

yapıldı. Daha sonra plağın tüm deliklerini 150 I.L1 enzim substratı

(HZ02

+

tetramethylbenzidine) konuldu. Mikrotitrasyon EJA plağı

40 dakika karanlıkta oda ısısında inkübasyona bırakıldı (7, 20).

Bek-leme süresini takiben tüm deliklere enzim-substrat reaksiyonunu

dur-durmak amacıyla 50 :J.I 4N HZS04 pipetlendi.

Oluşan sarı renk yoğunluğu Fotometrede (Titertek, Multiskan,

Finnland) 450 nm dalga boyunda okundu. Sonuçlar HP - 41 C mini

bilgisayarda sulandırma faktörü gözönünde tutularak hesaplandı ve

her hayvana ait progesteron profilleri çizildi (Şekil I, 2, 3). Kullanılan

212 _{N. SULU - S. ÖZSAR - B. GÜVEN}

katsayısı ~~ 12.3, deney içi varyasyon katsayısı

%

7. 1 olarak tespit

edildi (7, 14, 18).

Bulgular

Bakım, besleme ve sağlık koşulları aynı olan Sakız koyunlarında

siklus dönemindeki progesteron düzeyleri, siklus uzunluğu, gebelik

süresi ve yavru verimi, tablo i'de; tohumlama öncesi ve sonrası

pro-gesteron düzeyleri Şekil 1 a, b, c, 2 a, b, c, 3, a, b,c, d'de gösterilmiştir.

Tablo 1. Sakız koyunlarının çeşitli dölerme özellikleri P: Progesteron

Tohumlan-Hayvan Yavru Siklus Gebelik Tohumlama dıktan

15-sayısı verİmi uzunluğu süresi anında P 20 gün

son-miktarı miktarı ra P miktarı

--- --- -,--- ____ o

---Lo 1.9:1:0.99 16 . 3:i:1.28 150.40 i- 1. 28 0.37:+:0.10 4.64:1:3.07

(gün) (gün) (ngımı) (ngımı)

Tartışma ve Sonuç

Türkiyede Sakız koyunlarında hormonlar üzerinde yapılmış bir

çalışmaya rastlanmamıştır. Literatürde koyunlarda yapılan bazı

araş-tırmalarda özellikle çevresel faktörlerin östrus üzerine etkili olduğu

bildirilmektedir (4, 8, 15, 17). Araştırmamızda Sakız koyunlarında da

kızgınlığın mevsimsel, ısı ve gün uzunluğu gibi çevresel faktörlere

bağlı olduğu gözlenmiştir. Koyunlarda sabah ve akşam olmak üzere

günde iki defa koçla kızgınlık araması yapılmasının ve kızgınlık

gös-terenlerin 12 saat ara ile iki defa tohumlanmasının nedeni gebe kalma

şansını arttırabilmektir. Tablo 1'de tohumlanma sırasında 0.37

+

O.Lo

ng ımı olan serum progesieron düzeyinin kızgınlığı takiben arttığı,

nitekim 15. - 20. günler arasında 4.64

+

3.07 ng

ımı

değerine ulaştığı

ve luteal evrede bu değişim sınırının 1.5-12.7 ng ımı arasında oynadığı

görülmektedir. Buna göre deneyimizde en az 1.5 ng ımı'deki

proges-teron miktarı hayvanın gebe olduğu şeklinde yorumlanabilmektedir.

Bu ifademiz Rhind'in (17) bildirimine uygun bulunmaktadır.

ŞekiII, 2, 3'den anlaşılacağı üzere hayvanlar normal bir kızgınlık

tablosu göstermiş, tohumlandıkları anda saptanan Ö.37

+

O. 10 ng

ımı

miktarındaki düşük ortalama değer, Linzell ve Heap'in (12) önerdiği

biçimde, tohumlamanın uygun zamanda yani ovulasyon sırasında

c;

E

3 QJ

-.,

....• ~ ~ 2 ao bO o c ...

-o. i- LO o L\ : '

..

LO 15 20 4 c O ... ~ v E 3 .., uı ... QJ tLC bO C L O

-... ::ı. 4 c O ...

-t

e

3 uı ••.••. ~ ~ 2 0-... o. i- b o 5 LO 15 20 ii, ,ft. i '. , \ , "'l

'v

günler O 5 10 15 20 T; Tohumlama

Şekil ı:Sakız koyunlarında tohumlama öncesi ve sonrası progcsteron düzeyleri.

Deneye alınan koyunlarda ortalama siklus uzunluğu 16.3 gün,

(16.3

+

1.28), ortalama gebelik süresi ise 150 gün (150

+

ı

.17)

ola-rak belirlenmiştir. Ortalama siklus uzunluğu, 14 - 19 gün olarak

bil-dirilen diğer koyun ırklarıyla benzerlik göstermektedir (6, 8).

Koçla kızgınlık aramalarında aktif bir şekilde kızgınlık

göster-meyen koyunların progesteron profilleri (Şekil I-a, b, 2-b,c, 3-a,c) ile

hayvanların bu dönemde sikluslarının başladığı görülebilmektedir. Bu

sonuç koyunlarda siklusa başlamanın keçilerin aksine aktif bir

2]4. _{N. SULU - S. ÖZSAR - B. GÜVEN} c o ı.. ~ Q! •••• .u E <il •••••• '" tlli ot c: C -ı..

"'-,o.

. .•.

...• , günler 4 c O ~;:; 3 .u E <il •••••• ~ gı 2 0- <-OL 4 o 5 10 15 20 ~

"

, "

,

J:

_{O 5 10 15 20} O 5 10 15 T: Tohu",la",a

Şekil 2: Sakız koyunlarında tohumlama öncesi ve sonrası progesleron düzeyleri.

görülen bu durum nedeniyle progesteron hormonunun değerlerinin

bi-linmesi önem taşımaktadır. Keçilerin anöstrustan östrusa geçiş

döne-minde genel bir özellik olarak gözlenen, 6-7 gün gibi kısa süreli

sik-lusların koyunlarda görülmediğini bildiren araştırmacılar vardır (19).

Tohumlandıkları tarihten itibaren doğuma kadar izlenen hayvan- .

ların yavru verimi 1.9 ::;= 0.99 olarak bulunmuştur. Bu bulgumuz

Yal-çın (21) tarafından bildirilen 1.7-2.3 verilerine uymaktadır.

Deneylerimizde kullandığımız EIA tekniğinin daha önce inek

sü-tünde geçerliliği (7) kontrol 'edilmiş, bu araştırmada ise modifiye

A i- a c: o ₃ ı.~ cv ....• +> e 1Il'- ₂ cl) bil bil c 0-ı. ₁ p. o 5 10 15 20

,

-tb _f'"

,.

4

\;

c _T o ı.~ 3 ~ cı: ••••• +' e 1Il'-cv clli 2 bil c: o~ ı. o.. ~ O 5 10 15 20 ~ c 4

\

c: o ı.~ ₃ Gl ••••• +> e 1Il'-ol bil ₂ bil c: 0- '-c.. ₁ günler

.

O 5 10 15 20 '4 c: o ı. - 3 ol •...• +> e LIL'-ol bil ₂ clli c: o~ ı. p. O 5 10 15 O- 5 10 15 20 T: Tohumlama

Şekil 3: Sakız koyunlarında tohumlama öncesi ve sonrası progesteron düzeYIl'ri.

tayinine olanak sağlayabilmesi yöntemin ne kadar hassas olduğunu

gösteren bir ölçüm olmaktadır (7, 20).

Sonuç olarak Sakız koyunlarında sürdürdüğümüz bu çalışma,

216 _{N. SULU - S. ÖZSAR - B. GÜVEN}

kan serumunda tayin edilen progesteron düzeyi ile (> 1.5 ng ImI

serum) gebeliğin erken teşhisine yardımcı olabilecektir. Böylelikle

Türkiye hayvancılığında önemli bir yer olan Sakız koyunlarında

progesteron tayininin fertilite kontrolunda ve erken seleksiyona

gidilmesinde önemli bir parametre olabileceği kanısındayız.

Teşekkür

Araştırma sırasında yakın ilgi ve yardımlarını gördüğümüz

baş-ta Çanakkale Tarım İşletmesi Yet. Hekim Adnan Öney'e ve

koyun-culuk, hayvan bakıcısı Ali Leylekçi ve rahmetli İsmail Akçaın olmak

üzere tüm meslektaşlara ve personele candan teşekkürü borç biliriz.

Kaynaklar

ı. Alexander, G., Williams, D. (1966). PI'O!!esterone and placeııtal deı'elopıııent iıı the sıteep. J. EndoerinC'1. 34: 241-245.

2. Arıtürk, M. ye Özcan, H. (i 960). Boztepe iııekhaııesi ı'e Çeşme'de Italk elindeki Sakız

koyuıılartmn bedeıi ölçüleri, yapağı karakterleri, sı;t I'e YOl'1'lIrerimleri üzerinde muka-yeseli bir araşTIrma. A. Ü. Vet. Fak. Yayınları 130, 73.

3. Bona, G., Cairoli, F., Tamanini, c., Abrate, L. (1983). Progesteroııe, estrogene, LH,

FSH, and PRL eoııceııtratioıı.\"iııplasma during tlte estrlls cycleiııgoat. Reprod. Nutr.

Develop. 23 (2-A), 217-222.

4. Chemineau, P., Terqui, M.(i986). Seıısitirity of reproductil'e po/ential/o enl'ironmeıııal faetors in slteep and goats. International Atomic Energy Ageney, Vienna. SR-1 15 /25,

75-89.

5. Edquvist, L.E. and ,Johansson, E.D.B. (t972). Rf A and eompetetire pro/eiıı biııdiııg for

tlte measurement of eertain steroid hormones iııfarm aııimals. International Atomic Energy Agency, Vienna, 245-258.

6. Footc, W.c. (1983). fll1prol'ing reproduction peıformanfe of smail mminaııts. Utah State University. Anual report series, ı25-30.

7. Güven, B. (1988). Mikrotitrasyoıı plak EfA Yöııtemiyle lııeklerde Doğum Sonl'ası Süt Progestel'OlI DüzeyIeriliiıı Tayini. Doktora Tezi. A.Ü. Sağlık Bilimleri

Ensti-tüsü.

8. Hare, L. and Br)'ant, M.J.(i982). Cltaraeteristics of es/rus cycles aııd plasma

proges-teraııe profiles of YOllligfemale slteep duriııg tlteir first breediııg seasoıı. Anim. Prod.

35: 1-7.

9. Ishikawa, E.T., Kawai K. (1981). Eıızyme imıııımoııssay. Igaku-Shain, Tokyo-ISBN: 0-89640-055-7.

iO. Karg, H., Claus, R., Hoffmann, B., Schallenbcrger, E., Schams, S.D. (i976). Presellt

status aııd fu/ure possibili/ies of RIA in animal productioıı. IAEA symposium on

II. Karg, H. (1981). Physiological impaet 011 lertility iıı catt/e, wiıh special emplta.ris011

assessmell/ oL ıhe reproductire fimetion by progesterOlıe assay. Livestock Production

Science, 8: 233-24(,.

12. Linzell, J.L. and Heap, R.B. (1967). A comparison ojprogesteroııe metobo/ism iıı the pregııallt sheep and goat: Soll/'Ces of produetioıı aııd(1/1estimation of uptake by some

target organs. J. Eneldcr. 4i.433-43R.

13. Lalng, J.A. (I 976). Progesteroııe assays of mi/k and tlte colllrol of inferıiliıy. The Ririıish veterinary Journal. 132: 534-537.

14. Munro, C. and Stabenfeldt, G. (I 984). Derelopmenı of a mierotiıre plate

eıız)'meim-mııııoas.my. J. Endocr. 101,41-49.

15. Oyedipe, E.O., Patbiraga, N.O., Edgyist, L.E. and Buı'ancndran. (1986). Oııset of

pıı-berıy aııd eslrous cycle phenome17aiıı Yoııkasa ei.'es as moııitored h)' plasma pro!!este-roııe coııce17lralioııs. A. Repr. Sci. 12: 195-199.

Hi. Post, T.B. (1980). Tlte lise of RIli aııd related procedııres to improre rcproduclioıı oL domeslic aııimals 4th resetırch coordinated meetiııg 011 "The lise of RIA and re/ated

pro-eedU/'es to imprOl'e reprodııclioıı peıformaıice of domı'sıie animals" 5-9 July Ithaca,

New York.

17. Rhinds, M., Chesworth, J.M., Robinson, .J.J. (i978). A seasoııal (/if/ereııce in orine

periplıeral plasma prolactiıı and progesteroııe coııcelltra/ions iıı early pregnancy aııd İlı tlte re/atioıısltip between the tll'O Itormones. J. Reprod. Fert. 52, 79-81.

18. Rubenstein, K.E. (1978). Homogeneolis EIA /Oday. Scand. J. Immıınol. 8 (7), 57-62. 19. Shelton, M. (1980). Goats: lııllııenee of I'arioııs exteroeepıire fae/ors on initiation of

oestrus and omlation. International Goat and Sheep. i(2): 156-162.

20. Van de Wiel., D.F.M. and Koops, W. (1986). Developmellt aııd validatiOlI of an

eıızy-meimmııııoassCl)' fDr progesterone iıı horiııe mi/k or blood plasma. Anim. Rep. Sci., lO,

201-213.

21. Yalçın. B.C. (1986). FAO-UNDP, Animal Prodlletioıı aııd Heal/h paper No. 60, Sheep