HAYVAJNSAL
DOKULARDıA İNOE-TABIAKA iKROMA!TOGRıAFİ
YÖNTEMiİr.;E
TET·RAStKLiN ·REzfn·üuERiNiN T'AYiNiDetermination of tetracycline residues ·in animal tissues by thin-layer chromatography
H. Ahmet A!CET1 Ömer DEMET2
Bünyaırnin TRAŞ3 Su.mmary : This study was evaluated to determine by thin layer ohromatoıgraphy of tlheir residues to !be found in animal tissues of te-tracyel ine group antilbiotics, which were w~idely used in Veterinary field.
It was used IN H;:CL and methanol in extraction of samples and an AmıberJite X1
AD-.2 resin co'lornn for clean-uıp. Slicaıgel 60 G, cellulose and slk·agel HF254 were applied as adsorbent. It was shown that cellulo13e was better result than others.
Their recovery ·were approximetaly determined aıs 6~
%,
adding the tetracyclines at 0.5, ıl.O and :1.5 ppm ·concentrations to the tissues (muscle, liver, kidney) w.hidı was not found the tetracyclines residues. The analy-se analy-sensitivHy of ·this system ·was J.O ppm for liver and 0.5 ppm for muscle and kidney.It was concluded that tJhis method would be aJhle to be used for deter-mination of tetracyclines residues in an:iıma:l tissues as routine.
Özet : Bu ç·alışmada, Veteriner hekimliğinde yaygın olarak kulilanı
lan tetrasiklin grulbu antiibiyotiklerin hayıvıansal dokularda bulunaibile-cek rpzidülerinin ince tabaka kromatograıfi yöntemi iıle analizleri üzerin-de duruldu.
Ekstraksiyon işleminde ılN HCL ve metanol, temizleme aşamasında ise Amberlıi.te XAD-·2 resin ko;lonu kullanıldı. Plaka adsorıbanı olarak
se-(1) Doç. Dr., S. ü. Vet. ıFak. Farm. ve To'ks. 'Anabilim Dalı - Konya (2·} Yrd. Doç. Dr., S. ü. Vet. Fak. Farm. ve Toks. Anabilim Dalı - Konya (3) Arş. Gör., S. ü. Vet. Fak .ve Farm. ve Toks. Ana:bilim Dalı - Konya
146 R. Ahmet Acet - Ömer Demet - Bünyam~raş _ _ _ _ ~ lüloz, slikajel 60 G ve slilkajel HF254 uygulanarak, ıselülozun diğerlerine
göre daha iyi sonuç verdiği beli~lendi.
Re.koveri için tetrasiklin kalıntılarının :bulunmadığı belirlenen doku-lara (ıka!S, karaciğer, bobrek) 0.5, 1.0 ve 1. ·5ppm yoğunluklarında tetra-siklinler dlave edilereık, geriye kazanç yüzdeleri yaklaşık
'%
6ı2 olarak tes-pit ~dildi. Analiz duyaırlıJığı ise karaciğerde 1. ppm, kas ve böıbrekte 0.5 ppm olarak bulundu.Bu metodun hayvansal dokulardaıki tetrasiklin rezidülerinin tayinin-de rütin olarak kulılanılaibileceği sonucuna varıldı.
Giriş
Tetrasiklinler, Streptomyıees türü mantar kültürlerinden elde edilen geniş spektrumlu antibiyotiklerdir. Doğal kaynaklı tetrasiklin
türevle-rinden (Tetrasiklin, klortetrasiklin, . oıksıitetrasiklin ve dıimetıilklortetra si'kilin) başka, yarı sentetik (doksisiklin, minosiklin ve rolitetrasiklin) tü-revlerıi bulunmaktadır. Veteriner HekimHğinde, lbunlar en sık kuılanılan anübiyotiıklerin bulunduğu grulbu oluşturur. Günümüzde, bu antibiyo-tikler insan ve hayvanlarda bakteriyel hastalıkların tedavisinde yaygın olarak kul:lanılımaıkta (·3, 6, lı1, .15, 122)' ayrıca, ihastalıkı1arın kontrol al-tında tutulması ve canlı ağırlık artışı sağlamak amacıyla, genç sığırların ve kümes hayvanlarının yemlerine ilave katkı maddesi olarak da katıl maktadır (5, :21). Bu .giıbi yemleii'le bes'lerren ılıayvanların dokularında re-zidü düzeyinde tetrasiklin ·kalıntılarına rastlanmaktadır (2, 4, 6, 10, 16).
Son zamanlarda, başta et ve et ürünlerıi olmaık üzere hayvansal kö-kenli gıda maddelerinde !bulunması muhtemel olan 1bu kimya•sal rezidü-ler tüJ.retiıcinin yakından ilgisini ·çeıkmeye lba,şılamıştır. Bazı ülke1erde, in-sanlar tarafından gıda olcı,rak tüketilen hayvansal dokularda ve ürünler-de -rezidü analizleri gıda tüzüğüne göre ruıtin 'olarak yapılmaktadır. Ülke-mizde rle bu tür anaHzlerfn yapılması gereğiı kaç~nılmaz olmuştur.
Phzma ve dokularda tetraısik.Jin. rezidü düzeyleri mikro'biyolQjik (6, 13, 20), spektrofotometrik Q1ı5), fluorome,trik (!14), kolorimetrik (1 7) ve kroınatOıgrafik (1, 7, 8, 1Q, 112; :1ı8, 1l9) yöntem1erle tespit e.dileibilmek-tedir.
FDA ('Food and Drug Adminıistration) klortetrasiklin ve oksitetra-siklin'in yenilebilir dokularda.ki tolerans düzeylerini 1-4 ppm olarak be-lirtmektedir (9).
Bu çaılışmada, hayvansal do!ku;larda tetrasiklin rezidü düzeylerinin yarı-nic~l olarak tespit edilebilmesini sağlıyacak, ::Jıalboratuvar şartlarına
Hayvansal boku1arda ±nce-TaJbaka Kromatografi YÖnetimi He... 147 uygun, rutin analizlerde :ku1lanıılaıbilecek prıatik, güvenilir ve ekonomik bir yöntemin uyarlanması_ aımaçlann1ıştır.
M ateryaı ve M et ot a) Adsorbanlar :
1. Se:lüloz (Mi·kroıkristaJ, İnce-Talbaka Kromatografisi için Sigma, N o. S-.3504).
2. Sli'kaje:l G (İnce-Taıbaka Kromatogra§si •için, Type 60, Merck, Art. 7'7.3•1).
3. Slikajel H:F254 (İnce-Tabaka Kromatogrıafisi için, Type 60 Merck
Art. 7739).
4. Arniherlite XAD..:2 resin (Kolon Kromatografisi için, Siguna No. A-T -643) ..
b) Ayıraçlar :
1. 0.12-M di·sodyum hidrojenortafosfat çözeltisi : r2.84 g Disodyum hidrojenortofosfat, 100 ml'lik 'balon jojede distile su ile çözdürülerek ha-zırlandı.
2. OJlıM Sitrik asit çözeltisi : 12 . .10 g Sitrik asiıt 100 ml ıbalon jojede su tle çözdürülerek hazırlandı.
,3. 1N Hidroklorik as•it çözeıltisi : 180.6 ml HCL distile su iJe 1000 ml'-ye tamamlandı.
4. O.lN HidroJdorik asit çözeltisi : 8.06 ml HCL distile su ile 1000 ml'ye tamamlandı.
5. Etilen .gliıkol çözeltisi ('% ·20'1ik) : Metanolde .hazırlandı.
6. 0.2M Magnezyum klörür çözeltisi : 1.9 g Ma;g.nezyum klörür '100 ml'liık ba:lon jojede distile su ile çözdürülere·k hazırlandı.
· 7. Trietlhanolam:in ç·özeltisi
C%
lO'luk) : Metanolde hazırlandı. 8. Antibiyotik ıstandart solü.syontarı : Toz şe'klinde1~i oksitetrasiklin HCL, klortetrasiklin HCL, tetrasiıkılin HCL, standartlan _ Si.g,ma'dan sağ-landı.a. Stok çözelti (10 mıg/ml'lik) : Üç ayrı tetrasiklin standartından lOO'er mg tartılarak 10'ar ml'lik balon jojede 0.5 ,mı 0.1N HCL ile çöztıü-rüldü .. Me.tanol ile hacim tamamlandı.
148 H. Ahmet Acet - Ömer Demet - Bünyamin Traş
-'---~
b. Ça'lışma ç~özeltileri (0. 1 ve 0.2 mg/ml'lik) : Stok çözeltıilerin_den metanolde günlük hazırlandı.
c. Rekover ,çözeltileri (5 mg/ıml'lik) : O.lmg/ml çalışma çözeltilerin• den di.stile su ile günlük hazırlandı.
c) Çözücüler :
Metanol (Mercık, Art. .· 6008) · Etil ıasetat ('Merck, 'Art. 864) N-bütanol (Merck, Art. 98H)
d) Cihazlar :
1. İnce-Talbaka Kromatografi cithazı (Dese,ga)
2. UV-lambası (Dese:ga, uzun-.3166 nın ve 'kı.sa..i254 nım dalga) 3. Rotatif evaparatör (Heidelholph)
Metot
Çalışmada, uyarlıa·manın gerçekleşrtirilelbilrneısi için ekstrak13iyon . ve temizleme işlemlerinde Ryan ve Dupont (.18) 'un kromatograıfik i§lemler de ise, Szabo ve ark. (;19) 'nın ·önerdiıkleri teknikler dikkate alındı.
Temi·zlenmiş ekstraıkta tetrasiklin varlığının tespiti, çeşitlerıinin ayırt edilmesi ve yan-nieel olarak belir~enmesi, ince-tabaıka kromatografisin-de UV ışığı altında, triethanolamin ve ma,gnezyuım · klörür ayıraçlarına dayanan doğrulama testleriyle yapıldı (1:9).
İşlemler :
Homojenizatör kaıbma konulan .25 g 'kıyılmış doku örneği (kas, kara-ciğer ve 'böbrek) üzerine rekoveri çöze·ltilerinden 0.5, ·1.0 ve 1.5· ppm dü-zeylerinde tetrasiklin standartları ve 100 ml lN HCL konarak orta hızda 2 dk. homojenize edüdi. K:arışı1m ,250 ml'lik santrifüj tüplerine alındı. Ka-lın,tı 2 x 0.5 ml lN HCL ile yıkanıp tüplere ilave edilerek 5000rpm devirde 15 dk ~Santrifüj edildi. Üstte kalan faz, Whatıİnann No. 41 sü~geç kağıdın dan süzü1dü.
Kolon kromatografisi hazırlanması : lü x '20 cm iç çaplı cam kolonun
aH ucuna uygun bir şekHde cam pamuğu yerleştirildi. Üzerine 8 g Am-berlite X.AiD-!2 resin ilave edil~;rek yine aynı şekilde cam pamuğu yerleş ti:dldi. Sırasıyla lO'ar ml'li'k ~acimde aseton, metanol ve distile su ile ko-lon yıkandı. Kolona 15 ml lN HCL konarak kullanılıncaya kadar bu şekil~
1
1 ı1
-~
1· ~: 1Hay;vansal Dokularda İnce-Tabaka Kromato.grafi Yönetimi ile... 149 de- ·muhafaza edildi. Kuıllanılmadan önce kolon 100 ml'lik distile su ile yı kandı.
Kolon rejenerasyonu : 'Gerektiğinde kolonun yeniden kullanılması için; sırasıyla 50 ml metanol, 25 ml 1N HCL ve tekrar ı50 ml metanol, 25 ml 1N HCL ile yıkanarak rejenerasyon sağlandı.
Tetrasiklin standartlarının · elüsyonu : Süzülmüş filtrat hazwlanan kolona aktarılarak yavaş bir şekilde kolondan geçirildi. Kolon 75 ml dis~ ti1e su iJe yıkandıktan :sonra 50 .ml metanal kondu. İlk 1'5 ml'lik n1etanoi birimi musıluktan alınarak atıldı. Kalan hacim :315
ac
e-vaıporatörde ıkuru yuncaya .kadar uçuruldu. Kalıntı 0.5 ·.ml metano-lde çözdürülerek ince-ta-baka kromatografisinde kullanıldı.Plakaların hazırlanması : .3ü g selüloz, 70 ml OJ2M disodyum hidro-jenortafosfat ve 84 ml 0.1M sitrik asit karışHnında 12 dk. çalkalanarak iyi-ce homojenize edildi. Öniyi-ceden ılıazırlanmış 5 adet 020 x 1
20 cm) ca·m pla~ ka üzerine 0 .. 3 İnın kalınlık-ta olacak şekilde yayıldı. Plakalar 11
5 dk sü~ reyle laboratuvar ısısında kurutuldu ve etüvde 90 °C'de 30 dk tutularaık aıktirve edildi.
Tetrasiklin standartlarının ve nümunelerin plakaya uygulanması ve
devalapmanı :
Plakalar devolapınarı yonune paralel olaıcak şekilde 1'er cm aralık laJ'fla çizildi. Lekeler uyıgul:a:q.madan önce etilen glikol çöze·Itisine daldı rı'lıp çıkarılarak kurufuldu. Plakaların çö-zücü sistemine dahil olan alt kenanndan 2 cm yükseklikte işaretlenmiş semboli·k bir eksen 'boyunca 0.5 ml n1e.tanolde çözdürülmüş nümune ekstraktından 2, 5 ve 10 ml, tetra~ sik1in standartlarından ise 10, 120, ,3ıQ, '40, ı60, HO ve 100 nıg tetrasikld.n ih-tiva eden lekeler uygulandı. Hazırlanan plak'a ibir saat önceden, su ile do-yuruJ.muş etil asetat (.100 ml) konulmuş tanka yerleştiirldi ve '10 cm yük-se'kliğe kadar devalapman sağlandı. Devalapman işlemi ikf defa yapıldı.
Devalapman . :
1) 100 ml su- ile ıdoyurulmuş etil asetat,
2) Su ile dayurulmuş etH aset:ıt
+
n-butanol (90+
1'0), 3) Su ile doyuruln1uış e til asetat+
n..Jbutanol (60+
40),4) 100 ml su ile doyuruln1u~ n-lbutanol olmak üzere farklı solvent sistemlerinde karşılaştmınalı olarak denen'di. Tıanktan çıkarılan plaka lalbo-ratuvar ısısında kurutuldu. Plakaya önce triethanolamin ayıracı, daha s.onra da magnesium klörür ayıracı püsküxtüldü. Plaka karan'lık bir ortamda
150 H. Ahmet Acet - Ömer Demet - Bünyamin Traş
-uzun dalga UV-ışığ·ı (366 nın) a1 tında incelendi. Standart klortetrasiklin HCL, oksitetrasiklin HCL ve tetra\3iı~lin HCL farklı Rf değerinde ve sarı renkli floresans veren lekeler şeklinde belirlendi. Bununıla beraıber, nü-mune ekstraktında standart tetrasiklin 'le.kelerıiyle aynı renkte flon:..sans veren ve Rıf değeri gösteren lekeler, doku nümunesine katılan tetrasik-: linler olarak değerlendirildi. Fıloresans şiddeti ve leke alanları ibaıkıımın dan farklı y0ğunluklarda'ki tetras.iklin stanıdartları ile karşılaştırılmaları sonucu, nümune ekstraktına ait lekelerde bulunan tetrasi'kHn yoğunluğu yarı-nieel olarak ölçüldü.
Bulgular
Bu çalışmada, tetraısiklin HCL ve oksitetrasiklin HCL klortetrasiklin HCL analizleri, ince taibaka kromatografisinde farklı adsor\ban ve çöZ.ücü sisteınler kullanılarak yapddı. Tablo ı1'de görüldüğü gibi, tetrasiklin Rf değerleri kullanılan sistemlerin tümünde benzer !bulundu. Ancak stan-dartl:ır arasında en iyi ayırım su He dayurulmuş etil asetat ile sağlan dı. Devalapman süresinde çözücü sıistemlere gıöre ·önemli farklılıklar göz-lendi. Devalapman süresi su ile dayurulmuş etil asetat çözücü sisteminde 10-15 dk; etil a·setat
+
n-ıbütanol (9'0+ 10)
·çözüıcü .sisteminde 3ıQ-40 dk; etiıl asetat+
n-bütanol (ı60+ 40) sisteminde
il20o~13ü dk su He dayurul-muş n-ıbütanol sisteminde ise 4 saat olarak tesbit edi'1di.İnce-ta!baka kıromatografıisinde kullanilan slikajel ·60 G .ve slikajel
HF254 adsorbanlarında standart tetrasiklinlerin 'belir:gin bir yükselımesi
görülınediği halde selüloz adsonbanında yeterli düzieyıde bir yüıkseılme meydana geldi.
Çalışmada geriye kazanç yüzdesinin (belirlenmesi aıma:cıyla doku nü-munelerine (kas, karaıcİğer ve böbreık) 0.5, 1.0 ve 1.5 ppm düzieylerinde tetrasiklin standartlan katıldı. Tab[o 2'de ,görüldüğü gibi geriye kazanç yüızdesi; 0.5 ppm tetrasi:klin HCL katımı sonucu kaslarda '% 60, .bö\brek,te
%
612 olarak bulundu. Bu ıdüzeyde karaciğerde tesbit yapılamadı. Katılanoran 1.0 ppm düzieyine çıkarıldığında geriye kazanç yüzdesi kaslarda '% 6·5, karaciğerde '% 3·5 ve höbre}{:e '% 67 olarak be'lirlenir1ken, 1,'5 ppm'lik dü-zeyde bu oranlar kaslaırda % 7!2, karaciğerde % 30 ve böıbrekt.e '% 73 dü-zeylerinde !bulundu. UV-ışığı altında ıgörü~ebilir tetrasiklin yoğunluğu_ 20 nıg olarak belirlendi. Analiz duyarlılığının karaıciğ·erde 1.0 ppm, . dokular-da ise 0.5 ppm olduğu tesbit edildi.
Hayvansal·Dokularda İnce-Tabaka KromatOigrafi Yönetimi ile... 151
Tablo 1. Oksitetrasiklin HCL, 'klortetrasiklin HCL· ve tetrasiklin HCL'-nin se1ü:loz adsorıbanı ile kaplanmış ·pla'kalarda değişik çözücü 6istemleri ile devo1apmanın.dan sonra eılde edilen Rf değer lei.
Tetasiıklin s tandartları TetrasikEn HCL Oksi te.trasiklin HCL Klorte tr asoiıklin HCL Etil asetat 0.32 0.512 Etil asetat n-·bütanol (90/10) 0.33 0.315 Etil asetat n-ıbütanol (60/40) 0.35 0.35 0.53, N-ıbütanol 0.35 0.36 0.5·5
Taıblo 2. 'Doıku nÜJmunelerine 0.-5,' 1.0 ve L5 ppm düzeyılerinde tetrasiklin HCL standartlarının katıirması
He
·elde edilen geriye kazanç yüzde leri. Doku (ı25 g) Kırmızı ıkas Beyaz kas Karaciğer Böbrek Kır.mızı kas Beyaz kars Ka;raciğer B6breF-Kırmızı kas Beyaz kas Kara·ciğer Böbrek Katılan standart yoğunluğu .(mcg,/.g)ı 0.5 ı.o
1.5 Geriye kazanı'lan düzeyleri (m·cg) 7.3 7.3 7.5 16.2'5 116.,25 7.5 1'6.75 '27 ,27 -9 •. 37 127J27 Kazanç '%'si 60 60 6i5 6·5 25 67 7r272
30 7,3152 H. Ahmet Acet - Ömer ·Demet - Bünyamin Traş Tartışnıa ve Sonuç
Veteriner Hekimliğinde, gerek bakteriyel ha6talık1arın kontrol ve sa-ğrt~mııııia gerekse genç sığırların ve kanatlıların canlı ağırlı.Jk artışı sağ~ lanınasında yaygın olarak kullanılan tıe.trasiklıin HCL, oksitet.Tasiıklin HCL ve k'lortetrasiklin HCL anaLizleri, in{!e-tabaka kromatografisiınde farklı adsorlban ve çözücü sistemieri kullanılarak yapılmıştır.
Çalışma:da, ince-tıa\baka ıkaplayıcısı olarak kullanılan slikajel 60 G ve slikajel H:F254 adsorbanları ile ısolvent sistemlerinin hiç birinde
tetrasdJk-linlerin okunalbilir düzeyde yükseimeler:i sağlanamadı. Buna ıkarşılık Tab .. lo 1'de görüldüğü gıilbi selüloz adsorbanında tetrasikliın1erin Rf değerleri beılirlgin olarak hesaplanaıbildi. Çözücü sistemleri arasında en iyi sonuç su ile dayurulmuş etil asetat He alındı. Su ile dayurulmuş n-ıbütanol deva-lapman sürJesi 4 saat iken, etil asetat çözücüsünde ıbu süre 10 .. 1,5 dk olarak be1ir le ndi.
Doku nümunelerine 0.5 ppm düzeyinde tetraJSiklıin standartlarının katılmasıyla elde edilen ekstraktan 2 miikroılitrelik uygulamalarda oluşan renkler belirgin bir şekilde gözlenip değerlenıdirilemedi; 5 mikrolitrelik düzeyde ·gıörü'leıbilir, 10 makrolitrelik uyıgulaımaLar da ise tümüyle lbelir~ gin renkiler oluştu. Buna mukabil 1.0 ve 1.5 ppm düzeylerinde standart katılarak yapılan e:kstrakt uygulamalarında 2 mikrolitrelik lekeler de bi~ le renkler ve floresans şiddeti standartlarla karşılaştırmalı olarak yarı-: nice1 öl.çüm yapıla:cak kadar belirgin nlaraık görüldü. Niteıkim standart-ların 0.5 ppm düzeyinde katılması sonucu '2 mikrolitrelik uy;gulama]arda karacdğerıde belirgin 'bir leke :görülmediği halde 'LO vıe •1;5 ppm'lik katım larda elde edilen ekstraktan yapı1lan 2 mikrolitreıl.i'k uygulamalarda yarı-.
nicel olarak ölçülebilen lekeler oluşmuştur. UV ışığı altında okunaı'bilıir en düşük tJetrasiklin yoğunluğu .20 ng olarak belirlenmi'Ştir. FDA'nın ye-niılefbilir dıoiku1lardaıki tolerans düzeylerinin 1-4 ppm olarak belirttd.ği (9)
gözönüne alınırsa, yöntemin rutin anali:zlerde güvenle kullanılabileceği sonucuna varılalbilir.
İleri .temizleme aşamasında kullanılan amberlite XDA-l2 resin,
tetra-siklin anaLizılerinde önerilen (7, 18) non-iyojeniık bir adsoribandır. Tetra-siklinlerin bu aıdsorbandan ayırımı ıkolay olmaktadır. Rejenere edildik~ ten sonra yeniden ku1lanılalbilir olmaiSı laıboratuvar şartlarımızda avan-taj teşkil etmektedir.
Plazma ve dokularda tetrasiklin rez.idü düzeyleri mikrobiyolojik (6, 13, 20), spektrofotometrik ~15), fluorometrd.ık (14) kolo-ı~imetri:k (1 7) ve kromatografik (J1, 7, 8, ı1J2, 113, 1'8, 119) yöntemlerle tesibit edilebilmek-tedir. Bunlar arasında mi'krdbiynlojik ve kromato.grafik yöntemler
faz-Hayvansal Dokularda İnce-Ta,baka Kromatografi Yönetimi ı:ile... 153 laca kullanılmaktadır. Mikroıbiyolojik yönteımler ant~biyotik analizierin d uyar lı olmalarına rağmen, spes1fiık olmaımaları ve uzun süre almaları gibi· dezavantajlara sahiptirler (8). Kroamt0ıgrafik yöntemler arasında incıe-tabaka kromatoıgrafisi duyarlı bir yol olduğu gibi, ekonomik ve
iste-nildiğiınde lafboratuv:arlarda kolaylıkla uy,gulana!hilen 'bir yöntemdir. İn
ce-ta'bak.a kromato-grafisi ile ça'lışmamızda lbu avantajlar gözönünde tu-tulmuştur. Son zamanlarda, tetrasiklin analizlerünıde HPLC (yüksek per-formans likit kromatograJisi) yöntemi .giderek yayıgınlaşmaktadır (1, 7, 1;2). Ancak Iikıid ·kromatO'grafi cilhazının pahaü olması nedeniyle sayılı la-boratuvar bu yöntemi kullanıma şansına sahip olmaktadır.
So.nuç olarak,· hayvansal do~tularda tetrasik1in .reztdü düzeylerintin
yarı-nieel ola~ak tesbit edile'bümeisini sağlıyacaık lıalboraturvar şartlarına uy-gun tu tin· analizlerde kullaıulatbi·leceik ince-ta: baka kromatografi esasına
dayanan basit, güvenilir ve ekonomik rbir y~öritem uyarlanmıştır.
Kaynaklar
1. Ash worth, R. B. ( 19·8·5). Liq uid chroma:tographic ass ay of tetracyclines in · tissues of food producing animals. J. Assoc. Off. Anal. C'hem., 68, 5,
10.13-1017.
2. Black, W. D. and Gentry, R. D. (1984). The distribution of oxytetracycline in tissues of swine fallawing a single oral dose. Can. Vet. J., 25, ·1·58--161. 3. Booth, N. H., Mc Donald, L. E. (l984). Veter,inary Pharmacolo.gy and
Therapeutics, 5. ed, The Iowa State University Prees, Iowa.
4. Joıhnston, R. W., Remmer, R. H., Harris, E. W., Fugate, H. G. and Schwap, B. ( 1<98,1). A new screeninıg method for the detec:tiön o'f anttbiotic residues . in m~a,.t and .poultry tissues. J. Food Protection, 44, 82'8-8·3'1.
5. Katz, J. M. and Ka.tz, S. E·. (lı98'4). Rapid assay for tetracycline in premixes and mixe'd feeds. J. A. O. A. C., 67, 3, r57ı6-;579.
6; Korkeala, H., :Sorıvetula, O., Maekiıpetaeys, O. and Hirn, J. (19ı3i2). Com-par,ison of dİHerent agar diffusion rİıethods for the detection of antimicrobi-al residues in slaughter anim:antimicrobi-als. ~eta· Vet. Bcand., 23·, 407'-41'5.
7. Moats, W. A. (198-6). Determination of tetra.cycline antibiotics in tissues and blood serum of cattle and swine by h1ıgıh performance liquid chroma-tography. Journal of Ohromatography, 35·8, 25,3-125·9.
8. Neidert, E., Saschenbrecker, W. and Titttger, R. (.1:9-87). Thin layer chroma-tographic method for identüication of anttbiotic residues. J. Assoc. Off Anal. Chem., 70, ·2, 197-1200.
154 H. Ahm·et Acet - ömer nemet - Bünyamin Traş
·9. Nouws, J. F. M. (1981). Tolerances and detection of a.ntimicrohial residues in slaughtered animals. Arehiv Für L~bensmittelhyıgiene, 3:2, 4, 103·-110. lO. Nouws, J. F. M. ( 1·98;4). Iırratation, bioa.vailaıbility and residue aspects of
ten o~ytetracycline formulation administered intramuscularly to pigs. The
Veter:inary Quarterly, ı6, '2, Bü--84.
lıl. Nouws, J. F. M. and Koni.g, G. D. W. (1983). Penetration of same antilbio-tic3 into the lacrimaı fluid of sheep. The Veterinary Quarterly, 5,3, 114-12·1.
12. Oka, H., Ikai, Y., Kawamura, W., Uno, K. and Masuo, Y. (,1•9ı87). X-determi-nation of eigıht tetracyclines using :thin-layer and hıi.ıgh performance liquid chromatography. Journal of Chroma.tography, 3.93-, 285-ı296.
13. Ouderkirk, L. A. (l9ı7ı6). Evaluat'ion of two microbiological methods for detecting residueı antibiotics in milking. J. A. O. A. C. 59, 1'1122'-1 1.24.
14. Potger, H. and Schlacter, C. H. (l9·7ı6). Fluorim.etr1c determination of tet-racyclines in biological materials. Analyst., 101, 808-814.
15. Pollet, R. A. and Glatz, C. E. (t9.S·3.). Oral adsorbtion of chlortetracycline in turkeys: Influence o'f citric acid and pasteurella multocida infection. Poultry Sci., 6.3, Ul0-,1114.
16. Pollet, R. A., Glatz, C. iE., Dyer, D. C. and Barnes, H. J. (lo9·8ı3). Pharmaco-kinet'ics of chlortetracycline potentıiation with citric acid in the chicken. Am. J. Vet. Res., 44, 9, 17,1:8-17:21.
17. Roushdi, I. M., ]brahim, E. A., Belt~gy, Y. A. and Issa, A. (l9·7ı3). C'hlori-metric methöds for the estiınation oftetracycline hydrochloride and oxtet-racycline hydrochLorid. Pharmazie, 8; 4, 12316-2!3·7.
18. Ryan, J. J. and Dupont, A. (1.974). C'hemica.l analysis of tetracycline resi-dues in animal :tıissues. J. of A. O. A. C., 57, 4, 8128-8311.
19. Sza:bo, A., Nagy, M. K. and Tömörkemy, E. (198!1). Thin-layer chroma-tography assay of tetracycl'ines. Journal of Ohromachroma-tography, .1'51, 25ı6ı-2·58.
'2ü. Thorpe, U .. A. (19'7ı5). Aıgar well technigue for anttbiotics in animal feeds.
J. A. O. A. C., 5.8, '1, 9·5·-9ı8.
2'1. Torel, J., Cıllard, J. and Cıllard, P. 0'9'8·5). Determination of oxytetracycline; su1pham.ethazine and sulpıhamethoxyıpridazine in feed premixes. Journal oJ
Ohromatography, 330, 412:5-41218.
2ı2. Zııv, C. Gl9·812). Serum oxtetracycline concentration in cows and caLves after intramuscular injection ol conventional and two long acting oxytetracycline
