Synechocystis sp. İzolatlarının Ni(II) Duyarlılıklarının Belirlenmesi
Ebru Şebnem YILMAZ1* Belma ASLIM2 Emir CANSUNAR31Mustafa Kemal Üniversitesi, Fen-Edebiyat Fakültesi, Biyoloji Bölümü, Antakya-Hatay,TÜRKİYE 2Gazi Üniversitesi, Fen-Edebiyat Fakültesi, Biyoloji Bölümü, Ankara, TÜRKİYE
3Hacettepe Üniversitesi, Fen Fakültesi, Biyoloji Bölümü, Ankara,TÜRKİYE
*Sorumlu Yazar Geliş Tarihi : 15.11.2009
e-posta: ebrusebnem@gmail.com Kabul Tarihi : 13.12.2009
Özet
Bu çalışmanın amacı, Küçükçekmece gölünden izole edilen 10 Synechocystis sp. izolatının Ni(II) ağır metaline karşı oluşan duyarlılıklarını araştırmaktır. Siyanobakteri izolatları 14 gün boyunca 1-20 mg/L dozlarında Ni(II) metaline maruz bırakılmış, alınan örneklerin klorofil-a miktarları ölçülmüştür. Bu sonuçlardan probit analizi ile EC50 değerleri hesaplanarak izolatların canlılıklarını etkileyen metal konsantrasyonları belirlenmiştir.
EC50 değerlerine bakıldığında, en dirençli izolatın Synechocystis sp. BASO403 (EC50= 17,41 mg/L), en duyarlı izolatın ise BASO404 (EC50=
2,56 mg/L) olduğu tespit edilmiştir. Bu sonuçlar, Synechocystis sp. izolatlarında Ni(II) metaline karşı farklı dirençlilik frekansının oluştuğunu göstermiştir.
Anahtar Kelimeler: Küçükçekmece Gölü, Nikel(II), Siyanobakteri, Synechocystis sp.
Determination of Synechocystis sp. Isolates in Respect to Their Susceptibility to Ni(II)
Abstract
The main objective of this study was to investigate the susceptibility of ten Synechocystis sp. isolates from Kucukcekmece Lake to Ni(II) heavy metal exposure. All of the cyanobacterial isolates were exposed to Nickel(II) concentrations in the range of 5-25 mg/L for 14 days. Following exposure the chlorophyll-a values were determined. The results were processed by the probit analysis and the EC50 values of the isolates were
calculated. Our results showed that the most resistance isolate was Synechocystis sp. BASO403 (EC50= 17,41 mg/L), whereas the less resistance
isolate was BASO404 (EC50= 2,56 mg/l). The data obtained from the present study indicated that the Synechocystis sp. isolates display a differantial
susceptibility to Ni(II).
Keywords: Kucukcekmece Lake, Nickel(II), Cyanobacteria, Synechocystis sp.
GİRİŞ
Günümüzde dünya nüfus artışına paralel olarak çeşitli sanayi kuruluşları ve endüstriyel üretimler artmaktadır. Ağır metal, tekstil, boya, deri, pil yapımı gibi birçok endüstri tesislerinin faaliyetleri sonucunda oluşan atık suların ortama gelişigüzel bertaraf edilmesi nedeniyle, doğal sular aşırı şekilde kirletilmektedir [1]. Doğal sulak alanlarda kontrolsüz endüstriyel deşarjların sonucu olarak karşımıza çıkan ağır metaller su kütlesinde birikmektedirler. Bu maddeleri içeren atık sular sadece birleştiği suları kirletmekle kalmayıp, ekosistemlerdeki biyoçeşitliliği de azaltmakta ve ekolojik döngünün bozulmasına neden olmaktadır. Bu nedenle kirlilik oluşturan atık suların ağır metal içerikleri, çevreye verilmeden önce arıtılarak çeşitli su standartlarına göre izin verilen değerlerin altına düşürülmesi gerekmektedir. Çevresel olarak kabul edilebilir düzeylere indirgenmeleri gerekliliğinden, biyolojik olarak bu hedefe ulaşmada siyanobakteriler yeni bir potansiyel oluşturmuştur. Sucul olmaları, hücre büyüklükleri ve
hücre duvar yapısının bileşen özellikleri, ayrıca su kaynaklarından kolaylıkla elde edilebilmesi ve minimum maliyetle üretilebilmelerinden dolayı siyanobakteriler sudaki ağır metal çalışmalarında kullanılan önemli mikroorganizmalardır [2,3].
Küçükçekmece Gölü birçok endemik türü bünyesinde barındıran, dünyadaki doğal lagün göllerinden birisidir. Havzanın sahip olduğu özellikler, yerleşim, endüstri, tarım ve dinlenme-eğlenme bölgesi olarak kullanılmasını da beraberinde getirmektedir. Fakat göl ve çevresinde yapılan araştırmalar göstermiştir ki, bölgenin korunması ve söz konusu amaç doğrultusunda kullanımı gerçekleşmediği gibi alan, ciddi bir kirlilik problemiyle karşı karşıyadır [4]. Kaynaklara bağlı olarak Küçükçekmece Gölü’nde dönemsel olarak ötrofikasyon meydana gelmektedir [5]. Albay ve arkadaşları (2004) ile Üstün ve arkadaşları (2005 ve 2008) tarafından, Küçükçekmece Gölü ve Havzası’nın su kalitesi problemleri ile ilgili olarak yapılan araştırmalarda su ve sediment kalitesi izlemesinin (bazı ağır metaller de dâhil) Biyoloji Bilimleri Araştırma Dergisi 3 (1): 27-30, 2010
E. Ş. Yılmaz ve ark. / Bibad, 3 (1): 27-30, 2010
28
yanı sıra ötrofikasyon problemleri de araştırılmıştır [5,6,7,8].
Bu çalışmada, Küçükçekmece Gölü’nden,
ötröfikasyon döneminde alınan su örneklerinden izole edilen 10 siyanobakteri izolatının Ni(II)ağır metalline karşı dirençliliklerinin incelenmesi hedeflenmiştir.
MATERYAL VE YÖNTEM
Siyanobakterilerin İzolasyonu ve Kültür Şartları
Küçükçekmece gölünden alınan su örnekleri laboratuvara getirilip, sıvı BG11 besiyerinde 15-30 gün süresince geliştirilmiştir [9]. Siyanobakteri izolatlarının izolasyonu iki şekilde yapılmıştır. Genelde saflaştırma yoğun halde üreyen karışık kültürden, ucu alevde uzatılıp inceltilmiş cam pastör pipeti ile tek hücre halinde alınıp yeni bir besiyerine aktarılmak suretiyle yapılırken; bazı izolatlar BG11 agar plaklarında tek koloni yöntemi ile izole edilmişlerdir [2,5].
Saf kültürlerin teşhisi, Bergey’s in Manual of Systematic Bacteriology’e göre ve 16S rRNA’larından elde edilen dizi analizlerinin Gen Bankası (NCB1) verileri ile mukayese edilmesiyle gerçekleştirilmiştir. Kültürler fotosentetik bakterilere özel Minitron marka çalkalamalı etüvde, 100 rpm’de 25 oC ve 3000 lüks ışık
şiddetinde, 12 saat gündüz, 12 saat gece periyodunda geliştirilmişlerdir.
Metal Çözeltisinin Hazırlanması
Kulanılan metal çözeltisi, NiSO4.6H2O ile hazırlanan
1000 mg/L’lik ana stok çözeltilerden seyreltme yapılarak hazırlanmıştır. Denemelerde Ni(II) metalinin 1, 5, 10, 15 ve 20 mg/L olan konsantrasyonları kullanılmıştır.
Mikroorganizmaların Ni(II) Toleranslarının Belirlenmesi
Çalışmanın bu aşamasında, Ni(II) ağır metalinin siyanobakter izolatlarının canlılığına etkisi incelenerek
dirençlilikleri belirlenmiştir. İzole edilen siyanobakter örnekleri uygun şartlarda üretilerek, BG11 besiyeri içeren ve belirlenen konsantrasyonlarda hazırlanan Ni(II) çözeltilerine aşılanmıştır. Kültürler 14 gün boyunca 12/12 gece-gündüz periyodunda 25 oC ve
100 rpm’de inkübasyona bırakılarak, 0. gün de dahil olmak üzere her iki günde bir klorofil-a miktarları belirlenmiştir. Örneklerdeki klorofil-a miktarları, Myers ve arkadaşlarının (1955) önerdiği metodla hesaplanmıştır [10]. Ni(II)ağır metalinin izolatların canlılığı üzerine toksik etkisi, 6. gündeki klorofil-a değerleri kullanılarak probit istatiksel analiz yöntemi ile de belirlenmiştir [11].
BULGULAR VE TARTIŞMA
Çalışmamızda, başta endüstriyel olmak üzere, evsel ve çeşitli atıklarla kirlenmeye maruz kalan Küçükçekmece gölünden izole edilen 10 Synechocystis sp. izolatlarında Ni(II) ağır metaline karşı oluşan dirençlilik değerlendirilmeye çalışılmıştır.
Küçükçekmece gölünden alınan su örneklerinden elde edilen saf izolatlardan, morfolojik yapılarına ve bölünme özelliklerine göre yapılan incelemelerde 10 adet siyanobakter izolatı tespit edilmiştir. Seçilen 5 izolatın da 16S rRNA’larına göre tanımlamaları yapılmıştır [12]. Karşılaştırmalar sonucunda, izolatların % 99 oranında
Synechocystis sp. PCC 6803 suşuna benzerlik gösterdiği
tespit edilmiştir. Bu cinse ait siyanobakterilerin tatlı sularda bol miktarda bulundukları bildirilmiştir [13]. Siyanobakteri izolatlarının kodları ve cins adları verilmiştir (Çizelge 1). Kodlar Gazi Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Biyoteknoloji Laboratuvarı kültür koleksiyonuna göre verilmiştir.
Nikel ağır metal dozlarının mikroorganizmaların canlılığı üzerine etkisi, klorofil-a ölçümleri yapılarak EC50 değerleri ile belirlenmiştir. Tüm kontrol izolatlarının
klorofil a değerleri 14 günlük süreçte artış göstermiştir. Farklı Ni(II)metal konsantrasyonlarına maruz bırakılan izolatların özellikle 6. günden itibaren klorofil-a değerlerinde ise düşüş olduğu görülmüştür (Şekil 1,2).
İzolat kodu Cins Kaynak
BASO400 Synechocystis sp. Küçükçekmece Gölü, İstanbul
BASO401 Synechocystis sp. Küçükçekmece Gölü, İstanbul BASO402 Synechocystis sp. Küçükçekmece Gölü, İstanbul BASO403 Synechocystis sp. Küçükçekmece Gölü, İstanbul BASO404 Synechocystis sp. Küçükçekmece Gölü, İstanbul BASO405 Synechocystis sp. Küçükçekmece Gölü, İstanbul BASO406 Synechocystis sp. Küçükçekmece Gölü, İstanbul BASO407 Synechocystis sp. Küçükçekmece Gölü, İstanbul BASO408 Synechocystis sp. Küçükçekmece Gölü, İstanbul BASO409 Synechocystis sp. Küçükçekmece Gölü, İstanbul
29
E. Ş. Yılmaz ve ark. / Bibad, 3 (1): 27-30, 2010
Stres faktörlerinin siyanobakteri hücrelerine etkilerini belirlemek ve canlılıklarını tespit etmek için klorofil-a miktarlarına bağlı EC50 değerleri biyoteknoloji çalışmalarında sıkça kullanılmaktadır [14]. Çalışmamızda, probit analiz yöntemine göre hesaplanan EC50 değerleri, 6. günün sonunda kullanılan siyanobakteri izolatlarının % 50’sini öldüren metal konsantrasyonu olarak hesaplanmıştır. EC50 değerlerine bakıldığında, en dirençli izolatın BASO403 izolatı olduğu (EC50= 17,41 mg/l), BASO404’ün ise en duyarlı izolat olduğu (EC50= 2,56 mg/l) görülmüştür (Çizelge 2). Aynı cins olmalarına rağmen 10 izolatın EC50 değerleri farklılık göstermiştir. Bu durum, izolatların Ni(II) metaline metabolizmaya bağlı farklı dirençlilik mekanizmaları geliştirdikleriyle açıklanabilir. Banerjee ve arkadaşları (2004) Aulosira
fertilissima türleri ile yaptıkları çalışmada Ni(II) için farklı
EC50 değerleri tespit etmişlerdir [15]. Araştırmacıların yaptıkları çalışmalara benzer şekilde, çalışmamızdaki EC50 değerleri de farklılık göstermektedir.
Hızla gelişen endüstriyel faaliyetlerin sebep olduğu çeşitli bozulmalarda mikroorganizmalar ağır metallere
karşı direnç geliştiririr. Bakterilerde ağır metallere karşı tolerans görülmesi, çevrenin metallerle kirlendiğinin bir göstergesidir [16]. Mikroorganizmalar kalıtsal dirençlilikten ziyade bu dirençliliği ya mutasyonla ya da düşük konsantrasyondan büyük konsantrasyona doğru taşıyarak kazanır. Metale dirençli suşların geliştirdiği mekanizmaları, biyoteknolojik yöntemlerin geliştirilmesinde kullanılabilir.
Küçükçekmece Gölü ve Havzası ile ilgili yapılan çalışmalar sonucunda, ağır metallerinin su, sediment ve sediment arası boşluk suyunda en fazla konsantrasyona sahip olduğu görülmüştür [7]. Yapılan çalışmalar sonucunda, endüstriyel, evsel ve diğer çevresel atıkların herhangi bir arıtım işlemi uygulanmadan Küçükçekmece gölüne verilmesi, Synechocystis sp. izolatlarında Ni(II) metaline karşı farklı dirençlilik frekansının oluşmasına sebep olmuştur. Synechocystis sp izolatlarının dirençlilikleriyle ilgili sonuçlarına göre, tatlı su kirlilik standartları için test mikroorganizmaları olarak geliştirilebileceği öngörülmektedir.
Şekil 1. Synechocystis sp. BASO403’ün canlılığına Ni(II)’in etkisi.
E. Ş. Yılmaz ve ark. / Bibad, 3 (1): 27-30, 2010
30
TEŞEKKÜR
Bu çalışma, Hatay Mustafa Kemal Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından desteklenen 06 M 0101 nolu projenin bir kısmıdır.
KAYNAKLAR
[1] Zollinger H. 1987. Azo dyes and pigments. Colour chemistry-synthesis, properties and applications of organic dyes and pigments. New York, VCH. [2] Yılmaz EŞ. 2009. Siyanobakterilerle Ağır
Metallerin Giderimi ve Bunu Etkileyen Faktörlerin Araştırılması. Hacettepe Üniversitesi, Doktora Tezi, Ankara.
[3] Öztürk Ş. 2008. Çeşitli Tatlı Sulardan İzole Edilen Bazı Synechocystis sp.İzolatlarına Cr(VI) ve Cd(II) Ağır Metallerinin Etkisi ve Giderimi:Metal Gideriminin Protein ve Tiyoller Açısından Değerlendirilmesi. Gazi Üniversitesi, Doktora Tezi, Ankara.
[4] Ağcıoğlu B, 2004. Küçükçekmece Gölü ve Havzası’nın Çevre Sorunları ile Çevre Yönetim Biriminin Gerekliliği, Küçükçekmece Gölü ve Havzası İçin Çevre Yönetim Biriminin Oluşturulma Süreci ve Bölgeye Katkıları Çalıştayı. 20-22 Ekim 2004, İstanbul.
[5] Demirel S. 2008. Doğal Ortamlardaki Fizikokimyasal Şartların Ağır Metal Biyosorpsiyonuna Etkisi. Yıldız Teknik Üniversitesi,Doktora Tezi, İstanbul. [6] Albay M, Akçaalan R, Gürevin C, Aykulu G.
2004. Küçükçekmece Gölü ve Havzası’nın Çevre Sorunları ile Çevre Yönetim Biriminin Gerekliliği, Küçükçekmece Gölü ve Havzası İçin Çevre Yönetim Biriminin Oluşturulma Süreci ve Bölgeye Katkıları Çalıştayı. 20-22 Ekim 2004, İstanbul. [7] Üstün B, İnce N, Cansever G, Ülger E, Ağcıoğlu
B, Şapçı Z., Demirel S, Okumuş E, et al. 2005. The Development of Environmental Management Model in Küçükçekmece Basin. Joint Research and Development Project (GSRT-TUBITAK), Proje No: 102Y011.
[8] Üstün B, Kadırgan N, Oraltay , Peker İ, Okumus
E, Demirel S, Gökağaçlı NG, ve ark. 2008. Doğal Ortamda Ağır Metal İzlemesi: Uygulama Alanı Küçükçekmece Gölü Ve Havzası. TÜBİTAK Ulusal Araştırma Projesi 105Y116.
[9] Rippka R, Deruelles J, Waterbury J, Herdman M, Stanier R. 1979. Generic Assignments, Strain Histories and Properties of Pure Cultures of Cyanobacteria. Journal of General Microbiology, 111: 1–61.
[10] Myers J, Kratz WA. 1955. Relation Between Pigment Content And Photosynthetic characteristics in a Blue-Green Alga. Journal of General. Physiology, 39: 11–22.
[11] Finney DJ. 1963. Probit Analysis . Cambridge Univ. Press, London.
[12] Nubel U, Garcia-Pichel F, Muyzer G. 1997. PCR primers to amplify 16S rRNA genes from cyanobacteria. Applied and Environmental. Microbiology, 63: 3327-3332.
[13] Kaneko T, Sato S, Kotani H, Tanaka A, Asamizu E, Nakamura Y, Miyajima N, Hirosawa M, Sugiura M, Sasamoto S, Kimura T, et al. 1996. Sequence analysis of the genome of the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC6803. II. Sequence determination of the entire genome and assignment of potential protein-coding regions. DNA Research, 3: 109–136.
[14] Gregor J, Jančula D, Maršálek B. 2008. Growth assays with mixed cultures of cyanobacteria and algae assessed by in vivo fluorescence: One step closer to real ecosystems?. Chemosphere, 70: 10, 1873-1878.
[15] Banerjee M, Mishra S, Chatterjee J. 2004. Scavenging of nickel and chromium toxicity in
Aulosira fertilissima by immobilization: effect on
nitrogen assimilating enzymes. Electronic. Journal of Biotechnology, 7: 3- 15.
[16] Aking H, Stimamn A, Ganderen C, Van-Heerikhuizen H, Vant-Riet J. 1984. Inorganic phosphate accumulation and cadmium detoxification in Klebsiella aerogenes NCTC 418 growing in continuous culture. Applied and Environmental Microbiology, 47: 374-377. İzolat No 6. gün EC50 değerleri (mg/L) BASO400 13,24 BASO401 16,57 BASO402 7,12 BASO403 17,41 BASO404 2,56 BASO405 2,88 BASO406 8,67 BASO407 7,27 BASO408 3,04 BASO409 7,38
