Flukonazol ve amfoterisin B’nin Candida türlerine
postantifungal etkisi
Gazi Üniversitesi T›p Fakültesi T›bbi Mikrobiyoloji Anabilim Dal›, Beflevler, Ankara
Sultan Yolbakan, Feryal Çetin Gürelik, Ifl›l Fidan, Sibel Aydo¤an, Ayfle Kalkanc›, Semra Kufltimur
‹letiflim / Correspondence: Ifl›l Fidan Adres / Address: Gazi Üniversitesi T›p Fakültesi T›bbi Mikrobiyoloji Anabilim Dal› Beflevler/ANKARA Tel: 0 312 202 46 26, Fax: 0 312 214 11 31 E-mail: isilfidan@yahoo.com
Postantifungal effect of fluconazole and amphotericin B
on Candida species
ÖZET
Mantarlar›n antifungallere duyarl›l›k testleri genellikle CLSI standartlar›na göre yap›lmas›na ra¤men bazen minimal inhibitör konsantrasyon (M‹K) de¤erleri ile hastalar›n klinik yan›t› aras›nda uyumsuzluk görülebilmektedir. Bu çal›flmada Candida türleri üzerine flukonazol ve amfoterisin-B'nin postantifungal etkisinin (PAFE) belirlenmesi amaçlanm›flt›r. Candida izolatlar› antifungal ajanlar›n farkl› konsantrasyonlar› ile inkübe edilmifl ve daha sonra örneklerin optik dansiteleri ölçülmüfltür. Amfoterisin-B belirgin bir postantifungal etki olufltururken, flukonazol ile bu etki gözlenmemifltir. Bu nedenle antifungal ajanlar›n PAFE de¤erlerinin belirlenmesinin etkili bir antifungal tedavi için yararl› bir strateji olaca¤› düflünülmüfltür.
Anahtar Kelimeler:Candida, postantifungal etki, flukonazol, amfoterisin-B SUMMARY
Although the antifungal susceptibility tests of fungi are usually determined according to CLSI standards, sometimes there is a discordans between the minimum inhibitory concentration (MIC) values and the clinical response of the patients. Aim of this study is to determine the postantifungal effects (PAFE) of fluconazole and amphotericin-B on Candida species. Suspension of Candida isolates were incubated with various concentrations of antifungal agents. Then the optic dansities of the samples were measured. As a result it was seen that while amphotericin-B generated a marked postantifungal effect, fluconazole did not generate. So it was suggested that determining postantifungal effect of antifungal agents may be a useful strategy for an effective antifungal treatment.
Key words:Candida, postantifungal effects, fluconazole, amphotericin-B
G‹R‹fi
Dünyada fungal infeksiyon oran› giderek art›fl göstermekte ve immün sistemi bask›lanm›fl hasta-larda önemli mortalite ve morbidite nedeni olufl-turmaktad›r (1). Candida, do¤ada yayg›n olarak bulunur. Baflta Candida albicans (C.albicans)
ol-mak üzere di¤er Candida türleri özellikle AIDS, kanser hastalar› ile organ transplantasyonu yap›l-m›fl kiflilerde giderek artan bir s›kl›kta görülen hastane infeksiyonu etkenleridir (2). Amfoterisin-B, 5-florositozin, azollerden flukonazol gibi anti-fungal ajanlar kandidoz tedavisinde yayg›n
olarak kullan›lmaktad›r.
Funguslar›n antifungal ilaç duyarl›l›klar›n›n belir-lenmesinde Clinical Laboratory Standarts Institu-tion (CLSI) standart› yayg›n olarak kullan›lmas›-na ra¤men, özellikle amfoterisin-B gibi antifun-gal ajanlar›n M‹K (Minimal inhibitör konsantras-yon) de¤erleri ve klinik yan›t aras›nda tam bir uygunluk görülemeyebilmektedir (3). Bu nedenle, antifungal ajanlar›n invivo etkisi sadece intrensek aktivitesi ve farmakokinetik özelliklerine ba¤l› de¤il, ayn› zamanda antifungal ajan›n kendisinin oluflturdu¤u postantifungal etki (PAFE) ile iliflki-lidir (4). PAFE, fungal hücre ile muamele edil-mifl antifungal ilac›n ortamdan uzaklaflt›r›lmas›n-dan sonra, hücrenin antifungal ajan›n hasar olufl-turucu etkisinden kurtulmas› için gerekli olan sü-re olarak tan›mlan›r (5). M‹K de¤erleri, besiye-rinde antimikrobiyal etkinin statik ölçümü hak-k›nda belirli bir zaman dilimi içinde bilgi ver-mektedir. PAFE, klinisyen için daha önemlidir ve ilaç konsantrasyonu ile ortaya ç›kan farmakolojik etkiler aras›nda daha detayl› bilgi verir (6). Do-lay›s›yla antifungal ajan›n PAFE de¤erinin belir-lenmesi konvansiyonel M‹K de¤erleri yan›nda ikinci bir referans de¤er olarak önemliir. Bu de-¤er klinik kullan›m s›ras›nda antifungal dozunun belirlenmesinde de yarar sa¤layabilir (7). Uzun PAFE de¤erine sahip antimikrobiyal ilaç-lar, k›sa PAFE de¤erine sahip antimikrobiyal ajanlardan daha az s›kl›kta uygulanabilir. Bu du-rum antimikrobiyal ilac›n konakta oluflturaca¤› toksik etkilerin azalt›lmas› ve uygulama kolayl›-¤› aç›s›ndan önem tafl›maktad›r (8).
Bu çal›flmada, PAFE'nin antimikrobiyal ilaçlar›n etkinli¤inin belirlenmesindeki önemi nedeniyle, çeflitli klinik örneklerden izole edilen Candida türlerine karfl› flukonazol ve amfoterisin-B'nin postantifungal etkinliklerinin belirlenmesi amaç-lanm›flt›r.
GEREÇ VE YÖNTEM
Candida izolatlar›. Klinik örneklerden izole edi-len bir adet C.albicans, bir adet C. parapsilosis, bir adet C. inconspicua suflu çal›flma kapsam›na al›nm›flt›r. Candida sufllar›n›n isimlendirilmesinde ID32C maya tan›mlama sistemi (bioMerieux, Fransa) kullan›lm›flt›r.
Antifungal ilaçlar ve MIC de¤erlerinin belirlenmesi. Flukonazol (Pfizer, Türkiye) ve amfoterisin-B (Sigma,Almanya) ilaçlar›n›n morfolinopropansul-fonik asit (MOPS) ile tamponlanm›fl RPMI-1640 (Sigma, Almanya) besiyerinde stok solüsyonlar› haz›rlanm›flt›r. Candida sufllar›n›n flukonazol ve amfoterisin-B M‹K de¤erlerinin belirlenmesinde CLSI standard› kullan›lm›flt›r (9).
Postantifungal etkinin belirlenmesi. Sabouraud dextrose agar (SDA) besiyerinde bir gece inkübe edilen Candida sufllar›n›n spektrofotometride (Shi-madzu, UV-1201, ABD) 520 nm'de 1.5 olacak flekilde süspansiyonlar› haz›rlanm›flt›r. Flukonazol ve amfoterisin-B'nin her Candida suflu için M‹K, 2M‹K, 4M‹K, 8M‹K de¤erlerindeki ilaç konsan-trasyonu Candida süspansiyonlar› ile karfl›laflt›r›l-m›flt›r. Kontrol olarak antifungal içermeyen Can-dida süspansiyonlar› kullan›lm›flt›r. Antifungal içeren ve içermeyen Candida süspansiyonlar› 37ºC'de 1 saat çalkalay›c› etüvde inkübe edilmifl-tir. ‹nkübasyon sonras› antifungal ilaçlar›n uzak-laflt›r›lmas› için 2 kez santrifüj edilerek y›kama yap›lm›flt›r. Daha sonra 100 l Candida içeren süspansiyonu içinde 150 l RPMI-1640 besiyeri bulunan düz tabanl› 96 kuyucuklu mikroplak ku-yucuklar›na eklenmifltir. Herbir Candida suflu ve herbir M‹K de¤eri için 3'er kuyucuk haz›rlanm›fl-t›r. Plaklar 37ºC'de 24 saat süreyle inkübe edil-mifl, 0. saatten itibaren her 1 saatte bir otomatik ELISA okuyucusunda (Biotek, ABD) 595 dalga boyunda optik dansiteleri ölçülmüfltür.
PAFE de¤erlendirilmesinde PAFE=T-C formülü kullan›lm›flt›r. T, antifungal ilaç içeren Candida süspansiyonlar›n›n 0.05 absorbansa ulaflmas› için gerekli süreyi; C ise antifungal ilaç içermeyen kontrol Candida süspansiyonlar›n›n 0.05
absor-μ
μ
bans düzeylerine ulaflmas› için gerekli olan süre-yi ifade etmektedir (7).
‹statistiksel analiz. Sonuçlar›n de¤erlendirilmesin-de Mann-Whitney U testi kullan›lm›flt›r. p<0.05 de¤erleri istatistiksel olarak anlaml› bulunmufltur. BULGULAR
Her üç Candida suflu ile yap›lan amfoterisin-B ve flukonazolün postantifungal etkisinin belirlendi¤i çal›flmam›zda, M‹K, 2M‹K, 4M‹K ve 8M‹K de-¤erlerinde amfoterisin-B ile karfl›laflt›r›lan C.albi-cans, C.parapsilosis ve C. inconspicua sufllar›na ait postantifungal etki sürelerini gösteren de¤erler tabloda gösterilmifltir (Tablo 1).
Candida sufllar›nda amfoterisin-B'nin konsantras-yonunun artmas›n›n antifungal ajan›n postantifun-gal etki süresini uzatt›¤› görülmüfltür. Sufllar ara-s›nda amfoterisin-B'nin PAFE etkisi aç›ara-s›ndan farkl›l›k incelendi¤inde; M‹K düzeyinde C.albi-cans'a karfl› amfoterisin B'nin PAFE etkisinin di-¤er iki sufltan daha k›sa sürdü¤ü görülmüfltür. 2xM‹K ve 4xM‹K de¤erlerinde gruplar aras›nda PAFE süreleri aç›s›ndan anlaml› farkl›l›klar oldu-¤u belirlenmifltir (p<0.05) Amfoterisin-B'nin Can-dida sufllar› aras›ndaki PAFE etkisine ait p de-¤erleri tabloda gösterilmifltir (Tablo 2). Özellikle C.parapsilosis suflunda M‹K, 2xM‹K ve 4xM‹K de¤erlerinde PAFE'nin di¤er Candida türlerine gö-re daha uzun sügö-reli oldu¤u belirlenmifltir.
Flukonazol ise Candida sufllar›n›n hiç birinde an-tifungal ajan›n bulunmad›¤› kontrol örneklerine göre herhangi bir postantifungal etki oluflturma-m›fl ve kontrol örneklerinin 0.05 optik dansite de-¤erine ulaflt›¤› süre ile flukonazolün farkl› kon-santrasyonlarda uyguland›¤› test örneklerinin 0.05 optik dansite de¤erine ulaflt›¤› süre aras›nda an-laml› bir fark gözlenmemifltir.
TARTIfiMA
Candida infeksiyonlar›n›n tedavisinde kullan›lan antifungal ajanlara karfl› artan direnç, özellikle kandidozlar›n daha s›k görüldü¤ü immün sistemi bask›lanm›fl hastalarda sorun oluflturmakta ve bu nedenle uygulanan ilaçlar›n farmakolojik özellik-lerinin tam olarak belirlenmesi önem tafl›makta-d›r. Antifungal etkinli¤in belirlenmesinde kullan›-lan M‹K de¤erlerinin ilaç etkinli¤ini sadece k›sa bir zaman dilimi için belirleyebilmesi, klinikte antifungal ajanlar›n›n etkilerinin tespitinde PAFE gibi di¤er farmakodinamik parametrelerin kullan›-m›n›n yayg›nlaflmas›na yol açm›flt›r (6).
Üç farkl› Candida türüne karfl› amfoterisin-B ve flukonazol gibi antifungal ajanlar›n PAFE de¤er-lerinin belirlenmesi için yapt›¤›m›z çal›flmada, M‹K de¤erleri ve üzerindeki konsantrasyonlarda amfoterisin-B'nin belirgin PAFE göstermesine ra¤men, flukonazol ile bu tür belirgin bir etki tespit edilememifltir.
PAFE, antifungal ajan›n konsantrasyonu, ilac›n yap›s›, ilaçla karfl›laflan mikroorganizman›n
özel-Tablo 1. C.albicans, C.parapsilosis ve C. inconspicua sufllar›n›n PAFE süreleri (saat) (Ortalama±Standart hata)
M‹K 2xM‹K 4xM‹K 8xM‹K 1.83±0.16 3.50±0.28 10.5±0.28 20.33±0.33 4.16±0.16 6.16±0.16 16.83±0.44 19.33±0.33 2.94±0.35 5.66±0.57 13.72±0.92 19.88±0.21 Amfoterisin-B konsantrasyonu
C.albicans C.parapsilosis C. inconspicua
Tablo 2. Bulgular›n istatistiksel de¤erlendirilmesi (p de¤erleri)
C.albicans C.parapsilosis C.inconspicua M‹K 2xM‹K 4xM‹K 8xM‹K M‹K 2xM‹K 4xM‹K 8xM‹K M‹K 2xM‹K 4xM‹K 8xM‹K -0.01 p<0.001 p<0.001 p>0.05 0.072 p<0.001 0.001 p>0.05 0.01 p<0.001 p<0.001 p>0.05 -0.021 0.026 0.002 p>0.05 0.072 p<0.001 0.001 p>0.05 0.021 0.026 0.002 p>0.05 -C.albicans C.parapsilosis C.inconspicua
likleri, karfl›laflma süresi, pH gibi pekçok faktö-re ba¤l› olarak de¤ifliklik göstermektedir (3, 10). Çal›flmam›zda da görüldü¤ü gibi Candida türle-rinde amfoterisin-B arac›l›¤›yla oluflan PAFE, konsantrasyon ve antifungal ajanla karfl›laflma sü-resine ba¤l› olarak farkl›l›k sergilemektedir ve M‹K üzerindeki antifungal konsantrasyonlar› etki-li bir PAFE oluflturmaktad›r.
Özkütük ve ark (11) C.albicans sufllar›na karfl› amfoterisin-B'nin 7.5 ile 20 saat aras› süren pos-tantifungal etkisini gözlerken, flukonazolün bu sufllara karfl› ölçülebilir bir postantifungal etki göstermedi¤ini bildirmifllerdir.
Manavathu ve ark (5) amfoterisin-B'nin Aspergil-lus fumigatus'a karfl› uzun süreli bir PAFE sa¤-lad›¤›, ancak triazollerin k›sa PAFE'ye neden ol-duklar›n› ve fungisidal aktiviteli antifungal ilaçla-r›n fungistatik ilaçlara k›yasla daha uzun süreli PAFE oluflturma e¤iliminde olduklar›n› belirtmifl-lerdir. Ayn› flekilde Ernst ve ark (12) da fungi-sidal etkili mikofunginin doz ba¤›ml› PAFE et-kisi oldu¤unu bildirmifllerdir.
Garcia ve ark (4) amfoterisin-B ve florositozinin Candida türlerine karfl› M‹K, 4xM‹K, 8xM‹K konsantrasyonlarda anlaml› düzeylerde postanti-fungal etkiye yol açt›¤›n›, ketakonazol ve fluko-nazolün bu konsantrasyonlarda belirgin bir PAFE oluflturmad›klar›n›, ancak M‹K üzerindeki konsan-trasyonlarda antifungal uygulanm›fl sufllara daha sonra ilac›n sub-M‹K konsantrasyonlarda yeniden uygulamas›n›n etkili PAFE sa¤layabilece¤ini be-lirtmifllerdir. Azollerin doz protokolünde mikroor-ganizmalar›n büyüme dönemlerinin gözönüne al›nmas›n›n gerekli oldu¤unu bildirmifllerdir. Chryssanthou ve ark (13) C.albicans, C.glabrata ve C.krusei sufllar›nda amfoterisin-B'nin konsat-rasyonu artt›kça PAFE'de bir art›fl görüldü¤ünü, amfoterisin-B'nin yüksek konsantrasyonlarda daha az s›kl›kta verilmesinin daha uygun olabilece¤ini ve 24 saat infüzyon tarz› uygulaman›n etkide azalmaya yol açabilece¤ini belirtmifllerdir. Bonaventura ve ark.(1) C.guilliermondii, C.kefyr
ve C.lusitaniae sufllar›nda azollerin fungostatik aktivite sergiledi¤ini ancak ölçülebilir bir PAFE belirlenemedi¤ini, amfoterisin-B'nin doz ba¤›ml› fungisidal aktivite ve PAFE oluflturdu¤unu bildir-mifllerdir. Bizim de çal›flmam›zda flukonazol ile ölçülebilir bir PAFE de¤eri saptamam›z muhte-melen flukonazolün fungistatik etkili bir antifun-gal ajan olmas› nedeniyle olmaktad›r.
Ernst ve ark.(8) flukonazolün C.albicans ve Cryptococcus neoformans'a karfl› tek bafl›na veya ekinokandin ile kombine durumda iken belirli bir PAFE göstermedi¤ini ama amfoterisin-B'nin Can-dida sufllar›na karfl› 12 saate kadar PAFE olufl-turdu¤unu belirtmifllerdir.
Antifungal ajan ve etki aras›ndaki iliflki optimal tedavi dozlar›n›n belirlenmesinde temel oluflturur. Uzun PAFE'ye sahip antifungal ajanlar daha az s›kl›kta uygulan›rken, k›sa süreli PAFE oluflturan ajanlar›n daha s›k aral›klarla uygulanmalar› gerek-mektedir. Konsantrasyona ba¤l› aktivite ve daha uzun PAFE oluflumuna neden olan ajanlar›n da-ha az s›kl›kta uygulanan tedavi seçeneklerinin kullan›m› baflta ilaç birikimine ba¤l› oluflabile-cek toksisitelerin azalt›lmas›n› sa¤layaca¤› gibi, pekçok baflka avantaj› da beraberinde getirecek-tir. (14). Bu nedenle özellikle immünsüpresif has-talarda ciddi bir problem oluflturan Candida in-feksiyonlar›n›n tedavisinde kullan›lan özellikle fungisidal etkili antifungal ajanlar›n tedavi proto-kollerinin belirlenmesinde M‹K de¤eri yan›nda PAFE de¤erlerinin belirlenmesinin de önemli ol-du¤unu düflünmekteyiz.
Kaynaklar
1. Bonaventura GD, Spedicato I, Picciani C, D'Antonio D, Piccolomini R. In vitro pharmacodynamic characteristics of amphotericin B, caspofungin, fluconazole, and voriconazole against bloodstream isolates of infrequent Candida species from patients with hematologic malignnancies. Antimicrob Agents Chemother 2004; 48: 4453-4456.
2. Ashman RB, Farah CS, Wanasaengsakul S, Hu Y, Pang G, Clancy RL. Innate versus adaptive immunity in Candida albicans infection. Immunol Cell Biol 2004; 82:196-204,. 3. Vitale RG, Mouton JW, Afeltra J, Meis JFGM, Verweij PE. Method for measuring postantifungal effect in Aspergillus species. Antimicrob Agents Chemother 2002; 46: 1960-1965.
4. Garcia MT, Llorente MT, Minquez F, Prieto J. Postanti-fungal effect and effects of Sub-MIC concentrations on pre-viously treated Candida spp. ‹nfluence of growth phase. J In-fect 2002; 45: 263-267.
5. Manavathu EK, Ramesh MS, Baskaran I, Ganesan LT, Chandrasekar pH. A comparative study of the post-antifungal effect (PAFE) of amphotericin B, triazoles and echicandins on Aspergillus fumigatus and Candida albicans. J Antimicrob Chemother 2004; 53: 386-389.
6. Zhanel GG, Saunders DG, Hoban DJ, Karlowsky JA. Inf-luence of human serum on antifungal pharmacodynamics with Candida albicans. Antimicrob Agents Chemother 2001; 45: 2018-2022.
7. Shu M, Ellepola AN, Samaranayake LP. Effects of two different growth media on the postantifungal effect induced by polyenes on Candida species. J Clin Microbiol 2001; 39: 2732-2735.
8. Ernst EJ, Klepser ME, Pfaller MA. Posfungal effects of echinocandin, azole, and polyene antifungal agents against Candida albicans and Cryptococcus neoformans. Antimicrob Agents Chemother 2000; 44: 1108-1111.
9. National Committee for Clinical Laboratory Standards.. Re-ference method for broth dilution antifungal susceptibility
tes-ting of yeasts; approved Standard. Second edition, document M27-A2. National Committee for Clinical Laboratory Stan-dards, Wayne, Pa. 2002.
10. Garcia MT, Llorente MT, Minguez F, Prieto J. Influen-ce of pH and conInfluen-centration on the postantifungal effect and on the effects of Sub-MIC concentrations of 4 antifungal agents on previolusly treated Candida spp. Scand J Infect Dis 2000; 32: 669-673.
11. Özkütük A, K›rdar S, Do¤an Y. Amfoterisin-B ve flu-konazolün Candida albicans üzerindeki postantifungal etkinli-¤i. ANKEM Derg 2005; 19: 31-34.
12. Ernst EJ, Roling EE, Petzold CR, Keele DJ, Klepser ME. In vitro activity of micafungin (FK-463) against Candida spp.: Microdilution, Time-kill, and postantifungal-effect studi-es. Antimicrob Agents Chemother 2002; 46: 3846-3853. 13. Chryssanthou E, Cars O, Sjölin J. New automated met-hod for determining postantifungal effect of amphotericin B against Candida species: Effects of concentration, exposure ti-me, and area under the curve. Antimicrob Agents Chemot-her 2002; 46: 4016-4018.
14. Gunderson SM, Hoffman H, Ernst EJ, Pfaller MA, Klep-ser ME. In vitro pharmacodynamic characteristics of nystatin including time-kill and postantifungal effect. Antimicrob Agents Chemother 2000; 44: 2887-2890.
