TÜRKİYE CUMHURİYETİ BEZMİALEM VAKIF ÜNİVERSİTESİ
TIP FAKÜLTESİ HASTANESİ ÜROLOJİ ANABİLİM DALI
DENEYSEL İSKEMİ REPERFÜZYON MODELİ OLUŞTURULAN VE PARSİYEL NEFREKTOMİ YAPILAN SIÇANLARDA SAFLAŞTIRILMIŞ MİKRONİZE FLAVONOİD FRAKSİYONU’NUN RENAL İSKEMİ REPERFÜZYON
HASARINA KORUYUCU ETKİSİ
UZMANLIK TEZİ
Dr.Sina KARDAŞ Üroloji Anabilim Dalı
TEZ DANIŞMANI Öğr. Gör. Dr. Cevper ERSÖZ
TÜRKİYE CUMHURİYETİ BEZMİALEM VAKIF ÜNİVERSİTESİ
TIP FAKÜLTESİ HASTANESİ ÜROLOJİ ANABİLİM DALI
TEZ DANIŞMANI Öğr. Gör. Dr. Cevper ERSÖZ
Bu araştırma Bezmialem Vakıf Üniversitesi Bilimsel Araştırma Birimi tarafından desteklenmiştir.
İSTANBUL - 2016
DENEYSEL İSKEMİ REPERFÜZYON MODELİ OLUŞTURULAN VE
PARSİYEL NEFREKTOMİ YAPILAN SIÇANLARDA SAFLAŞTIRILMIŞ MİKRONİZE FLAVONOİD FRAKSİYONU’NUN RENAL İSKEMİ REPERFÜZYON HASARINA
KORUYUCU ETKİSİ
UZMANLIK TEZİ
Dr. Sina KARDAŞ Üroloji Anabilim Dalı
i
TEŞEKKÜR
Bezmialem Vakıf Üniversitesi Rektörü sayın Prof. Dr. Rümeyza Kazancıoğlu’na, Tıp Fakültesi Dekanı ve Üroloji Anabilim Dalı Başkan Vekili Prof. Dr. Dilek Sema ARICI’ya, bizlere sağladıkları imkan ve asistan eğitimine verdikleri önem için çok teşekkür ederim.
Uzmanlık eğitimimin önemli bir kısmını birlikte geçirdiğim, hem mesleki hem de sosyal açıdan çok değerli kazanımlar elde etmemi sağlayan, eğitime olan aşk ve şevklerini bizlere de aşılayan, asistanı olmaktan mutluluk duyduğum değerli hocalarım Prof. Dr. Şinasi Yavuz Önol ve Prof. Dr. Abdullah Armağan’a teşekkürlerimi ve saygılarımı sunarım.
Uzmanlık eğitimine ve tıp eğitimine verdikleri önemi her yaptıklarıyla gösteren, kısa çalışma süresi içerisinde bilgi ve tecrübelerinden istifade etme fırsatı bulduğum, farklı bakış açılarıyla fikir dünyamın gelişmesine katkı sağlayan değerli hocalarım Prof. Dr. Mevlana Derya Balbay ve Prof. Dr. Ali İhsan Taşçı’ya teşekkürlerimi ve saygılarımı sunarım.
Ben asistanlığa başladığımda tezini bitirmek üzere olan, bugün ise benim tez danışmanım olan ve asistanlığa başladığım ilk günden bugüne desteğini hiç esirgemeyen değerli abim Op. Dr. Cevper Ersöz’e, tez hazırlama sürecinde değerli katkıları bulunan Prof.Dr. Abdurrahim Koçyiğit’e, Dr. Eray Metin Güler’e, Uzm. Dr. Nurcan Ünver’e teşekkür ederim.
Asistanlık gibi zor bir süreçte mutlu, huzurlu ve samimi bir çalışma ortamında çalışmamı sağlayan, eğitimimde büyük katkıları bulunan ve her biri farklı bir ufuk olan değerli abilerim Doç. Dr. Abdulkadir Tepeler’e, Doç. Dr. Tolga Akman’a, Doç. Dr. Mesrur Selçuk Sılay’a, Yrd. Doç. Dr. Habib Akbulut’a, Op. Dr. Muzaffer Akçay’a, Op. Dr. Senad Kalkan’a, Op. Dr. Abdullah İlktaç’a ve Op. Dr. Fatih Gevher’e teşekkür ederim.
ii
Zorlu ve yoğun mesaimizde birbirimize dayanak olduğumuz, bu ekibin bir parçası olmaktan ve acısıyla tatlısıyla asistanlık sürecini birlikte yaşamış olmaktan mutlu olduğum, değerli abilerim Op. Dr. M.Remzi Erdem’e, Op. Dr.İsmail Başıbüyük’e, Op. Dr. Fatih Elbir’e ve kardeşlerim Dr. Muhammed Tosun’a, Dr. Yunus Kayalı’ya ve Dr. Seyidali Hamidli’ye teşekkür ederim.
Hekimlik mesleğini seçmemde ve bu seviyeye gelmemde şüphesiz en fazla emeği geçen, her zaman yanımda olan, yol gösteren, hiçbir fedakarlıktan geri durmayan canım annem Zülfiye Kardaş ve babam Ömer Kardaş’a çok teşekkür ederim.
Mesleğimin zorlu şartları karşısında en çok etkilenen olmasına rağmen sevgisini, desteğini cömertçe gösteren, başarılı olmam için çabalayan, beni hep düşündüğünü bildiğim, düşünceli ve kıymetli eşim Sibel’e ve en büyük moral ve motivasyon kaynağım, mutluluğum, tez zamanda baba demesini beklediğim, evladım Ömer Yusuf’a teşekkürlerimi sunarım.
iii
ÖZET
Deneysel İskemi Reperfüzyon Modeli Oluşturulan ve Parsiyel Nefrektomi Yapılan Sıçanlarda Saflaştırılmış Mikronize Flavonoid Fraksiyonu’nun Renal İskemi Reperfüzyon Hasarına Koruyucu Etkisi
Amaç: Parsiyel nefrektomi 4cm altı böbrek tümörlerinde standart tedavi yöntemidir. Bu
cerrahi işlemde esas olarak iki stres faktörü doku ablasyonu ve iskemi-reperfüzyonudur(İ-R). Bu çalışmada, saflaştırılmış mikronize flavonoid fraksiyonu (SMFF)’nun soliter böbrekte ve bilateral böbrekte yapılan parsiyel nefrektomi olgularında I-R hasarı üzerine koruyucu etkisini incelemeyi amaçladık.
Gereç ve Yöntem: Çalışmada 200–250 gr ağırlığında 8 haftalık 48 adet erkek
Sprague-Dawley türü ratlar soliter böbrek modeli oluşturulan (1.- 2. ve 3. Gruplar) ve soliter böbrek modeli oluşturulmayan bilateral böbrekli (4.- 5. ve 6. Gruplar) ratlardan oluşan 2 ana grup kendi içerisinde Sham grubu (1. ve 4. Grup) , iskemi-reperfüzyon(I-R) grubu (2. ve 5. Grup) ve tedavi grubu (3. ve 6. Grup) olmak üzere eşit sayıda 6 gruba ayrıldı. Soliter böbrek modeli için ilk 3 gruptaki ratlara sağ nefrektomi yapıldı. Kompansatris hipertrofi gelişmesi için 1 ay beklendi. Sham gruplarında abdomen diseke edildikten sonra sol renal pediküller açığa çıkarıldı ve renal iskemi uygulanmaksızın kapatıldı. I-R gruplarında ve tedavi gruplarında renal arter ve ven oklüzyonun ardından 45 dakika iskemi süresi içerisinde alt pol parsiyel nefrektomi yapıldı ve iskemi sonrası 24 saatlik reperfüzyon süresi tamamlandı. I-R oluşturulması amaçlı cerrahi işlemden önce, 3 gün boyunca, her gün 1 kez ve işlem günü işlemden yaklaşık 1 saat önce olacak şekilde, 80mg/kg(1ml/kg) SMFF tedavisi oral gavaj yoluyla tedavi gruplarına (3. ve 6. Grup) verildi. I-R gruplarında(2. ve 5. Grup) ise 1ml/kg(SMFF ile aynı miktarda) %0.9NaCl tedavi gruplarıyla aynı süre ve zamanda verildi. Ratlar 24. saatin sonunda kalpten kan örnekleri alınıp, sol rezidü böbrek dokuları alındıktan sonra sakrifiye edildi.
Bulgular: Doku ve serumda bakılan oksidatif stres belirteçlerinde ve inflamasyon
belirteçlerinde(TAK, TOS, OSI, PON1, ARES, CAT, MDA, IL-1β ve TNF-α) I-R gruplarında Sham gruplarına göre oluşan değişim anlamlı saptandı. Ancak tedavi gruplarında, I-R gruplarına göre değerlerde düzelme olmasına rağmen, bu düzelme istatistiksel olarak anlamlı değildi. Tedavi gruplarında, I-R gruplarına göre PCO(p<0.05) ve DNA hasarı(p<0.01)
iv
değerlerindeki değişimler istatistiksel olarak anlamlı saptandı. Renal histopatolojik hasar skoru Sham gruplarında diğer gruplara göre anlamlı olarak düşük bulunurken, tedavi gruplarında histopatolojik hasar skorunda I-R grubuna göre göreceli düzelme olsa da istatiksel olarak anlamlı saptanmadı. Bilateral böbrek grupları ile soliter böbrek grupları birbirleri ile karşılaştırıldığında, Sham gruplarının(1. grup ve 4. grup), I-R gruplarının(2. grup ve 5.grup) ve tedavi gruplarının(3. grup ve 6. grup) arasında fark saptanmadı.
Sonuç: Parsiyel nefrektomi esnasında meydana gelen sıcak I-R’ye bağlı, geride kalan böbrek
dokusundaki hasarın SMFF tedavisi ile azaltılmasının amaçlandığı çalışmamızda, SMFF tedavisi renal dokuyu R hasarından beklenildiği ölçüde korumamış, SMFF tedavisinin I-R’de renal dokuda meydana gelen DNA hasarını önlemede başarılı olduğu görülmüş, SMFF tedavisinin soliter veya bilateral böbrekli olduğu farketmeksizin renal I-R hasarını bir dereceye kadar azaltabildiği fakat histopatolojik değerlendirmelerde göz önüne alındığında beklenen olumlu etkilere ulaşmadığı sonucuna varılmıştır.
Anahtar Kelimeler: İskemi, Parsiyel nefrektomi, Reperfüzyon, Saflaştırılmış mikronize
v
SUMMARY
Protective Effect of Micronized Purified Flavonoid Fraction on Renal Ischemia Reperfusion Injury in Experimental Ischemic Reperfusion Model and Partial Nephrectomy Rats
Objective: Partial nephrectomy is the standard treatment for kidney tumors smaller than 4
cm.In this study, we aimed to investigate the protective effect of purified micronized flavonoid fraction (SMFF) on I-R injury after partial nephrectomy performed in solitary kidney and bilateral kidney.
Materials and Methods: Forty-eight male Sprague-Dawley rats weighing 200-250 g were
randomly assigned to a solitary kidney model (1st- 2nd and 3rd groups) and bilateral kidney model (4-5th and 6th groups) were divided into 2 main groups. These 2 main groups were divided equally into 6 groups, namely Sham group (1st and 4th group), ischemia-reperfusion (I-R) group (2nd and 5th group) and treatment group (3rd and 6th group). Right nephrectomy was performed on the rats in the first 3 groups to establish a solitary kidney model. We waited for 1 month for the developement of compensatory hypertrophy. After entering the abdomen in the Sham groups, the left renal pedicle was dissected and closed without renal ischemia. In the I-R groups and the treatment groups, partial nephrectomy of the lower pole was performed within 45 minutes of ischemia and post-ischemic 24-hour reperfusion period completed. Prior to surgery, for 3 days, Once a day and about 1 hour before the operation, 80 mg / kg (1 ml / kg) SMFF treatment was given to treatment groups (groups 3 and 6) by oral gavage. In the I-R groups (2nd and 5th groups), %0.9 NaCl was given at 1 ml / kg for the same time and same amount as SMFF. Rats were sacrificed at the end of 24 hours after blood samples from the heart and left kidney tissues were taken.
Results: Change in the oxidative stress markers and inflammatory markers (TAK, TOS, OSI,
PON1, ARES, CAT, MDA, IL-1β and TNF-α) measured in tissue and serum in the I-R groups was found to be significant in relation to the Sham group. However, despite the improvement in values in the treatment groups compared to the I-R groups, this improvement was not statistically significant. The changes in PCO (p <0.05) and DNA damage (p <0.01) values were statistically significant in the treatment groups according to I-R groups. Renal histopathological damage score was found to be significantly lower in the Sham group than in
vi
the other groups, although there was a relative improvement in the histopathological damage score in the treatment groups compared to the I-R group, it was not statistically significant. There was no difference between the Sham groups (group 1 and 4), I-R groups (group 2 and 5) and treatment groups (group 3 and 6) when bilateral kidney and solitary kidney groups were compared with each other.
Conclusion: In our study, which we aimed to evaluate the effect of SMFF treatment in renal
injury associated with warm ischemia-reperfusion occurred during partial nephrectomy, SMFF treatment did not protect the renal tissue from ischemia-reperfusion injury to the extend we expected, SMFF treatment was found to be successful in preventing DNA damage in the renal tissue in I-R, It has been concluded that SMFF treatment can reduce renal I-R damage to a certain extent, regardless of whether it is solitary or bilateral, but when histopathological evaluations were considered, we did not achieve the expected positive effects.
Key Words: Ischemia, Partial nephrectomy, Reperfusion, Purified micronized flavonoid
vii
İÇİNDEKİLER
SAYFA TEŞEKKÜR i ÖZET iii SUMMARY v İÇİNDEKİLER vii SİMGE VE KISALTMALAR DİZİNİ x ŞEKİLLER DİZİNİ xi GRAFİKLER DİZİNİ xii RESİMLER DİZİNİ xiii 1.GİRİŞ VE AMAÇ 1 2.GENEL BİLGİLER 2 2.1.İskemi 3 2.2.Reperfüzyon 62.3.Renal İskemi Reperfüzyon Hasarı 9
2.4.Saflaştırılmış Mikronize Flavonoid Fraksiyonu
(Diosmin-hesperidin) 11
2.5.Parsiyel Nefrektomi(Nefron Koruyucu Cerrahi) 12
3.YÖNTEM VE GEREÇLER 14
3.1.Deney Grupları 14
3.2.Saflaştırılmış Mikronize Flavonoid Fraksiyonu Hazırlanışı ve
Uygulanması 15
3.3. Anestezi ve Cerrahi Prosedür 15
3.3.1 Soliter Böbrek Modeli Oluşturulması 15
3.3.2. SMFF Tedavisinin Verilmesi 15
3.3.3.İskemi – Reperfüzyon Oluşturulması 16
viii
3.4.Biyokimyasal Parametreler 18
3.4.1.Kan Analizleri 18
3.4.1.1.Comet Assay Yöntemi ile DNA Hasar Tayini 19
3.4.1.2.Total Antioksidan Kapasite (TAK) 20
3.4.1.3.Total Oksidant Seviye (TOS) 21
3.4.1.4.Oksidatif Stres İndeksi (OSİ) 21
3.4.1.5.Katalaz (CAT) 21
3.4.1.6.Plazma Malondialdehit (MDA) 22
3.4.1.7.Protein Karbonilleri (PCO) 23
3.4.1.8.Paraoksonaz Aktivitesinin Ölçümü 24
3.4.1.9.Arilesteraz Aktivitesinin Ölçümü 25 3.4.1.10.Plazma Tümör Nekrozis Faktör Alfa ve İnterlökin 1 Beta
Analizleri 26
3.4.2. Doku Analizleri 26
3.4.2.1.Doku Total Antioksidan Kapasite (TAK) Analizleri 26 3.4.2.2.Doku Total Oksidan Status (TOS) Analizleri 27 3.4.2.3.Doku Tümör Nekrozis Faktör Alfa ve İnterlökin 1 Beta
Analizleri 27 3.5.Histopatolojik değerlendirme 27 3.6. İstatistiksel Değerlendirme 28 4. BULGULAR 29 4.1.Histopatolojik Bulgular 29 4.2.Biyokimyasal Bulgular 33
4.2.1.Kanda bakılan oksidatif stres ve inflamatuar parametrelerin
bulguları 33
4.2.2.Dokuda bakılan oksidatif stres ve inflamatuar parametrelerin
bulguları 40
ix
6.SONUÇLAR 50
x
SİMGE VE KISALTMALAR DİZİNİ
ABY :Akut böbrek yetmezliği
ATP : Adenozin trifosfat
CAT : Katalaz
GPx : Glutatyon peroksidaz
ICAM-1 : İnterselüler adhezyon molekülü-1 IL-1β : İnterlökin-1 beta
I-R : İskemi-reperfüzyon
iNOS : İndüklenebilir nitrik oksit sentaz LT-B4 : Lökotrien B4
MDA : Malondialdehit
NKC : Nefron koruyucu cerrahi OSİ : Oksidatif Stres İndeksi PAF : Trombosit aktive edici faktör PCO : Protein Karbonilleri
PECAM-1 : Trombosit-endotel hücresi adhezyon molekülü-1 PMNL : Polimorf nüveli lökositler
PN : Parsiyel nefrektomi
PSGL-1 : P-selektin glikoprotein-1 RHK : Renal hücreli kanser
SMFF : Saflaştırılmış mikronize flavonoid fraksiyonu SOR : Serbest oksijen radikalleri
SOD : Süperoksid dismutaz
TAK : Total Antioksidan Kapasite TNF-α : Tümör nekrozis faktör-alfa TOS : Total Oksidan Seviye
xi
ŞEKİLLER DİZİNİ
SAYFAŞekil-1: Hücre sitoplazmasında kalsiyum artışı ve sonuçları 4
Şekil-2: Serbest oksijen radikallerinin etkileri 5
Şekil-3: İskemi-reperfüzyon sürecinde oluşan lökosit göçü 7
Şekil-4: İskemi reperfüzyon hasarı patofizyolojisi 9
xii
GRAFİKLER DİZİNİ
SAYFAGrafik-1: Böbrek histopatolojik incelemesinde ortalama renal hasar skorları 29
Grafik-2: Serum TAK değeri ortalamalarının gruplara göre değişimi 33
Grafik-3: Serum TOS değeri ortalamalarının gruplara göre değişimi 34
Grafik-4: Serum TAK ve TOS değerlerine göre hesaplanan OSİ
ortalamalarının gruplara göre değişimi 34
Grafik-5: Serum PON1 ortalamalarının gruplara göre değişimi 35
Grafik-6: Serum ARES ortalamalarının gruplara göre değişimi 36
Grafik-7: Serum CAT ortalamalarının gruplara göre değişimi 36
Grafik-8: Serum MDA ortalamalarının gruplara göre değişimi 37
Grafik-9: Serum PCO ortalamalarının gruplara göre değişimi 37
Grafik-10: DNA Hasarı ortalamalarının gruplara göre değişimi 38
Grafik-11: Serum IL-1β ortalamalarının gruplara göre değişimi 39
Grafik-12: Serum TNF-α ortalamalarının gruplara göre değişimi 39
Grafik-13: Doku TAK ortalamalarının gruplara göre değişimi 40
Grafik-14: Doku TOS ortalamalarının gruplara göre değişimi 41
Grafik-15: Doku TAK ve TOS değerlerine göre hesaplanan OSİ
ortalamalarının gruplara göre değişimi 41
Grafik-16: Doku IL-1β ortalamalarının gruplara göre değişimi 42
xiii
RESİMLER DİZİNİ
SAYFAResim-1: Renal arter ve venin diseksiyonu ve dönülmesi 17
Resim-2: Soldan sağa sırasıyla enjektör kapağının renal arter ve ven altına yerleştirilerek
kompresyon sağlanması; Enjektör kapağının 180o döndürülmesi; Enjektör kapağının 360o
döndürülmesi ile renal arter ve venin torsiyone edilmesi; Enjektör kapağının iskemi süresince
cilde tesbiti 17
Resim-3: Parsiyel nefrektomi sonrası termokoter ile kanama kontrolü 18
Resim-4: Sham gruplarına ait histopatolojik kesit örnekleri 30
Resim-5: I-R gruplarına ait histopatolojik kesit örnekleri 31
Resim-6: Tedavi gruplarına ait histopatolojik kesit örnekleri 32
1
1.GİRİŞ VE AMAÇ
Parsiyel nefrektomi 4cm altı böbrek tümörlerinde standart tedavi yöntemidir (1). Parsiyel nefrektomide renal fonksiyonlara etki eden faktörler başlıca tümöre, hastaya ve cerrahiye bağlı 3 ana başlıkta değerlendirilmiştir. Hastaya bağlı faktörler; artmış yaş, soliter böbrek, düşük operasyon öncesi glomerüler filtrasyon hızı ve erkek cinsiyet; tümöre bağlı faktör artmış tümör çapı; cerrahiye bağlı faktör sıcak iskemi süresi olarak raporlanmıştır. Bu etkenlerden sadece sıcak iskemi süresi değiştirilebilir bir faktör olma özelliği ile diğerlerinden ayrılmıştır (2). Bu cerrahi işlemde esas olan iki stres faktördoku ablasyonu ve iskemi-reperfüzyondur(İ-R) (3). Renal iskemi, kompleks bir olayı başlatarak böbrek hücrelerinin hasarına ve ölümüne neden olur. İskemik böbrek dokusunun dolaşımının yeniden sağlanması için reperfüzyon gerekli olduğu halde, reperfüzyon renal hasara ve disfonksiyona neden olan ilave bir yıkıma neden olur (4). Renal iskemiye bağlı böbrek hasarının patofizyolojisi endotel hasarının eşlik ettiği postiskemik vazokonstriksiyon, inflamasyona sekonder mikrodamarların lökosit ve trombositlerce mekanik obstrüksiyonu ile açıklanırken (5); renal reperfüzyon hasarına neden olan patofizyolojik mekanizmalar içerisinde; polimorfonüklear lökositlerin yapışma ve aktivasyonu, proinflammatuar sitokinlerin serbestleşmesi, reaktif oksijen türleri ile reaktif nitrojen türlerilerinin oluşumu sayılabilir (6,7).
Saflaştırılmış mikronize flavonoid fraksiyonu(SMFF) %90 diosmin ve %10 hesperidin içerir (8). SMFF’nin, I-R’de mikrovasküler alanda oksidanlar ve inflamatuar maddeler tarafından uyarılan makromoleküllerin ekstravazasyonuna karşı koruyucu bir etkiye sahip olduğu bulunmuştur (9,10). Ayrıca postiskemik dönemde lökositlerin endotel hücrelerine olan adhezyonunun ve migrasyonunun SMFF tarafından azaltıldığı gösterilmiştir (9,11). Bunlarla birlikte SMFF’nin akut lenfödem modeli çalışmasında dokudaki ödemi ve inflamasyonu inhibe ettiği gösterilmiştir (12).
Biz bu çalışmada, SMFF’nin soliter böbrekte ve bilateral böbrekte yapılan parsiyel nefrektomi olgularında I-R hasarı üzerine koruyucu etkisini incelemeyi amaçladık. Bizim bilgilerimize göre bu çalışma SMFF’nin renal I-R hasarını korumasına ilişkin ilk deneysel çalışma olacaktır.
2
2.GENEL BİLGİLER
Arteryel kan akımında oluşan patolojiye bağlı dokuların yeterli kan temin edememesine iskemi, iskemik olan doku veya organın yeniden kanlanmasına da reperfüzyon denilmektedir (13). İskemi, hücrede enerji düzeyinin düşmesine ve toksik metabolitlerin dokuda birikmesine yol açarak hücre disfonksiyonundan hücre ölümüne kadar gidebilen biyokimyasal reaksiyonları başlatır (14). Bu reaksiyonları başlatan patofizyolojik etken doku iskemisi olmasının yanında, reperfüzyon da inflamasyona yol açmaktadır (15). Dokuda oluşan inflamasyon ise, serbest oksijen radikallerinin(SOR) artmasına, endotel disfonksiyonuna, medüller mikrosirkülasyonda değişikliğe ve tübüler hasara neden olmaktadır (16).
Hipovolemik şok, yanık, sepsis, pankreatit gibi perfüzyon bozukluğuna yol açan durumlar; iskemik inme ve miyokard enfarktüsü gibi uygulanan trombolitik tedavi veya revaskülarizasyon ameliyatlarına bağlı durumlar; kardiyovasküler cerrahide aortik ya da periferik arteryel klemp uygulamaları sonrası; vasküler, ortopedik ve rekonstrüktif cerrahilerde turnike uygulamaları sonrası gibi durumlar, tıbbın pek çok alanında sık karşılaşılan I-R klinik tablolarıdır (17,18). Tüm bu I-R modellerinde ortaya çıkan toksik ajanlar hem hedef organda hem de uzak organlarda hasara yol açabilmektedir (19).
Böbrekte; parsiyel nefrektomi ameliyatları, renal transplantasyon, sistemik hipotansiyon, hipovolemik şok, kardiyak arrest, renovasküler cerrahi, aortun klempajı gibi klinik durumlar sırasında sıcak I-R hasarı oluşabilmektedir (20,21). Bu hasarın şiddeti iskemi süresine paralel olarak artmakta, sonuçta belirgin doku hasarı olmaksızın gelişen prerenal azotemiden, tübüler veya kortikal nekroza bağlı ciddi akut böbrek yetmezliğine kadar değişebilen farklı klinik tablolar karşımıza çıkabilmektedir (20,22).
I-R hasarının fizyopatolojisi ile ilgili çeşitli faktörler ileri sürülmüştür. Bunlar birbiriyle ilişkileri karmaşık, hücresel ve hümoral olaylar serisidir (23,24). Özellikle; SOR oluşumu, polimorf nüveli lökositlerin rolü(PMNL), kompleman sisteminin rolü ve endotel hücrelerinin rolü I-R hasarının önemli faktörleridir.
3 2.1.İskemi
İskemi, dokunun oksijen ve diğer metabolitlere olan gereksiniminin dolaşım tarafından sağlanamaması ve bu süreçte oluşan atık ürünlerin yine dolaşım tarafından uzaklaştırılamamasıdır (25). İskemik hasarın derecesi hipoksinin derinliğine ve şiddetine bağlıdır. İskemiye bağlı dokuhasarında hücresel enerji depolarının boşalması ve toksik metabolitlerin birikmesi hücre ölümüne yol açar (26).
İskemi sonrasında adenozintrifosfat(ATP) depolarında azalma, sitozolde serbest kalsiyum birikimi, SOR oluşumu ile mitokondri hasarı meydana gelmektedir (15). Takiben gelişen lipit peroksidasyonu ve fosfolipaz aktivasyonu, hücre membran bütünlüğünün kaybolmasına yol açarak hücre nekrozuna sebep olmaktadır (15). Oksijenin ortamda bulunmaması hücrenin ATP depolarında hızla azalmaya yol açarak, ATP bağımlı iyon kanalları ve iyon transportörlerin fonksiyon kaybı ile oksidatif fosforilasyonda görevli enzimlerin işlev kaybına neden olur (27). Bu duruma bağlı olarak hücre içi Ca+2 seviyeleri
artar (27). Hücre içerisindeki Ca+2 miktarındaki artış, I-R hasarında ilk olarak göze çarpan olaylardan birisidir ve iskeminin süresi ile yakından ilişkilidir (28). Normalde hücre dışı Ca+2 konsanstrasyonu, hücre içi Ca+2 konsantrasyonundan 10000 kat fazladır. Bu fark plazma membranı ve endoplazmik retikulumda bulunan Ca-ATPaz ve Na/Ca değiştiricisi ile korunur. Hücre enerjisinin azalması Ca-ATPaz’ların aktivitesi azaltır. Hem Ca+2 hücre dışına çıkışı, hemde endoplazmik retikulumdan Ca+2 sekestrasyonunun bozulması ile hücre içi Ca+2 artar. Ayrıca enerji azlığı ile Na/K ATPaz aktivitesinin inhibe olması kalsiyumun Na/Ca değiştiricisi ile hücre içine girişini etkinleştirir (29). İntrasellüler Ca+2 artışı ile fosfolipazlar
ve proteolitik enzimler aktive olurlar (Şekil-1). Fosfolipaz A2 aktivasyonu ile membran
fosfolipidleri bozulmaya başlar; plazma ve mitokondriyal membran biyoenerjetikleri ve geçirgenlikleri de değişir (30). Araşidonik asit, fosfolipazların aktivasyonu sonucu oluşur. Araşidonik asit, direkt etkiyle mitokondriyal enzimleri inhibe ederek SOR oluşumunu artırır (31).
SOR, eşlenmemiş elektron içeren atom veya moleküldür (32). Biyolojik sistemlerde oluşan SOR’lerin endojen kaynakları oksijen, nitrik oksit, uyarılmış nötrofil, mitokondriyal elektron transport sistemi, endoplazmik retikulum, peroksizom ve plazma membranı olarak
4 EKSTRASELLÜLER ALAN
sayılabilir (32). Solunan oksijenin % 95’inden fazlası mitokondrilerde ATP şeklinde enerji oluşumunda kullanılırken, yaklaşık %5’i de son yörüngelerinde ortaklanmamış elektron içermesi nedeniyle toksik serbest radikallere dönüşmektedir (33).
Şekil-1: Hücre sitoplazmasında kalsiyum artışı ve sonuçları (39) (Kaynaktan faydalanarak çizilmiştir)
SOR’nin hücreler üzerinde lipit peroksidasyonu, hücre proteinlerinin oksidasyonu ve DNA hasarı gibi zararlı etkileri vardır (34). Hücresel hasara yol açmada başta hidroksil radikali olmak üzere peroksinitrit ve hiperkloröz asit gibi serbest oksijen radikalleri suçlanmıştır (35).
SOR’lerin ilk oluşanı ve öncüsü genellikle stabil olmayan ve hidrojen peroksit ile oksijene dönüşen süperoksit radikalidir (36). Fagositoz görevi yapan makrofaj, nötrofil ve
İNTRASELLÜLER ALAN
Stoplazmik Ca++ artışı
ATPaz Fosfolipaz Proteaz Endonükleaz
Ca++ Mitokondri Endoplazmik retikulum ATP azalması Fosfolipid azalması Membran ve hücre iskeleti proteinlerinin parçalanması Nükleer Kromatin Hasarı
5
monositler tarafından enzimatik olarak üretilirler (37). Hidrojen peroksit hücre membranlarından kolaylıkla geçebilen, endotelyal hücreleri hasarlayabilen güçlü bir sitokindir. SOR olmadığı halde birçok reaktifin oluşum reaksiyonlarına katıldığı için hidrojen peroksitte toksik metabolitler içinde yer alır. Toksik özellik gösterebilmesi için hidroksil radikaline dönüşmek zorundadır (36)(Haber-Weiss reaksiyonu). Hidroksil radikali, bilinen serbest radikaller içinde en güçlü olan ve doku hasarında sorumlu ana radikaldir (37). Çok kısa ömürlü ve reaktif olan bu radikal, protein, polisakkarit, nükleik asit ve ansatüre yağ asitleri gibi birçok biyolojik madde ile reaksiyona girer. Bu radikalin en önemli özelliği, hidrojen atomlarını hücre membranındaki poliansatüre yağ asitlerinden ayırmasıdır. Lipit peroksidasyonunu başlatarak hücre membranında çözülmeye ve buna bağlı hücre ölümüne yol açar (38)(Şekil-2).
Şekil-2: Serbest oksijen radikallerinin etkileri (40) (Kaynaktan faydalanarak çizilmiştir)
OKSİJEN RADİKALİ OKSİJEN RADİKALİ Kemotaksis Nötrofil Birikimi Kapillerde Nötrofil Tıkacı İSKEMİ Fagositoz Lipid peroksidasyonu Membran parçalanması HÜCRE HASARI
6 2.2.Reperfüzyon
İskemik dokudaki kan dolaşımının yeniden sağlanmasına reperfüzyon denir (41). İskemi sonrası kan akımının tekrar başlaması iskeminin oluşturduğu hasardan daha fazla hasara yol açabilir (42).
Reperfüzyon hasarını önlemeye yönelik antinötrofil serumlarla ya da lökosit adhezyon moleküllerine karşı monoklonal antikorlarla yapılan çalışmalar, reperfüzyonda mikrovasküler permeabilitedeki artıştan başlıca PMNL’lerin sorumlu olduğunu göstermiştir (43). İskemi reperfüzyon hasarında PMNL’nin rolü ile ilgili öne sürülen mekanizmalar: Mikrovasküler oklüzyona yol açması, yüksek miktarda SOR üretmesi, sitotoksik enzim salınması, vasküler permeabilite artışı ve sitokin salınmasında artıştır (44).
I-R ile lökosit aktivasyonu, kemotaksis ve lökosit endotel hücre adhezyonu meydana gelir (45). PMNL’lerin aktivasyon ve migrasyonları endotel hücrelerinde ve lökositlerde bulunan adhezyon molekülleri aracılığıyla olur. İlk olarak PMNL’lerde bulunan P-selektin glikoprotein-1(PSGL-1) adlı reseptörü ile etkileşerek düşük afiniteli lökosit endotel bağlantısını oluşturur (lökosit rolling)(46). İkinci aşamada, lökosit beta-2 integrinler (CD11a/CD18 ve CD11b/CD18) ile endoteldeki interselüler adhezyon molekülü-1(ICAM-1) arasındaki etkileşim sonucunda lökosit adhezyonu ve agregasyonu gelişir (46). Üçüncü aşama ile, trombosit-endotel hücresi adhezyon molekülü-1 (PECAM-1) ile endotel hücre bağlantıları arasındaki etkileşim ile lökosit transmigrasyonu gerçekleşir. Aktive lökositler damar dışına ulaşınca hasar bölgesine doğru göç etmeye başlarlar (kemotaksis, Şekil-3)(46).
Nötrofillerin dokuya gelebilmeleri için gerekli kemotaktik maddeler arasında C3a ve interlökin-1(IL-1), lökotrien B4(LT-B4), trombosit aktive edici faktör(PAF) ve prostaglandin
türleri vardır (46). Aktif lökositler, nükleer transkripsiyon faktörlerinin(NF-kB) aktivasyonuna ve tümör nekrozis faktör-alfa(TNF-α) sentezine yol açar (45). Aktif nötrofiller salıverdikleri maddelerle yol açtıkları hasarın yanı sıra, damar içinde oluşturdukları hücre toplulukları(agregatlar) ve aktif trombositlerle birlikte damar endoteline yapışarak mikrovasküler tıkanmaya da neden olurlar (48). Yapılan son çalışmalarda; nötrofillerin
7
aktivasyon ve dokuya infiltrasyon derecesi ile reperfüze dokudaki nekroz ve apoptozis derecesi arasında bir korelasyon olduğu bulunmuştur (49).
Şekil-3: İskemi-reperfüzyon sürecinde oluşan lökosit göçü (47) (Kaynaktan faydalanarak çizilmiştir)
İskemik dokunun reperfüzyonu, arteriyollerde endotel bağımlı dilatasyonun bozulmasına, kapillerlerde lökosit tıkaçlarının oluşmasına ve sıvı filtrasyonunun artmasına, postkapiller venüllerde plazma proteinlerinin damar dışına sızmasına ve böylece mikrovasküler fonksiyonun bozulmasına neden olur (20). Reperfüzyonun başlangıç döneminde, endotel hücrelerinde fazla miktarda süperoksit oluşurken nitrik oksit oluşumu ise azalır ve süperoksit radikali ile nitrik oksit arasındaki dengenin bozulması, endotel hücrelerinden PAF, TNF-α gibi inflamatuvar mediyatörlerin salınmasına ve lökosit-endotel hücre adhezyonuna aracılık eden adhezyon moleküllerinin biyosentezinin artmasına neden olur (50).
SOR oluşumunda ve I-R hasarında önemli bir kaynak olan nötrofiller azurofilik granüllerinde oksidan etkili NADPH oksidaz, elastaz ve miyeloperoksidaz enzimlerini
Damar Lümeni Bazal Membran Nötrofil (N) (N) (N) (N) (N) (N) (N) İnterstisyel alan ICAM-1 PECAM-1 CD11/CD18 P-selektin PSGL-1
8
içerirler. İskemi sonrası reperfüzyonun başlaması ile birlikte, dokuya sunulan oksijenin yaklaşık %70’i NADPH-bağımlı oksidaz ile süperoksit iyonlarına oksitlenmektedir. Süperoksit iyonları hidrojen peroksite, hidrojen peroksit ise klorür iyonlarının varlığında miyeloperoksidaz enzimi aracılığı ile hipoklorik aside indirgenir. Hipoklorik asit güçlü bir oksidandır ve birçok biyolojik molekülle kolayca reaksiyona girebilir (51).
İskemi reperfüzyon hasarında kompleman sisteminin aktivasyonu ile proinflamatuar komponentler; C3a, C5a, C3b ve C5b-9 oluşur. Kompleman sistemi, lökosit adhezyon moleküllerinden; vasküler hücre adhezyon molekülü 1 (VCAM-1), interselüler adhezyon molekülü 1 (ICAM-1), E-selektin ve P-selektin sentezini arttırır. Ayrıca TNF-α, IL-1 ve IL-6 üretimini uyararak inflamatuvar yanıtı amplifiye eder (52).
I-R hasarının oluşmasında endotel hücreleri önemli role sahiptir. Oksidatif stres endotel hücrelerinin aktivasyonuna ve işlevlerinin bozulmasına neden olur. Endotel hücreleri SOR için potansiyel hedef konumundayken diğer taraftan da SOR üretim kaynağıdır. Endotel, mikrovasküler homeostazdan sorumlu olan endotelini ve nitrik oksidi üretir. I-R hasarında endotelin/NO oranı endotelin lehine bozulur. Sonuçta arteriyel vazokonstriksiyon, venlerde vazodilatasyon olur (53). Nitrik oksitlerin radikal olarak reaktivitesi düşüktür, ancak metal içeren bileşikler ve radikaller ile büyük bir hızla tepkimeye girerler. Özellikle lipit radikallerle tepkimeye girmesi nitrik okside antioksidan bir etki kazandırır. İndüklenebilir nitrik oksit sentaz(iNOS) enziminin indüksiyonu sırasında nitrik oksit derişiminin artması ile oksidasyonu da hızlanır ve çeşitli reaktif nitrojen oksit türleri oluşur. Bu reaktif türler nitrik oksidin dolaylı etkilerinden sorumludur ve hücresel moleküllerin nitrozilasyonuna, nitrasyonuna, nitrozasyonuna yol açarak, proteinlerin ve enzimlerin aktivitelerinin sonlanmasına neden olabilirler (54).
9
Şekil-4: İskemi reperfüzyon hasarı patofizyolojisi (55) (Kaynaktan faydalanarak çizilmiştir)
2.3.Renal İskemi Reperfüzyon Hasarı
Böbreklerdeki I-R hasarının mekanizması multifaktöriyel ve birbirine bağlı hipoksi, serbest radikal hasarı ve inflamatuar cevaplarla ilişkilidir (56). Prerenal faktörlere bağlı gelişen iskemik hasarda preglomerüler vazokonstriksiyon, glomerüler filtrasyon hızının azalmasındaki en önemli sebep olarak gözükmektedir (57). Nörohormonal cevabın uyarılması ile renin anjiyotensin aldosteron sistemi aktive olur. Glomerüler plazma akımı %30-50 oranında azalır. Katekolaminlerin, anjiyotensin II’nin ve endotelinin seviyeleri artar ve vazokonstriksiyon gelişir (26). Preglomerüler sebepler sonucu makula densaya ulaşan solütlerin miktarının artması ile tübüloglomerüler feedback mekanizması da aktive olur ve bu aktivasyon vazokonstriksiyonun devam etmesine sebep olur (58). İskemik böbrekte vazokonstriktör maddelerin etkisine karşı aşırı bir hassasiyet ve vazodilatör maddelerin etkisine karşı da direnç söz konusudur (59). Oksijenlenmenin bozulması ile artan intraselüler kalsiyum birikiminin afferent arteriyollerdeki direnç artışı ile ilişkili olduğu bildirilmiştir (60).
Trombosit aktivasyonu (tromboz + vazokonstruksiyon) Metabolizma değişikliği (ATP kaybı) Doku Hasarı Reperfüzyon PAF + LTB4 + SOR Kemotaktik Faktörler Nötrofil Birikmesi Fagositoz Tıkaç SOR İskemi
Artmış Doku Hasarı
Lipid peroksidasyonu Endotel Hasarı
Membran Bütünlüğünün Bozulması
Vazokonstriksiyon, Agregasyon, Kemotaksis
10
Şekil-5: İskemik Renal hasar patogenezinde rol oynayan faktörler (56) (Kaynaktan faydalanarak çizilmiştir.)
Hipoksinin devam etmesi ve inflamatuar cevap, akut böbrek yetmezliğinde rol oynamaktadır. İskemik olay düzelse bile reperfüzyon sırasında kan akımında %40-50 oranında azalma devam eder (27). Kan akımındaki bu azalma, endojen vazokonstriktörler ve iskemi sonrası endotel geçirgenliğindeki artış ile ilişkili olduğu düşünülmüştür (61,62). Gelişen interstisyel ödem kan akımını, medulladaki damarlara bası uygulayarak daha da bozabilmektedir (63). Endotel hücrelerinde P ve E selektin ekspresyonu arttığından, lökositlerin endotel hücrelerine adhezyonu artar (64). Aynı şekilde ICAM-1 ekspresyonu da artmaktadır (65). Bu olayları takiben lökosit adhezyonu ve infiltrasyonu ile vazokonstriksiyon ve lokal kan akımındaki azalma bir kısır döngü halinde devam eder. Sonuçta glomerüler filtrasyon hızında azalma ile birlikte subletal hasardan apoptozise ve nekroza kadar gidebilen bir tablo gelişir (66).
İnterstisyumda basınç artışı Renal kanlanmada azalma
Medüller hipoksi
ATP eksikliği sitozol Ca+2 ve ROS artışı
Mitokondri hasarı
Adhezyon molekül ekspresyonu artar Sitokin salgılanması Tübüler hücre nekrozu
Apoptozis
Tübül hücrelerinde fırçamsı kenar kaybı Na-K ATPaz polarizasyonu Hücreler arası adhezyon bozukluğu
Hücre dökülmesi
Elektrolit transportunda bozukluk
Geriye sızıntı Tübüler tıkaçların oluşması Endotel hasarı NO azalır Adhezyon molekülleri İnflamasyon Lökosit infiltrasyonu Lökositlerden protez salgılanması artar Medüller konjesyon
11
Tübüler hasar gelişimindeki bir diğer mekanizma da oksidatif strestir. Özellikle proksimal tübül hücrelerinin metabolik açıdan yoğun olmaları, akut tübüler nekroz sırasında mitokondriyal hasar ve intrasitoplazmik kalsiyum artışı nedeniyle oksidatif moleküller fazla miktarlarda oluşur. Oluşan hidroksil radikalleri gibi SOR’ler, lipit peroksidasyonuna sebep olarak, hücre proteinlerini okside ederek, plazma ve mitokondri membranını bozarak ve DNA’ya hasar vererek hücre zedelenmesine sebep olur (67).
Tübüler hasarın gelişmesine katkıda bulunan bir diğer molekülde iNOS’dur. Hipoksi de iNOS protein düzeyleri ve nitrik oksit seviyeleri artmaktadır (68). Salgılanan nitrik oksidin oksijen radikalleri ile uzaklaştırılması sırasında oluşan peroksinitrit, tübül hasarına yol açmaktadır (69). iNOS blokajı sağlandığında ise lökosit infiltrasyonu ve iskemi-reperfüzyon hasarı engellenebilmektedir (70).
İskemik akut tübüler nekrozda inflamasyonu başlatan en önemli basamak, tübüler hasar sonucu tübül hücrelerinden inflamasyonu tetikleyen TNF-α, IL-6, IL-1α, ve TGF-β gibi sitokinlerle, monosit kemoatraktan protein-1, interlökin-8 ve RANTES gibi kemokinlerin salgılanmasıdır (71). İskemi-reperfüzyon hasarı sırasında kompleman sistemi de aktive olur, lökotrienler ve PAF gibi faktörler de salgılanır (72). Endotel ve lökositler arasındaki adhezyon sonrası lökositler hasarlı bölgeyi infiltre ederler. Kemokinler, SOR, IL-1 ve TNF-α gibi sitokinler de lökositleri bu bölgeye çekerler (73). Hasarlı bölgeye infiltre olan lökositler SOR, miyeloperoksidaz, elastaz, lökotrienler gibi enzimlerin salgılanmasına sebep olarak iskemik dokuda direkt hasara sebep olurlar (74).
2.4.Saflaştırılmış Mikronize Flavonoid Fraksiyonu (Diosmin-hesperidin)
SMFF %90 diosmin ve %10 hesperidin olarak ifade edilen flavonoid içerir (75). Günümüzde hemoroidal atak ve venöz yetmezlik hastalarının tedavisinde kullanılmaktadır (76). Diosmin oral yolla uygulandıktan sonra intestinal florada diosmetine dönüştürülerek ince bağırsaktan emilir (77). Maksimum plazma konsantrasyonuna ulaşma süresi 1 saattir. Plazma konsantrasyonu 2 saat sonra yavaşça düşmeye başlar. 48 saat sonra bile kanda
12
saptanabilir (78). Mikronize diosmin eliminasyonunun idrar ve feçes yoluyla ilk 24 saatte %34’ü, ilk 48 saatte ise %86’sı tamamlanır (75).
SMFF son derece güvenli görülmekte ve hiçbir ciddi yan etkisi bulunmamaktadır. Ratlarda yapılan çalışmada 26 hafta boyunca SMFF verilmesi sonrası ölüm, kilo değişimi, standart fonksiyonel testlerde herhangi bir değişim gözlenmemiştir (79). İnsan çalışmalarında, SMFF-plasebo karşılaştırılmasında minör yan etkiler SMFF grubunda %10, plasebo grubunda %13.9 gözlenmiştir (80). Yan etki insidansı 70 yaş üstü hastalarda veya ek hastalığı bulunanlarda(hipertansiyon, diyabet, ateroskleroz, nörolojik hastalık, alkolizm) toplumdan farklı saptanmamıştır. Ayrıca bu eşlik eden hastalıklarda kullanılan ilaçlarla herhangi bir etkileşimi de saptanmamıştır (81). Sistolik veya diyastolik kan basıncı ve laboratuar değerleri izlenen bir klinik araştırmada, bu parametreler her 4 ayda 1 kontrol edilmiş ve 1 yıl boyunca SMFF 500 mg günde 2 tablet ile tedavi sırasında kan basıncı değerleri değişmemiştir. Laboratuvar değerleri (lökositler, hemoglobin, karaciğer enzimleri, üre, kreatinin, kan şekeri ve lipidler) normal fizyolojik aralık içinde kalmıştır (81).
SMFF, nitrik oksit sentezi üzerine etkileri ile kılcal hiperpermeabiliteyi azaltır ve inflamatuar hasar oluşturan süreçlerden mikrosirkülasyonu koruyarak kılcal damar direncini arttırır (82). Ayrıca endotel hücreleri adhezyon molekülleri(ICAM-1, VCAM-1) ve lökositlerin adhezyon moleküllerinin(L-selektin, VLA-4, CD 11b) ekspresyonunu azaltır ve kılcal damar seviyesinde lökositlerin adhezyon, migrasyon ve aktivasyonunu inhibe eder (83,84). Enflamatuar mediyatörlerin, esas olarakta serbest oksijen radikallerinin ve prostoglandinlerin(PGE2, PGF2a) salınımında azalma sağlar (11,85).
2.5.Parsiyel Nefrektomi (Nefron Koruyucu Cerrahi)
Modern görüntüleme yöntemlerinin yaygın olarak kullanılması ile asemptomatik, küçük böbrek tümörlerinin saptanma oranı artmıştır (86). Küçük renal kitlelerin %83 kadarını renal hücreli kanserlerin(RHK) oluşturduğu bildirilmektedir (87). Lokalize RHK tedavisinde, 4cm’den küçük lezyonlar için parsiyel nefrektomi(PN), daha büyük lezyonlar için radikal
13
nefrektomi altın standart tedavidir (88). Son 10-15 yıllık süre içerisinde 4 cm’den küçük lezyonlar için PN tercih edilen yaklaşım olurken, zamanla uygun vakalarda 7 cm’den büyük lezyonlar için de tercih edilebilir bir yöntem olmuştur (89).
“Nefron koruyucu” terimi Cleveland Klinik’ten Licht ve Novick tarafından 1993 yılında yayınlanan bir makalede kullanılmış ve bu makalede 1967-1991 yılları arasında karşı taraf böbreği normal olan 241 hastada renal tümör rezeksiyonu bildirilmiştir (90). Bundan sonra açık parsiyel nefrektominin yaygın olarak kullanıma girmesi ile klinik bilgi artmıştır. Günümüzde açık, laparoskopik ve robot yardımlı olarak parsiyel nefrektomi yapılabilmektedir.
Parsiyel nefrektomide tümör rezeksiyonu, renorafi ve hemostaz gibi ameliyatın en önemli kısımlarını böbrekte kalıcı hasar yapmadan tamamlamak için çalışılabilecek maksimum sıcak iskemi zamanı 30 dakika olarak bildirilmektedir (91). Ancak son zamanlarda yapılan çalışmalar bu sürenin 20 dakika olması gerektiğini bildirmekte, bu sürenin altında dahi olsa her iskemik dakikanın zarar verici olduğu vurgulanmaktadır (92,93).
Parsiyel nefrektomi ile sağlanan nefron koruyucu yaklaşımın renal tümörü olan hastalardaki kronik böbrek yetmezliği riskini azalttığı ve onkolojik sonuçların radikal nefrektomi ile karşılaştırılabilir olduğu gösterilmiştir (94,95). Kardiyovasküler morbidite ile kronik böbrek yetmezliği arasındaki bağlantının gösterilmesi ile nefron koruyucu yaklaşımların önemi daha da artmış ve nefron koruyucu yaklaşımın genel sağ kalım üzerine olumlu etkisi kanıtlanmıştır (97,99).
14
3.YÖNTEM VE GEREÇLER
Deney protokolü Bezmialem Vakıf Üniversitesi Tıp Fakültesi, Deneysel Hayvan Etik Kurulu tarafından onaylandıktan sonra çalışmaya başlandı. Deney öncesi iki haftalık sürede laboratuvar koşullarına (22C 2, 12 saat aydınlık/ 12 saat karanlık, %45-50 nem, 1 atmosfer basınca) alıştırılan denekler kuru kafeslerde barındırılacaklardır. Beslenmelerinde standart sıçan yemi ve şehir şebeke suyu kullanılacaktır.
3.1.Deney Grupları
Çalışmada 200–250 gr ağırlığında 8 haftalık 48 adet erkek Sprague-Dawley türü ratlar soliter böbrek modeli oluşturulan(1.- 2. ve 3. Grup) ve soliter böbrek modeli oluşturulmayan bilateral böbrekli(4.- 5. ve 6. Grup) ratlardan oluşan 2 ana grup kendi içerisinde Sham grubu (1. ve 4. Grup), iskemi-reperfüzyon(I-R) grubu(2. ve 5. Grup) ve tedavi grubu(3. ve 6. Grup) olmak üzere 3’er gruptan toplamda eşit sayıda 6 gruba ayrıldı.
1.Grup: Soliter böbrek modeli olan sıçanlarda Sham operasyonu(soliter Sham grubu) 2.Grup: Soliter böbrek modeli olan sıçanlarda I-R + %0.9NaCl(soliter I-R grubu) 3.Grup: Soliter böbrek modeli olan sıçanlarda I-R + SMFF tedavisi(soliter tedavi grubu)
4.Grup: Bilateral böbrekli sıçanlarda Sham operasyonu(bilateral Sham grubu) 5.Grup: Bilateral böbrekli sıçanlarda I-R + %0.9NaCl (bilateral I-R grubu)
6.Grup: Bilateral böbrekli sıçanlarda I-R + SMFF tedavisi (bilateral tedavi grubu)
n=48
Soliter böbrekli ratlar (n=24) Bilateral böbrekli ratlar (n=24)
Soliter Sham grubu (n=8) Soliter I-R grubu (n=8) Soliter tedavi grubu (n=8) Bilateral Sham grubu n=8 Bilateral I-R grubu n=8 Bilateral tedavi grubu n=8
15 3.2.Saflaştırılmış Mikronize Flavonoid Fraksiyonu Hazırlanışı ve Uygulanması
SMFF, çözelti olarak 25ml distile su içerisine 2gr daflon(Daflon 500 mg, Servier, Türkiye)konularak hazırlandı (98). Homojen çözünmenin tam olarak sağlanabilmesi amacıyla distile su içerisine katılmadan önce daflon havanda dövülerek toz haline getirildi. Ardından 2500 devirde 2 dakika karıştırıldı. Son olarak, sonic titreşim uygulandı. SMFF, 80mg/kg(1ml/kg) olacak şekilde oral gavajla verildi (98). I-R gruplarında %0,9NaCl’de, SMFF ile aynı miktar(1ml/kg) ve aynı yolla(oral gavaj) uygulandı.
3.3. Anestezi ve Cerrahi Prosedür
Anestezi için 70mg/kg ketamin hidroklorid ve 10mg/kg xylazin hidroklorid intraperitoneal (i.p.) olarak uygulandı. Gerektiğinde ratların anestezi derinliğini sabit tutmak için ketamin (yarı dozda, 35 mg/kg) refleks yanıtlara (pensetle ayağa ağrılı uyaran verilmesi-pedal refleks, palpebral ve korneal refleksler) bakılarak tekrarlandı.
3.3.1 Soliter Böbrek Modeli Oluşturulması
Soliter böbrek modeli oluşturmak için 1. 2. ve 3. Gruplar tarif edildiği şekilde anestezi altına alındıktan sonra, karın cildi traş edilerek % 10 povidoniyod ile temizlenerek abdomen 2cm’lik üst orta hat insizyonu ile açılarak batına girildi. Bağırsaklar ekarte edilerek sağ renal pedikül bulundu. Sağ böbrek pararenal yağlı dokudan serbestlendikten sonra renal pedikül bağlanıp kesildi ve sağ nefrektominin tamamlanması suretiyle soliter böbrek modeli oluşturuldu. Batın açıkken zorunlu kaybedilen sıvıyı yerine koymak amacıyla 2-3ml steril serum fizyolojik intraperitonal olarak verildi. İnsizyon kas ve cilt ayrı ayrı sütüre edilerek kapatılıp, %10 povidoniyod ile dezenfeksiyon yapıldı. İşlem sonrası karşı böbrekte hipertrofi gelişiminin olabilmesi amacıyla 30 gün beklendi.
3.3.2. SMFF Tedavisinin Verilmesi
I-R oluşturulması amaçlı cerrahi işlemden önce, 3 gün boyunca, her gün 1 kez ve işlem günü işlemden yaklaşık 1 saat önce olacak şekilde, daha önce tarif edildiği şekilde, hazırlanmış 80mg/kg(1ml/kg) SMFF tedavisi oral gavaj yoluyla tedavi gruplarına(3. ve 6.Grup) verildi (82). I-R gruplarında(2. ve 5.Grup) ise 1ml/kg(SMFF ile aynı miktarda) %0.9NaCl tedavi gruplarında olduğu gibi cerrahi işlemden önce 3 gün boyunca, her gün 1 kez ve işlem günü işlemden yaklaşık 1 saat önce olacak şekilde, oral gavaj yoluyla verildi.
16 3.3.3.İskemi – Reperfüzyon Oluşturulması
Soliter böbrek modellerinin oluşturulmasından 30 gün sonra aynı anestezi protokolü kapsamında tüm gruplara işlem yapıldı. İlk cerrahi işlemden farklı olarak rektus kası sol lateral kenarına denk gelecek şekilde yaklaşık 2-3cm’lik abdominal insizyon yapılarak batına girildi. Böylece bağırsakların daha kolay ekartasyonu ve sol renal pediküle daha kolay ulaşılması sağlandı.
İskemi sağlanması için pararenal yağlar serbestlenmeden sol renal pedikül diseke edildi (Resim-1). Sol renal pedikülün posteriorundan 10cc’lik enjektör kapağı geçilerek renal arter ve venin kompresyonu sağlandı. Ardından enjektör kapağı 360o döndürülerek renal
arterin torsiyone edilmesi suretiyle iskemi sağlandı (Resim-2).
Sham operasyonu gruplarında(1.grup ve 4.grup) iskemi yapılmaksızın, 45dk iskemi süresince cerrahi stres oluşumu sağlanılıp sonrasında insizyon kapatıldı. 24 saat reperfüzyon süresi beklendi.
I-R gruplarında(2.grup ve 5.grup) ve SMFF tedavisi gruplarında(3.grup ve 6.grup) 45dk iskemi süresi içerisinde sol böbrek alt pol parsiyel nefrektomi yapıldı (Resim-3). 45dk iskemi süresi sonunda enjektör kapağı alınıp, renal arter detorsiyone edildikten sonra, reperfüzyonun başlaması ile birlikte alt pol rezeksiyonunun olduğu kısımda meydana gelen hemoraji, termokoter kullanılarak koagüle edilmek suretiyle kontrol edildi (Resim-3). Kanama olmadığından emin olunduktan sonra insizyon hattı kapatılarak, 24 saat reperfüzyon süresi beklendi.
3.Gruptan bir rat anestezi altında iken solunum depresyonu ile ex oldu. 2.grup, 5.grup ve 6.gruptan 1’er rat, uyandıktan sonra 24 saatlik reperfüzyon süresini doldurmadan ex oldu. 2. – 5. ve 6.Gruptaki ratlara ölüm nedeni hakkında fikir sahibi olmak amacıyla otopsi yapıldı. 2 ratta akciğer ödemi, 1 ratta ise akciğer ödemiyle birlikte alt pol çevresinde minimal renal hematom saptandı.
17
Resim-1: Renal arter ve venin diseksiyonu ve dönülmesi
Resim-2: Soldan sağa sırasıyla enjektör kapağının renal arter ve ven altına yerleştirilerek kompresyon sağlanması; Enjektör kapağının 180odöndürülmesi; Enjektör kapağının 360o döndürülmesi ile renal arter ve venin torsiyone edilmesi;Enjektör kapağının iskemi süresince cilde tesbiti
18
Resim-3: Parsiyel nefrektomi sonrası termokoter ile kanama kontrolü
3.3.4. Örnek Alımı ve Sakrifikasyon
Tüm gruplardan, 24 saatlik reperfüzyon süresini tamamladıktan sonra anestezi altında, parsiyel nefrektomi sonrası kalan rezidü böbrek dokusu ve intrakardiyak kan alındı. Örneklerin alınması tamamlanan rat anestezi altında servikal dislokasyon ile sakrifiye edildi.
3.4.Biyokimyasal Parametreler 3.4.1.Kan Analizleri
Tüm hayvanlardan oksidatif stres, DNA hasarı ve enflamasyonu belirlemek için heparinize tüplere intrakardiyak alınan kan örnekleri hemen buzlu su içine konularak laboratuara ulaştırıldı. Örnekler öncelikle DNA hasar ölçümü için mononükleer lökositlerin seperasyonunda kullanıldı. Kalan örnekler daha sonra 3000 rpm de 5 dakika santrüfüj edilerek ayrılan plazma oksidatif stres parametrelerinin ölçümünde kullanılmak üzere 80°C derin dondurucuda saklandı.
Mononükleer Lökositlerin Seperasyonu
Bir ml histopaque–1077 üzerine bir ml taze heparinize kan yavaşça konup 2100 rpm ve 250oC'de 30 dakika santrifüj edildi. Orta tabakada biriken mononükleer lökositler pipet yardımıyla alınıp bir ml tuzlu fosfat tamponu (pH=7.4) ile karıştırıldıktan sonra 170 rpm ve 250oC’de 10 dakika santrifüj edildi. Üstteki süpernatan atılıp pellet tuzlu fosfat tamponu (pH=7,4) ile 106 mononükleer lökosit/μl olacak şekilde dilüe edildi.
19 3.4.1.1.Comet Assay (alkali mononükleer hücre elektroforezi) Yöntemi ile DNA Hasar Tayini
Yöntemin Prensibi
Comet assay yöntemi alkali pH da farklı molekül ağırlıklarına ve farklı elektrik yüke sahip DNA moleküllerinin elektriksel alanda farklı göç etmeleri esasına dayanmaktadır. Tek hücreler veya çekirdekçikler agaroza yerleştirilir ve lizisten sonra zarar görmemiş DNA’lar taşınma sırasında comet (kuyruk) oluşturmazlar. Oysa DNA fragmente olmuşsa fragmentler (nükleik asitler) farklı moleküler ağırlıklara ve farklı elektrik yüklerine sahip olacaklarından elektriksel alanda farklı hızlarda hareket ederek kuyruk şeklinde bir görüntü oluştururlar (99,100).
Yönteminin Uygulanışı Slaytların Hazırlanması
%1,0 ‘lik NMP agaroz jel hazırlanarak 80μl jel kenarları buzlanmış lam üzerine damlatıldı ve üzeri lamel ile kapatılarak buzdolabında (2-4 oC) 5 dakika bekletildikten sonra
lamelleri kaldırıldı. PBS (Fosfat buffered saline) ile mm3 te 104 hücre olacak sekilde dilüe
edilmiş mononükleer hücrelerden 10 μl alınarak 80 μl %0,5’lik low melting point (LMP) agaroz jel (37°C) ile karıştırılarak birinci tabaka üzerine tabakalandırıldı ve tekrar lamel ile kapatılarak buzdolabında donması için 5 dakika bekletildi. Üçüncü aşamada da aynı konsantrasyonda LMP agaroz jel hazırlanarak ikinci tabakanın üzerine ince bir tabaka halinde tabakalandırılarak slaytların hazırlanması tamamlandı (99,100).
Lizis aşaması
Hazırlanan lamlar yaklaşık bir saat süre ile yüksek konsantrasyonda tuz ve deterjan içeren soğuk lizis solüsyonunda bekletildi. Lizis solüsyonunun içeriği 100 mM EDTA, 2,5 M NaCl, 10 mM trizma base ve %1 oranında triton X-100’den oluşmaktadır. Bu solüsyonun pH ‘sı 10’a ayarlandı. Lizis tamponu ile hücre ve çekirdek zarı lizise uğratıldı (99,100).
Elektroforez Tamponu
Elektroforezde yürütmeden önce DNA zincirlerinin ayrılması için slaytlar alkali elektroforez tamponunda (1mM EDTA ve 300 mM sodyum hidroksit pH <13) 20–30 dakika inkübasyona bırakıldı (99,100).
20 Elektroforezde Yürütme
Alkali elektroforez tamponunda inkübasyon tamamlandıktan sonra DNA’lar bu tampon çözeltisi içerisinde 300 mA, 14 volt’luk elekriksel alanda ve 5–25oC’de 30 dakika yürütüldü (99,100).
Nötralizasyon
Elektoroforezde yürütme işlemi tamamlandıktan sonra alkali tampon çözeltisini ortamdan uzaklaştırmak için slaytlar 3 dk süre ile 3 kez nötralizasyon tamponu ile (0.4 M Tris-HCL, pH 7.5) yıkandı (99,100).
Boyama
Nötralizasyon tamamlandıktan sonra etidyum bromit boyası ile (5mg/ml) boyandı(3-4). Herbir slayt için 20 mL boya slayt üzerine damlatıldıktan sonra lamel ile üzeri kapatılarak 20 büyütmeli floresan mikroskop ile (Eksitasyon DB: 546 nm, Emisyon DB: 20 nm) DNA görüntüsü değerlendirildi.
Analiz
DNA‘daki hasarların kuyruklu yıldız görüntüleri florasan mikroskobunda ortalama 50 hücre sayılarak comet ölçüm programı ile değerlendirildi.
3.4.1.2.Total Antioksidan Kapasite (TAK) Prensip:
Erel tarafından(101) gelistirilen tam otomatik bir yöntem olup, güçlü serbest radikallere karşı vücudun total antioksidan kapasitesini ölçen bir metoddur. Fe2+ –o-dianisidine kompleksi hidrojen peroksid ile Fenton tipi reaksiyon oluşturarak OH radikalini oluşturur. Bu güçlü reaktif oksijen türü indirgen düşük pH’da renksiz o-dianisidine molekülü ile reaksiyona girerek sarı-kahverengi dianisidyl radikallerini oluştururlar. Dianisidyl radikalleri ileri oksidasyon reaksiyonlarına katılarak renk oluşumu artmaktadır. Ancak örneklerdeki antioksidanlar bu oksidasyon reaksiyonlarını bastırarak renk oluşumunu durdurmaktadırlar. Bu reaksiyon otomatik analizörde spektrofotometrik olarak ölçülerek sonuç verilmektedir (101).
21 3.4.1.3.Total Oksidant Seviye (TOS)
Prensip:
Örnekte bulunan oksidanlar ferröz iyon-o-dianisidine kompleksini ferrik iyona oksitlerler. Ortamda bulunan gliserol bu reaksiyonu hızlandırarak yaklaşık üç katına çıkarmaktadır. Ferrik iyonlar asidik ortamda xylenol orange ile renkli bir kompleks oluştururlar. Örnekte bulunan oksidanların miktarıyla ilişkili olan rengin şiddeti spektrofotometrik olarak ölçülmektedir ve tam otomatik kolorimetrik bir yöntemdir (102).
3.4.1.4.Oksidatif Stres İndeksi (OSİ)
Total Oksidatif Stres (TOS) / Total Antioksidan Kapasite (TAK) şeklinde bölünerek Oksidatif Stres indeksi (OSİ) hesaplandı (103).
3.4.1.5.Katalaz (CAT) Prensip
Katalaz H2O2’nin su ve moleküler oksijene yıkımını katalizler. H2O2’nin ışığı absorbe
etmesinden yararlanılarak 230 nm’de H2O2‘nin yıkım hızı spektrofotometrik olarak ölçülür
(104).
2H2O2 2H2O + O2
Ayıraçlar
Tris-EDTA tamponu (1 M tris-HCl-5 mM EDTA, pH 8.0): 12.1 g tris, 168 mg disodyum-EDTA 80 ml suda çözülür, HCl ile pH 8’e ayarlanır ve hacim 100 ml’ye tamamlanır.
10 mM hidrojen peroksit % 95 etanol
Deneyin Yapılışı
Deneyin yapılmasından hemen önce 1:20 eritrosit hemolizatı, -merkaptoetanol-EDTA çözeltisi ile 100 kez sulandırıldı. Katalaz ve hidrojen peroksitin oluşturabileceği katalazın inaktif şekli olan kompleks II’nin yıkımını sağlamak üzere, sulandırılmış hemolizata 0.02 ml/1 ml hemolizat olacak şekilde etanol eklendi. Bir reaksiyon küvetine, 0.05 ml
22
EDTA tamponu, 0.9 ml 10 mM hidrojen peroksit, 0.03 ml distile su konulup karıştırıldıktan sonra 37oC de 10 dakika tutuldu. Daha sonra bu karışıma 0.02 ml etanollü hemolizat eklendi ve 230 nm’de absorbans değişimi izlendi. Ayıraç körü için hidrojen peroksit yerine su kullanıldı.
Hesap
Enzim aktivitesi hidrojen peroksitin 230 nm’deki ekstinksiyon katsayısı (0.071 mM-1
cm-1) kullanılarak hesap edildi. Sonuçlar, gram hemoglobin başına enternasyonal ünite (IU/g Hb) olarak belirtildi.
CAT Aktivitesi (U/ml) = X
ΔOD = Optik Dansite Değişimi
0,071 = 1 µmol H2O2’nin 1 cm’lik ışık yolunda verdiği OD değeri
VToplam = Toplam hacim
VÖrnek = Hemolizat hacmi
CAT Spesifik Aktivitesi =
3.4.1.6.Plazma Malondialdehit (MDA) Prensip
Lipit peroksidasyonu ürünleri ile (başlıca MDA) tiyobarbitürik asit (TBA) arasındaki reaksiyon sonucu oluşan kırmızı renk spektrofotometrik olarak ölçüldü. TBA ile reaksiyona girerek aynı rengi veren suda çözünür maddelerin ortamdan uzaklaştırılması için, serum lipitleri proteinlerle birlikte fosfotungstik asit/sülfürik asit ile çöktürülür.
VÖrnek 0,071 VToplam ∆OD/ dak Hb değeri CAT Aktivitesi
23 Ayıraçlar
0.084N H2SO4
%10 Fosfotunstik Asit (PTA)
TBA Reaktifi: Eşit hacimde %0.67 TBA ve Asetik asit karışımı. N – Bütanol
TMP (Tetrametoksipropan std.)
Deneyin Yapılışı
Cam bir tüpe 0,3 mL serum konularak üzerine 2.4 ml 0.084 N H2SO4 ilave edildi. 0.3 ml %10 PTA eklenerek 5dk beklenir. 1600 g de 10 dk santrifüj edildi. Süpernatan atılır ve sedimente 4mL distile su ve 1 mL TBA eklenir. Su banyosunda 95oC’de 60dk tutulduktan sonra soğutulup 3 ml N-bütanol ilave edildi. İyice karıştırıldıktan sonra 1600g’de15dk santrifüj edildi ve bütanol fazının absorbansı 532 nm de okundu. Blank olarak distile su ile TBA karışımı kullanıldı.
Hesap
MDA için saptanmış optik dansite değeri (1,56 x 106 M-1 cm-1) kullanılarak sonuçlar hesaplandı ve nmol MDA/mL plazma olarak ifade edildi (105).
3.4.1.7.Protein Karbonilleri (PCO) Prensip
Oksidan etki sonucu protein yapılarında oluşan karbonil grupları 2,4-dinitrofenilhidrazin ile reaksiyona sokulup oluşan ürünün verdiği absorbans spektrofotometrik olarak hesaplanır.
Ayıraçlar
%20 Trikloroasetik asit (TCA) ve %10 TCA 2,4-DNPH (19,8 mg/ 10 ml 2 N HCl içinde) 1N NaOH çözeltisi
24 Deneyin Yapılışı
İlk önce 250μl örnek alınır ve 500μl %20 TCA ile karıştırılır. 11,000 x g ‘de santrifrüj edildikten sonra süpernatant atıldı. Çökelti üzerine 500μl DNPH ilave edildi. Oda sıcaklığında ara sıra karıştırılarak 1 saat inkübe edildi. Üzerine 500μl %20 TCA eklendi, 2-3 dakika bekletildikten sonra, 11,000 x g’ de 3 dakika santrifüj edildi. Süpernatant atıldı, çökelti %10 TCA ile yıkandı. Tekrar santrifüj edilerek, bu işlem iki kez tekrarlandı. Pellete 1 ml 1N NaOH eklendi ve 37oC’de tutularak çözülmesi sağlandı. Oluşan rengin absorbansı 360 nm’de okundu. Kör olarak DNPH yerine 2 N HCl kullanıldı.
Hesap
Sonuçlar protein karbonilleri için ekstinksiyon kat sayısı olan 22,000 M-1 cm-1 kullanılarak μmol/mg protein olarak ifade edildi (106).
3.4.1.8.Paraoksonaz Aktivitesinin Ölçümü(PON1)
Paraoksonazaktivitesi(PON1) , Furlong(107,108)ve Mackness'ın(109) metodları kullanılarak ölçüldü. Paraoksonaz’ın katalizlediği reaksiyon aşağıda görüldüğü gibidir.
Aril dialkil fosfat + H2O → Dialkil fosfat + aril alkol
Paraoksonaz enzim aktivitesi ölçümünde substrat olarak paraokson (0,0- diethy -0- nitropheny phosphate), arilesteraz ölçümünde ise substrat olarak fenil asetat kullanılmıştır.
25
Paraoksonaz aktivite ölçümünde 5 mM CaCI2 ve 7 mM paraokson ihtiva eden pH=8 olan 100 mM Tris- CI tamponu kullanıldı ve Reaktif 1 (Rı) olarak kabul edildi. Numune hacminden 10μL reaktif ’den 220μL alınarak abbott aeroset otoanalizör cihazına tatbik edilerek çalışıldı. Paraoksonaz’ın enzimatik hidrolizi sonucu oluşan p-nitrofenol’ün 412 nm deki dakikalık absorbans oluşumu kaydedildi. Molar absorbsiyon katsayısı 18290 (ε) alınarak (107,108), aktivite için 1 ünite, 1 mikromol p-nitrofenol/ml serum/dk olarak aşağıdaki formüle göre hesaplandı.
A: Absorbans
ΔA/dk : Dakikalık absorbans artışı
T.V: Deney tüpündeki toplam sıvı miktarı
106: Sonucları μmol /dk/L = U/L'ye çevirme katsayısıdır.
ε : Ekstinsiyon katsayısı: Reaksiyon sonunda okunan maddenin molar absorbtivite katsayısı olup sabit bir değerdir.
ε = A/l x C'dir. A= çözeltinin gerçek absorbansı, l= ışık yolu (cm), C= çözeltinin konsantrasyonu (mol/L) dir.
Işık yolu: Okuma küvetinin çapı (cm cinsinden) N.V: Reaksiyona katılan numune hacmi.
3.4.1.9.Arilesteraz(ARES) Aktivitesinin Ölçümü
Arilesteraz aktivitesi(ARES) ölçümleri için ise 2 mM CaCI2 ihtiva eden 100 mM Tris-HCI; pH=8 tamponu kullanılarak; substrat olarak paraokson yerine son konsantrasyonu 13 mM olacak şekilde fenilasetat ilave edilmistir ve arilesteraz’ın enzimatik hidrolizi sonucu oluşan fenol 270 nm de Jasco V-530 UV/VİS spektrofotometresinde dakikalık fenol oluşum absorbansı ölçülmüstür. Molar absorbsiyon katsayısı 1310 (ε) alınarak (107,108,109), arilesteraz aktivitesi için 1 ünite, 1 mikromol fenol/ml serum/dk. olarak tanımlanmıştır. Bu
26
çalışmada numune volümü 400 kat dilüe edilerek çalışılmıştır. Sonuçlar yine paroksanazdaki enzim aktivitesi formülüne göre hesaplandı ve U/L olarak değerlendirildi.
Reaktif 1 tekrar hazırlanıp fenotipik ayırım için içerisine 1M NaCI ilave edilerek paraoksonaz ve arilesteraz aktivitesi için tekrar çalışıldı. Sonuçlar yine yukarıdaki gibi hesaplandı.
3.4.1.10.Plazma Tümör Nekrozis Faktör Alfa ve İnterlökin 1 Beta Analizleri
Plazma örnekleri, Rat İnterlökin 1 Beta(IL-1β) (Eastbiopharm, Cat. No: CK-E30419), ve Rat Tümör Nekrozis Faktör Alfa(TNF-α) (Eastbiopharm, Cat. No: CK-E30635) ticari ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) kitleri kullanılarak Thermo marka Varioskan Multireader’da spektrofotometrik olarak ölçümleri yapıldı.
3.4.2. Doku Analizleri
Deney sonunda; sıçanlardan alınan doku örnekleri tartılıp, 1/5 oranında soğuk %1,15 M KCI solüsyonu ile 14000 devirde 30 dakika homojenize edildi. Daha sonra +4 °C’de 10000 x g’de 30 dakika santrifüj edilerek süpernatanları ayrıldı. Süpernatantlarda interlökin 1 beta, interlökin 6, tümör nekrozis faktör alfa ile total antioksidan kapasite ve total oksidan düzeyleri ölçüldü. Protein tayini Lowry yöntemine göre yapıldı.
3.4.2.1.Doku Total Antioksidan Kapasite (TAK) Analizleri
Total antioksidan durum ölçümü Erel yöntemine göre yapıldı. Yöntemin prensipi, örnekteki antioksidanların, koyu mavi-yeşil renkli ABTS radikalini, renksiz ABTS formuna indirgemesine dayanır (102). Standartlar, doku yerine 0 (standart 1) ve 1 (standart 2) milimolar Trolox ekivalan/ litre (mmol Trolox Eq/L) konsantrasyonlarındaki standart çözeltileri kullanılarak çalışıldı. İkinci ve ilk ölçümler arasındaki farktan absorbans değişimi
27
(ΔAbs) hesaplandı. Dokulardaki TAS düzeyleri (mmol Trolox Eq/L) kitte belirtilen aşağıdaki formülle hesaplandı.
TAS = (ΔAbs standart 1)-(ΔAbs numune) / (ΔAbs standart 1)-(ΔAbs standart 2)
3.4.2.2.Doku Total Oksidan Status (TOS) Analizleri
Total oksidan durum ölçümü ölçümü Erel yöntemine göre yapıldı. Yöntemin prensipi, örnekteki oksidanların ferröz iyon-şelatör kompleksini ferrik iyonlara okside etmesine ve oluşan ferrik iyonların asidik ortamda kromojen madde ile renk oluşturması esasına dayanır (103). Standart, doku yerine 20 mikromolar hidrojen peroksit (H2O2) ekivalan/ litre (mmol
H2O2 Eq/L) içeren dilue standart çözeltisi kullanılarak çalışıldı. İkinci ve ilk ölçümler
arasındaki farktan absorbans değişimi (ΔAbs) hesaplandı. Dokulardaki TOS düzeyleri (mmol H2O2 Eq/L) kitte belirtilen aşağıdaki formülle hesaplandı.
TOS = (ΔAbs doku) / (ΔAbs standart) x 20
Doku Oksidatif Stresi İndeks Analizi (OSI)
OSI = [(TOS, lmol H2O2Eq. g1 protein) / (TAS, lmol Trolox Eq. g1 protein)].
3.4.2.3.Doku Tümör Nekrozis Faktör Alfa ve İnterlökin 1 Beta Analizleri
Homojenize edilmiş doku örneklerinde Rat İnterlökin 1 Beta (Eastbiopharm, Cat. No: CK-E30419), ve Rat Tümör Nekrozis Faktör Alfa (Eastbiopharm, Cat. No: CK-E30635) ticari ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) kitleri kullanılarak Thermo marka Varioskan Multireader’da spektrofotometrik olarak ölçümleri yapıldı.
3.5.Histopatolojik değerlendirme
Histomorfolojik inceleme için sıçanlardan elde edilen böbrek dokuları, ışık mikroskobik inceleme için %10’luk tamponlu formaldehid içinde fikse edildikten sonra parafine gömüldü. Daha sonra hazırlanan parafin bloklardan 4-5 μm kalınlığında kesitler alındı. Elde edilen kesitler hematoksilen-eozin boyası ile boyandı. Boyama işleminden sonra kesitler ışık mikroskopik olarak incelendi. Deney gruplarına ait böbrek dokusu kesitlerinde
28
ışık mikroskopik olarak; mononükleer hücre infiltrasyonu, eritrosit ekstravazasyonu, renal korpüskül morfolojisi, proksimal tübüluslarda vakuolizasyon, fırçamsı kenar kaybı, tübüler dilatasyon, kast formasyonu değerlendirildi.
Kesitlerden elde edilen görüntüler değerlendirilirken semikantitatif olarak tübülointertisyel hasar için (mononükleer hücre infiltrasyonu, eritrosit ekstravazasyonu, renal korpüskül morfolojisi, proksimal tübüluslarda vakuolizasyon, fırçamsı kenar kaybı, tübüler dilatasyon, kast formasyonuparametreleri için) skorlama yapıldı. Skorlama 0 = hiç yok, 1 = % 0-10, 2 = % 11-25, 3 = % 26-45, 4 = % 46-75, 5 = % 76-100 olarak uygulandı (110). Her grup, bütün parametreler için ayrı ayrı yapılan hasar skorlamasının toplamının ortalaması üzerinden değerlendirildi.
3.6. İstatistiksel Değerlendirme
Çalışmamız sonucunda elde edilen verilerin değerlendirmesinde SPSS programı kullanılmış, gruplar arası p<0.05 olan değerler anlamlı kabul edilmiştir. Histopatolojik hasar skorunun değerlendirilmesinde Kruskall-Wallis non-parametrik varyans analizi kullanıldı. Doku ve serum örneklerinin sonuçları ile ilgili diğer biyokimyasal değerlerin yorumlanmasında ise One way ANOVA-posthocTukey testi kullanılmıştır.
29
4. BULGULAR
4.1.Histopatolojik Bulgular
Soliter böbrek gruplarının kendi içinde karşılaştırılmasında Sham grubuyla(1.Grup), I-R grubu(2.grup) arasında iskemiye bağlı renal hasar skorlamasında, I-I-R grubundaki daha yüksek hasar skoru klinik anlamlı saptandı (p:0.014). Ancak tedavi grubunda(3.Grup) I-R grubuna(2.Grup) göre hasar skorunda azalma saptanmasına karşın, bu değişim klinik olarak anlamlı saptanmadı (p:1).
Grafik-1: Böbrek histopatolojik incelemesinde ortalama renal hasar skorları
(*) SoliterI-R grubu ile Soliter Sham grubu karşılaştırıldığında (p<0.05), Bilateral I-R grubu ile Bilateral Sham grubu karşılaştırıldığında (p<0.01)
Bilateral böbrek gruplarının kendi içerisinde karşılaştırılmasında, soliter böbrek gruplarıyla benzer olarak Sham grubuyla(4.Grup), I-R grubu(5.grup) arasında iskemiye bağlı renal hasar skorlamasında I-R grubunda elde edilen daha yüksek hasar skoru klinik anlamlı saptandı (p:0.001). Ancak tedavi grubunda(6.Grup) I-R grubuna(5.Grup) göre düşük olan hasar skoruklinik olarak anlamlı saptanmadı (p:1).
