Vel. nil. Der~. (2000), 16, 2 : 89-92
KARAKAYA BARAJ GOLU BAZI BALlKLARININ KAN SERUM
PROTEiNLERiNiN ELEKTROFORETiK MODELLERi UZERiNE TAKSONOMiK
BiR
C;ALI~MA
Muhittin Yllmaz10 Yusuf TOrk6z2,
A.
Omit Erdemlil, Ercan Kalkan 1,Yllmaz
9i9remi~ 1.A Taxonomical Study on Electrophoretic Pattern of
Blood Serum Protein of Some
Fish of
Karakaya Dam Lake
Summary: In Ihis study, an electrophoretic comparison 01 serum blood proteins of two species 01 fish, Cspoeta trulla
and Capoels capoeta umbls, were carried out. Study was carried between june and october in 1997. Using the Ran· dom Sampling Method, 92 C. capos's umbla and 86 C. trutta which the same age and sex were used. The iden· dification of species and subspecies were done though their metric and meristic characteristics. While 16 band pat· tern was observed in C. trutta, the number 01 protein bands for C. capoeta umbla was 11. From the electrophorelic mobility 8 bands of species gave similar pattern, but the rest was seen to be different. As a result, we concluded that, there is a %50 similarity between C. trulta and C. capoeta umbla based on their serum blood proteins.
Key words: Fish, SOS·PAGE. Serum Proteins
Ozet: Bu ara~IIfITla haziran ile ekim 1997 tarihleri arasmda gergekle~tirildi. Ar~t,"Tlada, y,*lan ve cinsiyetleri aynl alan 92 adet Capoeta caposts umbJa ve 86 adet Capoet8 tlUtta kullanllch. SOz konusu ballklann metrik ve meristik de· gerierine gOre klasik olarak tur ve all lOr tespili yaplldl. C. IlUtta ve C. capoela umbla'iann kan serum proteinlerinin SOS·Poliakriiamid Jel Elektroforez (SOS·PAGE) yOntemi ile incelenerek yapllan fUr ve alt tOr 9all~maslnda, C. tlUt -t{J'd8 16, C. capoeta umbla'da ise 11 protein bandl tespit edildi. C. trutta'nln eleklroforegrammda diger lOre gOre 8 farkl1 protein band! gOzlendi. Bunun yanl sira 8 aOOt protein bandl bu iki ballk arasmda benzerlik gOsterdi. SOS-PAGE lie elde edilen verilere gOre, C. tlUtta va C. capoeta umbla arasmda eleklroforegamda olu$an protein banllan ba-klmmdan %50'lik farkllllk tasp!1 edilmi~ ve bunun laksOrlOmik ayldan Onemfi ofdugu sonucuna vanlml~tlr.
Anahtar keflmefer: Balik, SOS-PAGE , Serum Proteinleri
Giri,
GOnumuze deOin ballklarda yapllan lak· sonomik yall~malar daha yok mortomelrik 61· yOmler, analomik karaklerler, renk ve karyolipleri Ozerinde yap!lml~lIr (Kuru 1975, Kalkan ve Erdemli 1996). Ancak bu yOnlemler baz! ballklarda, lak· sonomik ayldan bilim adamlann! zorluklara so-kabllmekledir. Mortometrik oranlarda islatistiki gOy-IUkler, analomik karakter.lerde yok ender de olsa bir tOnin bireyleri araslnda, yak!n bir tOr iyin be· lirleyici karakterler ortaya ylkabilir. Bahklann temel renkleri genelik kontrol alt!nda olmasma ra~men,
bir ballO!n renginin ya~ama ortamma ve cinsiye!ine g05re deOi~mesinden dolayl de~j~ken bir ka-raklerdir. Bu yOnteminde zorluOu, bahOIn · mu -halazast Slfaslnda kullan!lan liksatil maddelerden dolay! renginin solmasld!r (Oemir 1992).
Son Yillarda sOz konusu bu gOylOkler elek!-rolorez tekniOi ile !Orlenn proteinlennin (yoOunlukla
Gc1i$ Tarihi : 02.03.2000. @:muhiltin@inonu.edu.1r
enzim) benzerliklerinin ve larkl!lIklann!n incelenmesi ile a~!lmaya yall~!lmaktad1r. TOrlenn bulundurduOu proleinlerin benzerli~i, genetik benzerliOin bir OlyOsO oimasl nedeni Ue bu teknikle taksonomik ayldan Onemli sonuylar elde edilebilir(Mukhopadhyay ve ark. 1987, Theophilus va Rao 1988, Khan ve Gadru 1988, Komagata ve ark.1991).
Bu amayla, proteinlerin tOrler aras!nda po. limorfizm gOstermesinden yararlanarak, 50S-PAGE yOntemi He Caposta capoeta umbra va Caposta truna'lann kan serum proteinlerinin analizi ite bu iki to
ron
akrabalJk deraceleri incelenmaye yah~!ldl.Materyal ve Metot
Bahklann lemini iyin karakaya baraj g0510ndeki atabay leribo! iskelesi ve imamh k6yO mevkii is-lasyon olarak s~ildi. Ara~l!rma iyin s~ilen ba-hklann Ozellikle sa~hk durumlanmn iyi olmasma d ik-·kat edildi. Elde edilen ornakler metrik ve meristik
olyOmrer iyin bidonlarla canh olarak laboratuara
ge-I. lne,nO Oniversilesi Fcn.Edcbiyal FakUllesi Biyoloji BO!Umll, Malalya. 2. loono Onivcrsilesi TIp Fak01tesi Biyokimya Anabi1im Dah, Malalya.
YILMAZ. TURKOZ, ERDEMLI, KALKAN, C;ICREMI~
tirildi ya da yerinde kuyruklafl kesilerek kan ahnd!.
Kan allml sonraSl, ballklar dij)er analizler i~in % 4'lOk formaldehit i~eren bidonlarda muhafaza adi-lerek laboraluara getirildi: Numuneler musluk suyu allinda temizlendikten soma metrik ve merislik 01-~umler, ya~ ve cinsiyel layininde kullamld!. Oaha
soma % 35-40 elil alkol ieeren cam kavanozlara
all-narak muhafaza edildi.
Sallklann kuyruj)u kesilerek kan allnmasl yon-teminde kuyruk kesimi sonrasl ballj)m dorsal aort damanndan yakla$lk 2-3 ml kan allndl ve
la-boratuara getirildi. Su kan numuneleri +4!!C ve 3000
rpm'de 10 dk sanlriluj edilerek serumun aynlmasl sa{jtandl. Analizi daha soma yapllacak numunelere proleotilik aklivileyi inhibe elmek iein son kon-santrasyonlan 10 ve 0,1 mM olacak ~ekilde eli-lendiamintetraasetikasit (EOTA) ve lenil meW sul-fonil ftorur (PM SF) ilave edilerek -20!!C 'de saktandl, Numunelerin protein konsanlrasyonlan bi-Oret (Robert ve Michael 1993) yonlemi ile ok;:Uldu.
50S-PAGE i~lemi Laemmli (1970) ve O'Farrell
(1975) meloltanna gOre ya.plldl. Proteinler, 12x8 cm boyullannda ve 1 mm kallnh{jlOda slab jelde separe adildi. Stab jet, proteinlerin stoklandlj)1 yo{junla~lIncl ve daha soma da proteinlerin separe edildij)i aYlricl
jet klslmlanndan meydana gelmektedir.
AYlncl jet (% 10 Akrilamid i~eren) elektroforez i$leminden 12 saal once hazlrlanarak pOlimerize edildi ve bir geee buzdolablnda saklandl. Yo-{junla~llncl jel ise (% 4 Akrilamid ilferen) etekt-roforez i~leminden 2 saal Once hazlrlanarak po-limerize edildi. Her numune ve slandart % 10
gliserol, % 2 merkaploetanol (2-ME), % 2 sodyum dodesil sOllal (50S), % 0.01 brom fenol blue (BPS)
i~eren numune tamponu ile kan$tmlarak prolein konsantrasyonlan sireSI ile 2 1lg/IlJ ve 0,5 1lg/IlJ'e ayarlandl. Oaha soma numuneler ve standartlar kaynar suda 3 dk bekletiterek proteinlerin de-naturasyonu sa{jtandl.
Yo{junla~hnci jeJde her line 20 mikrolitre nu-mune ve standar! uygulandl. Srom fenol blue jelin en all klsmma gelinceye kadar jele 200 voilluk ge-rilim verildi. Eleklroforez i~lemi somasl jeller, % 0:125 commassie blue R-250, % 40 metanol ve % 7 asetik asit bulunan boya c;:6zeltlsi k;erisinde 12
saal beklelilerek boyandl. Jeldekl fazla boya % 5 metanol ve % 7.5 asetik asit Ilferen c;:Ozellide 24 saat bekletilerek dekolare edildi. Elektrofarez uy-gulamaslnda prolein standard I olarak, slj)lr albOmini (66.2 kO), yumurta albOmini (45 kO), tripsinajen (24 kO) ve tizozim (14.3 kO) kullanlldl.
PrOleinlerin malekOI a~lrllklan Weber ve ark. (1972) meloduna gore hesaplandl. BPS'nun
uy-gulama noktaslOdan elektroforez sonuna kadar
gil-ligi mesafe bir birim kabul edildi ve molekul aj)lrllgl
bilinen standart proteinlerin g6(; mesaleleri bununla
mukayese edilerek her prolein iein bir rolatil RI
de-{jeri bulundu. Bu RI dej)erlerine ka~lllk gelen
mo-leka! a{Jlrllklan logarilmik bir grali{Je yerle~lirilerek
duz bir ej)ri ve elde edildi. MoiekOI a{Jlrll{J1
bi-linmeyen protein banttannm molekOI a{Jlrllklan ~ekiI1'deki grafikten hesaplandl.
'.
S' 1~ ; 11 ~~
'.
t
'.
J"
~
"
i
"
~ 1,1 90 '~--~----~----~----r---~o
0,' Ri:ilalif GOf (Rt)~ekil 1. 5tandart proleinlerin kalibrasyon eQrisi
Bulgular
Capoeta trutta ve Capoeta capoeta umbla'iann kan serum proteinlerinin 5D5-Poliakrilamid Jel
Elektrolorez yOntemi ile incelenerek yapllan tUr ve alt lOr ~all~maslOda Capoeta trutta'dan 16 serum protein bandl, Capoeta capoeta umbla'dan 11 serum protein bandl elde edildi. Su .-;ah~mada, Ca-poeta trutla1arm 8 protein bandl, Capoeta capoeta umbla'lann protein banllanndan larkhhk gOsterdi. ~ekil 2'de a,b,c,d,e,l,g,h ile g6sterilen farkh protein bantlannm malekOler a{Jlrllklan zikredildikleri Slraya gore kD cJnsinden 135, 113.2, 96.8, 61.6, 52.5, 34_6, 12.5 ve 9.5'dir. Bunun yanl slra 8 protein bandl bu iki ballk arasmda benzerlik goslerdi.
C.
trutta'iarda pre-albumin bantlan otdukca netg6-rOIOrken Capoeta capoeta umblalarda pre-albumin 2 bandl gOrOlmedi ve pre-albumin 1 bandl bu ballkta oldukc;:a belirsiz olarak gOrOldO.
C.
trutta'iarm yOk-sek malekul a{Jlrllkll globulin bantlanndan biri (banl-b), C. capoeta umbla'iardaki ayO! hizada bulunan protein bandmdan daha koyu olarak boyandlglgoz-lendi. Aynca
C.
truttalarda gOzlenen 3 albumin bandl (bant-c,d,e) C. capoeta umbla'iarda g6-rOlemedLKllrllkaya Baraj COli! 8a:u Bahklarmm Kan Strum ...
$ekJI 2. Capaeta lruffa ve Capoeta capoels umbla'nm SOS-PAGE yOntemiyle elde edilen serum proleinlerinin
eleklroforegaml. 1.2.3.4. Une'lar Capoeta capoeta umble'nm serum proteinleri, 5. line standart proleinler.
6.7.8.9.Une'lar Capaels trutta'nm serum proleinleri.
Tartl,ma ve Sonulj:
. Elektroforez tekni{Ji ba~langl~ta, insanlarda
serum proteinleri, lipoproteinleri, izoenzimleri va
hemoglobin tiplerinin incelenerek bir~ok hastallgm
le~his ve ledavisinin takibi amacl ila kullanllml~tlr
(Burtis ve Aswood 1996). Oaha sonra glda
ala-nmda OzeWkle et mamOliarinin kalite kontrolO va
i~eriginln lespilinde alektroforez teknigi ile ~ok
Onemli sonuclar elde edilmi~tir (An va ark.1988 ve 1989, McCormick 1992). Son zamanlarda ise bu
teknigin taksonomik ara~tlrmalarda
kul-lanllabilece{jl ve onemli a~lhmlar getirecegi itade
edilmi~lir (Mukopadhyay ve ark.1987, Schreiber ve
ark 1992, Theophilus ve Rao 1998). Bu ara~
tlrmada, C. Irulta ve C. capoela umb/a'nlO serum proteinlerini SOS-PAGE teknigi lie incelenerek
elde edilen veriler literalOriarin 1~lglOda
yo-rumlanmaya ~ah~llml~tlr.
Bu yell~mada; C. truUa ve C. capoeta
umbla lann albumin, pre-albumin-1 ve pre-
al-bumin-2 bantlar!, Ney ve Smilt:l'in (1976) Lepomis
macrochirus kan proleinleri Ozanne yapml~ oldugu
~ah~ma ve Menzel'in (1970) Nolnpis ballglnlO kan
proteinleri Ozerine yapml~ oldugu ~all~malara gore
!anlmlandl. SummerleU'in (1964) yapml~ oldug!J bir
~ah~mada, elaktroforezde en yava~ hareket eden fraksiyonun globulin oldugu !espi! edilmi~tir. Aynl
ara~tltlci Notemigonus crysoleucas'lO kan serum proteinlerini analiz etmi~ ve en yava~ hareket eden fraksiyonu euglobin olarak isimlendirmi~lir. Vine Menzel (1970), Notripis cyprinidae'nin kan serum proteinlerini elektroforetik olarak analiz ederek en
yava~
gtMt
eden protein fraksiyonunun globulin 01-91dugunu gostarmi~tir. Ney ve Smith'in (1 976) ara~
tlrma sonuylan, Summerlelt'in (1964) yeh~maslOl
leyil elmi~tir. Yukandaki literatOrler baz almarak
ye-h~mamlzda elde edtlen elektroforegramda en yava~
hareket eden serum protein, globulin fraksiyonu
ola-. rak kabul edHmi~, bunun yanlslta serum protein fraksiyon-2 albumin bandl olarak dikkate allnml~tlr.
Vine aym ara~lItiellar albumin bandlOlO iki fraksiyon halinde bulunabilecegini belinmi~ler ve serum pro-tain fraksiyon-3'de albumin i~erigi olarak kabul
et-mi~lerdir. Vine serum protein fraksiyon-4 ve 5'de Iransferin ve pre-albumin i~eriklen gozlenmi~tir.
Normalde kandaki albumin proteini O~ farkh lonk-siyona sahiptir (Murray ve ark. 1992). Bunlar; kanm
osmatik baslnClnln dOzenlenmesi, meveul diger
pro-teinlenn yaplslOlO korunmasl ve bir~ok madden in
kanda ta~lOmaslOlO saglanmasldlt. Ney ve Smith'in
(1976), Lepomis maerochlrus Ozerlnde yapuklan
ara~tltmada elektroforezde en hlzll g~ eden
frak-siyonun pre-albuminler oldu!)unu gOzlemtediler.
Pre-albuminlerin tiroid hormonlarl, tiroksin (T4),
tri-idotironin (T3) ta~lnmasl ve baglanmaslOda gorevli
olduklatl, transferrinin Ise demi, ta~lOmaslOda
gO-revll olduklan belirtilmi~lir.
SOS-PAGE ire yaptlglmlz ~all~mada, ~ekil 2'de gOrOldOgO gibi Capoeta fruita ve Capaeta capoeta umbfa araslOda 8 adel protein bandl farkllilk gos-terdi. Aynea 8 adel protein bandl da benzerlik gos-terdi. MotekOI a!)lrllgl en buyQk olan globulin bandl 135 kO ve molekOI aglfh~1 en k~Ok olan pre-albumin ban(h ise 9,5 kO motekOI a!)lrllglnda idi. Bu
iki ballk arasilldaki en bOyOk larklar matekOI
aglt-hklan 45 kO ve 9,5 kO olan albumin protein banUan araslnda gOzOktO.
Capoeta fruita ve Capoeta caposta umbla lar molekOl a!)lrllklan bOyOk olan globulin banttan ara-Slnda sadeee iki bant (a,b) larkll gorOldO ve bu fark-IIl1kta Capoeta trutta'ya ait bantlann C. capoeta umbfa'ya gore daha koyu boyanmasldlf. Komagata ve arkada~lan",n " 988). Hypomesus nipponensis ile yapml~ oldugu anaJizda aynl lOre ait erkek ve
di~i ballklarda istisnaslz 3O'dan lazla protein bandl gOzlendi{Jini belirtmi~ va molekGl a{Jlrllklan 94 kD Ozerinde olan O~ prolein bandlOln farkh oldugunu
gOzlemi~tir. Call~mamlzda bu bilginin 1~lgl altlOda aynl cins ve aynl ya~taki bireyler kul1anllml~tlr. Vine
Ura ve arkada~la(l (1994), Oncorhyncus masou'da
parr ve smoltlann serum profillerini western blotting
ile birle~linrmi~ iki yOnlO SOS-PAGE ve
kar-~lla~llrmah ImmOnelekroforez (CIE) ile analiz elmi~
ve parr va smoltlarm protein banUan araslOdaki lark-lann genelde dO~Ok molekOI aglthkh protein bant-lannda oldu!)unu gOzlemi~lerdir. Yapllglmlz
YILMAZ. TURKOZ. ERDEMLI. KALKAN. <;ICREMIS
umbla'iarm protein banUan arasmdaki farklann
bliyuk bir ktsmt du~uk molekul aQtrltkh protein
banj-larrnda g6zlendi.
Theophilus ve Aao'nun (1998), Channa
ge-nusuna ait u(( turOn serum proleinleri uzerine
yap-Itklan elektroforetik valt~malarda 0(( lOran hepsinde
de ba~hca
10
protein fraksiyonu elde etml~ler vebun un her bir tOr ivin yOksek de recede ka-rakteristik modeller olduQunu gOstermi~lerdir. Bu
ara~tlnctlar bu bahklardan elde edilen elektroforetik farklann onemli oldugunu belirtmi~le(dir. Schreiber ve arkada~lan (1992), omurgaslz bir hayvan olan Priapulida'ntn 4 10rOnun kan proteinlerini
in-celeyerek ((ok OnemU lakSonomik sonu((lar elde
et-mi~le(dir. Khan ve Gadru (1988), Cyprinidae
fa-milyastna ait bazt bahklann kan serum proteinleri
uzerinde yaptlkJan elektroforetik ((alt~mada
SDS-PAGE y6ntemi ile tar ve alllOr tespitinin ya-pllabilecegini beJirtmi~lerdir. Vine Mukhopadhyay ve ark. (1987), bazt lath su kemikli ballklanmn
se~um proteinleri uzerinde yaptlklan elektroforetik
vall~mada 6nemli biyosistematik veriler ortaya
koy-mu~lardlr.
LI
(1991), di~i Cyprinus carpio, erkekCtenopharyngodon idella ve bu bireylerin
hib-rillerinin serum proteinlerini poliakrilamid jel elekt-roforezi ile analiz etmi~ ve her bir ebeveynin
elekt-rolerogram liplerinde far1dlhklar bulmu~tur.
Capoeta fruita ve Capoeta capoeta umbla
tarO bahklarm serum proleinlerinin
SDS-Poliakrilamid Jel Elektroforez yOntemiyle in-celendigi bu ((all~mada Onemli farkllhklar elde
adil-mi~tir. Serumdaki her proteinin bir veya birden lazla gen larahndan kodlandlgl dikkate ahndlgmda,
bu iki IOn]n elektroloregramlnda gOzlenen bu farkh
protein bantlartmn taksonomik a((ldan Onemli 01-dugu ve taksonomik ara~tlrmalarda
kul-lantlabilecegi sonucuna vanlml~tlr. Kaynaklar
An: H., Wei, C.I.. Zhao, J., Marshall, M.A., Lee, C.M. (1989). Electrophoretic identification of fish species
used in surimi products. J. Food. Sci., 54, 253-257.
An, H., Marshall, M,A., Otwell, W.S., Wei, C.1. (1988),
Electrophoretic identification of raw and cooked shrimp
uSing various protein extraction system. J. Food.
Sci .. 53,313-318.
Burtis, CA , Aswood, e.A. (1996). Tietz fundamentals of
ctinica chemistry. W.B.Saunders Company.,Philadelphia
Demir. N. (1992). Ihtiyoloji. 1st. Oniv. Fen Fak. Basrmevi.
306.
~alkan, E. ve Erdemli, A.t). (1996). Tohma Balrklarr
Uzerine Faunistik Bir Ara~tlrma. TOrk Doga Bil.Dergisi,
20,153-160.
Khan, A.A., Gadru, M. (1988). Electrophoretic patterns
Of. blood serum pattem of some fish of Kashmir. Trop.
92
Freshwat BioI., 11,62,70.
Komagata, K., Kawarabayashi, S., Kuwabara, A. (1991).
Sexual dimorphism in electrophoretic patterns of blood
serum proteins in a smell Hypomesus nippponensis. Su'
-· isan Gakkaishi Bull Jap Soc Sci Fish. 57,8, 1599.
Kuru, M. (1975). Dicle-Flrat, Kura-Aras, Van GO!O ve
Ka-radeniz Havzasl Tatl! Sularmda Ya~yan Bahklann
(Pis-ces) Sistematik ve Zoocografik VOnden Incelenmesi.
Ata-tOrk Oniv. Yay., (D~entlik Tezi)
Laemmli (1970). Cleavage of structural proteins during
the assemble, of the head of bacteriophage T 4, Nature,
227,680.
U, C. (1991). Electrophoretic analysis on the serum pro-teins of Xinggua Red Carp, Grass Carp and their hybrid F
sub (1). Freshwat Fish Danshui Yuye, 6,12-14.
McCormick, A.J., Collins, D.A., Field, RA, Moore, T.D.
(1992). Identification of meat from game and domestic
species. J. Food Sci,57, 516·520.
Menzel, B.W. (1970). An electrophoretic analysis of the
blood proteins 01 subgenus Luxilus (Notripis cyprinidae).
Ph. D. Thesis. Cornell University.
· Mukhopadhyay, S., Basu, S., Data, C., Bose. A. (1987).
Electrophoretic study on serum proteins of fresh water Teleosts. Nucleus, 30, 3,101-103.
Murray, A.K., Granner, O.K., Mayes, P.A., Rodwell, V.W. (1992). Harper's Biochemistry. Appleton and Lange Press. Connecticut.
Ney, J.J., Smith, L.L.J. (1976). Serum protein variability in
geographically defined bluegill Lepomis macrochirus
po-pulations. Trans Am Fish Soc., 2, 281-28~.
O'Farrell, P.H. (1975). High resolution two-dimensional
electrophoresis of biological properties and Significance.
Comp Biochem Physiol.. 88 M, 497-501.
Robert, A., Michael, J.D. (1993) Enzyme assays. Oxford
University Press, Newyork.
Schreiber, A., Svavarsson, J., Storch, V. (1992). Blood proteins in bipolar priapulida. Polar Bioi., 12, 6-7,
667-672.
Summerfelt, A.D. (1964). Blood proteins, their pattoms,
· variations and functions in the golden shiner, N
o-temigonus crysoleucas, Cyprinidae. Ph. D. Thesis,
Uni-versity 01 Southem Illinois, Carbondale.
Theophilus, J., Rao, P.A. (1998). Electrophoretic studies
on the serum proteins 01 the three species of genus
chan-na. Indian. J Rsh., 35,4 294-297.
Ura, K., Hara, A, Kawamura, H., Yamauchi, K. (1994).
Immunochemical studies on serum proteins in juvenile
masu salmon, Oncorhyncus masou. Compo Biochem. Physiol., 1078, B, 2, 225·229.
Weber, K., Pringle, J., Osborn, M. (1972). Measurement of molecular weights by electrophoresis on SDS-
