74
Candida Albicans Üzerine Omeprazolün In Vitro Antifungal Etkisinin Flukonazol İle
Karşılaştırmalı Çalışması
In Vitro Antifungal Effect of Omeprazole in Candida Albicans and its Comparison with Fluconazole
Zeynep SÜMER
*, Serpil KAYA
* , Ali ÇETİN
**, Yahya HAKGÜDENER
** Cumhuriyet Üniversitesi Tıp Fakültesi Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı
** Cumhuriyet Üniversitesi Tıp Fakültesi Kadın Hastalıkları ve Doğum Anabilim Dalı ÖZET
Mantar hastalıklarının tedavisinde kullanılan ilaçların yan etkileri çok fazla gözlenmektedir. Bu yüzden insan hücreleri ile mantar hücrelerinde ortak olmayan yeni hedefler bulunması ve yan etkileri daha az veya hiç olmayan yeni ilaçların araştı-rılması gerekmektedir. Bu çalışmada Candida albicans’a karşı in vitro şartlarda omeprazolün antifungal etkisini araştırmayı ve yaygın kullanılan bir antifungal olan flukonazolün antifungal etkinliği ile karşılaştırmayı amaçladık. Vaginit tanısı almış kadın-lardan izole edilen 33 adet C.albicans’la birlikte, çeşitli örnek-lerden izole edilmiş 5 adet C.kefyr, 4 adet C.tropicalis, 3 adet
C.glabrata, 1 adet C.krusei, toplam 48 adet Candida izolatı ve 2
adet de standart suş kullanıldı. Antifungal duyarlılık deneyi NCCLS standartlarının M27A kılavuzunda belirtilen mikrodilüsyon yöntemi kullanılarak yapıldı. 33 C.albicans
suşundan 4’ü (%12.0) 1280 µg/ml’de, 16’sı (%48.7) 320 µg/ml’de, 9’u (%27.3) 10µg/ml konsantrasyonda omeprazole duyarlıydı. Suşların 37’si (%77.1) flukonazole duyarlı bulundu. Flukonazol sonuçları literatürle uyumluydu.
Anahtar sözcükler: Omeprazol, Candida, Antifungal, Flukonazol.
SUMMARY
Many side effects of the drugs that are commonly used for antifungal therapy have been observed. Therefore, new targets not sharing same properties between human and fungal cells should be discovered and new antifungal drugs having less or no side effects should be designed. We aimed to investigate the effect of omeprazole against Candida species in vitro and to compare the antifungal activity of omeprazole with fluconazole. Thirty three C. albicans strains isolated from women diagnosed as vaginitis and strains of 5 C.kefyr, 4
C.tropicalis, 3 C.glabrata, 1 C.krusei, 2 standard strains were
used in the study. The in vitro antifungal susceptibilities of
Candida spp. were determined by microdilution method
according to NCCLS M27A standards. Four of 33 C.albicans
strains (12.0%) were susceptible to omeprazole at 1280 µg/ml concentration, while 16 (48.7%) were susceptible to omeprazole at 320 µg/ml concentration, and 9 (27.3%) were susceptible at 10 µg/ml concentration. Thirtyseven of 48
Candida strains (77.1%) were found to be susceptible to
fluconazole and this finding was in concordance with the literature.
Key Words: Omeprazole, Candida, Antifungal, Fluconazole.
C. Ü. Tıp Fakültesi Dergisi 27 (2): 74 – 78, 2005 GİRİŞ
Fungal infeksiyonların insidansı giderek artış gös-termektedir. İmmünsuprese hastalar başta olmak üzere birçok durumda hastalar, artık bilinen patojenler yanın-da fırsatçı mantarlar için de hedef haline gelmişlerdir. Fungal infeksiyonlar çok kısa sürede hayatı tehdit eden klinik tablolara dönüşebildikleri için patojen mikroorga-nizma en kısa sürede tanımlanmalı ve uygun tedaviye
başlanmalıdır (1). Fungal infeksiyonların artışına paralel fungal ilaç kullanımının yaygınlaştığı bildirilmiştir (2).
Flukonazol sistemik ve yüzeyel mikozların teda-visinde kullanılan geniş spektrumlu bir triazol bileşiğidir. Flukonazolün proflaksi veya tedavi amacıyla yaygın kullanımı sonucu Candida türlerinde Flukonazole karşı direnç gelişimi çeşitli araştırmalarda klinik bir sorun olarak ortaya konmuştur (3, 4).
Mantar hücre yapısının insan hücresi gibi ökaryot olması nedeniyle fungal tedavide kullanılan ilaçların yan etkileri çok fazla gözlenmektedir. Bu yüzden insan hücreleri ile mantar hücrelerinde ortak olmayan yeni hedefler bulunması ve yan etkileri daha az veya hiç olmayan yeni ilaçların araştırılması gerekmektedir (5). Bir proton pompa inhibitörü olan omeprazol genelde peptik ülser tedavisinde etkin olarak kullanılmaktadır. Ancak Omeprazolün teorik olarak mantar hücre metabo-lizmasını inhibe ederek üremelerini durdurması gerek-mektedir.
Bu çalışmada Candida türlerine karşı in vitro şart-larda omeprazolün etkisini araştırmayı ve yaygın kullanı-lan bir antifungal okullanı-lan flukonazol ile omeprazolün antifungal etkinliğini karşılaştırmayı amaçladık.
GEREÇ VE YÖNTEM
Kullanılan izolatlar: Çalışmada İnönü üniversitesi Tıp Fakültesi Kadın Hastalıkları ve Doğum polikliniğine başvuran vaginit tanısı almış kadınlardan izole edilmiş 33 adet C.albicans’la birlikte, çeşitli örneklerden izole edilmiş 5 adet C.kefyr, 4 adet C.tropicalis, 3 adet C.glabrata, 1 adet C.krusei ve 2 adet de standart suş kullanıldı. (ATCC 25522, ATCC 90028). Çalışmaya alı-nan suşlar çalışma gününe kadar -80ºC’de saklandı.
Çalışmada kullanılan besiyerleri: Sabouraud-Dextroz-Agar (SDA)(Oxoid), RPMI 1640, MOPS buffer (Aplichem) kullanıldı.
Antifungal duyarlılık deneyi: Deney NCCLS stan-dartlarının M27A kılavuzunda belirtilen mikrodilüsyon yöntemi kullanılarak yapıldı (6). SDA besiyerinde pasajla canlandırılan Candida suşları RPMI 1640 besiyerine inoküle edildi ve pH 7.0 olan MOPS buffer kullanılarak sulandırıldı. Tüm suşlar Mac Farland 0.5’e göre otomatik ölçüm cihazı kullanılarak ayarlandı.
Omeprazole’un aktivasyonu: Antifungal olarak test edilecek omeprazol DMSO içinde çözüldükten sonra HCL kullanılarak pH 2’ye ayarlanarak asit ortamda 15 dakika aktive olması sağlandı. Preparatın renginin
por-takal rengi olmasıyla aktivasyonu anlaşıldı. Daha sonra pH tekrar 7.0’a yükseltildi (7). Daha sonra ilaç konsant-rasyonları birincisi 2560 µg/ml ve sonuncusu 5 µg/ml konsantrasyonda olacak şekilde ayarlandı. Hazırlanan tüm omeprazol örnekleri mikroplaklara 100’er µl dağıtıl-dı. Daha sonra omeprazol dağıtılmış kuyucuklara 100’er µl Mac Farland 0.5’e göre ayarlanmış Candida süspansi-yonları dağıtıldı. Böylece omeprazol konsantrassüspansi-yonları yarıya düştü ve sonuç konsantrasyonları 1280-2,5µg/ml oldu. Birer kuyucuk maya üreme kontrolü olarak kulla-nıldı ve sadece maya hücresi konuldu, omeprazol ek-lenmedi. Son kuyucuklara ise sadece besiyeri konularak besiyeri kontaminasyonu kontrol edildi. İşlemler tamam-lanıp mikroplakların üzerleri kapatıldıktan sonra 35ºC’de 48 saat inkübe edildi ve sonra 450 nm dalga boyunda spektrofotometrede okutularak değerlendirildi. Elde edilen sonuçlar frekans dağılımı olarak verildi.
Flukonazol için duyarlılık testleri: Flukonazol aktif maddesinin (Pfizer) distile su ile yapılan stok solüsyo-nundan, yukarıda anlatılan esaslara uygun olarak NCCLS M27-A protokolüne göre mikrodilüsyon yöntemi ile du-yarlılık durumu araştırıldı. Son ilaç konsantrasyonu 64 µg/ml-0.125 µg/ml olacak şekilde hesaplanmıştır. 48 saatlik inkübasyonun ardından spektrofotometrik olarak 450 nm’de yapılan okuma ile değerlendirildi. NCCLS flukonazol için duyarlılık sınırını ≤8 µg/ml, dirençlilik sınırını ≥64 µg/ml olarak bildirilmiştir (6).
BULGULAR
Deneye 33’ü Candida albicans, 13’ü Candida spp., 2 adedi de standart suş olmak üzere toplam 48 adet suş alındı.
ATCC 25522 ve ATCC 90028 nolu Candida albicans suşları 320µg/ml konsantrasyonda omeprazole duyarlı olarak bulundu. Candida albicans suşlarının omeprazole karşı duyarlılıkları Tablo 1’de gösterilmiştir. 33 C.albicans suşundan 4’ü (%12.0) 1280 µg/ml’de, 16’sı (%48.7) 320 µg/ml’de, 9’u (%27.3) 10µg/ml kon-santrasyonda omeprazole duyarlıydı. Çalışılan suşların çoğunluğunun duyarlılık konsantrasyonları standart suşların duyarlılık konsantrasyonlarına eşitti.
76
Tablo 1. Candida albicans suşlarının omeprazole karşı duyarlı-lıkları Konsantrasyon (µg/ml) Sayı % 10 9 27.3 20 1 3.0 80 2 6.0 320 16 48.7 640 1 3.0 1280 4 12.0 TOPLAM 33 100.0
Diğer 13 Candida spp. suşu incelendiğinde: 4 Candida tropicalis suşundan 2 tanesi Omeprazole’e dirençliydi. Diğer 2 adet Candida tropicalis’le birlikte, 5
Candida kefyr, 3 Candida glabrata ve 1 Candida krusei suşları ise 10µg/ml konsantrasyonda omeprazole duyarlı olarak bulundu. Çalışmada yer alan non-C.albicans suşların sayısı yetersiz olduğundan sadece duyarlılık durumları verilmiştir.
Omeprazol bu çalışmada yeni bir antifungal ola-rak denendiğinden bu konuda daha önceden saptanan bir duyarlılık sınırı yoktur. Bu yüzden standart suşların duyarlı olduğu MİK değeri(≤320µg/ml) duyarlılık sınır değeri olarak ele alınarak Candida albicans suşlarının omeprazol duyarlılığı incelenmiştir. Candida albicans suşlarının flukonazole karşı duyarlılıkları ile omeprazole karşı duyarlılıkları Tablo 2’de gösterilmiştir. Flukonazole karşı orta duyarlı bulunan suşlar dirençli olarak değer-lendirilmiştir.
Tablo 2: Candida albicans suşlarının omeprazol ve flukonazole karşı duyarlılık durumları
Flukonazol Omeprazol ≤ 8µg/ml > 8µg/ml ≤320µg/ml >320µg/ml Duyarlılık Sınırı n % n % n % n % Toplam 25 75.8 8 24.2 28 84.8 5 15.2 33 100 TARTIŞMA
Sağlıklı kişilerin normal florasında bulunan Candida’lar fırsatçı mantarlar olup, özellikle immun sistemi baskılanmış kişilerde önemli bir morbidite ve mortalite nedeni olarak günümüzde önem taşımaktadır (8). Yeni antifungal ilaçların bulunması ile fungal infeksiyonlar ile oluşan morbidite ve mortaliteyi azalt-mayı amaçlayan çok sayıda çalışmalar yapılmaktadır.
Mantar plazma zar proton ATP’azı ion-taşıyıcı, ATP’azların P-tipi sınıfına ait bir integral zar proteinidir. P tipi ATP’az üyeleri Na+ K+ ATP’az (hayvan hücreleri) gastrik H+,K+-ATP’az (sarko-plazmikratikulum ve kan hücreleri), bazı düşük ökaryotik parazitlerin proton– pompalama ATP’azları, bitki hücrelerinin, mantar hücre-lerin ve bazı prokaryotik ATP’azlardır (9, 10).
Omeprazol bir pyridinyl-2-methylenesulfinyl-2-benzimidazole derivesidir. Bu ilaç gastrik H+, K+ ve ATPazı selektif olarak inhibe ederek mide ülserlerinin tedavisinde yaygın olarak kullanılmaktadır (5). Omeprazolün maya plazma membranı H ATP’azı ile
ilişkisinin moleküler doğasını açıklamaya yönelik çeşitli araştırmalar yapılmıştır. Johnson ve ark. yaptıkları bir çalışmada omeprazolün bir antifungal olan itrakonazolün serum konsantrasyonunu arttırarak antifungal etkisini pozitif yönde etkilemekte olduğunu göstermişlerdir (11). Yapılan bazı öncül çalışmalarda omeprazolün fungal ATPaz ile direkt olarak ilişkiye girdi-ğini ve gastrik H, K ATPaza benzer şekilde bu enzimi inhibe ettiğini belirtmektedir (5).
Keeling ve ark. asitle degrade edilmiş omeprazolün (H+K)-ATP’az’ı, (Na+K) ATP’aza göre daha az inhibe ettiğini göstermişlerdir. Ayrıca (H+K)-ATPazı inhibe etmek için çok yüksek omeprazole kon-santrasyonuna ihtiyaç olduğunu da belirtmişlerdir (7). Ulaşabildiğimiz kaynaklarda ülkemizde Omeprazolün antifungal etkisi ile ilgili yapılmış çalışmalara rastlana-mamıştır..
Ülkemizdeki yapılan çeşitli çalışmalarda Candida suşlarının çeşitli antifungallere karşı duyarlılıkla-rı araştıduyarlılıkla-rılmıştır. Bu çalışmalarda flukonazole karşı duyarlılık oranlarının %76 -100 arasında değişen
oran-larda bildirilmiştir (12-17). Çalışmamızda 33 Candida albicans suşunun flukonazole karşı duyarlılık oranı %75.8 olarak bulunmuştur. Bu oranın ülkemizde yapıl-mış çalışmalarda bulunan oranlara yakın olduğu gö-rülmektedir.
Flukonazolün özellikle tekrarlayan kürler şeklinde veya subterapötik dozlarda uzun dönemli proflaksi ama-cıyla kullanımı başta olmak üzere tüm fungal infeksiyonlarda artmış kullanımının flukonazol direnci ile ilişkili olduğu bildirilmektedir (18). Çalışmamızda bulu-nan Candida albicans suşlarında flukonazole karşı azalmış bu duyarlılık oranının da aynı nedenle oluşmuş olabileceğini düşünmekteyiz.
Sonuç olarak çalışmamızda Candida suşların bü-yük bir çoğunluğunun 320 µg/ml gibi bü-yüksek bir omeprazol konsantrasyonuna duyarlı olduğu görülmüş-tür. Farklı ilaçlarla yapılmış çalışmalara bakıldığında bu konsantrasyonun çok yüksek olduğu gözlenmektedir. Bu nedenle ilaç konsantrasyonu düşürebilmek için farklı ilaç kombinasyonları veya farklı preparatları denemenin yararlı olacağını, sistemik kullanım yerine lokal kullanı-mın denenebileceğini düşünmekteyiz. Bu konuda in vitro çalışmaların yanı sıra in vivo çalışmaların arttırılmasını önermekteyiz. Ayrıca fungal infeksiyonların tedavisi için uygun ve etkin antifungal seçiminde in vitro antifungal duyarlılık testlerinin öneminin vurgulanması gerektiğini düşünmekteyiz.
KAYNAKLAR
1. Costa MRE, Lacaz CDS, Kawasaki M, Camargo ZP. Conventional versus molecular diagnositc tests. Medical Mycology 2000; 38(Suppl 1): 139-45.
2. Lamb DC, Kelly DE, White TC, Kelly SL. The R467K aminoacid substitution in Candida albicans sterol 14 alpha-demetylase causes drug resistance through reduced affinity. Antimicrob Agents Chemother 2000; 44: 63-7.
3. Nyugen MH, Peacock JE, Morris AJ, Taner DC, Nyugen DR, Snydman DR, Wagener MM, Rinaldi MG, Yu VL. The changing face of candidemia: emergence of non-Candida
albicans species and antifungal resistance. Am J Med
1996; 100: 617- 23.
4. Pfaller MA, Jones RN, Messer SA, Edmond MB, Wenzel RP. National surveillance of nosocomial blood stream infection due to species of Candida other than Candida
albicans: frequency of occurence and antifungal
susceptibility in the SCOPE program. Diagn Microbiol Infect Dis 1998; 30:121-9.
5. Monk BC, Perlin DS. Fungal plasma membrane proton pumps as promising new antifungal targets. Critical Reviews in Microbiology 1994; 20(3): 209-23.
6. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 1997. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts. Approved Standard M27-A. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Wayne,Pa.
7. Keeling DJ, Fallowfield C, Milinler KJ, Tingley SK, Ife RJ, Underwood AH. Studies on the mechanism of action of Omeprazole. Biochem Pharma 34:16;2967-73.
8. Gölle H, Öztürk A, Yuluğ N. Sistemik infeksiyonlardan izole edilen Candida’ların çeşitli antifungal ajanlara duyar-lılık oranları. İnfeksiyon Derg 2001; 15:221-224. 9. Monk CB, Niimi M, Shepherd MG. The Candida albicans
plasma membrane and H(+)-ATPase during yeast growth and germ tube formation. J Bacteriol 1993 175;17:5566-74.
10. Seto-Young D, Monk B, Mason AB, Perlin DS. Exploring an Antifungal target in the plasma membrane H(+)-ATPase of fungi. Biochim Biophys Acta 1997; 12;1326(2):249-56. 11. Johnson MD, Hamilton CD, Drew RH, Sanders LL, Pennick
GJ, Perfect JR. A randomized comparative study to determine the effect of omeprazole on the peak serum concentration of itraconazole oral solution. J Antimicrob Chemother. 2003, 51;453-7.
12. Kuştimur S, Kalkancı A, Mansuroğlu H, Yalınay Çırak M.
Candida’ların disk diffüzyon ve mikrodilüsyon yöntemi ile
flukonazol’e duyarlılıklarının değerlendirilmesi. Türk Mikrobiyol Cem Derg 2002; 32:92-96.
13. Kuştimur S, Kalkancı A, Mansuroğlu H. Candida türlerinin flukonazole duyarlılıklarının saptanmasında iki farklı mikrodilüsyon yönteminin karşılaştırılması. İnfeksiyon Derg 2001; 15(3):349-351.
14. Şener G, Karapınarlı K, Çelik C, Türker M, Kurultay N.
Candida suşlarının amfoterisin B ve flukonazol
duyarlılığı-nın belirlenmesi. İzmir Atatürk Eğitim Hastanesi Tıp Derg 2001; 39(1):33-37.
15. Orhon H, Özbakkaloğlu B, Sürücüoğlu S, Tünger Ö, Arısoy AS. İnfeksiyon etkeni olan Candida albicans suşlarında
78
slime üretimi ve antifungal ajanlara duyarlılıkları. Türk Mikrobiyol Cemiy Derg 1998; 28(1-4): 103-106.
16. Özkütük A, Göller S, Yuluğ N. Yüzeyel mikoz etkenlerin-den dermatofit ve Candida’ların çeşitli antifungal ajanlara duyarlılıkları. İnfeksiyon Derg 2001; 15(1): 93-96. 17. Kiraz N, Erturan Z, Uzun M, Durmaz G, Us T, Akgün Y,
Anğ Ö. Üçyüz Candia albicans suşunun amfoterisin B,
flusitozin, flukonazol ve mikonazole duyarlılıklarının araştı-rılması. Klimik Derg 1998; 11(3): 116-8.
18. Liebowitz LD, Ashbee HR, Evans EG, Chong Y, Mallatova N, Zaidi M, Gibbs D, Global Antifungal Surveillance Group. A two year global evaluation of the susceptibility of
Candida species to fluconazole by disk diffusion. Diag
Microbiol Infect Dis 2001; 04:27-33.
Yazışma Adresi :
Zeynep SÜMER
Cumhuriyet Üniversitesi Tıp Fakültesi Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, SİVAS Tel: 2191010/ 2927
