T.C.
TRAKYA ÜNİVERSİTESİ
TIP FAKÜLTESİ
KALP DAMAR CERRAHİSİ
ANABİLİM DALI
Tez Yöneticisi
Prof. Dr. Mutasım SÜNGÜN
SAFEN VEN HAZIRLANMASINDA SERUM
FİZYOLOJİK VE LAKTATLI RİNGER SOLÜSYONU
KULLANIMININ ENDOTEL HASARI ÜZERİNE
ETKİSİ
(Uzmanlık Tezi)
Dr. Muhammet Murat CANTÜRK
TEŞEKKÜR
Eğitimimiz için; çağdaş, özgür ve bilimsel çalışma ortamı hazırlamak amacıyla fedakarlıktan kaçınmayan, sağladığı olanaklarla uzmanlık eğitimimizi başarıyla sürdürmemizi sağlayan, mesleki bilgi, deneyimimizde yardımlarını esirgemeyen, bize cerrahi sanatını öğreten değerli hocalarım Rektörümüz Sayın Prof. Dr. Enver DURAN ve Dekanımız Sayın Prof. Dr. Murat DİKMENGİL’e, tez danışmanım ve Anabilim Dalı başkanımız Sayın Prof. Dr. Mutasım SÜNGÜN hocama, Histoloji Anabilim Dalında Sayın Prof. Dr. Mehmet KANTER’e, Uzm. Biyolog Mustafa ERBOĞA’ya, İstanbul Üniversitesi Cerrahpaşa Tıp Fakütesi Biyokimya Anabilim Dalında Sayın Prof. Dr. Hafize UZUN’a, Arş. Gör. Hayriye ERMAN’a, Hocalarım Sayın Prof. Dr. Suat CANBAZ’a ve Sayın Prof. Dr. Turan EGE’ye, diğer hocalarıma ve tüm arkadaşlarıma teşekkür ederim.
İÇİNDEKİLER
GİRİŞ VE AMAÇ ... 1
GENEL BİLGİLER ... 4
KORONER ARTER BYPASS CERRAHİSİ ... 4
BÜYÜK VE KÜÇÜK SAFEN VEN ... 7
VENLERİN MORFOLOJİK VE HİSTOLOJİK YAPISI ... 10
VASKÜLER ENDOTELYAL HÜCRELER ... 13
TROMBOZİS ... 16
İNTİMAL HİPERPLAZİ ... 17
ATEROSKLEROZİS ... 17
NİTRİK OKSİT ... 18
CD34 ( ENDOTEL PROGENİTÖR HÜCRELER) ... 21
APOPTOZİS ... 22
REAKTİF OKSİJEN TÜRLERİ (SERBEST OKSİJEN RADİKALLERİ) ... 23
HEPARİN ... 25
GEREÇ VE YÖNTEMLER ... 26
BULGULAR ... 32
TARTIŞMA ... 48
SONUÇLAR ... 57
ÖZET ... 59
SUMMARY ... 61
KAYNAKLAR ... 63
EKLER
SİMGE VE KISALTMALAR
AT : Anjiotensin
Ca+2 : Kalsiyum
CD34 : Endotel progenitör hücreler
cGMP : Siklik Guanosin 5-Monofosfat
E-1 : Endotelin-1
ED : Endotel disfonksiyonu
EDRF : Endothelium derived relaxing factor
eNOS : Endoteliyal nitrik oksit sentaz
EPH : Endotelyal progenitör hücreler
ET : Endotelin
HE : Hematoksilen eozin
İTA : İnternal torasik arter
İÜCTF : İstanbul üniversitesi cerrahpaşa tıp fakültesi KABG : Koroner arter bypass greft
KAT : Katalaz
L-NMMA : NG-nitro-monometil-l-arginin
LR : Laktatlı ringer
MDA : Malondialdehit
nNOS : Nöronal nitrik oksit sentaz
NO : Nitrik oksit
NOS : Nitrik oksit sentaz
RA : Radial arter
ROT : Reaktif oksijen türevleri
SF : Serum fizyolojik
SOD : Süperoksit dismütaz
TA : Tunika adventisya
Tİ : Tunika intima
TM : Tunika media
TÜTF : Trakya üniversitesi tıp fakültesi VEBF : Vasküler endotelyal büyüme faktörü
VSM : Vena safena magna
VSP : Vena safena parva
GİRİŞ VE AMAÇ
Kalp cerrahisi günümüzde tüm dünyada sıklıkla uygulanan bir cerrahi yöntem olarak literatürde yer almaktadır (1-3). Koroner arter bypass greft operasyonu (KABG), gelişmiş ülkelerde yapılan en sık majör operasyondur ve tüm dünyada her yıl yaklaşık 1 milyon hastaya yapılmaktadır (4). İskemik kalp hastalıklarına yönelik ilk cerrahi girişimler 1930’lu yıllara dayanmaktadır (1). 1937 yılında Kalp akciğer makinesinin Gibbon tarafından keşfi bugün ki kalp cerrahisinin gelişiminde büyük önem taşımaktadır. 1968 yılında Favoloro vena safena magna (VSM) kullanarak aortokoroner bypass ameliyatlarını yayınlamış ve sonrasında VSM yaygın kullanım alanı bulmuştur (5).
Koroner arter hastalığında miyokardın revaskülarizasyonu için cerrahi tedavi en etkili ve uzun süreli bir çözümdür (1). Cerrahi sonuçlar kısa ve orta dönemde iyi iken uzun dönemde greft yetmezliği ile etkilenmektedir (6). Aortokoroner bypass greftlerinin cerrahi girişim sonrası ilk 3 ayda tıkanma hızları %7-12, birinci yılda %10-20 arasındadır ve yıllık %2-5 oranında ilerler. Beşinci yılda Aortokoroner greftlerin %25’i, onuncu yılda ise %35’i tıkanır (7). En sık kullanılan greftler, büyük safen ven (SV), internal torasik arter (İTA) ve radial arter (RA)’dir. SV hızla çıkarılabilmesi, hazırlanmasının kolay olması, mükemmel bir akım sağlayabilmesi ve spazm olmaması gibi özelliklerinden dolayı koroner arter bypass cerrahisinin ilk gününden beri kullanılmaktadır. Safen ven çıkarıldıktan sonra dışarda bekleme süresine ve bekletildiği solüsyon seçimine dikkat edilmelidir. Ven duvarında oluşabilecek hasar, intimal hiperplazi gelişimine yol açarak greftin erken dönemde stenozuna neden olan en önemli faktördür (8-10). Endotel hasarı greft başarısızlığında en büyük neden gibi görünmektedir. Bu hasar venin cerrahi olarak çıkartılması sırasında yapılan aşırı germe,
kaba cerrahi travma, uygunsuz solüsyonlarla bekletme veya anastomoz öncesi vücut dışında uzun süre bekletmeye bağlı serbest oksijen radikalleri ve iskemiye bağlı olarak ortaya çıkar.
Erken, orta ve geç dönem olmak üzere 3 tip greft başarısızlığı mevcuttur. Erken greft başarısızlığı operasyondan ilk 30 gün içerisinde görülür. Hızlı greft trombozu olur. Orta dönem greft başarısızlığı özellikle anastomoz bölgesinde ve greft duvarında ilk iki yıl içinde görülen fibröz hiperplazi nedeniyle ortaya çıkar. Geç dönem greft başarısızlığı ise beş yıldan sonra ven greftlerinde, hızlanmış ateroskleroz gelişmesine bağlıdır. Endotel hasarına ek olarak kardiyopulmoner bypass’a bağlı gelişen trombosit aktivasyonu ve hiperkoagulabilite ve kan akımında oluşabilecek staz diğer greft başarısızlığında önemli faktörlerdir (11).
Endotel kaybı luminal yüzde fibrin birikimine neden olur, erken greft açıklığını azaltan faktörlerden olan plateletler ve nötrofiller ortamda artar, doku plazminojen aktivatör üretimi azalır (12). Endotel kaybı eksojen koagülasyon kaskatını aktive ederek trombozu başlatır. İntimal hiperplazi, düz kas hücreleri ve ekstrasellüler matriksin intimal kompartmanda birikmesi olarak tanımlanabilir ve implante ven greftlerinde ilk 1 ay-2 yıllık dönemde gelişen majör greft hastalığıdır. Koroner arter bypass cerrahisinden sonraki birinci yıldan itibaren iskemik belirtilerin yeniden ortaya çıkması ve safen vende oluşan zayıflamanın temel nedeni aterosklerozistir. Ancak bypass cerrahisinden sonra gelişen miyokard iskemilerinde %70-85 olguda suçlu lezyon, trombüsle yüklenmiş ven greft aterosklerozisidir (13).
Fonksiyonları bozulmuş bir endotelin başlıca belirtilerinden biri, biyolojik açıdan yararlanılabilir nitrik oksit (NO) düzeylerinin düşük oluşudur. Bu, NO sentezindeki bir düşme ya da lokal olarak reaktif oksijen türevlerinin (ROT) yapımının artışına bağlı NO inaktivasyonundaki bir artışın sonucu olarak ortaya çıkabilir. Uzayan iskemi sonucunda bozulmuş endotel fonksiyonu, endotel bağımlı vazodilatasyonun baskılanması ve vasküler adezyonun artması ile ilişkilidir (14).
Hücre kültürleri ve hayvan çalışmaları; Endotelyal Progenitör Hücreler (EPH)’nin, endotel disfonksiyonu (ED) ve ateroskleroz gelişiminde koruyucu rol oynadığını düşündürmektedir. Bu hücrelerin insan üzerindeki patofizyolojik rolü çok açık değildir (15). Prematür EPH’lerin, iskemik olaylardan sonraki anjiyogenezin yanında doku yenilenmesinde de etkili olduğu gösterilmiştir. Son dönemde yapılan çalışmalarda dolaşan EPH’nin; statin, östrojen veya egzersiz ile sayısının arttırılmasının vasküler hasar sonrası reendotelizasyonu iyileştirebileceği öne sürülmüştür (16,17).
Oluşan endotel hasarı sonucu oksidan-antioksidan dengenin, oksidan lehine bozulması durumunda, oksidatif hasardan söz edilebilir. Oksidatif hasar, superoksitten kaynaklanan
serbest radikaller ile NO’in reaktif türlerinin neden olduğu hasarların toplamıdır (18). Süperoksit radikallerinin oluşması; membran lipid ve proteinlerinin yapısını bozarak hücre fonksiyonunu engellemekte, çekirdek membranını hasarlayarak DNA’yı kırılma ve mutasyonlara açık hale getirmektedir. Bu şekilde hücre fonksiyon bozukluğu ve/veya ölümüne neden olmaktadır. Süperoksit, süperoksit dismutaz (SOD) tarafından peroksidlere çevrilir. Dismutasyon reaksiyonun ürünü hidrojen peroksiddir. Katalaz ve gulutatyon peroksidaz tarafından parçalanır (19).
İskemiye uğramış ve endotel kaybına uğramış safen ven greftindeki düz kas hücreleri apoptozisin etkisiyle erken dönemde fibröz dokuyla yer değiştirebilir. Bu karşılıklı değişim geç dönemde ise safen ven greftin dejenerasyonunda önemli rol oynar (20). Sonuç olarak; Vasküler düz kas hücreleri ve endoteliyal hücrelerin apoptozisi insan damarlarının gelişimi sırasında belgelendirilmiştir. Akut hasar sonrası intimal lezyonlardaki vasküler düz kas hücrelerinin turnoverinden apoptozisin sorumlu olabileceği ve medyada meydana gelen hücresel azalmaya apoptotik vasküler düz kas hücre ölümünün katkıda bulunabileceği gösterilmiştir (21).
Koroner arter bypass cerrahisinin başarısı, bütün vasküler girişimlerde olduğu gibi, bypass greftlerinin uzun süre de açık kalmalarına bağlıdır. Greft başarısızlığında en büyük neden endotel hasarı gibi görünmektedir. Bu hasar, venin cerrahi olarak çıkartılması sırasında yapılan cerrahi travma, uygun olmayan solüsyonlarda bekletme ve vücut dışında anastomoza kadar geçen bekleme süresinin uzamasına bağlı serbest oksijen radikalleri ve iskemiye bağlı olarak ortaya çıkmaktadır. KABG operasyonları sırasında greft olarak kullanılan safen vende, uygun hazırlama ve saklama solüsyonu olarak birçok sıvı kullanılmış. Yapılan çalışmalarda serum fizyolojik ve laktatlı Ringer sürekli kontrol grubu olarak alınmıştır. Fakat kendi aralarında kapsamlı karşılaştırmalı bir çalışma yapılmamıştır. Bundan dolayıdır ki kardiyovasküler klinikler tarafından en çok tercih edilen bu iki solüsyonun endotel hasarı üzerine etkilerini göstermek, endotel hasarı en aza indirgenerek greft patensi (açıklık) oranı arttırmak, intimal hiperplazi oranını düşürmek ve hastada uzayan greft açıklık süresi ile beklenen yaşam süresini uzatmak hedeflenmiştir.
Bu çalışmada; koroner arter hastalarında uygulanan, KABG operasyonlarında bypass grefti amaçlı kullanılan safen venin, implantasyona kadar geçen sürede, serum fizyolojik ve laktatlı Ringer solüsyolarında bekletilmesinin endotel hasarı üzerine etkileri değerlendirilecek ve karşılaştırılacaktır.
GENEL BİLGİLER
KORONER ARTER BYPASS CERRAHİSİ
Kalp cerrahisi günümüzde bulunduğu düzeye gelinceye kadar hızlı bir gelişme göstermiştir (1,2). Karanlık çağlarda kalple ilgili bilgiler gözlemlerle ve kalbe ilişkin yaralanmalar sonucu meydana gelen değişikliklerle sınırlı iken, günümüzde tüm dünyada sıklıkla uygulanan bir cerrahi yöntem olarak literatürde yer almaktadır (1-3). Koroner arter hastalığında miyokardın revaskülarizasyonu için KABG en etkili ve uzun süreli çözümdür (22). KABG, gelişmiş ülkelerde yapılan en sık majör operasyondur ve tüm dünyada her yıl yaklaşık 1 milyon hastaya yapılmaktadır (4). Ülkemizde ise bu rakamın yaklaşık yıllık 20.000 düzeyinde olduğu tahmin edilmektedir.
İskemik kalp hastalıklarına yönelik ilk cerrahi girişimler 1930’lu yıllara dayanmaktadır. Beck 1932 yılında deneysel olarak, pektoral kas flebini miyokardın etrafına sararak bu yönde ilk çalışmaları başlatmıştır (1,23). 1935 yılında ilk defa insanlar üzerinde uygulanmaya başlayan bu yöntemi, sonrasında omental ve akciğer flepleri izlemiştir (24). 1941 yılında yine Beck koroner sinüsü daraltarak ve epikarda abrazyon uygulayarak granulasyon dokusunun gelişimi ile miyokardı kanlandırmayı amaçlamıştır. 1946’da Vineberg ilk defa sol ventrikül miyokardı içine İTA’yı yan dalları açık bir şekilde gömerek miyokardial kanlanmayı amaçlamıştır. Vineberg prosedürü olarak da adlandırılan bu yöntemde İTA %80-90’lara varan oranlarda patent kalmıştır (25,26).
1900’lü yılların başında köpeklerde deneysel amaçlı aortokoroner bypass ameliyatını ilk defa Alexis Carrel gerçekleştirmiştir. Bailey 1956 yılında ilk defa başarılı koroner endarterektomi ile koroner arterlerin kendisine yönelik direkt cerrahi girişimlerin gündeme
gelmesine yol açmıştır (27,28). 1960’lı yılların başında Sabiston ve Garrett ilk VSM’ı kullanarak aortokoroner bypass ameliyatlarını vaka takdimleri olarak yayınlamışlardır (29-31). Sonrasında 1968 yılında Favoloro VSM kullanarak aortokoroner bypass ameliyatlarını yayınlamıştır (5). Bu dönemden sonra VSM yaygın kullanım alanı bulmuştur. Yine aynı yılda Green İTA kullanarak ilk koroner bypass serisini yayınlamıştır (32,33). 1960’ların sonları ile 1970’lerin başlarından itibaren aortokoroner venöz bypass ile birlikte İTA-koroner arter anostomozlarının yapılması giderek popülarite kazanmış ve günümüzde en çok yapılan büyük ameliyatlardan birisi haline gelmiştir.
Diğer yandan standart miyokard revaskülarizasyon operasyonlarının dışında; robotik koroner cerrahisi, anjiyoplasti ve stent yöntemleri, hibrid yöntemler, transmiyokardiyal lazer revaskülarizasyon, genetik endojen revaskülarizasyon, anjiyojenik ve kök hücre transferi gibi alternatif stratejilerde gelişmektedir (34).
Kalp cerrahisinin başarıyla gerçekleştirilebilmesi için genellikle sahanın kansız ve hareketsiz olması gerekir. Kalbin pompalama ve akciğerlerin solunum fonksiyonunu geçici olarak üstlenen cihaza kalp akciğer makinası denir. Kalp akciğer makinesini 1937 yılında Gibbon icat etmiştir (35). Kalp ve akciğerlerin devre dışı bırakıldığı ve dolaşımın kalp akciğer makinası ile sürdürüldüğü bu duruma ekstrakorporeal dolaşım, yapılan işleme ise “kardiyopulmoner bypass” denir. Kardiyopulmoner bypass ve ekstrakorporeal dolaşım, açık kalp cerrahisinin yanısıra bazı intrakranial ameliyatlarda, kan değişimi uygulamalarında (eritroblastosis fetalis), pulmoner embolektomide, akciğer, karaciğer, böbrek gibi organ transplantasyonlarında, venakavanın rezeksiyonu sırasında, donma nedeniyle hastanın ısıtılmasında ve kemoterapötiklerin verilmesi sırasında izole ekstremite perfüzyonunda da kullanılabilen bir yöntemdir (36).
Koroner arter bypass yapılacak damarın darlığı kural olarak; kesit alanı %70 ya da anjiografide %50’den fazla olmalıdır. Aksi taktirde doğal koroner akım baskın olacağı için (competition) greft açıklığı tehlikeye girecektir (37). Çok damar koroner arter hastalığında miyokardın revaskülarizayonu için cerrahi tedavi en etkili ve uzun süreli bir çözümdür (2). Cerrahi sonuçlar kısa ve orta dönemde iyi iken uzun dönemde greft yetmezliğinden etkilenmektedir (6). Koroner arter bypass cerrahisinde hedef, hastalara en uzun süre açık kalacak greftlerin seçilmesidir. Greftin seçiminde hastanın yaşı, klinik durumu yanında kullanılacak greftin çap, uzunluk, duvar kalınlığı ve ateroskleroz gelişme insidensi gibi biyolojik özellikleri ve greft bulunabilirliği de tercihte belirleyici olmaktadır (2). Greftlerde bypass sonrası gelişen stenoz ve oklüzyon nedeniyle oluşan greft yetmezlikleri, greftin uzun
dönem açıklık oranlarını etkilemektedir. Aortokoroner bypass greftlerin cerrahi girişim sonrası ilk 3 ayda tıkanma hızları %7-12, birinci yılda %10-20 arasındadır ve yıllık %2-5 oranında ilerler. Beşinci yılda aortokoroner bypass greftlerin %25’i, onuncu yılda ise %35’i tıkanır (7). Bypass greftlerde cerrahi tekniklerle de yakından ilişkili olan; kötü distal geri akım, hiperlipidemi, vazokonstriksiyon ve vazospazm, greft iskemisi, uygunsuz greft hazırlama, saklama tekniği ve anastomoz tekniği gibi predispozan faktörler koroner arter bypass operasyonundan sonraki erken dönem komplikasyonlarından sorumludur (38).
Günümüzde çok sayıda merkezde, cerrahın tercihine göre farklı greft seçimleriyle revaskülarizasyon prosedürleri uygulanmaktadır. Koroner arter bypass greftlerinde kullanılan arteriyel greftler; İTA (sol ve sağ İTA), RA, gastroepiploik arter, inferior epigastrik arter, ulnar arter, splenik arter, inferior mezenterik arterdir. Venöz greftler ise; VSM, vena safena parva (VSP) ve sefalik vendir (Tablo 1). En sık kullanılan greftler, VSM, İTA ve RA’dir. Safen ven; hızla çıkarılabilmesi, hazırlanmasının kolay olması, mükemmel bir akım sağlayabilmesi ve spazm olmaması gibi özelliklerinden dolayı koroner arter bypass cerrahisinde ilk günden beri kullanılmaktadır. Ancak distal ve proksimal çaplar arasında çap uyumsuzluğu, varikozite, skleroz ve özellikle obez, diyabetik ve periferik vasküler hastalığı olanlarda bacak yaralarında iyileşmeme gibi problemlerle karşılaşılabilmektedir (2,3). Ayrıca ven greftlerinin, progresif intimal hiperplazi ve ateroskleroz nedeniyle tıkanmaya başlaması çok erken dönemlerde ortaya çıkar. Endotel hasarı greft başarısızlığında en büyük neden gibi görünmektedir. Bu hasar venin cerrahi olarak çıkartılması sırasında yapılan aşırı germe, kaba cerrahi travma uygunsuz solüsyonlarla şişirme ve bekletme veya anastomoz öncesi vücut dışında uzun süre bekletmeye bağlı serbest oksijen radikalleri ve iskemiye bağlı olarak ortaya çıkar. Endotel kaybı, intima ve mediada akut, ancak geri dönüşlü geçici inflamatuvar hücre reaksiyonu ve ödem ile sonuçlanır. Fibrin veya trombüs intimal yüzeyde toplanır. Dört ile altı haftalık bir süreçte, düz kas hücrelerinin proliferasyonu, fibroblastlar ve endotelyal hücreler, intima kalınlaşmasına neden olur (38). On yıllık açıklık oranları venöz greftler için %40 olarak bildirilmişken, İTA için bu oran %90’dır (6).
Tablo 1. Koroner Arter Bypass Operasyonlarında Kullanılan Greftler (39)
Arteryel Greftler Otogreft olanlar
İnternal torasik arter Sağ gastroepiploik arter İnferior epigastrik arter Radial arter Splenik arter Interkostal arter Subskapular arter Venöz Greftler Otogreft olanlar
Vena safena magna Vena safena parva Sefalik ve basilik venler
Otogreft olmayanlar
Homogreft vena safena magna
Umbilikal ven
Artifisyel greftler PTFE, Dacron, Bovin İTA
İTA: İnternal torasik arter, PTFE: Politetrafloroetilen BÜYÜK VE KÜÇÜK SAFEN VEN
Alt ekstremitelerde venöz dolaşım; yüzeyel, derin ve bunları birbirine bağlayan perforan venler olmak üzere 3 ayrı sistemden oluşur (40). Yüzeyel venler, VSM ve VSP olarak bilinir. Yüzeyel venler membranöz fasyanın üstünde seyrederler ve derin venler gibi kas kompartmanında yer almadıkları için destek dokusundan yoksundurlar. VSM ayak dorsalinde v.marginalis medialis’in devamı olarak dorsal venöz arkdan başlar, iç malleol önünden geçip, baldır iç yüzünde ilerleyerek popliteal boşluğun posteromedial kenarından uyluk iç yüzüne gelir. Buradan yukarı çıkarak yüzeyel inguinal bölgede fossa ovalisten femoral vene dökülür (40). VSM, v.communicans’lar aracılığı ile VSP ile v.perforans’lar yardımıyla da derin venöz sistemi ile bağlantı kurar (41) (Şekil 1).
Şekil 1. Vena safena magna (42)
Postero-medial uyluk veni ve antero-medial uyluk veni gibi diğer dallar kasığın yakınlarında safen sistemde sonlanır. Bu venlerden her biri bulundukları bölgelerde variköz kümelere dönüşebilir (40).
Vena safena parva ise ayak lateralindeki dorsal venöz arktan başlayarak baldır orta kesiminden yukarı çıkar ve VSM’ den farklı olarak derin fasyayı penetre ederek popliteal vene dökülür. Variköz venlerin oluşumunda VSP’den daha çok VSM sorumludur (40).
Yüzeyel venlerde distalde kapakçık sayısı proksimale göre fazladır. Bileşke bölgelerindeki kapakçıklar daha kuvvetli olup, kapakçık içeren kısımlardaki ven duvarında belirgin sinüzoid genişlemeler vardır. VSM’de en az 6 kapakçık vardır. Bunlardan biri, olguların %85’inde safeno-femoral bileşkenin 2-3cm distalindedir. VSP’de ise kapakçıklar birbirine yakın olup sayıları 4-13 arasında değişir (40). Venöz sistemin ısı regulasyonu, taşıma, muskulo-venöz pompa yanında diğer önemli bir görevi de kan depolamadır (43).
Venöz sistem volümü arterden üç kez daha fazla olup total kan volümünün %64’ünü oluşturur (43). Alt ekstremite yüzeyel venler ise bu volümün % 15-20’sini oluştururlar. Böylece kolay ulaşılabilir olması ve düşük volüm kapasitesi nedeniyle çıkarılmaları sonrasında komplikasyon çok az görülebilir. Bu yüzden alt ekstremite yüzeyel safen venleri koroner arter bypass ve periferik damar cerrahisinde sıklıkla kullanılır.
Vena Safena Magna, ven greftleri içerisinde en yaygın kullanılan grefttir. Uzun dönem sonuçları açısından 5 yıllık patensi oranları LAD pozisyonunda %80’lerde, diğer damarlarda %60’lar düzeyindedir (44-46). Bacak venleri uygun olmadığında, kol venleri en son çare olarak kullanılabilir (47). Venler histolojik yapılarından dolayı arterlerden farklı özelliklere sahiptirler. Bu farklılık ven duvarının sistemik basınca arter duvarı kadar dayanıklı olmaması, kandan venlere lipid geri alınımı, venlerde lipid sentezinin daha aktif olması ve lipid yıkım hızının daha yavaş olması şeklinde özetlenebilir (48-50). Bu özellikler venlerde intimal hiperplazi ve aterosklerozun daha hızlı gelişimine yol açar.
Vena safena magna çıkarılırken, damarın travmatize etmeden çıkarılmasına dikkat edilmelidir. Ven duvarında oluşabilecek hasar, intimal hiperplazi gelişimine yol açarak greftin erken dönemde stenozuna neden olan en önemli faktördür (8-10). Bu yüzden damar adventisyadan tutulmalı tam kat manüplasyondan ise kaçınılmalıdır. Yan dalların kapatılması ince 4/0 ipek veya klipslerle, damar duvarını distorsiyona uğratmadan 1-2mm mesafeden yapılmalıdır. Ven grefti çıkarıldıktan sonra dengeli elektrolit solüsyonları içerisinde saklanmalıdır. Bazı cerrahlar saklama solüsyonları içerisine heparinize kan ve papaverin de koymaktadırlar. Bir diğer önemli nokta da saklama süresidir. Genellikle çalışmalar bir saate kadar olan iskemik sürenin iyi tolere edildiğini, bir saatten sonra endotel hasarının gelişmeye başladığını göstermektedir (51,52). Ven greftinin çıkarıldıktan sonra distansiyonu oluşabilecek damar spazmalarını önleyen bir faktördür. Burada dikkat edilmesi gereken nokta çok yüksek basınçla distansiyondan kaçınmaktır. Bu durum endotel hasarına yol açan diğer önemli bir faktördür (53,54). Bazı cerrahlar bu durumu önlemek amacıyla arteriyel kanüle bağlanan bir hat vasıtası ile sistemik arteriyel basınçta ven dilatasyonunu yaparlar.
Son olarak ven grefti hazırlanırken dikkat edilmesi gereken diğer bir faktör cilt insizyonları ve enfeksiyonudur. Özellikle şişman hastalarda bacak enfeksiyonları sıkça ortaya çıkmakta ve bu durum hasta açısından sorun teşkil etmektedir. Bu durumun önlenebilmesi için yara çok dikkatli kapatılmalı, hematom oluşumu önlenmeli, multipl insizyonlar ile ven grefti çıkarılmalıdır. Son yıllarda gündeme gelen endoskopik ven çıkarılması yöntemi ile yara problemlerinin daha az ortaya çıktığı gözlenmiştir (55).
Ven greftlerinin %10-15’i ilk bir ay içerisinde tıkanmaktadır. Bir yıl içerisinde ise bu orana ilaveten %5-10 oranında tıkanma görülür. İlk bir yıl içerisindeki stenozlarda distal anastomozdaki teknik hata, greftin kısa olması ve buna bağlı anastomoz hattında oluşan gerilim, ven grefti hazırlanırken oluşan endotel hasarı ve buna bağlı gelişen erken dönem intimal hiperplazi en önemli rolü oynar (56-59). Bu dönemde kardiyopulmoner bypass’a bağlı gelişen trombosit aktivasyonu ve hiperkoagulabilite ve kan akımında oluşabilecek staz diğer önemli faktörlerdir (11). İlk bir yıldan sonra fibröz intimal hiperplazi, greft stenozlarında en önemli faktör olarak karşımıza çıkar. Araştırmalar fibröz intimal hiperplazinin ameliyat sonrası altı hafta içinde gelişmeye başladığını gösterse bile bu tablo ilk bir yılda sonra belirgin hale gelir. Bir ile beş yıl arasındaki dönem ven greftleri açısından “altın dönem” olarak adlandırılır. Bu dönemde ven greftleri yılda %2-3 oranında stenoza uğrar. Bu dönemde fibröz intimal hiperplazi genelde stabil kalır ve daha çok ateroskleroz ön plana çıkar. Beş yıldan sonra, ven greftleri yılda %5 oranında stenoza uğrar ve bu dönemde ana pataloji ateroskleroz olarak karşımıza çıkar. Bu oranlar dikkate alındığında ven greftlerinin yaklaşık %50’si on yıl içerisinde stenoza uğramaktadır. Bununla beraber VSM günümüzde hala en çok tercih edilen konduitlerden biri olarak birçok cerrah tarafından yaygın olarak kullanılmaktadır. Ven grefti stenozunu önlemek amacıyla erken dönemde antitrombosit tedaviye başlanmalı ve hiperlipidemi agresif olarak tedavi edilmeli, LDL kolesterol değerlerinin 100mg/dl altına çekilmesine gayret edilmelidir.
VENLERİN MORFOLOJİK VE HİSTOLOJİK YAPISI
Kan, kalbe kapiller ağdan venler arcılığı ile taşınır. Venlerin kalbe doğru ilerlerken duvarları kalınlaşır, çapları dereceli olarak artar, yaklaşık 1mm'den 4cm'ye kadar varabilen çaplarda değişik genişliklerde olabilirler. Venlerin arterlere oranla daha geniş lümenleri ve daha ince duvarları vardır. Arterlerden daha fazla sayıda olmakla birlikte yine arterlere göre duvarları daha esnek ve daha az elastiktir. Bu şekilde alınan kesitlerde, venler genellikle kollabe ve lümenleri düzensiz ve yarıklıdır. Fakat venlerin duvar yapısı ile çapları her zaman uyumlu olmayabilir. Ayrıca çok fazla varyasyon gösterir, aynı venin farklı bölgeleri dahi kendi aralarında farklılıklar gösterebilir. Arterlerde görülen musküler ve elastik doku venlerde neredeyse gelişmemiştir, oysa bağ dokusu komponentleri çok daha belirgindir (60). Venler histolojik olarak aşağıdaki tunika intima, media ve adventisya tabakalarından oluşmaktadır (60,61) (Şekil 2).
t: tunika
Şekil 2. Orta çaplı venlerin şematik diyagramı (62) Tunika İntima (Tİ)
Yapısal olarak intimal tabaka, endotel, subendotelyal tabaka ve lamina elastica internadan oluşmaktadır. Bu yapısı ile de arter duvarıyla benzerlik göstermektedir.
Tunika Media (TM)
Yapısal olarak heliks biçiminde dizilmiş düz kas hücre tabakalarından oluşmaktadır. Bu kas hücreleri arasında elastik ve kollegen lifler bulunmaktadır. Mevcut retiküler lifler çoğunlukla tip 3 kollagenden oluşmaktadır.
Tunika Adventisya (TA)
Yapısal olarak uzunlamasına dizilimli kollagen ve elastik liflerden oluşmaktadır. Buradaki kollajen, çoğunlukla tip l'dir. TA genellikle içinden geçtiği organın etrafını saran bağ dokusu ile kaynaşmaktadır. Bazı büyük ven TA’larında, kan akımının yer çekiminin karşıt yönünde oluşmasını sağlayan uzunlamasına ve dairesel düzenlenmiş kas demetleri bulunmaktadır. Bu kas demetleri aynı zamanda venin gerilmesini önlemekte ve damara direnç
kazandırmaktadır. TA, ayrıca sinir ve kapiller ağlar içerir. Venlerde en gelişmiş tabaka ise TA’dır (63) (Şekil 3).
Şekil 3. Venöz damar yapısı (42)
Endotel hücre tabakası, damarların iç yüzeyini döşeyen tek sıra yassı epital hücrelerden meydana gelir. Damar iç yüzeyini döşeyen bu endotel hücreleri, bazal lamina üzerinde bulunmaktadır. Endotelin hemen altında seyrek düz kas hücreleri içerebilen gevşek bağ dokusunun oluşturduğu subendotelyal tabaka bulunur (Şekil 4).
Venöz kapakçıklar, küçük ve orta boy venlerde iki endoteliyal kıvrım konkavitesinden meydana gelmişlerdir. Fibroelastik tabaka içerirler ve bu tabaka ise kapakçıkların sıkılığını sağlar. Venöz kapakçıklar, elastik bağ dokusuna sahiptirler ve dıştan iki tarafta da endotel ile kaplıdırlar. Lamina elastica interna, arterlere göre ven duvarlarında çok daha az gelişmiştir. Bu yüzden ven duvarı kapakçık bölgesinde daha incedir (64). Kapakçıkların açılımı akım yönüne doğrudur. Görevleri ise reflüyü önlemektir (Şekil 5).
Şekil 5. Venöz Kapakçık Fonksiyonu (42)
Vasküler duvarlar, vasa vasorum denilen kendi besleyici damarları ile donatılmıştır. İyi gelişmiş media tabakasına sahip büyük damarlarda, intima besin materyalini mikrovaskulatuarda olduğu gibi sadece luminal kandan diffüzyon yoluyla almaz, bunun yanında beslenme adventisyada ve bazı arterlerde medianın dış katmanında bulunan vasa vasorumlarla sağlanır. Duvarın geri kalan kısmı ise diffüzyonla beslenir. Venlerin vasa vasorumları daha bol olmakla birlikte intimaya arterlerin vasa vasorumlarından daha çok penetre olurlar (65).
VASKÜLER ENDOTELYAL HÜCRELER
Vasküler sistemde bütün damarlar bazal membran üzerine oturmuş olan devamlı bir endotelle döşelidir. Endotel, tek tabaka poligonalden, romboid veya elipsoide değişen şekillerdeki hücrelerden oluşur. Damarın longitudinal ekseni boyunca dizilen bu endotel
hücrelerinin eni 15μm boyu ise 25-30μm'dir. Endotel hücresi şişkin nükleusa sahiptir. Endotel hücreleri metabolik fonksiyonları çok olan hücre grubu olmasına rağmen, diğer hücre ve dokulara nazaran daha düşük bir biyokimyasal aktivitesi mevcuttur. Bu hücrelerin düşük biyokimyasal aktivitesini, az sayıda serbest ribozom, az miktarda endoplazmik retikulum ve küçük bir Golgi kompleks varlığı yansıtmaktadır. Sitoplazmada bol miktarda 9-11nm çaplı mikroflament gözlenmesi bu hücrelerin kasılabilir olduklarını düşündürmektedir. Endotel hücreleri, sitoplazmalarının üst üste binmiş konumlarıyla kiremit çatı şekli görünümündedirler.
Endotel hücreleri arasında birtakım bağlantı yerleri vardır. Ara bağlantılar, interselüler iletişimin gerçekleştiği bölgelerdir. Sıkı bağlantı yerleri ise hücreler arası madde alışverişinde rol oynar. Yarı geçirgen bir membran olarak endotel, arteriyel duvar içine ve kapillerlerin ve venüllerin duvarları içinden küçük ve büyük moleküllerin geçişlerini kontrol eder. Endotel hücreleri, kan ve dokular arasındaki etkileşimde aktif bir katılımcıdır (66,67).
Endotel hücreleri "iletişimi baskılanmış" hücre gruplarından biridir. Bu hücreler hasar sonrasında gelişen kayıp hücrenin yerini birbirleri vasıtasıyla kaynaşarak kapatma yeteneğinden yoksundurlar. Oluşan bu hücresel hasar, kayıp hücrelerin kenarlarındaki ve hemen yakınındaki hücrelerle telafi edilir. Bu mekanizma yakın komşuluktaki hücrelerin hem bölünmelerini, hem de mevcut boşlukları doldurmak için göç etmelerini zorunlu hale getirmektedir. Bu olay, özellikle aterogenez sürecinde rol oynamaktadır. Vazoaktif maddeleri salgılama yoluyla, vasküler düz kas hücre relaksasyonu ve plateletlerin proagregatuar ve antiagregatuar davranışları arasındaki dengeyi koruyarak antitrombotik özelliklerin sağlanmasında görev almaktadır (68). Kapiller endotel hücrelerinin bazı metabolik işlevleri de vardır. Bradikinin, serotonin ve prostaglandinlerin biyolojik inaktivasyonunu gerçekleştirirler. Ayrıca trombositlerin damar duvarına yapışmasını engelleyen bir madde olan prostasiklini sentezlemektedirler (69).
Eskiden sadece mekanik bir bariyer olduğu düşünülen endotel hücrelerinin bugün vasküler tonus, permeabilite, transport, inflamasyon ve koagülasyon gibi pek çok olayın içinde aktif olarak yer aldığı bilinmektedir. Endotel hücreleri çok çeşitli mediyatörler sentezleyerek bu olaylara katılır ve inflamasyon, tromboz veya damar hasarını izleyerek hücreler arası iletişim ve etkileşimi yönetirler. Sağlıklı bir damar duvarı için sağlıklı bir endotel hücre tabakasına gereksinim olduğu açıktır. Endotel hücrelerinin mekanik veya fonksiyonel bütünlüğünün bozulması vasküler hasarın başlaması ve sürdürülmesine neden olan pek çok sayıda patofizyolojik mekanizmayı tetikler (70).
Endotelyal disfonksiyon, yapısal olarak sağlam olan endotel hücrelerinin çeşitli uyaranlara bazı fonksiyonlarında ayarlama yaparak ve yeni özellikler kazanarak cevap vermesidir ve sıklıkla çevresel uyarılara cevap olarak oluşan, endotel hücrelerinin fonksiyonel durumunda potansiyel olarak geriye dönüşlü değişiklikleri tanımlamada kullanılır. Endotelyal disfonksiyonda, vazodilatör ve vazokonstrüktörlerin endotelyal üretimi arasındaki denge bozulmuştur. Endotel hücreleri birçok stimulusla en çok da sitokinlerle aktive olarak endotelyal lökosit adhezyon molekülleri, büyüme faktörleri, sitokinler ve vazoaktif meditörlerin indüksiyonunu sağlarlar (67).
Günümüzde endotel disfonksiyonunun kardiyovasküler risk faktörlerine yanıt olarak ortaya çıkıp, aterosklerozun gelişimine öncülük ettiği düşüncesi herkes tarafından kabul edilmektedir. Yayınlanmış bilgiler ışığında, endotel disfonksiyonu, risk faktörleri ile aterosklerotik yük arasındaki köprü olarak değerlendirilmekte ve aterosklerozun erken ve geç dönem mekanizmalarını uyararak plak oluşumunda aktif rol oynamaktadır (71).
Endotel, damar yapısının korunmasında, en önemli homeostatik düzenleyicidir. Endotelin en önemli görevleri vazodilatasyonun sağlanması, düz kas hücre büyümesinin ve inflamatuvar yanıtın baskılanmasıdır. Bu görevler büyük ölçüde en önemli endotelyal vazodilatör olan nitrik oksit, prostasiklin ve bradikinin tarafından sağlanmaktadır. Endotel hasarı, vazodilatasyon ve vazokonstriksiyon arasındaki dengeyi bozar ve aterosklerotik süreci başlatarak hızlandırır. Endotel disfonksiyonu bu yönüyle, ateroskleroz belirteci olarak da kabul edilebilir. Nitekim aterosklerotik risk faktörleri endotel disfonksiyon etiyopatogenezinde de rol oynar (72).
Endotelyal fonksiyon, özellikle arterlerde ateroskleroz gelişimini etkileyebilir (73). Majör kardiyovasküler risk faktörleri endotelyum bağımlı vazoaktif homeostazisi etkilemektedir. Diyabet, hipertansiyon, hiperkolesterolemi gibi risk faktörlerin varlığında, vazodilatör ve vazokonstrüktör faktörlerin endotelyal üretimi arasındaki denge bozulmuştur. Bu durumda, düz kas hücre migrasyon ve proliferasyonunun kontrolü kaybolmakta ve bu durum, intimal hiperplazi ve ateroskleroz gelişmesine öncülük etmektedir. Ayrıca hipertansiyon, diyabet ve hiperkolesterolemide zedelenmiş relaksasyon ve antitrombotik kapasite vazokonstrüksiyon ve trombüs oluşumunu kolaylaştırır. Bu durum greft olarak kullanılan damarların vazospazmına, erken ve geç greft disfonksiyonu ve yetmezliğine neden olabilir (68).
Koroner arter bypass uygulamalarında; greftin travmatik çıkartılmasından, uygun saklama solüsyonlarının kullanılmaması ve implantasyona kadar geçen sürenin uzaması
sonucu oluşan endotel hasarı, erken ve geç postoperatif dönemde greftin açıklık oranında önemli rol oynamaktadır. Endotel fonksiyonlarındaki bozulma greft açıklığının erken dönemde riske girmesi yanında greftte aterosklerozun gelişmesinde de ilk adımdır.
Erken greft başarısızlığı: Operasyondan sonraki ilk 30 gün içerisinde görülür. Hızlı greft trombozu genellikle anastomoz hattında tıkayıcı sütur, intimal flep veya greftin kendi üstüne katlanması gibi nedenlerle ortaya çıkar. Tüm greft başarısızlıklarının %5’inden az bir sıklıkta görülür (7).
Orta dönem greft başarısızlığı: Özellikle anastomoz bölgesinde ve greft duvarında ilk iki yıl içinde görülen fibröz hiperplazi nedeniyle ortaya çıkar ve %15-20 oranında greft başarısızlıklarından sorumludur. Fibröz hiperplazi gelişimi (yumuşak kas hücrelerinin intimaya göçü, gelişmesi ve ekstrasellüler matriks üretimi) daha çok endotel disfonksiyonu ve/veya endotel hasarlanması ile başlamaktadır. İntimal hiperplazi greft tıkanmasına neden olmakla beraber genellikle kendi kendini sınırlayan bir süreçtir ve çoğunlukla greft konulduktan iki yıl sonrasında gelişimi yavaşlamaya başlar (7). Fibröz hiperplazi oluşumunu kolaylaştıran faktörler arasında; cerrahi travma, greft arter uyumsuzluğu, arteriyelize venin damar yüzeyinin trombozu, iyi olamayan anastomoz endotelizasyonu sayılabilir.
Geç dönem greft başarısızlığı: Beş yıldan daha yaşlı ven greftlerinde, hızlanmış ateroskleroz gelişmesi greft başarısızlığında etkendir. Bu tip ateroskleroz normal damarlarda doğal gelişimli aterosklerozdan daha şiddetli, hızlı ve belirgindir. Hızlanmış aterosklerozda T hücreleri ve makrofajların birincil rol oynadığı düşünülmektedir (7).
TROMBOZİS
Erken ve orta dönem greft trombozunun temel nedeni venin hazırlanması evresinde yapılan travmadır. Greft hazırlanırken optimal şartlar sağlansa da endotelyal ayrışmalar oluşmaktadır (74). Özellikle pedikülsüz bir biçimde çıkartıldığında safen ven, dolaşımdaki potent vazokonstriktör olan endotelin-1 (E-1)’e daha duyarlıdır. Kardiyopulmoner bypass başladığında E-1 düzeyi belirgin olarak artış gösterir. Bu da venokonstriktör cevaba neden olarak spazmla akımın azalması ve stazın artmasına yol açabilir (62).
Greft hazırlanırken oluşan spazmı gidermek amacıyla yüksek basınçla veni şişirmek endotel kaybı ve media hasarı yapabilir. Endotel kaybı luminal yüzde fibrin birikimine neden olur, erken greft açıklığını azaltan faktörlerden olan plateletler ve nötrofiller ortamda artar, doku plazminojen aktivatör üretimi azalır (12) . Endotel kaybı eksojen koagülasyon kaskatını aktive eder. Doku faktörü kardiyopulmoner bypass’a geçtikten 2 saat içinde inflamatuvar
sitokinlerce aktive endotel üzerinde yayılır. Trombomodulin normal endotelden salınan ve trombinle bağlanarak antitrombik etki gösteren önemli bir ajandır ve Protein C gibi dolaşan antikoagulanları aktive eder. Ven hazırlanırken trombomodulin aktivitesi %30’un üzerinde azalır (75).
Erken greft oklüzyonunda protrombotik faktörler etkili olduğu gibi venöz kapakların duruyor olması, anastomoz darlıkları, ateromlu bölgeye anastomozun yapılması gibi greft akımını azaltan teknik faktörler de önemlidir (62).
İNTİMAL HİPERPLAZİ
İntimal hiperplazi, ekstrasellüler matriksin ve düz kas hücrelerinin intimal kompartmanda birikmesi olarak tanımlanabilir ve implante ven greftlerinde ilk bir aydan iki yıla kadar olan dönemde gelişen majör greft hastalığıdır. Greft olarak kullanılmadan önce birçok ven orta derecede intimal ve medial fibrozis gösterebilir. Ancak arteriyel sisteme implante olan hemen tüm venlerde intimal kalınlaşma ilk 4-6 hafta içinde gelişerek lümende %25 kadar daralma yapabilir (13). Bu süreç tek başına nadiren önemli stenoza neden olur.
Akut olarak arteriyel basınçla karşılaşma sonucunda safen vende duvar stresinde artma ve endotel kaybı olur. Büyüme üzerine uyarıcı ve inhibitör pek çok faktör içeren endotel hücrelerinin tahribatı, intimal büyüme üzerindeki kontrolün kalkmasına ve intimal hiperplazi gelişmesine neden olur. Başlangıçta aktive endotel hücreleri, plateletler ve makrofajlardan salınan çok sayıda büyüme faktörleri ve sitokinlere bağlı olarak medial düz kas hücrelerinde proliferasyon gelişir. Sonra düz kas hücreleri intimaya göç eder ve daha sonra ise ekstrasellüler matriks sentezi ve depolanması gerçekleşir (76). Arterlere göre venlerde daha önemli olan vazo vazorumlardan kan sunumunun kaybı iskemik ve fibrotik sürecin devamına neden olur.
ATEROSKLEROZİS
Bypass cerrahisinden sonraki ilk yıldan itibaren iskemik belirtilerin tekrar ortaya çıkması ve safen vende oluşan zayıflamanın temel nedeni aterosklerozisdir. Nativ koroner arter hastalığı yıllık %5 oranında ilerleme gösterir ve nativ damar hastalığının ilerlemesi de iskemik belirtilerin tekrar ortaya çıkmasında önemlidir. Ancak bypass cerrahisinden sonra gelişen miyokard iskemilerinde %70-85 olguda suçlu lezyon, trombüsle yüklenmiş ven greft aterosklerozisidir (13).
Otopsi çalışmalarında, safen ven greftlerinde bypasstan sonraki ilk 1 yıl içinde ateromatöz plağa ait deliller bulunmuştur. Fakat semptomatik olgularda hemodinamik olarak önemli stenoz, greft konulduktan sonraki üçüncü yıldan önce nadir görülmektedir. Klinik olarak önemli greft stenozu belirgin olarak 5-7. yıllarda artış gösterir. Temel olarak arteriyel sistemdeki patogeneze benzemekle birlikte, venlerde histolojik ve topografik bazı farklılıklar vardır. Ven greft ateromu histolojik olarak yüksek oranda köpük hücresi, inflamatuvar hücreler ve multinükleer dev hücreler içerir. Morfolojik olarak ven greft aterosklerozisi yaygın, konsentrik ve gevrektir, fibröz kapsülleri çok zayıf veya yoktur ve yetersiz kalsifiye yapılardır. Nativ damar aterosklerozu ise proksimal, fokal, eksantrik, dayanıklı, sağlam, iyi gelişmiş fibröz kapsülü olan ve sıklıkla kalsifik ateromlardır (13). Greftlerdeki ateroskleroz gelişimi ve sonuçları, Şekil 6’da verilmiştir (77).
LDL: Düşük yoğunluklu lipoprotein
Şekil 6. Greftlerdeki ateroskleroz gelişimi ve sonuçları (77) NİTRİK OKSİT
1980 yılında ilk olarak Furchgott ve Zawadzki endotel kaynaklı gevşetici faktörün (EDRF: Endothelium Derived Relaxing Factor) vasküler tonus üzerine olan etkilerini tespit etmiştir (78). Bu çalışmada intakt ve perfüzyonu düzgün olan tavşan aort kesitlerinde noradrenalin ile oluşturulan vasokonstrüksiyonun asetilkolin ile vazorelaksasyona dönüştüğü, fakat endotel tabakası çıkarılan aort kesitlerinde vasküler düz kasın vasodilatasyon yeteneğinin kaybolduğu gözlenmiştir. Bu nedenle EDRF olarak tanımladıkları nonprostanoid
vasodilatör bir maddenin varlığına işaret etmişlerdir. Daha sonra yapılan çalışmalarda bu yeni faktörün normal endotel tarafından salındığı ve çeşitli ilaç ve ilaç dışı maddeler ile salınımının arttırıldığı gözlenmiştir (78). 1987’de Furchgott ve Vanhoutte (79) ile Ignarro (80) bağımsız olarak yaptıkları çalışmalarda NO ile EDRF’nin benzer biyolojik özellikler gösterdiklerini buldular. Palmer ve ark. (81,82) eş zamanlı biyoanaliz ve kimyasal analiz yoluyla NO ile EDRF’nin aynı biyolojik aktiviteleri olduğunu ve L arginin prekürsörleri olduğunu gösterdiler (83). EDRF ve NO’in her ikisi de nitrovazodilatör etkilerini cGMP stimülasyonuyla oluşturmaktadır. cGMP, protein kinazı aktive eder ve myozinin hafif zincirindeki defosforilasyonuna sebep olur ve böylece kas relaksasyonu gerçekleşir (14,84) (Şekil.7).
Ca+2: Kalsiyum, NOS: Nitrik oksit sentaz, GTP: Guanizin trifosfat, sGC: Guanin core
NO: Nitrik oksit, L-arg: L arginin
Şekil 7. Nitrik oksit sentazın aktive edilerek nitrik oksit sentezlenmesi ve nitrik oksitin etkisi (84)
Nitrik oksit, L-arjininin guanidin N terminalinden nitrik oksit sentaz (NOS) tarafından sentezlenir (14,83) (Şekil 8). NOS’un tip I (nöronal: nNOS), tip II (inducible: iNOS) ve tip III (endoteliyal: eNOS) olmak üzere 3 formu vardır. eNOS endotele özgüdür. eNOS ve nNOS vücutta kardiyovasküler fizyolojide rol oynayan birçok hücrede bulunur. Bu izoformlar kalsiyum (Ca+2)/kalmodilin bağımlıdır. NO yapımı endotele bağımlı relaksasyonun temelini oluşturur. Bu etki koroner, sistemik, mezenterik, pulmoner ve serebral arter ve venlerde meydana gelir (83).
Şekil 8. L-Argininden nitrik oksit biyosentezi (14)
Endotelyal NO sentezi, plateletlerin agregasyonuna ve lökositlerin adezyonuna etki eder. NO inhibisyonunu sağlayan NG-Monometil-L-Arginin (L-NMMA)’in invitro vasküler yatağa ilave edilmesi ile plateletlerin ve lökositlerin adezyonu artmaktadır (14). Eğer endotel, kan akımı ve kan basıncını sürdürmede otokrin rol oynuyorsa; endotel hasarı, kardiyovasküler hastalığa neden olacaktır (85). Fonksiyonları bozulmuş bir endotelin başlıca belirtilerinden biri, biyolojik açıdan yararlanılabilir NO düzeylerinin düşük oluşudur. Bu, NO sentezindeki bir düşme ya da lokal olarak reaktif oksijen türevlerinin (ROT) yapımının artışına bağlı NO inaktivasyonundaki bir artışın sonucu olarak ortaya çıkabilir (86).
Endotel disfonksiyonu (ED), genetik veya kazanılmış bir bozukluk olarak tarif edilebilir. ED genellikle sonradan kazanılır. Sigara ve diyetle gelişen hiperlipidemi, travma veya uzayan iskemi sonucunda bozulmuş endotel fonksiyonu, endotel bağımlı vazodilatasyonun baskılanması ve vasküler adezyonun artması ile ilişkilidir. NO ve prostasiklin gibi endotelyal faktörlerin üretimi, salınımı ve etkilerindeki bozukluk; mental ve fiziki streslerde vazodilatör tonusun azalmasına ve paradoksik vasküler cevap oluşumuna neden olur (14).
Venöz greft yetersizliğin önlenmesinde NO önemli bir rol oynar. NO’nun vazodilatasyon, antiplatelet aktivite, neointimal hiperplazi ve aterosklerozisde önemli rolü vardır. NO siklik guanosin 5-monofosfat (cGMP) oluşumunu artırır. Guanosin 5-monofosfat artışı vazodilatasyona ve trombosit agregasyonunun inhibisyonuna sebep olur. Bu etkilerine
ilave olarak nötrofillerin endotel yüzeyine adezyonunu azaltır. Aynı zamanda serbest oksijen radikallerini ortadan kaldırarak hücre koruyucu etki yaptığı da gösterilmiştir. Nitrik oksit düz kas hücre proliferasyonunu inhibe ederek neointimal hiperplaziyi de sınırlar (87). Kown ve ark. (88) L-arginin ile venöz greftlerde NO seviyesinin artışını ve neointimal hiperplazinin azaldığını göstermişlerdir.
Sonuç olarak cerrahi manüplasyonla travmatik endotelyal hücre kaybı sonucu NO’nun biyolojik etkileri kaybolur ve endotelyal hücre hasarı aterosklerozu başlatan olaylardan biridir.
CD34 ( ENDOTEL PROGENİTÖR HÜCRELER )
Endotelyal progenitör hücreler (EPH) kemik iliğinden köken alırlar. Vasküler endoteli destekler ve ateroskleroz gelişimine karşı koruyucudur. Ateroskleroz endotel fonksiyon bozukluğu ve vasküler endotelin kronik hasarlanması ile karakterizedir. Yapılan birçok çalışmada endotel disfonksiyonunun varlığı ve yaygınlığının kardiyovasküler hastalık riski ve koroner arter hastalığı olan hastalar için güçlü bir prediktör olduğu gösterilmiştir. Endotel hücre apoptozisi, nitrik oksit biyoyararlanırlılığının azalması gibi çok çeşitli moleküllerin olayda anahtar rol oynadığı düşünülmektedir. Sürekli endotel hasarına yanıt olarak endotelyal rejenerasyon için çeşitli tamir mekanizmaları devreye girer. Matür endotel hücrelerinin rejeneratif kapasitesi sınırlıdır. Dolaşan EPH’e özellikle de bunların postnatal neovaskülarizasyondaki rollerine ve endotele integre olma fonksiyonuna ilgi giderek artmaktadır. Yakın zamanda in vivo ve in vitro çalışmalarda endotelyal progenitör hücrelerin aterosklerotik plağın ilerlemesinin inhibisyonunda önemli olan hasar sonrası vasküler rejenerasyonda rolü olabileceği gösterilmiştir (89). Farelerde bu hücrelerin sistemik verilmesi ile endotel disfonksiyonu ve neointimal formasyonun azaldığı ve aterosklerotik plak progresyonun bozulduğu görülmüştür (90). Azalmış dolaşan EPH sayısı endotelyal disfonksiyon, kesinleşmiş kardiyovasküler hastalığı olmayan hastalarda yüksek Framingham risk faktör skoru ve 10-12 aylık takipte artmış aterosklerotik olay riski ile ilişkilidir (91).
Hücre kültürleri ve hayvan çalışmaları; EPH’nin, endotel disfonksiyonu ve ateroskleroz gelişiminde koruyucu rol oynadığını düşündürmektedir. Bu hücrelerin insan üzerindeki patofizyolojik rolü çok açık değildir (15). Prematür EPH’in, iskemik olaylardan sonraki anjiyogenezin yanında doku yenilenmesinde de etkili olduğu gösterilmiştir. EPH’in aynı zamanda erişkinlerde damar tamiri ile de ilişkisi olabilir. Son dönemde yapılan
çalışmalarda dolaşan EPH’nin; statin, östrojen veya egzersiz ile sayısının arttırılmasının vasküler hasar sonrası reendotelizasyonu iyileştirebileceği öne sürülmüştür (16,17).
Risk faktörlerine kronik olarak maruz kalma endotel hücrelerinde hasara neden olur ve onların yenilenmelerini gerektirir. Risk faktörleri muhtemelen EPH’nin mobilizasyonunu, hasarlı vasküler alana integrasyonunu ve anjiyogenik kapasitesini de etkilemektedir. EPH disfonksiyonu yaşlanma ve apoptozla ilişkili olabileceği gibi kemik iliğindeki havuzun tükenmesi ile de ilişkili olabilir. In vivo ortamda anjiyogenik sitokinlerin düzeyinin azalması da EPH mobilizasyonunun azalması ile lişkili bulunmuştur. Vasküler endotelial büyüme faktörü (VEBF) ve NO üretiminde yaşla birlikte azalma olduğu bildirilmiştir (92,93). Bu faktörler endotel hücrelerinin mobilizasyon, migrasyon, proliferasyon ve yaşam sürelerinin azalmasında sinerjistik etki göstermektedir.
APOPTOZİS
1972 yılında Kerr ve ark. (94) tarafından iskemiye maruz kalan dokunun etrafında nekrozdan daha farklı hücre ölümü gösterilmiş ve buna Latince sonbaharda ağaç veya çiçeklerden kuruyan yaprakların düşmesi anlamında ‘apoptozis’ sözcüğü ile adlandırılmıştır. Apoptozis ve embriyogenesis, immün repertuvarın gelişimi ve iltihabi olayların rezolusyonu gibi birbirinden farklı birçok süreçte istenmeyen hücrelerin eliminasyonu için gerekli bir olaydır (95).
Hücre ölümü nekroz ve apoptoz olmak üzere başlıca iki şekilde meydana gelir. Nekroz ve apoptoz arasında morfolojik ve biyolojik olarak belirgin değişiklikler vardır. Nekroz kimyasal ve fiziksel zarara takiben ortaya çıkan patolojik bir ölüm şeklidir. Başta mitokondriyum olmak üzere sitoplazmik organeller hasarlanır, hücre membranı selektif permeabilitesini kaybeder ve şişerek rüptüre olur. Hücre içeriği çevre dokuya yayılarak, inflamatuvar bir cevaba neden olur (96). Apoptoziste, nekrozun aksine en çarpıcı değişiklik hücre çekirdeğinde meydana gelir.
Apoptozis çok çeşitli iç ve dış uyarılar ile tetiklenebilmektedir. Örnek olarak; reaktif oksijen radikalleri, toksinler, iyonize radyasyon, çeşitli kimyasallar, kemoterapik ajanlar, ısı şoku, yaşlanma veya iskemi sonucu gelişen subletal hasarlar ve DNA hasarlanmaları hücredeki apoptotik süreci aktive edebilir. Apoptozisi indükleyen en önemli yollardan biri ölüm reseptörlerinin uyarılmasıdır. Hücreler büyüme faktörleri azlığında, hormon ve sitokinlerin sinyalleri olmadığında apoptozise giderler. Sonuç olarak çekirdekte, hücre
membranında, mitokondriyumda veya hücre içi herhangi bir bölgeden gelebilecek bir uyarı apoptozisi başlatabilir (97)
Vasküler düz kas hücrelerinin tekrar yapılanması; primer aterosklerozda, anjiyoplasti sonrasında, restenozda, vasküler travmada ve mekanik distansiyonda meydana gelebilir. Her ne kadar bu durumların tümünde şüphesiz apoptozis meydana gelse de sonuç olarak yeniden yapılanmada, vasküler düz kas hücre apoptozisin rolü önemlidir (98).
Safen ven greftindeki düz kas hücreleri apoptozisin etkisiyle erken dönemde fibröz dokuyla yer değiştirebilir. Bu karşılıklı değişim geç dönemde ise safen ven greftin dejenerasyonunda önemli rol oynar (20). Ven greftin erken dönem hasarlanmasındaki apoptotik süreçte, medial düz kas hücrelerinde önemli hasar oluşur. Bu hasarın temelinde ven greftin mediasında bulunan düz kas hücreleri, fibroblastlar ve inflamatuar hücreler önemli rol oynar (99). Mekanik distansiyon, inflamasyon ve medial iskeminin fibrozise neden olduğu ve bu medial düz kas hücre yapılanmasının programlanmış hücre ölümü (apoptozis) ile birlikte olduğu tespit edilmiştir (100).
Karabulut ve ark. (101) insan safen ven greftinin koroner bypass için hazırlanması sırasında, farklı basınçlar kullanmış, 100mmHg üzerindeki basınç uygulamalarında önemli derecede endotel hasarı oluştuğunu, 100mmHg altındaki uygulamalarda daha az endotel hasarı oluştuğunu tespit etmişlerdir. Ancak yapılan çalışmalarda ven greftlerinde mekanik distansiyon olmadan da şiddetli düz kas hücre kaybı olabileceği gösterilmiştir (99).
Sonuç olarak; vasküler düz kas hücreleri ve endoteliyal hücrelerin apoptozisi insan damarlarının gelişimi sırasında belgelendirilmiştir. Akut hasar sonrası intimal lezyonlardaki vasküler düz kas hücrelerinin döngüsünden apoptozisin sorumlu olabileceği ve medyada meydana gelen hücresel azalmaya apoptotik vasküler düz kas hücre ölümünün katkıda bulunabileceği gösterilmiştir (21).
REAKTİF OKSİJEN TÜRLERİ (SERBEST OKSİJEN RADİKALLERİ )
Yeryüzündeki bütün canlı türleri, organik moleküllerin içindeki oksijene ihtiyaç duyarlar. Fakat anaerobik canlılarda oksijen toksik etkilidir. Bunun nedeni reaktif oksijen türlerine (ROT) karşı anaeroblarda savunma sisteminin bulunmamasıdır. Oksijen anaerobik türlerde olduğu gibi, yaşamları oksijene bağımlı olan canlılarda da oksidatif hasara neden olabilmektedir (18).
Kısaca oksidan-antioksidan dengenin, oksidan lehine bozulması durumunda, oksidatif hasardan söz edilebilir. Oksidatif hasar, superoksitten kaynaklanan serbest radikaller ile nitrik oksidin reaktif türlerinin neden olduğu hasarların bir toplamıdır (18).
Serbest oksijen radikallerinin (süperoksid anyonu O2-, hidrojen peroksid H2O2,
hidroksil radikalleri OH-) doku hasarında ve çeşitli kalp hastalıklarında rolleri olduğu ileri sürülmüştür. Serbest oksijen radikallerinin, membran fosfolipidlerinin peroksidasyonuna sebep olarak sitotoksik etki gösterdiği düşünülmektedir. Bu etki membran sıvısında geçirgenliğin artışına ve membran devamlılığında kayba neden olur ve lipid peroksidasyonu ürünü olan malondialdehit (MDA) ile sonuçlanır (19) (Şekil 9). Kan ve aort dokusundaki MDA’nın artışı ile doku hasarında serbest oksijen radikallerinin rolü olduğunu düşündürmektedir.
Ca+2: Kalsiyum, DER: Düz endoplazmik retikulum, DNA: Deoksiribonükleikasit, PER: Protein
endplazmik retikulum
Şekil 9. Lipid peroksidasyonu (102)
Endotel hücreleri shear stres ve bradikinin gibi endoteliyal agonistlere yanıt olarak oksijenden türeyen serbest radikaller ve hidrojen peroksid salgılar. Süperoksid anyonları NO aktivitesi ve endotel fonksiyonu için major belirleyicidir. Süperoksid anyonları NO’yu inaktive eder. Bu durum arterlerde vasokonstrüksiyon ile sonuçlanır. ROT ayrıca damar düz kaslarında sitozolik Ca+2 mobilizasyonunu da uyarır. Kontraktil elemanların Ca+2’a
duyarlılığını arttırır. Endotel kaynaklı süperoksid anyonu NO’nun kimyasal olarak antagonistidir (103).
Vasküler dokularda oksijenden türeyen serbest radikallerin yapımı ve birikmesi mitokondriyal oksidatif metabolizma sonucu oluşur. Başka enzimler de NADH, NADPH oksidasyonu sonucu süperoksid anyonunu arttırabilir. Sitokrom P450 redüktaz ve siklooksijenaz okside lipid peroksidleri ve süperoksid anyonlarını oluşturur. Süperoksid radikallerinin oluşması; membran lipid ve proteinlerinin yapısını bozarak hücre fonksiyonunu engellemekte, çekirdek membranını hasarlayarak DNA’yı kırılma ve mutasyonlara açık hale getirmektedir. Bu şekilde hücre fonksiyon bozukluğu ve/veya ölümüne neden olmaktadır.
Süperoksid, süperoksid dismutaz (SOD) tarafından peroksidlere çevrilir. Dismutasyon reaksiyonunun ürünü hidrojen peroksidtir. Hidrojen peroksid ise Katalaz ve glutatyon peroksidaz tarafından parçalanır (19).
HEPARİN
Heparin Howell tarafından 1922 yılında bulunmuştur. Suda eriyebilen mukopolisakkarit yapısındaki bu maddeye, karaciğerde bol miktarda bulunmasından dolayı bu isim verilmiştir. Heparin, molekül ağırlığı 3000-30.000 (15.000) dalton arasında değişen bir glukozaminoglikandır. Sülfat ve karboksilik asit gruplarından dolayı kuvvetli olarak asidiktir (62).
Heparin, antitrombin III aracılığı ile koagülasyon üzerindeki etkisini ortaya koyar. Heparinin düşük dozları antitrombin III'ün, faktör X’a ve trombin üzerine olan etkilerini artırır. Aralıklı ve devamlı heparin tedavisi alanlarda, antitrombin III aktivitesi normal değerinin üçte birine kadar azalabilir. Heparin, paradoksal olarak trombotik eğilimi arttırabilir. Östrojen içeren oral kontraseptifler, antitrombin III düzeyini düşürüp, oral antikoagülan aktivitesini arttırırlar. Heparin, lipemik plazmayı lipoprotein lipazı aktive ederek berraklaştırır (62).
Heparinin yarı ömrü 100, 400, 800U/kg verildiğinde sırasıyla 1, 2 ve 3 saattir. Heparin, heparinaz tarafından karaciğerde metabolize edilir. İnaktif metabolitler idrarla atılır. Karaciğer ve böbrek yetmezliği olan hastalarda yarılanma ömrü daha da uzamaktadır.
Heparin tedavisi aktif kanaması olanlarda, hipersensitivite durumunda, hemofili hastalarında, trombositopeni, purpura, intrakranial hemoraji, aktif tüberküloz, bakteriyel endokardit, gastrointestinal ülseratif lezyonlarda, osteopeni, ağır hipertansiyon ve düşük tehdidinde kontrendikedir (104).
GEREÇ VE YÖNTEMLER
Bu çalışma için Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi (TÜTF) Etik Kurulundan 20.04.2011 tarih ve 09/14 karar no ile onay alındı (Ek 1). TÜTF Kalp ve Damar Cerrahisi Anabilim Dalı'nda, Mayıs - Haziran 2011 tarihleri arasında aortokoroner bypass ameliyatı uygulanan, 2 bayan, 8 erkek toplam 10 hasta çalışmaya rızaları alınarak dahil edildi (Ek 2).
Çalışmaya katılan hastaların ortalama yaşı 58,5 (32–77 yaş arası) idi (Tablo 2). Çalışmada bu hastalardan greft olarak kullanılması planlanan safen venlerden alınan yaklaşık 10cm’lik artık veya yan dal ven örnekleri kullanıldı.
Tablo 2. Hastaların peroperatif verileri
No Cins Yaş Greft Sayısı Safen Ven
1 E 60 5 4 2 E 65 3 2 3 E 49 4 3 4 K 62 3 2 5 E 59 3 2 6 E 61 4 3 7 E 32 3 2 8 E 60 3 2 9 K 60 3 2 10 E 77 2 1
ARAŞTIRMAYA DAHİL ETME VE ARAŞTIRMAYA ALMAMA KRİTERLERİ
• 18 yaş üstü olması
• Koroner Arter Hastalığına sahip olması
• Kardiyovasküler Cerrahi Konsey tarafından operasyon endikasyonu konması ve opere edilmesi
• Operasyon önerilip operasyonu kabul etmesi
• Operasyon için kontrendikasyon durum bulunmaması
Koroner bypass cerrahisinin klasik safen ven hazırlama tekniği ile aynı cerrahlar tarafından safen ven explore edildi. Safen ven greftin kullanılmayan distal bölgesinden atravmatik müdahaleyle 10cm kadar parçası alındı. Çıkarıldıktan sonra greft endotelini korumak için serum fizyolojik ile şişirilme işlemi yapılmadan safen parçası lümende darlık oluşturmayacak şekilde bütün yan dalları tek tek 4/0 ipekle bağlanarak hazırlandı. Hazırlanan safen ven parçasından kontrol grubu örneği greft ucundan atravmatik olarak 1cm uzunlukta alındı. Histopatolojik ve biyokimyasal olarak incelenmek üzere 0,5cm’lik iki eşit parçaya bölünerek uygun bir parçasının histopatolojik inceleme için fiksasyonu yapıldı, diğer parça -85 ’ye biyokimyasal inceleme için konuldu ve ikisi de kontrol grubu (fiksasyon) olarak sınıflandırıldı.
Kalan safen ven grefti sekiz eşit parçaya bölünerek dört tanesi Heparinli serum fizyolojik (SF) (100mL SF solüsyonu içine 1000U heparin) solüsyonu içerisine ve geri kalan dördü ise Heparinli laktatlı ringer (LR) (100mL LR solüsyonu içine 1000U heparin) solüsyonu içerisine konuldu. 15 dakika (dk) bekletildikten sonra SF’ten histopatolojik ve biyokimyasal olarak incelenmek üzere sırası ile iki parçadan biri 15 SF grubu olarak histopatolojik inceleme için fiksasyonu yapıldı, diğer parça -85 ’ye biyokimyasal inceleme için konuldu. Aynı işlem 15 LR grubu içinde tekrarlandı. Heparinli SF ve LR solüsyonlarında kalan diğer safen ven parçaları 45dk bekletildikten sonra SF’ten histopatolojik ve biyokimyasal olarak incelenmek üzere sırası ile iki parçadan biri 45 SF grubu olarak histopatolojik inceleme için fiksasyonu yapıldı, diğer parça -85 ’ye biyokimyasal inceleme için konuldu. Aynı işlem 45 LR grubu içinde tekrarlandı. Toplamda biri kontrol grubu diğer dördü deney grubu olmak üzere beş grup oluşturuldu. Fiksasyonu yapılan örnekler TÜTF Histoloji Anabilim Dalı'nda, ışık mikroskopik inceleme (IM), immünohistokimyasal inceleme
ve Tunel boyama çalışılması yapılması için hazırlandı. Derin dondurucu da -85 ’ye konulan örnekler ise İstanbul Üniversitesi Cerrahpaşa Tıp Fakültesi (İÜCTF) Biyokimya Anabilim Dalı’nda dokuda biyokimyasal parametreleri çalışılmak üzere hazırlandı.
HİSTOPATOLOJİK İNCELEME Işık Mikroskobik İnceleme
Işık mikroskobik incelemeler için alınan safen ven örnekleri, TÜTF Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı Işık Mikroskopi Laboratuvarı’nda işlemlendirildi. Bu amaçla safen ven dokuları Bouin fiksatöründe 4 gün fikse edildikten sonra yıkama işlemine geçildi. Dokular 2 gün %70’lik alkolde yıkanarak, dehidratasyon işlemine geçildi. Dokular artan alkol serilerinde (%70, 90, 96, 100) 1’er saat tutuldu. Dehidratasyon aşamasından sonra saydamlaştırma basamağı için dokular 3 seri 15’er dk toluol ile muamele edildi. Gömme işleminden önce dokular yumuşak parafinde 1 gece tutuldu. Bir sonraki gün safen ven örnekleri yumuşak parafinden alınarak 1 saat sıvı sert parafinde tutularak, bloklandı. Bu bloklardan Leica RM-2245 silindirli mikrotom kullanılarak 6μm (mikrometre) kalınlığındaki kesitler alındı. Safen ven dokusunun genel özelliklerini ortaya koyabilmek amacıyla alınan kesitler hematoksilen eozin (HE) ile boyandı.
İMMÜNOHİSTOKİMYASAL İNCELEME
İmmünohistokimyasal inceleme için safen ven örneklerinden 6μm kalınlığında kesitler alındı ve deparafinizasyon işlemini takiben kesitler suya indirildi. Suya indirilen kesitler antijen retrival içinde mikrodalga fırında 20dk kaynatıldı. Oda ısısında 20dk soğumaya bırakıldıktan sonra kesitler PBS ile yıkandı. Bu aşamadan sonra hidrojen peroksidaz aktivitesinin giderilmesi için metanolde (Riedel-de Häen 24229) hazırlanan %3’lük hidrojen peroksit (H2O2) ile 20dk muamele edildi. Distile su içinde çalkalanarak kesitler Fosfat Buffer Solusyonu (PBS; pH 7.6) ile yıkandı. Özgül olmayan antikor bağlanmalarını bloklamak üzere kesitlere %1 preimmün rabbit serum (Ultra V Block, LabVision, TA-015-UB) uygulandı. Daha sonra kesitler nemli chamber içinde 1/100 oranında sulandırılmış primer antikor ile 1 saat süre ile inkübe edildi. Kullanılan antikorlar, rabbit polyclonal eNOS antibody (ab66127, Abcam, USA), ve rabbit polyclonal CD 34 antibody (CD34-250591, Abbiotec, USA) idi. Kesitler 3 kez PBS ile yıkama sonrasında 20dk sekonder antikor solüsyonunda (Biotinylated Goat Anti-Mouse, LabVision, TM-015-BN) tutuldu. PBS’de 3 kez yıkanan kesitlere 20dk
streptavidin peroksidaz solüsyonu (Streptavidin Peroxidase, LabVision, TS-015-HR) uygulandı. Kesitlere 3 kez PBS ile yıkama sonrasında 10dk 3-amino 9 etil karbazol (AEC) kromojen solüsyonu (LabVision, TA-002-HAC) uygulaması yapıldı. Kesitler distile su ile yıkandıktan sonra 5dk Mayer hematoksilen uygulanarak zıt boyama yapıldı. Akarsuda 5dk yıkanan kesitler kapatma solüsyonu (Mounting Medium, LabVision, TA-060-UG) konarak lamel ile kapatıldı ve ışık mikroskobunda değerlendirmeye alındı.
Tüm gruplarda eNOS ve CD-34 immunreaktivitelerinin yoğunluğu semikantitatif olarak saptandı (Tablo 2). Semikantitatif değerlendirme, aşağıdaki biçimde yapıldı; yok (-), zayıf (±), hafif (+), orta (++), güçlü (+++), çok güçlü (++++).
TUNEL BOYAMA
Parafin bloklardan lam üzerine alınan 6μm’lik kesitler 1 gece 37°C’lik etüvde tutulduktan sonra toluolde 3x5dk bekletilerek parafinden iyice arındırılarak azalan alkol serilerinden (%100, %95, %70) 3’er dk geçirilip distile suya indirildi. Distile suda 5dk tutulan kesitlere daha sonra antijen iyileştirme amacıyla 15dk oda ısısında proteinaz K (20μg/ml, Chemicon, 21627) uygulandı. Distile su ile yıkanan kesitler endojen peroksidazı bloklamak için metanolde hazırlanan %3’lük H2O2’de 5dk bekletildi. Distile su ve PBS ile çalkalandıktan sonra lam üzerinde kesitlerin etrafı hidrofobik kalem (Zymed, 00-8899) ile çizilerek havuz oluşturuldu ve kesitlere 5dk oda ısısında dengeleme tamponu uygulandı. Daha sonra kesitler 37°C’de terminal deoksinükleotidil transferaz enziminde 1 saat bekletildikten sonra durdurma/yıkama tamponuyla 15 saniye çalkalandı ve oda ısısında 10dk bekletildi. PBS’de 3 kez yıkanan kesitlere antidigoksigenin konjügatı uygulandı ve oda ısısında 30dk tutuldu. Kesitlere 3 kez PBS ile yıkama sonrasında 10dk diamino benzidin (DAB) kromojen solüsyonu (LabioVisn, TA-002-HAC) uygulaması yapıldı. Kesitler distile su ile yıkandıktan sonra 10dk Methyl green uygulanarak zıt boyama yapıldı. Distile sudan hızla geçirilen kesitler %100 N-Butanolden de hızla geçirildi. Dehidrate edilen kesitler 3x2dk toluolde tutulduktan sonra kapatma solüsyonu konarak lamel ile kapatıldı ve ışık mikroskobunda değerlendirmeye alındı. Işık mikroskobunda (Olympus CX31-Japan) incelenerek, bulguların fotoğrafları çekildi.
Ayrıca tüm gruplarda TUNEL pozitif hücre sayıları semikantitatif olarak saptandı (Tablo 2). Semikantitatif değerlendirme, aşağıdaki biçimde yapıldı; yok (-), nadir (±), az(+), orta (++), fazla (+++), çok fazla (++++).
Biyokimyasal Parametreler
Doku homojenizasyonu: Daha sonra örnekler (doku ve serum) oda sıcaklığına
getirildi. Doku örnekleri hassas terazi ile tartıldı. Takiben 0,15M fosfat tamponu ile homojenize edilerek % 10’luk homojenatlar elde edildi. Homojenizasyon işlemleri +4°C’de yapıldı. Homojenizasyon işlemi bittikten sonra MDA tayini için hazırlanmış homojenatlar 3000rpm’de 10dk, NO, SOD, Katalaz için hazırlanmış olanlar ise 13000rpm’de 15dk santrifüj edilerek süpernatantlar elde edildi.
Nitrik oksit tayin yöntemi: NO, stabil metabolitleri olan nitrit ve nitrat iyonlarının
konsantrasyonlarıyla tayin edildi (Roche, Nitric Oxide Colorimetric Assay, 1756281). homejenatta bulunan nitrat, nitrat redüktaz (10U/ml), NADPH (1mM) ve FAD (0,1mM) varlığında nitrite indirgenir. NADPH fazlası piruvat (100mM) ve laktat dehidrogenaz (1500U/ml) etkinliğinde uzaklaştırılarak, ortamdaki total nitrit, Griess reaktifi (%2 sülfanilamid ve %0.2 N-naftil etilendiamin) ile reaksiyona sokulur. Oluşan pembe renkli diazo bileşiği 550nm dalga boyunda okunur.
Nitrik oksit standart eğrisi ise 6,5/3,25/1,25/1,625/0,812mg/l konsantrasyonlarındaki potasyum nitrat çözeltileriyle hazırlandı. Bütün grup örneklerinden ve paralel olarak standart çözeltilerinden 50μl kullanılarak Griess yöntemi uygulandı. Kör, standart ve deney tüplerine 90μl distile su, 10μl FAD, 50μl NADPH, 50μl nitrat redüktaz eklenerek karıştırıldıktan sonra 37°C’de 30dk bekletildi. Takiben 3μl laktat dehidrogenaz ve 25μl piruvik asit eklenerek karıştırıldı ve 37°C’de 10dk inkübe edildi. Her tüpe Griess reaktifi eklenerek 37°C’de 10dk inkübe edildi. Spektrofotometrede 550nm dalga boyunda köre karşı absorbansları okunduktan sonra, standart eğri kullanılarak sonuçlar mg/gram yaş doku olarak hesaplandı.
Malondialdehit tayin yöntemi: Lipid peroksidasyon son ürünü MDA, asit ve sıcak
ortamda tiobarbitürik asid (TBA) ile kırmızı renkli ürün oluşturur. Oluşan bu ürünün absorbansı 535nm’de okunur. Takiben 125μl homojenat 1350μl reaktif (0.25 N HCl + %0.375 TBA + %15 TCA) eklenerek tüplerin ağızları kapatıldı ve 30dk kaynar su banyosunda tutuldu. 1000g’da 10dk santrifüjü takiben süpernatant absorbansı 535nm’de köre karşı okundu. Molar ekstinksiyon katsayısı 1.56 x 105 M-1 x cm-1 kullanılarak hesaplar yapıldı ve sonuçlar mikromol/gram yaş doku olarak verildi (105).
Süperoksit dismütaz tayin yöntemi: Ksantin/ksantin oksidaz sistemiyle oluşan
süperoksit anyonları, nitroblue tetrazoliumu indirger ve bu indirgenme SOD tarafından inhibe edilir. Reaksiyon karışımı 200ml’lik bir behere hazırlandı: 40ml ksantin (0.3mM) + 20ml EDTA (0.6mM) + 20ml nitroblue tetrazolium (150μM) + 12ml Na2CO3 (400mM) + 6ml sığır serum albumini (1gr/L) konuldu ve pH’sı 10.2’ye ayarlandı.
Takiben 0.1ml süpernatant, 1ml reaksiyon karışımına konarak 0.5ml ksantin oksidaz eklendi ve 25°C’de 20dk inkübe edildi. Bu sürenin sonunda tüplere 0.05ml CuCl2 eklendi ve
560nm dalga boyunda formazan oluşumu ölçüldü. Bir ünite SOD aktivitesi, nitroblue tetrazoliumun indirgenme hızını %50 inhibe eden miktar olarak tanımlanır. SOD aktivitesi U/ml olarak hesaplandı (106). Sonuçlar U/gram yaş doku olarak verildi.
Katalaz tayin yöntemi: Modifiye Aebi yöntemi kullanıldı. Reaksiyon hızı, 240nm’de
hidrojen peroksitin absorbansındaki azalma izlenerek belirlenir.
Takiben 0.005ml homojenat + 0.395ml Fosfat Tamponu (pH: 7) + 0.2ml H2O2
karıştırılarak reaksiyon başlatıldı ve 0.dk olarak kabul edilerek absorbans ölçüldü. 30°C’de 5dk inkübe edilerek son absorbans ölçüldü (107).
kU/L Aktivite = ∆absorbans/ dk X (600/5) X 1/0.04 şeklinde hesaplandı.
İSTATİSTİKSEL ANALİZ
İstatistiksel değerlendirme, AXA507C775506FAN3 seri numaralı STATISTICA AXA 7.1 istatistik programı kullanılarak yapıldı. Ölçülebilen verilerin normal dağılıma uygunlukları tek örnek Kolmogorov Smirnov testi ile bakıldıktan sonra normal dağılım göstermediği için gruplar arası kıyaslamalarda Kruskal-Wallis varyans analizi ve sonrası ikili kıyaslamalarda Mann Whitney U testi kullanıldı.
Tanımlayıcı istatistikler olarak Median (Min-Max) değerleri ve aritmetik ortalama±standart sapma verildi. Tüm istatistikler için anlamlılık sınırı p<0.05 olarak seçildi.
BULGULAR
IŞIK MİKROSKOPİK BULGULARÇalışmamızda; fiksatif grubundaki HE boyalı safen ven kesitleri ışık mikroskobunda incelendiğinde; normal yapıda tunika intima, media ve adventisya görüldü. Endotel hücrelerinin normal yapıda olduğu izlendi. Subendotel katmanın oldukça dar olduğu ayırt edildi. İç elastik membranın girintili çıkıntılı olduğu görülürken düz kas hücreleri ve kollagen lifler normal yapıda seyrediyordu (Şekil 10).
Şekil 10. Fiksatif grubuna ait histolojik görünüm (Hematoksilen Eozin, X200)
HE boyalı 15 LR grubundaki safen ven kesitleri ışık mikroskobunda incelendiğinde; endotel, subendotel, internal elastik membranın ve kas dokunun oldukça korunduğu ve
