T.C.
EGE ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ GÖZ HASTALIKLARI ANABİLİM DALI Anabilim Dalı Başkanı: Prof. Dr. Filiz AFRASHİ
OTOLOG SERUM GÖZ DAMLASINDA BULUNAN EPİTELYOTROFİK FAKTÖRLERİN STABİLİTESİ VE OTOLOG SERUM GÖZ DAMLASININ
MİKROBİYAL KONTAMİNASYONA KARŞI DAYANIKLILIĞI
UZMANLIK TEZİ Dr. Zerrin ALKAN
TEZ DANIŞMANI Prof. Dr. Sait EĞRİLMEZ
II T.C.
EGE ÜNİVERSİTESİ
EGE ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ GÖZ HASTALIKLARI ANABİLİM DALI Anabilim Dalı Başkanı: Prof. Dr. Filiz AFRASHİ
OTOLOG SERUM GÖZ DAMLASINDA BULUNAN EPİTELYOTROFİK FAKTÖRLERİN STABİLİTESİ VE OTOLOG SERUM GÖZ DAMLASININ
MİKROBİYAL KONTAMİNASYONA KARŞI DAYANIKLILIĞI
UZMANLIK TEZİ Dr. Zerrin ALKAN
TEZ DANIŞMANI Prof. Dr. Sait EĞRİLMEZ
III ÖNSÖZ
Uzmanlık eğitimim süresince bilgi ve deneyimlerini hiçbir zaman esirgemeyen, eğitimim ve tezimin hazırlanmasındaki katkılarından dolayı değerli hocam ve tez danışmanım Prof. Dr. Sait Eğrilmez’e, bilgi ve deneyimlerini paylaşarak emeklerini harcayan sayın hocalarım; anabilim dalı başkanımız Prof. Dr. Filiz Afrashi’ye, Prof. Dr. Jale Menteş’e, Prof. Dr. Ayşe Yağcı’ya, Prof. Dr. Cezmi Akkın’a, Prof. Dr. Süheyla Köse’ye, Prof. Dr. Halil Ateş’e, Prof. Dr. Tansu Erakgün’e, Prof. Dr. Önder Üretmen’e, Doç. Dr. Melis Palamar Onay’a teşekkürlerimi sunarım.
Eğitimime büyük katkıları olan sayın uzmanlarım Dr. Serhad Nalçacı’ya, Dr. Suzan Güven Yılmaz’a, Dr. Elif Demirkılıç Biler’e, Dr. Zafer Öztaş’a, Dr. Özlem Barut Selver’e, göstermiş oldukları sabır ve hoşgörüden dolayı teşekkür ederim.
Tezimi hazırlamamdaki destekleri için Enfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı öğretim üyesi Doç. Dr. Oğuz Reşat Sipahi’ye ve Biyokimya Anabilim Dalı öğretim üyesi Prof. Dr. H. Hakan Aydın’a teşekkür ederim.
Beraber görev yaptığım dostluklarını unutmayacağım sevgili asistan arkadaşlarıma, klinik sekreterimiz sayın Zuhal Esenkan’a, hemşirelerimize, teknisyenlerimize ve personelimize teşekkürlerimi sunarım.
Hiçbir zaman sevgi ve desteğini esirgemeyen babama, artık aramızda olmayan ama her zaman yanımda olduğunu hissettiğim, karakterimin oluşmasındaki en önemli kişi olan biricik anneme, hep örnek aldığım ve gurur duyduğum, bana her zaman güvenen ve destek olan ablama, sevgisi ve desteği ile en sıkıntılı anlarımda yanımda olan eşime sevgi ve teşekkürlerimi sunarım.
IV İÇİNDEKİLER ÖNSÖZ ... III İÇİNDEKİLER ... IV ÖZET... VI ABSTRACT ... VII KISALTMALAR ... VIII TABLO LİSTESİ ... IX A. GİRİŞ VE AMAÇ ... 1 B. GENEL BİLGİLER ... 4
1. Oküler Yüzey Ve Gözyaşı Filmi ... 4
1.1. Gözyaşı Film Tabakası ... 4
1.1.1. Lipid Tabaka ... 4
1.1.2. Aköz Tabaka ... 5
1.1.3. Müsin Tabaka ... 7
1.2. Kornea ... 7
1.3. Konjonktiva ... 11
2. Kornea Fonksiyonları Üzerine Etkili Büyüme ve İyileştirme Faktörleri ... 11
2.1. Epidermal Büyüme Faktörü ... 12
2.2. Transforme Edici Büyüme Faktörü-β ... 13
2.3. Keratinosit Büyüme Faktörü ... 13
2.4. Hepatosit Büyüme Faktörü ... 14
2.5. Platelet Kaynaklı Büyüme Faktörü ... 14
2.6. Fibroblast Büyüme Faktörü ... 14
2.7. Sinir Büyüme Faktörü ... 15
2.8. Fibronektin ... 15
2.9.Diğer Büyüme Faktörleri: İnsülin-benzeri Büyüme Faktörü, Kemik Morfogenik Proteini, Vasküler Endotelyal Büyüme Faktörü ... 15
V
3. Kan Ürünü Gözyaşı Takviyeleri ... 17
3.1. Serum ... 17
3.2. Kordon Kanı Serumu ... 24
3.3. Trombosit Süspansiyonları ve Trombosit Jelleri ... 24
3.4. Albumin ... 25
3.5. Plazma ... 26
C. GEREÇ VE YÖNTEM ... 27
1. Otolog Serum Hazırlanması ... 27
2. EGF, TGF-β1, TGF-β2 ve Fibronektin Düzeylerinin Belirlenmesi ... 27
3. Mikrobiyal Kontaminasyonun Değerlendirilmesi ... 28
4. İstatistiksel Analiz ... 29
D. BULGULAR ... 30
1. Epitelyotrofik Faktörlerin Düzeyleri ... 30
2. Mikrobiyal Kontaminasyonun Değerlendirilmesi ... 30
E. TARTIŞMA ... 32
F. SONUÇ ... 38
VI ÖZET
Amaç: Otolog serum göz damlasında bulunan epitelyotrofik faktörlerin değişik saklama koşullarında stabilitesinin ve otolog serum göz damlasının mikrobiyal kontaminasyona karşı dayanıklılığının değerlendirilmesi amaçlanmıştır.
Gereç ve Yöntem: Sağlıklı 13 gönüllüden alınan kan örnekleri ile prezervan madde içeren yapay gözyaşı ve dengeli tuz solüsyonu (BSS) kullanılarak % 20 konsantrasyonda olmak üzere iki farklı şekilde otolog serum göz damlası hazırlandı. Yapay gözyaşı ile hazırlanan otolog serum göz damlasında bulunan epitelyotrofik faktörlerin (Epidermal büyüme faktörü, EGF; transforme edici büyüme faktörü β1, TGF-β1; transforme edici büyüme faktörü β2, TGF-β2 ve fibronektin) konsantrasyonları 1. günde ELISA yöntemi ile ölçüldükten sonra örnekler hem 4°C’de saklanarak 15. günde ve 1. ayda, hem de -20°C’de saklanarak 1. ve 3. ayda ayrı ayrı epitelyotrofik faktör ölçümü için kullanıldı. Yapay gözyaşı ve BSS ile hazırlanan ve 4°C’de saklanan damlalardan sırasıyla 1., 4., 7., 14., 20. ve 30. günlerde; -20°C’de saklananlardan ise 1., 3. ve 6. aylarda kültür örneği alındı. Bunun yanında gerçek hayattaki durumu değerlendirmek amacıyla oküler yüzey hastalığı nedeniyle otolog serum damla ile tedavi edilen 43 hastanın poliklinik kontrolüne geldiği andaki kullanmakta olduğu damlalardan alınan örnekler mikrobiyal kontaminasyon açısından değerlendirildi.
Bulgular: Sağlıklı gönüllülerden hazırlanan otolog serum göz damlalarındaki epitelyotrofik faktörlerin 4°C’de 1 ay ve -20°C’de 3 ay boyunca stabil kaldığı saptandı. Ayrıca 4 °C’de saklanan otolog serum göz damlalarında 1 ay ve -20°C’de saklananlarda ise 6 ay boyunca mikrobiyal üreme olmadığı gözlendi. Bunun yanısıra 43 hastanın kullanmakta olduğu otolog serum damlalarından alınan örneklerin birinde (%2.32) küf mantarı (Alternaria türleri) ve Klebsiella oxytoca üredi.
Sonuç: Saklama koşullarına uyulduğu sürece otolog serum göz damlası 3 ay boyunca stabil kalabilmektedir. Otolog serum göz damlası kullanan hiçbir hastada oküler enfeksiyon bulgusu izlenmemiştir. Ancak hastalarda damlaların kontaminasyonuna bağlı gelişebilecek oküler enfeksiyon riski akılda tutulmalıdır.
VII ABSTRACT
Aim: Aim of this study was to investigate the stability of epitheliotropic factors in autologous serum eye drops in different storage conditions and to evaluate resistance of autologous serum eye drops to microbial contamination.
Method: After obtaining blood from 13 healthy volunteers, supernatant serum was diluted with artificial tear drop and balanced salt solution (BSS) to 20%, creating to two different autologous serum eye drops. The concentrations of epitheliotropic factors (Epidermal growth factor, EGF; transforming growth factor-beta1, TGF-β1; transforming growth factor-beta2, TGF-β2 and fibronectin) in those autologous serum eye drops preparations were determined ELISA at baseline and after different storage conditions: at 4°C for 15 days and 1 month; and at −20°C for 1 and 3 months. Samples were collected for culture at the day of preparation and then on the 4, 7, 14, 20, and 30 th day from eye drops stored at 4° C and 1, 3 and 6 months stored at -20° C. Also, to evaluate real life conditions, samples were collected for culture from eye drops of 43 patients being treated for ocular disease with autologous serum eye drops during rutin clinical follow-up.
Results: Epitheliotropic factors in autologous serum eye drops were stable at 4° C up to 1 month and at -20° C up to 3 months. None of autologous serum eye drops which were obtained from 13 healthy volunteers showed any microbial contamination. Only one (2.23%) sample from 43 patients autologous serum eye drops had positive
culture for mold (Alternaria species) and Clebsiella oxytoca.
Conclusion: Autologous serum eye drops can be sufficiently stable for up to 3 months, when stored properly. No ocular enfection was detected in patients using autologous serum eye drops, but the risk caused by microbial contamination of the eye drops must be kept in mind.
VIII
KISALTMALAR Ab: Antikor
Ag: Antijen
BSS: Dengeli tuz solüsyonu
bFGF: Temel fibroblast büyüme faktörü D: Dioptri
DNA: Deoksiribo nükleik asit
ELISA: Enzyme-linked immunosorbent assay EGF: Epidermal büyüme faktörü
EGFR: Epidermal büyüme faktörü reseptörü ESM: Ekstraselüler matriks
FGF: Fibroblast büyüme faktörü HGF: Hepatosit büyüme baktörü
HGFR: Hepatosit büyüme faktörü reseptörü KGF: Keratinosit büyüme faktörü
Ig A: İmmunglobulin A Ig G: İmmunglobulin G Ig M: İmmunglobulin M
IGF: İnsülin-benzeri büyme faktörü MUC: Müsin benzeri glikoprotein NGF: Sinir büyüme faktörü
PDGF: Platelet kaynaklı büyüme faktörü SOK: Stabilize oksikloro kompleks
TGF-β: Transforme edici büyüme faktörü-β VEGF: Vasküler endotelyal büyüme faktörü
IX
TABLO LİSTESİ
Tablo 1: Serum ve gözyaşının biyokimyasal özellikler açısından karşılaştırılması .. 18 Tablo 2: Otolog serum damla hazırlanması, saklanması ve kullanımındaki farklı uygulamalar ... 19 Tablo 3: Epitelyotrofik faktörlerin bazal değerleri ... 30 Tablo 4: Farklı saklama koşullarında epitelyotrofik faktörlerin konsantrasyonları .. 30 Tablo 5: Oküler yüzey hastalıkları ... 31
1
Kazan Big aydur:“Muştulık Pay Püre Big oğlun geldi” didi. Pay Püre Big aydur: “Oğlum idügin andan bileyim, sırça parmağını kanatsun, kanını destmala dürtsün, gözüme süreyin, açılacak olur ise oğlum Beyrek’dür” didi. Zira ağlamakdan gözleri görmez olmış idi. Destmalı gözine siliçek Allah Taala’nun kudretiyle gözi açıldı. Atası anası küvlediler, Beyregün ayağına düşdiler”(1).
Güncel Türkçesi:
Kazan Bey der: "Müjde Bay Püre bey, oğlun geldi! " Bay Püre Bey der: "Oğlum olduğunu şundan bileyim, serçe parmağını kanatsın, kanını mendile silsin, gözüme süreyim, açılacak olursa oğlum Beyrek’tir". Zira ağlamaktan gözleri kör olmuştu. Mendili gözüne sürünce Allah Taala’nın kudreti ile gözü açıldı. Babası anası feryat ettiler. Beyreğin ayağına kapandılar.
A. GİRİŞ VE AMAÇ
Yukarıda orjinal halini, hemen altında da güncel Türkçe ile ifadesini okuduğunuz paragraf, Dede Korkut’un Bamsı Beyrek öyküsünden alınmıştır. Gözleri ağlamaktan kör olmuş bir babanın, oğlunun mendilden süzülmüş kanını gözüne sürdükten sonra görmesinin düzeldiğini anlatmaktadır. Bu öykü, orjinali Dresden kütüphanesinde bulunan Dede Korkut Kitabı’nda yer almaktadır. Dede Korkut Kitabı, destan türü Oğuz hikâyelerinin dergisidir. Çok eskiden yaşanmış ve asırlarca Türklerin arasında yaşayıp gelişen bu destanlar, 15. yüzyılın sonları ile 16. yüzyılın başlarında yazıya geçirilmiştir.
Öykünün burada konu edilen paragrafı, bir körlük türünün kan ürünü bir sıvıyla tedavisini anlatmaktadır. Körlük ‘ağlamaktan’ meydana gelmiştir. Tedavisi de aynı kandan birinin serçe parmağından mendile akıtılıp, mendilden süzülen sıvıyı göze sürmek olarak tanımlanmıştır.
Folklorümüzde "ağlamaktan kör olmak", ağladığında dahi gözünden yaş gelmeyen ve gözleri iyi görmeyen hastaları tarif etmekte kullanılır. Tıbbi karşılığı ise ‘ağır kuru göz hastalığı’dır. Hikayede göze doğrudan kan damlası damlatılmamaktadır. Mendile silinmiş kanın pıhtılaşması kaçınılmazdır, göze
2
sertleşen pıhtı bölümünün değil, mendili ıslatan sıvı kısmı olan serum bölümünün sürülmesi mümkün ve mantıklı görünmektedir (2).
Kuru göz tedavisinde kişinin kendi kanının serumunun gözyaşı takviyesi olarak kullanımı, Fox tarafından modern tıpta ilk kez 1984 yılında gerçekleştirilmiştir (3). Ancak, bundan 15 yıl gibi uzun bir süre sonra Tsubota ve arkadaşları serumun içerdiği oküler yüzey üzerine etkili büyüme faktörlerini değerlendirerek otolog serum damla hazırlamak için bir protokol oluşturmuşlardır (4). Bu anlamda da Dede Korkut’un modern tıptan en az 5 asır önce serum ile göz yüzeyi hastalığı tedavisinden bahsettiğini söylersek, mübalağa etmiş olmayız (2).
Gözyaşı, oküler yüzeyin beslenmesini sağlamasının yanısıra immün savunması için gerekli antimikrobiyal maddeleri ve oküler yüzey epitelinin çoğalması, gelişmesi ve farklılaşması için gerekli olan büyüme faktörlerini içeren dinamik bir yapıdır. Oküler yüzey hastalıklarının nedeni ya da sonucu olarak doğal gözyaşının yetersizliği sıklıkla görülen bir durumdur. Yapay gözyaşı damlaları, konjonktiva ve korneanın neminin yerine konulması, osmolaritenin düşürülmesi ve inflamatuar debrisin uzaklaştırılması için son derece faydalıdır. Ancak, doğal gözyaşında bulunan büyüme faktörü, vitaminler ve antimikrobiyal içeriklere sahip değildirler. Bir bakıma formül mamalar ile anne sütü arasındaki farklılık da olduğu gibi, yapay gözyaşı damlalar ile doğal gözyaşı arasında da eşdeğer kabul edilmelerini olanaksız kılan içerik farkı mevcuttur (5-7). Ayrıca raf ömrünün uzatılması için sıklıkla kullanılan prezervan ve diğer katkı maddeleri toksik ve alerjik reaksiyonlara neden olabilmektedir (8). Bu nedenle oküler yüzeyin desteklenmesi amacıyla gözyaşının içeriğine yakın vücut sıvılarının kullanımı gündeme gelmiştir. Serum, pıhtılaşmış kanın pıhtısından arta kalan bölümüdür. Serum biyokimyasal (osmolalite, pH) ve biyomekanik özellikleri bakımından doğal gözyaşına benzerdir. Büyüme faktörleri ve vitaminler gibi oküler yüzey beslenmesi için gerekli maddeleri, lizozim, IgG ve komplemanlar gibi bakteriostatik bileşenleri içerir (5).
Klasik tedavinin yeterli gelmediği oküler yüzey hastalıklarında, içerdiği bileşenler bazında doğal gözyaşına çokça benzer olan kan ürünleri, eşsiz bir tedavi seçeneği olarak gündeme gelmektedir (7).
Oküler yüzey hastalıkları sıklıkla kronik seyirlidir, bu nedenle otolog serum tedavisi genellikle uzun süre verilmektedir. Uzun süreli tedavi gerekliği olan
3
hastalarda otolog serum göz damlasının saklanma süresinin uzatılması ile hastaların hastaneye geliş sıklığı ve hastane personelinin iş yükü azaltılabilir. Epitelyotrofik faktörlerin kantitatif olarak değerlendirilmesi ve saklanma koşullarında ne derece stabil kaldıklarının belirlenmesi klinik pratikte oldukça yaygın kullanılan bu tedavinin etkinliğinin değerlendirilebilmesi açısından önemlidir.
Çalışmamızdaki amacımız otolog serum göz damlasında bulunan epitelyotrofik faktörlerin stabilitesinin ve otolog serum göz damlasının mikrobiyal kontaminasyona karşı dayanıklılığının araştırılmasıdır.
4 B. GENEL BİLGİLER
1. Oküler Yüzey
1.1. Gözyaşı Film Tabakası
Gözyaşı tabakası kornea ve konjonktivanın yüzeyini nemlendirir, hava-göz arayüzeyinde düzgün optik yüzey oluşturur, kornea epiteline oksijen ve büyüme faktörleri sağlar. İçerdiği lizozim, immunglobulin ve laktoferrin gibi antimikrobiyal elemanlar sayesinde korneayı enfeksiyonlara karşı korur. Gözyaşı tabakası gözyaşı bileşenlerini ve artıkları punktumlara taşır. Normal gözyaşı hacmi 6 μl ile 7 μl arasındadır olup gözyaşı sekresyonu 1-2 μl/dakikadır. Prekorneal gözyaşı tabakası 3 tabakalı bir yapı göstermekte olup önde lipid tabakası, ortada aköz ve arkada müsin tabakadan meydana geldiği kabul edilmektedir (9-11).
1) Yüzeyel lipid tabaka (0,11 μm) 2) Orta, aköz tabaka (7 μm) 3) Müsin tabaka (0,02-0,05 μm)
1.1.1. Lipid Tabaka
Lipid tabaka, gözyaşının en dış kısmında yer alır, 0,1 μm kalınlığındadır. Meibomian, Zeiss ve Moll bezlerinden salgılanan polar ve non-polar lipitlerden oluşur. Lipid tabaka, altında bulunan aköz tabakanın buharlaşma yoluyla kaybını önler ve sürfaktan gibi etki göstererek, düzgün bir optik yüzey sağlar. Aynı zamanda, yabancı maddelere karşı bariyer vazifesi görür ve antimikrobiyal özellikler gösterir (11). Lipid tabaka, esas olarak meibomian bezlerde üretilmektedir. Meibomian bezler, farklılaşmış holokrin sebase bezlerdir. Bezler üst ve alt göz kapağının tarsal kısmında yerleşmişlerdir, tarsta dik ve birbirine paralel olarak sıralanmışlardır. Üst kapakta yaklaşık 30–40 adet, alt kapakta 20–30 adet meibomian bezi mevcuttur. Her bir bezin ağzı tarsal gri çizgi ve mukokütanöz bileşke arasında kirpiklerin hemen arkasındadır. Zeiss sebase bezleri, göz kapağı kenarında yerleşmişlerdir ve kirpik kökleri ile yakın ilişkilidirler. Moll bezleri, modifiye ter bezleridir ve kapak kenarlarında bulunurlar. Zeiss ve Moll bezleri gözyaşı tabakasına katılan lipidleri salgılarlar (9-11).
5
Lipid tabaka, polar ve nonpolar olmak üzere iki fazdan oluşur. Polar faz fosfolipidlerden, nonpolar faz ise kolesterol esterleri, hidrokarbonlar, trigliseritler ve yağ esterlerinden oluşmaktadır. Nonpolar lipidler alttaki aköz tabakanın buharlaşmasının engeller. Polar lipidler aköz arayüzünde yerleşmişlerdir. Sürfaktan özelliği göstererek aköz tabaka ile lipid tabaka arasındaki etkileşimi ve gözyaşı stabilitesini sağlarlar. Aköz tabaka içinde bulunan hidrofobik moleküllere bağlanma yeteneği olan lipokalinler ile polar lipidler kompleks oluşturarak gözyaşı stabilitesine katkıda bulunurlar (9,10,12,13). Bakteriyel enfeksiyonlar bu lipid formu bozar, serbest yağ asidi oluşumuna yol açar. Bu irritan yağ asitleri gözyaşı filmi stabilitesini azaltarak aşırı buharlaşmaya sebep olur ve kuru göz oluşumuna zemin hazırlar (13). Lipid tabakanın fonksiyon görebilmesi için, miktarının yeterli olması ve içeriğindeki lipid türlerinin oranlarının uygun olması gerekmektedir (14).
Lipid tabakanın fonksiyonları
1- Aköz tabakanın buharlaşmasını engellemek ve gözyaşı film kalınlığını korumak 2- Gözyaşı filminin düzgün dağılımını sağlamak
3- Düzgün oküler yüzey oluşturarak, net görmeye katkıda bulunmak 4- Hidrofobik bir engel oluşturarak gözyaşının taşmasını engellemek
1.1.2. Aköz Tabaka
7 μm kalınlıktadır ve gözyaşı filminin en büyük hacimli tabakasıdır. Ana ve yardımcı gözyaşı bezleri tarafından salgılanır. Refleks salınım ana gözyaşı bezinden, bazal salınım ise yardımcı gözyaşı bezleri olan Krause ve Wolfring bezlerinden yapılır. Aköz tabaka yüksek oranda (%98.2) su içermektedir. Ayrıca çeşitli sitokinleri, elektrolitleri, proteinleri, vitaminleri, antimikrobiyal maddeleri, hormonlar ve büyüme faktörlerini içermektedir. Korneanın oksijen ihtiyacı da gözyaşı tarafından karşılanmaktadır. (12,15,16).
Elektrolitler kornea epitel hücreleri ile gözyaşı tabakası arasındaki ozmotik akımı düzenler, gözyaşı pH’sini tamponlar ve membran geçirgenliğini kontrol eden enzimlerin kofaktörü olarak görev alırlar (12,15,16).
Gözyaşında bulunan başlıca proteinler; albumin, lizozim, laktoferrin, lipokalin ve immunglobulinlerdir. Gözyaşında en yüksek konsantrasyonda bulunan
6
antikor IgA’dır. Ana ve yardımcı gözyaşı bezleri ve konjonktivanın lamina propriası tarafından oluşturulur. Lakrimal bezin asiner hücreleri tarafından üretilen salgısal komponent ile sabitlenerek oküler yüzeye salınır. Salgısal komponent IgA’nın proteolitik enzimler tarafından parçalanmasını engeller. IgA; bakteri ve virüslerin mukozal yüzeye tutunmalarını engeller, bakteri enzim ve toksinlerini inaktive eder ve Opsonizasyon ve antikor bağımlı hücresel sitotoksisite ile enfeksiyonun engellenmesini sağlar. IgG, IgM, IgD ve IgE gözyaşında bulunan diğer immunglobulinlerdir. Laktoferrin, bakterilerin üremesi için gerekli olan serbest demiri bağlayarak bakteriostatik etki göstermektedir. Lizozim, gram (+) bakterilerin hücre duvarındaki muramik asit ve glikozaminler arasındaki bağı parçalayarak hücre duvarında delik açmaktadır (12,15-17).
Gözyaşında bulunan büyüme faktörleri ve sitokinler sağlıklı epitel yüzeyi için gereklidir. Kornea ve konjonktiva epitelinin çoğalmasını, göçünü ve farklılaşmasını düzenlemektedirler. Gözyaşında transforme edici büyüme faktörü-β (TGF-β), epidermal büyüme faktörü (EGF), interlokin-1α ve 1β (IL-1α ve 1β), hepatosit büyüme faktörü (HGF) ve tümör nekroz faktörü-α (TNF-α) gibi çeşitli büyüme faktörleri bulunmaktadır. Gözyaşının aköz komponentinin salgılanmasında azalma, gözyaşındaki büyüme faktörlerinin miktarında azalmaya neden olur. Bu durum, oküler yüzey sağlığının bozulmasına yol açar (12,15,16).
Gözyaşı tabakası üre, laktat, sitrat, askorbik asit ve aminoasitleri de içermektedir. Hepsi sistemik dolaşımla gözyaşına girer ve konsantrasyonları serumla paralellik gösterir.
Aköz tabakanın fonksiyonları
1- Avasküler kornea epiteline oksijen sağlamak
2- Oküler yüzey epitelinde sabit elektrolit bileşimini sürdürmek
3- İçerdiği antimikrobiyal maddeler sayesinde oküler yüzeyi enfeksiyondan korumak 4- Kornea yüzeyindeki küçük düzensizlikleri ortadan kaldırmak
5- Kornea ve konjonktiva üzerinde biriken artıkları temizlemek 6- Oküler yüzey epitel hücrelerinin fonksiyonlarını düzenlemek
7 1.1.3. Müsin Tabaka
Müsin tabaka ise gözyaşı film tabakasının en iç tabakasıdır ve 0.02–0.04 μm kalınlığındadır. Müsin, goblet hücrelerinden, limbal konjonktivadaki Manz bezlerinden ve fornikslerdeki Henle kriptlerinden salgılanır (10,12). Kornea epiteli hidrofobiktir. Müsin tarafından oluşturulan hidrofilik tabaka aköz tabakanın oküler yüzey üzerinde dağılımını kolaylaştırır. Ayrıca müsin tabaka hem bakterilerin oküler yüzeye bağlanmasını engeller hem de mukozal yüzeyde IgA toplanmasını sağlar (18).
Gözyaşındaki müsinler transmembran müsinler ve sekretuar müsinler olarak ikiye ayrılır. Transmembran müsinler, patojenlere karşı bariyer olarak görev yapan glikokaliksleri oluştururlar. Sekretuar müsinler, polimerler oluşturarak müsine viskoelastik özellik kazandırarak gözün açılıp kapanması sırasında oluşabilecek oküler yüzey hasarını önlemektedir (19).
Stevens-Johnson sendromu ve kimyasal yanık gibi hastalıklar goblet hücrelerinin veya epitelyal glikokaliksin hasar görmesine yol açabilir. Bunun sonucunda oluşan müsin eksikliği, oküler yüzeyin yetersiz nemlenmesine ve epitel hasarına yol açmaktadır (20).
Müsin tabakanın fonksiyonları:
1- Oküler yüzeyin lubrikasyonunu sağlamak
2- Hidrofobik olan kornea epitelini hidrofilik hale dönüştürerek gözyaşının oküler yüzeye düzgün dağılmasını sağlamak
3- Yüzey gerilimini azaltmak, gözyaşı filminin stabilitesini sağlamak
4- Dökülen epitel hücrelerin, yabancı cisimlerin ve bakterilerin yakalanmasını sağlamak
1.2. Kornea
Kornea, üzerini kaplayan gözyaşı filmi ile birlikte gözün başlıca refraktif yüzeyini oluşturur. Gözü enfeksiyonlara karşı ve göziçi dokuları yaralanmalara karşı korur. Kornea, avasküler ve saydam yapıdadır. Kalınlığı merkezde 520 μm, periferde 650 μm’dir. Erişkinde horizontal çapı 11.5-12 mm’dir, vertikal çapı horizontal çapından 1 mm azdır. Ortalama eğrilik yarıçapı 7,8 mm’dir. Kornea, insan gözünün
8
toplam 58.60 D olan kırma gücünün %74’üne, yani +43.25 D kırma gücüne sahiptir. Refraktif indeksi 1.376’dır (21-23).
Kornea 5 anatomik tabakadan oluşur 1- Epitel tabakası
2- Bowman tabakası 3- Stroma
4- Descement membranı 5- Endotel tabakası
Epitel tabakası: Kornea epiteli 35-50 µm kalınlığında olup tüm kornea kalınlığının 1/10’unu oluşturur. Kornea epiteli en yüzeyde yer alan non-keratinize, çok katlı skuamoz epitel yapısındadır. Kornea epitel tabakası 5-6 tabakadan oluşur. En içte bazal hücreler, üzerinde 2-3 sıra geniş kanat hücreler ve yüzeyel yassı hücreler olmak üzere üç farklı hücre tipi mevcuttur (9).
En üstte yer alan yüzeyel hücrelerin apikal yüzlerinde çok sayıda mikrovillus ve mikrofilaman bulunmaktadır. Bu çıkıntılar glikokaliks adı verilen glikoprotein yapıda filamantöz bir madde ile örtülmüştür. Glikokaliks, kornea yüzeyini hidrofilikleştirerek gözyaşı dağılımını ve stabilitesini sağlar. Yüzeyel hücreler birbirlerine zonula okludenslerle bağlıdır. Bu sıkı bağlantılar gözyaşının stromaya penetrasyonunu engeller (9,21).
2-3 sıra halinde dizilmiş poligonal kanat hücre tabakası bazal hücre tabakasının üzerini örter. Burada komşu hücreler arasında çok sayıda desmozomal bağlantılar vardır (24).
Epitelin en derin tabakasını tek sıra silindirik hücrelerden oluşan bazal tabaka oluşturmaktadır. Hücreler birbirlerine ve bazal membrana hemidesmozomlar ile bağlanmışlardır. Korneal epitel erozyonları sonrası hemidesmozomlar tam olarak oluşmadığında tekrarlayan epitel erozyonları görülebilir. Bazal membran, bazal epitel hücrelerinden salgılanmaktadır. Bazal membran, elektron mikroskobu ile incelendiğinde bazal hücre tabakasının altında açık renkli izlenen lamina lucida ve derinde yerleşmiş koyu renkli lamina densa adı verilen iki tabakadan oluşmuştur. Lamina lucida, bazal hücrelere hemidesmozomlarla bağlanmıştır. Lamina densa,
9
lamina lucidanın altında yer alır. Bowman membranı ve lamina lucida ile sıkı bağlantılar yapar. Bazal membran büyük oranda tip IV kollajen ve lamininden oluşmuştur. Lamina lucida, hücre migrasyonunda önemli rol oynayan ve epitel hücreleri için kemotaktik olan fibronektini içermektedir. Bazal membran hayat boyu değişime uğrar, kalınlığı yaşla birlikte artar (24,25).
Epitel hücrelerinin yenilenme kabiliyeti çok yüksektir. Perilimbal bazal epitel hücrelerinin (limbal kök hücreler) devamlı çoğalması diğer tabakaların yüzeyel epitele farklılaşmasını sağlar. Bu hücreler olgunlaşıp en dış yüzeylerinde mikrovillus ile kaplanırlar ve daha sonra gözyaşına dökülürler. Bu farklılaşma işlemi 7-14 günde tamanlanır (21). Limbal kök hücrelerinin yaygın hasarı kronik epitel defektlerine yol açar (9). Korneaya oksijen, preoküler gözyaşı tabakası, kapak damarları, humör aközden ve limbus damarları tarafından sağlanır. Korneanın glukoz ihtiyacı humör aközden temin edilir (9,21).
Bowman tabakası: Bowman tabakası; 8-14 μm kalınlığındadır ve epitel bazal membranının hemen altında yer almaktadır. Rastgele dizilmiş 30 nm çapında olan tip I ve tip V kollajen liflerinden oluşmuştur. Bu lifler, proteoglikan ve glikoproteinlerden meydana gelen bir matriks içinde ağ gibi sarılmışlardır. Arka sınırı stroma ile birleşmiştir. Bowman tabakası, embriyogenez sırasında ön stromal keratositler ve epitel tarafından salgılanır. Hücre bulunmadığı için rejenere olamaz. Bu nedenle hasarlanmalar skar dokusu ile iyileşir. Bunun yanında sert bir tabaka olduğu için travmaya karşı dirençlidir (9).
Stroma: Stroma kornea kalınlığının %90’ını oluşturmaktadır. Kollajen üreten keratositlerden, ekstraselüler matriks ve kollajen lamellerinden oluşmaktadır. Kollajen fibrilleri stromanın ön 1/3’lük kısmında oblik, arka 2/3’lük kısmında paralel lameller oluştururlar. Kollalen fibrilleri korneanın tüm çapı boyunca yer alırlar ve sonunda limbus etrafında çevresel olarak uzanırlar (9). Boyutları ve birbirine olan mesafeleri oldukça belirlidir. Kollajen fibrillerinin kafes şeklindeki dizilimi kısmi olarak korneanın saydamlığına katkıda bulunmaktadır. Bu dizilim yıkıcı interferans neticesinde oluşan ışık saçılımını azaltır. Kafes şeklindeki kollajenlerin boyutları görülebilen ışığın dalga boyundan küçük olduğu için kornea saydamdır (21).
10
Korneanın saydamlığı aynı zamanda stromanın %78 oranında su içermesine bağlıdır. Korneanın hidrasyonu büyük oranda sağlam bir epitel, sağlam endotelyal bariyer ve endotelyal pompa fonksiyonu tarafından kontrol edilir. Korneada damar ve keratositler dışında hücre bulunmaması da korneanın saydam olmasındaki diğer faktörlerdir (21).
Korneanın ara maddesini kollajen fibrilleri arasında uzanan proteoglikanlar oluşturur. Proteoglikanlar, keratositler tarafından sentezlenir ve stromaya hidrofilik özellik kazandırır. Kornea stromasında keratan sülfat, kondriotin sülfat ve dermatan sülfat olmak üzere 3 tip proteoglikan bulunmaktadır. Stromal kollajen fibrilleri arasındaki yerleşim düzeninin proteoglikanlar ve kollajen fibrilleri arasındaki özel etkileşim sonucu oluştuğu düşünülmektedir. Bu etkileşim bozulduğunda korneanın şeffaf kalabilme yeteneği önemli ölçüde etkilenir (9,21).
Descement membranı: Descement membranı 10 μm kalınlığında, endotel ve arka stroma arasında yer alan özelleşmiş bir bazal membrandır. Kornea endotelinin bazal membranıdır ve endotel tarafından salgılanır (9). Bu nedenle endotel hastalıkları descement membranının yapısında değişikliklere yol açar. Diğer bazal membranlar gibi tip IV kollajenden zengindir. Yüksek miktarlarda glisin, hidroksiglisin ve hidroksiprolin içerir. İçerdiği kollajen yapısı farklı olduğu için kollajenazlara karşı daha dirençlidir. Bu sayede derin korneal ülserlerde perforasyona karşı bariyer görevi görür. Yaşam boyunca kalınlığı artar. Descement membranı hasara uğradığı zaman kısmen rejenere olabilir (9,21).
Endotel tabakası: Endotel, descement membranının arkasında tek sıra hegzagonal hücrelerden oluşmuştur. Hücrelerin apikal yüzleri ön kamaraya bakar, bazal yüzleri ise descement membranına bitişiktir. Tipik olarak genç endotel hücreleri geniş nükleusa ve mitokondriye sahiptir. Endotel hücrelerince iyonların aktif transportu stromadan suyun geçişini sağlayarak korneanın normal kalınlığını ve saylamlığını devamını ettirir. Cerrahi hasar, inflamasyon veya kazanılmış hastalık (örn: Fuchs endotel distrofisi) gibi nedenler endotel hücre disfonksiyonu ve endotel hücre kaybına yol açabilir. Bu durum sonucunda endotel yetmezliği, stromal ödem ve görme kaybı gelişebilmektedir. İnsan kornea endotel hücreleri rejenere olamadığı
11
için sayıları yaşla birlikte giderek azalır. Doğumda endotel sayısı 3500-4000 hücre/mm² iken, erişkin hayatta 2500 hücre/mm² civarındadır. Endotel hücre kaybı sonucunda oluşan boşluklar, komşu hücrelerin genişlemesi ve defektli alana ilerlemesi ile kompanse edilir (9).
1.3. Konjonktiva
Konjonktiva palpebral, fornikal ve bulber olarak 3 coğrafi zona bölünebilir. Konjonktiva; alt ve üst kapak serbest kenarlarından başlar, kapakların iç yüzeyini ve bulbus oküliyi örter, limbusta sonlanır. Palpebral konjonktiva kapağın mukokütanöz bileşkesinde başlar ve kapağın iç yüzeyini örter. Üst göz kapağının levator aponörozu ve Müller kasının fibröz elemanlarıyla birleştiği fornikslerde gevşekleşerek rahatça hareket eder. Alt gözkapağında inferior rektus kasının fibröz yayılımları alt tarsal kasla kaynaşır. Konjonktiva kesesinde yönünü değiştirir ve globa yapışır. Tars üzerindeki konjonktiva alttaki dokulara sıkıca yapışıktır. Bulber konjonktiva serbestçe hareket eder ve tenon kapsülü ile birleşerek limbusta sonlanır (9).
Konjonktiva, epitel ve substansia propria olmak üzere iki tabakadan oluşmaktadır. Konjonktiva epitelinin morfolojisi tarsın üzerinde çok katlı kübik epitelden, fornikste kolumnar, globda ise skuamöz epitele uzanan çeşitlilik gösterir (21). Yüzeyel hücreler çok sayada mikrovillus ve mikropilikalara sahiptirler. Goblet hücreleri tek hücreli müköz bezlerdir ve konjonktivadaki bazal hücrelerin % 10’unu oluşturur. En fazla tarsal konjonktiva epitelinde ve konjonktivanın alt ve medial (özellikle de karünkül ve plika semilunalis) bölgesinde bulunurlar. Subtansia propriada gevşek bağ dokusu, bol miktarda kan damarları, lenfatikler, sinirler ve yardımcı gözyaşı bezleri bulunmaktadır (9,25,26).
2. Kornea Fonksiyonları Üzerine Etkili Büyüme ve İyileştirme Faktörleri
Hücresel proliferasyon, diferansiyasyon, motilite ve apoptozis arasındaki denge sonucunda kornea yüzeyinin bütünlüğü korunmaktadır ve korneal yara iyileşmesi sağlanmaktadır. Kornea fonksiyonlarının sürdürülebilmesi için epitel, stroma ve endotel tarafından üretilen büyüme faktörleri ve reseptörlerinin kritik
12
önemi vardır. Gözyaşı filmi, oküler yüzeyde epitel hücrelerinin döngüsünü regüle eden büyüme faktörleri ve diğer besin maddelerinin kaynağını oluşturur (27).
2.1. Epidermal Büyüme Faktörü
Epidermal büyüme faktörü yaklaşık 6 kDa molekül ağırlığa sahip bir polipeptittir ve epitel hücreleri için güçlü bir mitojendir. Hücreler tarafından eksprese edilen EGF reseptörünün (EGFR) düşük afinite ve yüksek afinite bölgelerine bağlanır. Kornea epitel hücrelerinde ve lakrimal bezde üretilir. Gözyaşında bulunur (28). EGF, lakrimal bez ve gözyaşı filminde 0.7-9.7 ng/ml konsantrasyonda bulunur (29,30).
Kornea epitel (özellikle limbal bölgede) ve endotel hücrelerinde düşük afiniteli ve yüksek afiniteli EGF reseptörleri bulunurken stromal keratositlerde yalnızca az miktarda düşük afiniteli EGF reseptörleri vardır. EGF; kornea hücrelerini parakrin, otokrin ve jukstakrin yollarla etkilemektedir (30).
EGF, EGFR’ye bağlanarak intrinsik tirozin kinaz reseptör aktivasyonunu sağlamaktadır. Böylelikle DNA sentezi ve ekstraselüler matriks (ESM) moleküllerinin (fibronektin ve hyalüronik asit) üretimine yol açar. Hücre proliferasyonu, kontakt inhibisyonla (hücre membranlarının birbirine teması ile ortaya çıkan yanıt) sınırlandırılır. Reseptör fosforilasyonu ayrıca hücre içi anti-apoptotik proteinleri ve sitoskeleton proteinlerini aktifleyerek hücre morfolojisini ve motilitesini ayarlar. ESM moleküllerinin, özellikle de fibronektinin polarizasyonunun değişmesi ile migrasyonun doğru yönü belirlenir ve integrinler ile EGFR arasındaki bağlantı kolaylaşır (28,31).
EGF’nin kornea vaskülarizasyonu ile ilişkili olduğuna dair yayınlar mevcuttur (32,33). EGF tarafından uyarılan anjiyogenezisin, yara iyileşmesi sırasında mevcut olan diğer büyüme faktörleri, özellikle fibroblast büyüme faktörü ile kombine ilişkisi ile bağlantılı olabilileceği düşünülmektedir (34). EGF’nin korneal epitel hücrelerinin terminal diferansiasyonunu inhibe ettiği ve proliferasyonunu arttırdığı gösterilmiştir (35). Normal korneal epitelyal kalınlığının devamlılığında otokrin ve lakrimal bez tarafından üretilen EGF önemli rol oynamaktadır (30).
Stromal keratositlerde yalnızca düşük afiniteli EGFR bulunması nedeniyle EGF’nin stromal hücre büyümesine etkisi zayıftır (35).
13
2.2. Transforme Edici Büyüme Faktörü-β
TGF-β ailesi üç izoformu bulunan, her biri yaklaşık 25 kDa moleküler ağırlığa sahip polipeptidlerden oluşur. Birçok hücre tarafından sentezlenen TGF-β; hücre bölünmesi, farklılaşması, adezyonu, morfogenezi, ekstraselüler matriks oluşumu ve programlı hücre ölümü gibi çeşitli hücresel süreçlerin kontrolünü sağlamaktadır (36). Bir çok farklı yollar ile etkileşerek oküler yüzeyin homeostazında önemli rol oynamaktadır. TGF-β genel olarak epitelyal, endotelyal ve lökosit hücre büyümesini inhibe ederken, fibroblastların proliferasyonunu stimüle etmektedir (37).
TGF-β reseptörleri; kornea stromal hücrelerinde, limbal ve santral korneal epitelyal hücrelerde bulunmaktadır. Üç tipi mevcuttur. Bunlar arasında TGF-β2, kornea ve humör aközde bulunan ana formdur.
TGF-β; EGF tarafından uyarılan epitelyal hücre proliferasyonunu ve migrasyonunu zayıf bir şekilde, keratinosit büyüme faktörü (KGF) ve hepatosit büyüme baktörü (HGF) tarafından uyarılanı ise güçlü şekilde inhibe eder. Bu durum korneal hücre proliferasyonunun regülasyonunda önemlidir. TGF-β1 ve TGF-β2’nin her ikisi de epitel hücre proliferasyonunu inhibe eder. Ancak inhibitor etki esas olarak TGF-β2 reseptörleri ile oluşturulur (35). TGF-β’nın, kornea ve humör aköz içerisinde bulunmasıyla bu bölgedeki anjiyogenezis kontrol altında tutulur (38).
2.3. Keratinosit Büyüme Faktörü
KGF; fibroblast büyüme faktörü (FGF) ailesinden, 28 kDa molekül ağırlığına sahip bir polipeptiddir. Kornea epitel hücrelerinde bulunur. EGF, FGF ve TGF-α ile aynı uyarı yolağını kullanır (39). KGF, heparine bağlanır ve ihtiyaç durumunda salınmak üzere ESM’de depolanır. KGF reseptörleri yalnızca kornea epitelinde bulunur, ancak KGF transkripsiyonu stromada gerçekleşir (35). KGF, kornea epitel hücrelerine parakrin yolla etki eder. KGF, kornea epitel hücrelerinin migrasyon ve diferansiasyonunu etkilemeden selektif olarak proliferasyonu uyarır. Korneal hasarın olmadığı durumlarda da KGF’nin bazal ekspresyonun devam etmesi korneal epitel bütünlüğünün sürdürülmesini sağlamaktadır (40).
14 2.4. Hepatosit Büyüme Faktörü
HGF, 90 kDa molekül ağırlığında ekstraselüler matrikse bağlanan glikopreteindir. Korneal epitel hücreleri üzerindeki etkilerini c-Met trozin kinaz protoonkogen HGF reseptörü (HGFR) ile gerçekleştirir. HGFR aktivasyonu; epitel hücrelerinde proliferasyonu, motiliteyi ve fibroblast benzeri fenotipe dönüşümü uyarır.
HGF, temel olarak stromal fibroblastlarda üretilir. Gözyaşında (200 pg/ml) ve lakrimal bezde bulunur. Kornea epitel hücrelerini parakrin yolla etkiler ve korneal epitelin sağlığının sürdürülmesine katkıda bulunur (41).
2.5. Platelet Kaynaklı Büyüme Faktörü (PDGF)
PDGF; 35 kDa ağırlığında, disülfit bağıyla bağlanmış A ve B zincirinden oluşan bir glikoproteindir. PDGF-AA, PDGF-AB ve PDGF-BB izomerleri vardır (42). Her üç formunun biyolojik aktiviteleri temelde benzerdir ve reseptöre bağlandıklarında mitojenik etki gösterirler (36). PDGF-BB izoformu, kornea epitelinde üretilir ve bazal membrana bağlanır. Korneal fibroblastlarda ve endotel hücrelerinde PDGF için reseptör vardır. PDGF-AA ve PDGF-BB fibronektin varlığında kemotaksisi uyarır (43).
Ayrıca TGF-β tarafından uyarılan fibroblast proliferasyonuna aracılık eder. TGF-β, keratinositlerde PDGF proteini ve reseptör ekspresyonu üzerinden doku büyümesini düzenler. Düşük TGF-β konsantrasyonunda PDGF üretimi artarken, yüksek TGF-β konsantrasyonunda PDGF reseptör ekspresyonu azalır (44).
2.6. Fibroblast Büyüme Faktörü
FGF ailesi 20 farklı protein içerir ve yaklaşık 18 kDa molekül ağırlığına sahiptir. Proliferasyonu, migrasyonu, diferansiasyonu, ekstraselüler matriks yapısını ve anjiyogenezi düzenlemektedir (37). Degradasyona uğramamak için koruyucu glikoproteinlere (heparan sülfat) bağlanır (45). FGF, yüksek afiniteli tirozin kinaz reseptörüne bağlanır. Epitel, endotel ve stroma için mitojeniktir (46).
15 2.7. Sinir Büyüme Faktörü (NGF)
NGF, glial hücre kaynaklı nörotropik faktör, nörotropin-3 ve 4 gibi nörotropik faktörler ve reseptörleri kornea epitelinde bulunurlar. Bu faktörler kornea epitelinin proliferasyonuna ve duyusal fonksiyonuna destek olurlar (47). Korneal sinirler, kornea fonksiyonlarının sürdürülmesi için gereklidir. Korneanın innervasyon kaybı epitel metabolizmasına zarar verir ve ülserasyona yol açar. Sinirlerden salgılanan nörotropinler doku homeostazisinde önemlidir (48). NGF, proliferasyonu ve diferansiyasyonu arttırır. Ancak etkinliği EGF’ye göre çok daha azdır (49). Korneanın sensöryel inervasyon yetersizliğinde topikal uygulanan NGF’nin korneal epitel defektlerinde iyileşme sağladığı bildirilmiştir (48).
2.8. Fibronektin
Fibronektin; plazma, serebrosipinal sıvı, amniotik sıvı, tükrük, humör aköz ve gözyaşı gibi vücut sıvlarında bulunan yüksek molekül ağırlıklı bir glikoproteindir. Hücre adezyonunda, migrasyonunda ve farklılaşmasında rol oynar. Lökosit ve makrofajların fagositik aktivitelerini arttırır. Gözyaşı filminde bulunan fibronektin ile plazmada bulunan fibronektinin molekül ağırlıkları benzerdir (~440 kDa). Fibronektin, oküler yüzeyde korneal yara iyileşmesinde önemli rol oynar. Oküler yüzey hasarlanmalarında refleks lakrimasyon ve konjonktival damarlarda dilatasyon olur. Oküler yüzey hasarlanmalarında dilate konjonktiva damarlarından plazma fibronektini gözyaşı filmine sızar. Bunun yanında korneal yara iyileşmesi sırasında korneal epitel hücreleri ve keratositler tarafından fibronektin üretimi olmaktadır (50). Persistan korneal epitel defektlerinin tedavisinde fibronektin içeren göz damlaları ile başarılı sonuçlar bildirilmiştir (51).
2.9. Diğer Büyüme Faktörleri: İnsülin-Benzeri Büyüme Faktörü (Igf), Kemik Morfogenik Proteini, Vasküler Endotelyal Büyüme Faktörü (Vegf), P Maddesi
IGF ve reseptörü; kornea epitelinde, stromasında ve trabeküler ağda bulunur. Hücre proliferasyonunu ve diferansiasyonunu uyarır.
Kemik morfogenik proteini, TGF-β ailesindendir. Stromal keratositlerin proliferasyonunu ve kemotaksisini uyarır (46).
16
VEGF, bazal konsantrasyonlarda korneanın avasküler yapısının sürdürülmesini sağlar (46).
Kornea inervasyonu, korneanın yapısının ve fonksiyonlarının sürdürülebilmesi için gereklidir. Korneal sinirin hasarlanması sonucunda; 1- Korneal epitel hücrelerinin geçirgenliği artar. 2- Hücre proliferasyonu azalır. 3- Hücre fenotipinde değişiklik olur. 4- Yara iyileşmesinde gecikme olur. Kornea, insan vücudunda en çok sinir sonlanmasına sahip dokulardan biridir. P maddesi (SP), duyusal sinir liflerinden salınan bir nöropeptitdir. Nörotransmitter ve nöromodülatör olarak görev yapmaktadır ve oküler dokular üzerinde etkili olduğu gösterilmiştir. SP ve IGF-1’nin tek başına kornea epitel hücre göçüne etkisi olmadığı halde kombinasyonlarının sinerjistik olarak kornea epitel hücre göçünü arttırdığı gösterilmiştir. Nörotrofik keratopatiye bağlı persistan korneal epitel defektinin IGF-1 ve SP içeren göz damlası ile etkili bir şekilde tedavi edildiği gösterilmiştir (52).
2.10. Sitokinler
Sitokinler; hücre büyümesi, farklılaşması, bağışıklık, inflamasyon, yara iyileşmesi ve apoptozis gibi birçok fonksiyonu olan düşük molekül ağırlıklı glikoproteinlerdir. Korneanın hasarlanmasından sonra dakikalar içinde salınımı başlar. IL-1, kornea yara iyileşmesinde en önemli role sahip sitokindir. IL-1 α ve β’nın mRNA'ları ve proteinleri kornea epiteli, IL-1 reseptörleri ise keratositlerden ve korneal fibroblastlar tarafından sentezlenir. Yalnızca korneanın hasarlandığı durumlarda keratositlerde ve myofibroblastlarda IL-1 saptanır. Hasarlanmış epitel hücrelerinden salınan IL-1 ve TNF-α Fas/Fas ligand sistemini aracılığı ile keratosit ve fibroblast apopitozunu indükler. IL-1, keratositler tarafından üretilen HGF ve KGF'nin primer düzenleyicisidir. HGF ve KGF, keratosit ve myofibroblastlardan salınır. Stroma ve epitel arasındaki ilişkiyi düzenler. Epitel hücrelerinin proliferasyonunu, hareketini ve farklılaşmasını sağlar. Hasarlanma sonrasında IL-1, HGF ve KGF'nin üretimini uyararak epitel hücrelerinin tamir sürecini düzenler. Keratositler tarafından üretilen kollajenaz, metalloproteinaz gibi enzimlerin üretimini arttırır. Bu enzimler ile korneal yara iyileşmesi sırasında kollajende remodeling sağlanmaktadır (43).
17 3. Kan Ürünü Gözyaşı Takviyeleri
Gözyaşı; kornea epitelinin beslenmesi, immun savunması için ve yüzey epitelinin çoğalması, gelişmesi ve farklılaşması için gerekli maddeleri içeren dinamik bir yapıdır. Suni gözyaşı damlaları, konjonktiva ve korneanın neminin yerine konulması için son derece faydalıdır. Ancak, doğal gözyaşı içeriklerine sahip değildirler. Bunun yanında raf ömrünün uzatılması için sıklıkla kullanılan prezervan ve diğer katkı maddeleri toksik ve alerjik reaksiyonlara neden olabilmektedir (8).
Kan ürünlerinin içerdiği bileşenler gözyaşına çok benzemektedir. Bu nedenle klasik tedavilere dirençli oküler yüzey hastalıklarında eşsiz bir tedavi seçeneği olarak gündeme gelmiştir (7). Gözyaşı yetersizliği olan hastaların serum içerikleri, sağlıklı gözyaşına sahip olan kişilerin serum içerikleri ile benzerlik göstermektedir. Böylelikle otolog serum kullanılması, enfeksiyon ve immünolojik reaksiyon riskini ortadan kaldırmıştır (53,54)
3.1. Serum
Serum, kanın şekilli elemanlarından ve pıhtılaşma faktörlerinden ayrılmış olan sıvı içeriğidir. EGF, fibronektin, temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF), substance P, IGF-1, TGF-β, NGF, PDGF, albumin, α 2 makroglobulin, vitamin A gibi epitel üzerine etkili birçok faktörü içermektedir. Serumun A vitamini, TGF-β, IGF-1, NGF, fibronektin ve lizozim konsantrasyonları gözyaşından fazla iken IgA, EGF ve C vitamini konsantrasyonları gözyaşındaki düzeylerden düşüktür (40,55). Fibronektin, hücre migrasyonunu etkileyen en önemli faktörlerden biridir. EGF, epitel hücrelerinin migrasyonunu arttırır ve antiapopitotik etki gösterir. TGF-β, stroma ve epitel tamirinde görev alır. α2 makroglobulinin antikollajenaz, albuminin ise antiapoptotik etkileri vardır. A vitamini eksikliği; goblet hücre kaybına, keratinizasyona, kornea ve konjonktiva epitel metaplazisine yol açar. PDGF, korneal fibroblast proliferasyonunu düzenler ve yara iyileşmesinde migrasyonu arttırır. HGF, kornea epitel hücrelerinde proliferasyonu, motiliteyi ve diferansiyasyonu düzenler. FGF, direkt olarak ve TGF-β aracılı hücre proliferasyonunu aktive ederek yara iyileşmesini uyarır (27,35,56-59). Serum, biyokimyasal (osmolalite, pH) ve biyomekanik özellikleri bakımından doğal gözyaşına benzerdir (Tablo 1). Büyüme faktörleri ve vitaminler gibi oküler yüzeyin
18
sağlıklı kalabilmesi için gerekli maddeleri içermektedir. Ayrıca lizozim, IgG ve komplemanlar gibi bakteriostatik bileşenler bulunmaktadır (5,6).
Tablo 1: Serum ve gözyaşının biyokimyasal özellikler açısından karşılaştırılması
Bu bilgilerden yola çıkarak 1984 yılında Fox ve ark. ilk defa otolog serum kullanımının kuru gözde etkili bir tedavi olduğunu bildirmişlerdir (3). Otolog serum kullanımının özellikle ciddi seyirli kuru göz olgularında etkili bir tedavi seçeneği olduğunu kanıtlayan birçok yayın yapılmıştır (5,60). Delphi panelinde kabul edilen tedavi basamaklandırmasında da 3. derece ciddiyeti olan olgularda otolog serumun kullanılması önerilmektedir (61). Sjögren sendromu, kuru gözün ciddi ve yıkıcı seyrettiği hastalıklardan biridir. Bu hastaların tedavisinde otolog serum kullanımı ile başarılı sonuçlar elde edilmiştir (4).
Otolog serum, oftalmolojide kuru göz dışında farklı hastalıkların tedavisinde de kullanılmaktadır. Kronik inflamatuar bir hastalık olan superior limbik keratokonjonktivit, travma veya korneal bazal membran distrofisine sekonder gelişen rekürren erozyon sendromu, kuru göz veya romatoid artrit gibi hastalıklar sonucu oluşabilen persistan epitel defektleri ve graft-versus-host hastalığı otolog serumun tedavide kullanılabildiği bazı hastalıklardır. Özellikle dirençli persistan epitel defektleri; keratokonjonktivitis sicca, açıkta kalma keratopatisi, nörotrofik keratit, limbal kök hücre yetmezliği ve post-enfeksiyöz ülserler sonucunda gelişebilmektedir
19
(4,62-65). Otolog serumun içerdiği büyüme faktörleri ve proteinler klasik tedavilere dirençli bu hastalığın tedavisinde yarar sağlayabilmektedir. Oküler yüzey hastalıklarında klasik tedaviler ile otolog serumun karşılaştırıldığı çalışmaların sonucunda otolog serumun klasik tedavilere göre daha etkili ve güvenli olduğu bulunmuştur (60).
Otolog serum göz damlası hazırlama protokolü çalışmalar arasında farklılık göstermektedir. Kanın pıhtılaşmaya bırakılma süresi, santrifüj hızı, santrifüj süresi, sulandırma için kullanılan madde ve sulandırma miktarı açısından farklı görüşler mevcuttur (Tablo 2).
Tablo 2: Otolog serum damla hazırlanması, saklanması ve kullanımındaki farklı uygulamalar
Kanın pıhtılaşmaya bırakılma süresi farklı çalışmalarda 15 dakika ile 72 saat arasında değişmektedir. Bekleme süresi arttıkça daha yüksek konsantrasyonlarda EGF, TGF-β1 ve HGF elde edildiği gösterilmiştir. Bu durum pıhtılaşma süresinin uzaması ile trombositlerin alfa granüllerinde depolanan büyüme faktörlerinin salınımının artması ile açıklanabilir (6). Her ne kadar pıhtılaşma için ayrılan sürenin uzaması ile büyüme faktörlerinin miktarı artsa da klinik işleyişte uygulanabilirliği açısından pıhtılaşma için 2 saatlik süresinin ayrılması en yaygın görüştür.
Santrifüj hemolize neden olmadan serum ve kan pıhtısını ayırmalıdır. Farklı çalışmalarda santrifüj parametreleri 5 dakika 500 g hız ile 15 dakika 3000 g hız aralığında değişmektedir. Uzun süreli ve yüksek hızda santrifüj ile serumdaki EGF ve A vitamini miktarı artarken, TGF-β1 miktarı azalmaktadır. 3000 g santrifüj ile serum tam olarak ayrılırken, 500 g santrifüj ile serum içinde bir miktar lökosit bulunabilir. Serumun depolanması sırasında lökositler parçalanır ve TGF-β1 gibi
20
proteinlerini ortama salarlar. 500 g santrifüjde hazırlanan serumda daha yüksek konsantrasyonda TGF-β1 olması bu şekilde açıklanabilir. Ayrıca düşük yetersiz santrifüj yapıldığında serum içinde bulunan trombosit membranları apopitozu uyarabilir ve koagüle fibrin serum göz damlasının etkinliğini azaltabilir. Ayrıca uzun süreli ve yüksek hızlı santrifüj serum ve pıhtının daha iyi ayrılmasını sağlar ve elde edilen serum miktarını arttırır (6,53). EGF konsantrasyonu bazal gözyaşında 1.9-9.7 ng/ml, refleks salgıda 0.7-8.1 ng/ml olarak bildirilmiştir ki serumdaki konsantrasyonu olan ~0.5 ng/ml’den oldukça yüksektir. TGF-β’nin gözyaşındaki konsantrasyonu ~10 ng/ml, serumdaki konsantrasyonu ise ~50 ng/ml’dir. Bu nedenle yüksek hız ve uzun süreli santrifüjde TGF-β1 konsantrasyonunun düşmesi bir dezavantaj olarak görülmeyebilir. Ayrıca TGF-β’nin antiproliferatif etkisinin de olduğu bilinmektedir ve yüksek konsantrasyonlarda oküler yüzey epitelinde yara iyileşmesini baskılayabilir. Bazı araştırmacılar TGF-β konsantrasyonunu gözyaşı ile benzer seviyelerde tutmak için serumun dilüe edilmesini önermektedir (4,66). Ancak serumun dilüe edilmesi ile diğer epitelyotrofik faktörlerin konsantrasyonları düşmektedir. Bununla birlikte % 100 konsantrasyonda kullanılan otolog serum damlasının epitel iyileşmesi üzerine herhangi bir olumsuz etkisi gösterilmemiştir (6,66).
Otolog serum göz damlaları için farklı seyrelticiler tarif edilmiştir. Literatürde serum fizyolojik, BSS, gentamisin, kloramfenikol, sodyum hyaluronat gibi maddeler otolog serum hazırlanmasında kullanılmıştır (4,53,67-69). Liu ve ark.’nın yaptığı çalışmada BSS ile dilüe edilen serumların, serum fizyolik ile dilüe edilenlere göre daha fazla epitel hücre proliferasyonu sağladığı gösterilmiştir (6). Lopez-Garcia ve ark.’ın çalışmasında sodyum hyaluronat ve serum fizyolojik ile hazırlanan %20 konsantrasyondaki otolog serum göz damlaları karşılaştırılmıştır. İki grupta da EGF, TGF-β, PDGF-AB ve albumin düzeylerinin 4°C’de 1 ay ve -20°C 3 ay boyunca stabil kaldığı saptanmıştır. Gözyaşı film stabilitesi, floresein ve Rose Bengal ile boyanma, korneal ve konjonktival metaplazi ve hasta memnuniyeti açısından sodyum hyaluronat ile sulandırılmış otolog serum damla anlamlı olarak üstün bulunmuştur. Araştırmacılar, sodyum hyaluronat ile kademeli büyüme faktörü salınımı sağlandığı, serumun oküler yüzeyde kalma süresinin ve etkinliğinin arttığını
21
göstermişlerdir. Bunun sonucu olarak hastaların tedaviye uyumunun artacağını ve daha az sıklıkta damla damlatma gerekliliği sağlayacağını savunmuşlardır (70).
Literatürde %20 ila %100 arasında değişen konsantrasyonlarda otolog serum damla kullanılmaktadır. Liu ve ark. %12.5-25 konsantrasyondaki serumla tedavi edilen hastalardaki hücre proliferasyonunun daha iyi olduğunu gözlemlemişlerdir. Bu durum bazı büyüme faktörlerinin düzeylerinin bu konsantrasyonda en uygun düzeye ulaştığını düşündürmektedir. Hücre göçünün dilüe edilmemiş serumda %25 konsantrasyondaki seruma göre daha iyi olduğunu saptamışlardır. Bunun muhtemel nedeni dilüe edilmemiş serumdaki yüksek fibronektin konsantrasyonudur (6). Tedavide kullanılacak serum konsantrasyonu hastanın ihtiyacına göre, hastalık bulgularının şiddetine göre klinisyen tarafından belirlenmelidir.
Konsantrasyonun dışında doz sıklığı tedavinin başarısını etkileyen diğer önemli bir değişkendir. Takamura ve ark., otolog serum damla günde sekiz defa kullanıldığında hastaların %94’ünde, günde dört defa kullanıldığında hastaların % 54’ünde subjektif yakınmaların düzeldiğini bildirmişlerdir (71).
En iyi etkinin sağlandığı minimum konsantrasyon ve doz hastanın ihtiyacına göre, hastalık bulgularının şiddetine göre ayarlanmalıdır.
Otolog serumun içeriğinde yer alan büyüme faktörlerinin bir bölümünün 24 saatlik bekleme sonrasında %50’den fazla azaldığı gösterilmiştir (72). Şüphesiz en etkin otolog serum her gün taze olarak hazırlanandır. Ancak otolog serumun her gün yeniden hazırlanması hastanın damarına her gün işlem yapılması, sağlık personelinin aynı iş gücünü her gün harcaması nedeniyle rutinde uygulanabilir görünmemektedir (7). Bu durum EGF, TGF, fibronektin gibi daha uzun ömürlü büyüme ve yara iyileşme faktörlerinin etkisine güvenerek 4°C’de 1 ay, -20°C’de 3 aya kadar saklanabilen günlük dozlara bölünmüş çok sayıda serumun bir defada hazırlanması eğilimini popüler hale getirmektedir (4,6).
Geerling ve ark. otolog serum hazırlanmasında optimum protokolün belirlenmesi için pıhtılaşma süresinin, santrifüj hızı ve süresinin, seyrelticinin tipi ve seyreltme miktarlarının epitelyotrofik faktörlerin konsantrasyonu ve epitel iyileşmesi üzerine etkilerini incelemişlerdir (5,6).
22 Bu protokole göre:
Hastalar öncelikle ulusal kan bağışı ve kan ürünü kullanma klavuzuna göre değerlendirilir ve HBV, HCV, HIV ve sifiliz açısından serolojik inceleme yapılır. Serolojinin pozitif olması durumunda hastaya otolog serum damla tedavisi verilmez
Aseptik koşullar altında 100 ml tam kan alınır
Tam kan oda sıcaklığında (18-25°C ) pıhtılaşmaya bırakılır 15 dakika 3000xg hızda santrifüj yapılarak serum ayrılır 1/4 oranında BSS ile sulandırılır
Steril olarak filtrelenerek (0.2 µm delik büyüklüğünde) 2 ml’lik tek kullanımlık porsiyonlara bölünür
Hazırlanan otolog serum göz damlasından mikrobiyal kontaminasyonun değerlendirilmesi için örnek alınır. Herhangi bir üreme olmaması durumunda hastaya teslim edilir
-20°C’de saklanır (maksimum 3 ay)
Her gün yeni bir şişe açılır ve açılan şişe 4°C’de saklanır
İngiltere ve Galler’de otolog serum damla Ulusal Kan Bankası tarafından hazırlanmaktadır. Uygulanan protokolde tam kan 4°C’de 24-72 saat pıhtılaşmaya için bırakılmaktadır. Elde edilen serum 1/1 oranında steril salin ile sulandırılmakta ve 3 ml’lik şişelere paylaştırılmaktadır. Beş şişe mikrobiyal kontaminasyon açısından değerlendirildikten sonra mikrobiyal üreme olmaması durumunda hastaya verilmektedir. Her gün yeni bir şişenin açılacağı ve kullanılmayan şişelerin -30°C’de 6 ay saklanabileceği bildirilmektedir (73).
Çoğu Japon araştırmacı Tsubota ve ark.’ın ptotokolünü uygulamaktadır. Tsubota ve ark. hastadan alınan kana 5 dakika süre ile 1500 devir/dakika santrifüj uyguladıktan sonra elde ettikleri serumu ¼ oranında salin ile dilüe etmişlerdir. Hazırlanan damlayı, A vitamininin bozulmaması için ultraviole ışığa karşı koruyucu 5 ml damlalıklara bölmüşlerdir (4).
Otolog serum yoğun protein içeriği nedeniyle kontaminasyona oldukça açık bir preparattır. Ancak yoğun protein içeriğinin yanı sıra lizozim, kompleman ve bazı Ig’ler gibi bakteriostatik maddeleri de içermektedir. Bu nedenle ayrıca bakteriostatik
23
bir madde eklenmesi gerekli görülmemektedir. Otolog serumun hazırlanması, saklanması ve kullanılması sırasında son derece dikkatli olunmalı ve sterilite şartlarına uyulmalıdır. Bu şartlara gerekli şekilde uyulması durumunda ciddi bir enfeksiyon ya da komplikasyon riski oldukça azdır (4,60,74).
Otolog serum uygulamasının mediko-legal yönü:
Halen geçerli olan ve 11.04.2007 tarihinde kabul edilip 5624 kanun numarası ile 2 mayıs 2007 günü 26510 sayılı resmi gazetede yayınlanan ‘’ Kan ve Kan Ürünleri Kanunu’’ içinde ‘’otolog’’ ve ‘’serum’’ sözcükleri geçmemektedir. Bir kan ürünü olarak otolog serumu ilk ele alan yasal düzenleme, bu kanuna bağlı olarak 04.12.2008 günün 27074 sayılı resmi gazetede yayılanan ‘’Kan ve Kan Ürünleri Yönetmeliği’’dir. Bu yönetmelik gereğince otolog kan ürünü hazırlama ve hastaya teslim etme işlemlerinin bilgilendirme ve rıza sonrası yapılması zorunlu kılınmış, etiketleme işleminin diğer kan ürünleri gibi yapılması istenmiş, ancak otolog uygulamalarda ‘’kan bağışçısı uygunluk kriterleri’’nin aranması gerekli görülmemiştir (7).
Avrupa Birliği ve Almanya’da otolog serum damla hazırlamak için ilaç denetimi yapan kurumlardan ruhsat almak gerekmektedir. Ancak tıp doktorları bu zorunluluktan muaf tutulmuşlardır. Tıp doktorları kendi sorumluluklarında ilaç hazırlayıp uygulayabilirler (75). İngiltere’de otolog serum damla ulusal kan bankası tarafından hazırlanmaktadır (73).
İmmünolojik reaksiyon riski ve hastalık bulaştırma riski: Otolog serum göz damlası uygulaması, allojenik serum göz damlası uygulamasına tercih edilmelidir. Ayrıca gözyaşı eksikliği-yetersizliği bulunan bireyler ile gözyaşı sağlıklı olan bireylerin serumlarının farklı olmadığının gösterilmesi, hastaların kendi serumlarının, sağlıklı başka kimselerden alınan serumlar kadar etkin olacağını göstermektedir (53,54). Ancak kronik greft-versus-host hastalığı bulunanlarda, damar yoluna girilmesi güçlük arzeden hastalarda (özellikle çocuklarda) allojenik (tercihen 1. derece yakınlardan alınan kan ile hazırlanan) serumunda etkili olduğu bildirilmiştir. Bu durumda serolojik tarama büyük önem taşıyacaktır (7,76).
24 3.2. Kordon Kanı Serumu
Kordon kanı serumu, oküler yüzey üzerine iyileştirici etkileri olan EGF, A vitamini, TGF-β, IGF-1, P maddesi, NGF gibi faktörlere sahiptir. İçerdiği EGF, NGF, TGF-β ve P maddesi konsantrasyonları periferik kan serumundan yüksek, A vitamini ve IGF-1 düzeyleri ise daha düşüktür. Ancak umbilikal kord serumunda bulunan A vitamini düzeyi gözyaşından yüksektir (77,78). Yoon ve ark. konvansiyonel tedavi yöntemleri ile fayda sağlanamayan kuru göz ve nörotrofik keratitli hastalarda, kordon kanı serumu tedavisi ile klinik ve histopatolojik düzelme saptamışladır (77,79). Akut kimyasal yaralanma sonrası oküler yüzey restorasyonunda kordon kanı serumunun, otolog serum ve yapay gözyaşına göre daha etkili olduğu bildirilmiştir (78,80). Ancak otolog serumla karşılaştırıldığında alerji ve bulaşıcı hastalık riski gibi dezavantajları vardır. HIV, HBV ve HCV gibi bulaşıcı hastalıklar açısından inceleme yapılsa bile hastalıkların pencere dönemi akılda tutulmalıdır (7,78). Amnion membranı uygulamasında, membranlar hazırlanıp -80 °C bekletilmekte ve verici anneden 6 ay sonra yapılan ikinci serolojik inceleme de temiz çıkınca klinik olarak kullanımı serbestleşmektedir. Bu bekleme sürecinde kordon kanından hazırlanan serumun içerdiği büyüme faktörleri düzeylerinde azalma olacağı düşünüldüğünde, bu uygulamanın medikolegal risk almadan etkin şekilde uygulanamayacağını göstermektedir (7).
3.3. Trombosit Süspansiyonları-Trombosit Jelleri
Trombosit süspansiyonları tampon solüsyon içinde istenilen miktarda trombosit içeren hazır kan ürünlerinden biridir (7,81). Yara iyileşmesi sürecinde büyük öneme sahip çeşitli büyüme faktörlerinin kaynağı trombositlerdir (6). Trombosit süspansiyonları 20-24°C’de 5 gün saklanabilir
.
Trombositlerin, trombin ile uyarılmasıyla içerdikleri büyüme faktölerinin salınması sağlanabilir. Apoptotik hücre ölümünü uyardığı düşünülen trombosit membranları santifüj ile uzaklaştırılarak trombosit kaynaklı büyüme faktörlerince zengin trombosit jeli (platelet releasate) elde edilmekte ve bu jel dondurularak aylarca saklanabilmektedir. Trombosit jellerinin, taze donmuş plazma (TDP) ve seruma göre çok daha yüksek konsantrasyonlarda büyüme faktörü içerdiği saptanmıştır. Hücre kültürü ortamında, hücre proliferasyonunu en iyi trombosit
25
jelinin desteklediği, bunu serum ve TDP’nin izlediği, hücre göçü ve farklılaşmasını ise en iyi serumun desteklediği, bunu trombosit jeli ve TDP’nin izlediği gösterilmiştir (82). Serumun hücre göçü üzerine daha üstün etkisinin olması, serumda yüksek konsantrasyonda fibronektin bulunmasına karşılık trombosit jelinde düşük konsantrasyonda fibronektin bulunması ile açıklanabilir.
3.4. Albumin
Albumin 66 kDa ağırlığında çözünür, monomerik bir proteindir. Serum total proteininin yarısını oluşturmaktadır. Serum albumininin başlıca görevi serbest yağ asitlerinin, kortikosteroidlerin ve bazı hormonların taşınmasıdır. Gözyaşı içinde de yoğun miktarda albumin mevcuttur. Gözyaşı içindeki fizyolojik rolü tam olarak bilinmemektedir. Serum albuminine benzer şekilde gözyaşı içerisindeki fizyolojik olarak aktif maddelerin taşınmasında görev almaktadır (83). Albumin dilate konjonktiva damarlarından gözyaşına geçer. Gözyaşındaki konsantrasyonu gözün kapanması ve yaralanması ile artar (50,84). Bu nedenle gözyaşı albumininin oküler yüzey bütünlüğünün spesifik olmayan bir belirteci olduğu düşünülebilir (84). Albumin infüzyon tedavisi yaygın olarak kullanılmaktadır ve hazır preparatları vardır. Ancak insan kanından elde edilmiş ürünlerin kullanımında virüs ve prion gibi enfeksiyon etkenlerinin bulaşma riski akılda tutulmalıdır. Rekombinant insan serum albumini ile bulaşıcı hastalık riski ortadan kalkmaktadır. Shimmura ve ark. Sjögren sendromlu hastalarda %5’lik albumin tedavisi ile floresein ve Rose Bengal boyanma skorlarının düştüğünü ancak gözyaşı parçalanma zamanında ve hastaların subjektif semptomlarında düzelme olmadığını bildirmişlerdir (83). Hayvan deneylerinde %10’luk albumin tedavisi ile korneal yara iyileşmesinin hızlandığı ve epitel apoptozisinin azaldığı gösterilmiştir (85).
26 3.5. Plazma
Plazma, pıhtılaşmayı önleyen antikoagülan bir madde eklenerek yapılan santrifüj sonucunda kanın şekilli elemanların çökertilmesiyle elde edilen sıvıdır. Serumdan farklı olarak fibrinojen ve diğer pıhtılaşma faktörlerini içerir. Trombositler büyüme faktörlerinin kaynağını oluşturmaktadır. Trombositlerden büyüme faktörleri henüz salınmadan intakt trombositlerin uzaklaştırılması nedeniyle plazma büyüme faktörleri açısından fakirdir (82). Serumdan farklı olarak TDP kan bankalarında hazır olarak bulunan bir üründür. -30°C’de 2 yıl saklanabilir (7,67).
27 C. GEREÇ VE YÖNTEM
Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Göz Hastalıkları Anabilim Dalı polikliniğine Aralık 2013 - Haziran 2014 tarihleri arasında başvuran sağlıklı 13 gönüllü ve oküler yüzey hastalığı nedeni ile otolog serum göz damlası kullanan 43 hasta çalışmaya dahil edildi. Çalışmaya başlanmadan önce EÜTF etik kurulundan çalışma onayı alındı. Gönüllülere yapılması planlanan çalışma konusunda ayrıntılı bilgi verilerek, hazırlanan özel onam formları okutulup onayları alındı.
1. Otolog Serum Hazırlanması
Otolog serum hazırlamak için antisepsi kurallarına uyarak antekübital venden vakumlu, antikoagülansız kuru tüplere tam kan alındı. Tüpler dik vaziyette, oda ısısında güneş almayan bir odada 2 saat bekletilerek kanın şekilli elemanlarının çökmesi sağlandı. Kanlar daha sonra 15 dakika 4000 devir/dakika (3340 g) hızda santrifüj edilerek serumun ayrılması sağlandı. Sağlıklı 13 gönüllüden elde edilen serumlar steril şartlar altında etken madde olarak sodyum karboksimetil selüloz, prezervan madde olarak stabilize oksikloro kompleks (SOK) içeren yapay gözyaşı preparatı (Refresh Tears Lubricant, Allergan, California) ve prezervan madde içermeyen dengeli tuz solüsyonu (BSS) ile, 43 hastadan elde edilen serumlar yapay gözyaşı preparatı ile %20 oranında dilüe edildi.
Otolog serum göz damlası kullanacak hastalar, kullanılmak üzere açılan damlalığın buzdolabında (4°C’de), kalanların ise derin dondurucuda (~-20°C’de) muhafaza edilmesi, kullanmakta oldukları damlaları buzdolabında saklamaları ve yanlarına aldıklarında mutlaka soğutucu bir kapta taşımaları, kullandıkları damlalığı 20 gün sonra atmaları ve derin dondurucuda saklanan yeni bir damlayı buzdolabında çözdürerek kullanmaları konusunda bilgilendirildiler.
2. EGF, TGF-β1, TGF- β2 ve Fibronektin Düzeylerinin Belirlenmesi
13 sağlıklı gönüllüden yapay gözyaşı ile hazırlanan otolog serum göz damlası örnekleri epitelyotrofik faktörlerin stabilitesinin değerlendirilmesi için 4°C’de ve -20°C’de saklandı. 4 °C’de saklanan damlalarda 1., 15. ve 30. günlerde, --20°C’de saklanan damlalarda 1. ve 3. ayda EGF, TGF- β1, TGF-β2 ve fibronektin düzeyleri
