Cumhuriyet Üniversitesi Dişhekimliği Fakültesi Dergisi CİLT 3, SAYI 2, 2000
ENDODONTiK LEZYONLU DiŞLERiN PERiAPiKAL EKSUDASINDA iNTERLÖKiN-1β ve
TÜMÖR NEKROZ FAKTÖRÜ-α DÜZEYLERi ve RADYOGRAFiK BULGULARLA İLİŞKİSİ
Yrd. Doç. Dr. Hanife ATAOĞLU1 Yrd. Doç. Dr. Seyfullah HALiLOĞLU2 Dr. Hale ARI3
ÖZET
İnterlökin-1β (IL-1β) ve Tümör Nekroz Faktörü-a (TNFα)'nın oldukça patent kemik rezorbe edici faktörler oldukları gösterilmiş ve periapikal granülomaların patogenezinden sorumlu tutulmuşlardır. Bu çalışmanın amacı 35 tek köklü dişten elde edilen periapikal eksuda örneklerinde ELISA yöntemiyle IL-1β ve TNF-α düzeylerini belirlemek ve radyografik bulgular ile olası ilişkilerini değerlendirmek amaçlanmıştır. Eksuda örnekleri Periapikal indeks (PAl) skorlarına göre gruplandı. Periapikal eksuda örneklerinde IL-1β 'nın ortalama konsantrasyonu (72.79 ng/ml) TNF-α konsantrasyonu (6.17 ng/ml)'ndan yaklaşık 12 kat daha yüksekti. PAl skorlarına göre oluşturulan gruplar arasında anlamlı farklılık yoktu (p>0.05). incelenen iki sitokin arasında korelasyon bulunamadı, ancak lezyon boyutu IL-1β ve PAl ile pozitif, TNF-α düzeyi eksuda volümü ile negatif korelasyon gösterdi (p<O.05). Büyük radyolusent alana (uzun aksı 1cm) sahip kanallarda IL-1 β düzeyleri küçük alana sahip olanlardan anlamlı şekilde daha yüksekti (p<0.05). ÇaIışmanın bulguları periapikal eksudadaki IL-1β ve TNF-α düzeylerinin periapikal lezyon şiddetinin duyarlı bir parametresi olamayacağını, ancak bu sitokinlerden IL-1β 'nın periapikal kemik kaybında TNF-α 'dan daha önemli olduğunu ortaya koymaktadır.
Anahtar Kelimeler:
SUMMARY
Interleukin- IL-1β (IL- IL-1β) and tumor necrosis factor-α (TNFα) have been shown to be patent bone resorbing mediators and have been implicated in the pathogenesis of periapical granulomas. The aim of this study was to determine IL-1β and TNF-α levels in periapical exudates obtained from 35 single rooted-teeth using enzyme-linked immunosorbent assays and to evaluate their possible relations with radiological findings. Periapical exudate samples classified according to Periapical index scores. The mean concentration of IL-1β (72.79ng/ml) in periapical exudates were approximately 12-fold higher than TNF-α (6. 17ng/ml). No significant difference can be found bet-ween PAl groups (p>0.05). There was no correlation betbet-ween these cytokines, but dimension of lesion correlated positively with IL-1β and PAl, and TNF-α levels negatively with exudate volumes (p<0.05). IL-1β levels in canals with larger radiolucents area (Iong axis 1cm) were significantly higher than those determined as small (p<0.05). The findings of this study suggest that periapical exudate levels of IL-1β and TNF-α can not be a sensitive parameter for the severity of periapical disease, however, of these cytokines IL-1β is likely to be of greater importance than TNF-α in periapical bone lass.
Key Words:
GiRiŞ
Dental pulpanın bakteriyel enfeksiyonu so-nucu periapikal lezyonların geliştiği ve periapikal alanda kemik yıkımına neden olduğu bilinmektedir. Makrofajlar, T ve B-Ienfositler ve plazma hücreleri gibi hücrelerin periapikal lezyonlarda varlığı hasta-lığın patogenezinde konak immün cevabının rolü olduğunu ortaya koymaktadır.1-4
İnterlökin-1β (IL-1β), interlökin-1 α, tümör nekroz faktörü-a (TNF-α ) gibi sitokinler çözünür mediatörlerdir ve enflamatuar olaylar esnasında immün cevaptan sorumlu hücrelerce salınırlar. Bu sitokinler fibroblastlar ve osteoblastlar gibi bir çok hücreyi kemik rezorbsiyonu, prostaglandin sentezi ve proteaz üretimi için stimule ederler.5-9 Periapikal lezyonlarda PGE2, IL-1β ve TNF-α 'nın lokal olarak üretildiği gösterilmiştir.10-12
Eksuda enflamatuar cevabın bir ürünüdür ve konak cevabı ile ilişkili konak mediatörleri içerir. Önceki çalışmalarda, kanallardan toplanan periapi-kal eksuda endodontik lezyonlarda konak cevabını araştırmak için kullanılmış ve tespit edilebilir sevi yelerdeIL-1β, IL-1α, PGE2, ve TNF-α
saptanmış-tır.13-15 Sitokinler ve ilgili dişe ait periapikal lezyon şiddeti ile ilişkisini araştıran çalışmalar literatürde nadirdir. Bu bilgilerin ışığında, bu çalışmada periapikal eksudalarda IL-1β ve TNF-α düzeylerini saptamak ve bu sitokinlerin ilgili dişin periapikal lezyon şiddeti ile ilişkisini değerlendirmek amaç-lanmıştır.
MATERYAL VE METOD
Çalışmadaki hastalar Selçuk Üniversitesi Dişhekimliği Fakültesi Endodonti bölümü kliniğine başvuran ve periapikal lezyonları nedeniyle kanal tedavisi uygulanan bireyler arasından seçildi. Ça-lışmanın amacı hastalara açıklandı ve kendilerinden izin alındı. Tüm hastalarda çalışmanın amacına engel olacak herhangi bir sistemik problem yoktu. Periapikal eksuda örnekleri periapeks bölgesinde radyolusent alanları olan 35 tek köklü dişin ka-nalından elde edildi. Lezyonlu dişlerde periodontitis bulgusu yoktu ve lezyonlar maksiller sinüs ile ilişkisizdi. Örnekleme esnasında ayrıca periapikal lezyonu değerlendirmek amacıyla periapikal radyog-1 - Selçuk Üniversitesi Dişhek Fak, Ağız-Diş-Çene Hast ve Cerr Anabilim Dalı, Konya
2 - Selçuk Üniversitesi Veteriner Fak, Biyokimya Anabilim Dalı, Konya 3 - Selçuk Üniversitesi Dişhek Fak, Endodonti Bilim Dalı, Konya
C.Ü. DİŞHEKiMLiĞi FAKÜLTESi DERGiSi 2000
graf elde edildi. Periapeks çevresindeki radyolusent alanın boyutu iki araştırmacı tarafından saptandı. Periapikal lezyonlar radyolusent alanın uzun aksı 1 cm'den kısa ise küçük, eşit veya büyükse büyük olarak sınıflandırıldılar.
İlgili dişler rubber dam ile izole edildi. Pulpa odasına girildi ve giriş yolu kavitesi düşük hızda, round frezlerle gerçekleştirildi. Diş kökünde kanalda çalışma boyunun hesaplanmasını takiben, kök kanalı #40'a kadar genişletildi. Kök kanalı steril ka-ğıt koniler ile kurutulduktan sonra, iki #40 kaka-ğıt koni (Absorbent paper points, Kerr Manufacturing Co., Romulus, MI) ardı sıra kök kanalına çalışma boyuna kadar itilerek yerleştirildi ve 30 sn süre ile tutuldu. Çıkarıldıktan sonra kağıdın ıslanma uzun-luğu hemen ölçüldü. Toplanan sıvının hacmi daha önce tarif edilen standart eğriden 16 hesaplandı ve µl. olarak ifade edildi. Her iki kağıt koni 250 ml PBS içeren tüplere yerleştirildi, 1 dakika süre ile voteks-lendi ve analiz zamanına kadar -30°C'de saklandı-lar.
IL-1β ve TNF-α düzeyleri ELlSA yöntemiyle belirlendi. Analizler üretici firmanın (Immunotech, Marseille, FRANCE) direktifleri doğrultusunda yü-rütüldü. IL-1β ve TNF-α miktarları her analiz için oluşturulan standart eğri (0'dan 1000 pg/ml) refe-rans alınarak belirlendi. Sitokinlerin her bir örnek-teki konsantrasyonu dilüsyon ve eksuda volümleri hesaba katılarak belirlendi. Sonuçlar mililitre'deki nanogram (ng/ml) olarak ifade edildi.
Periapikal eksuda örneklemesi yapılan dişIe-rin periapikal lezyon şiddeti Periapikal indeks (PAl) ile değerlendirildi. 17 Bu indeks sistemi 1 (sağlık-lı)'den5 (eksaserbasyon bulguları ile şiddetli apikal periodontitis)'e kadar değişen aralıkta değerlendir-me yapmaktadır. İndeks skorları için değerlendirdeğerlendir-me negatoskop üzerinde gerektiğinde büyüteç kul-lanılarak yapıldı.
PAl skorları ve lezyon çapına göre oluşturu-lan gruplar arasında periapikal eksudadaki sitokin düzeyi farklılıkları değerlendirildi. Bu gruplar ara-sında periapikal eksuda IL-1β ve TNF-α düzeyleri Mann Whitney U testi kullanılarak karşılaştırıldı. Sitokin düzeyleri, PAl skoru, lezyon boyutu ve ek-suda miktarı arasındaki ilişki Pearson korelasyon analizi ile incelendi.
BULGULAR
IL-1β aktivitesi tüm periapikal eksuda örnek-lerinde tespit edilirken, TNF-α 35 örneğin 25'inde saptandı. IL-1β ve TNF-α konsantrasyonları bü-yük bir değer aralığında değişmekteydi ve IL-1β konsantrasyonu TNF-α 'dan yaklaşık 12 kat daha fazla olarak bulundu (Tablo1).
CİLT: 3, SAYI: 2
Ort.(ng/ml) Std sapma Std hata Minimum Maksimum Tüm örnekler (n=35) IL-1β 72.79 113.03 19.11 0.63 502.35 TNF-α 6.17 8.86 1.50 0.00 32.51 PAl 3 (n=6) IL-1β 48.27 49.63 20.26 2.41 135.74 TNF-α 5.76 5.04 2.06 0.08 13.26 PAl 4 (n=9) IL-1β 75.95 161.89 53.96 0.63 502.35 TNF-α 5.72 5.58 2.86 0.00 27.17 PAl 5 (n=20) IL-1β 78.73 104.63 23.39 1.52 429.11 TNF-α 6.50 10.13 2.27 0.00 32.51 Lezyon boyu ≥1cm (n=l7) IL-1β 117.12 147.38 35.74 1.52 502.35 TNF-α 4.51 8.25 2.00 0.00 32.51 <1cm (n=18) IL-β 30.92 35.89 8.46 0.63 135.74 TNF-α 7.74 9.37 2.21 0.00 30.38
Tablo 1: istatistiksel veriler
Araştırmaya dahil edilen dişler periapikal lez-yonu olduğu için en düşük PAl skoru3 olarak belir-lendi. PAl skorlarına göre oluşturulan gruplardaki sitokin düzeylerinin ortalamaları Tablo 1 'de veril-miştir. En yüksek sitokin düzeyi ortalaması PAl skoru 5 olan grupta, en düşük düzey ise indeks skorunun 3 olduğu grupta elde edildi. Gruplar arasında istatistiksel açıdan anlamlı fark bulunamadı(p>0.05) (Tablo 2). Büyük radyolusent alanlara sahip kanallardan elde edilen eksudalar anlamlı şekilde daha fazla miktarda IL-1β içermekteydi (p<0.05) (Tablo 2).
Mean Rank Mean Rank U Z P
PAl 3 4 IL-1β 9.17 7.22 20.0 -0.825 0.409 TNF-α 9.00 7.33 21.0 -0.708 0.479 PAl 3 5 IL-1β 12.50 13.80 54.0 -0.365 0.715 TNF-α 16.33 12.65 43.0 -1.050 0.294 PAl 4 5 IL-1β 12.50 16.13 67.5 -1.061 0.289 TNF-α 16.00 14.55 81.0 -0.433 0.665 Lezyon boyu >1cm <1cm IL-1β 21.85 14.36 87.5 -2.162 0.031* TNF-α 15.38 20.47 108.5 -1.486 0.137
Tablo 2: PAl skorlarına ve lezyon boyuna göre oluşturulan
gruplar arasında sitokin düzeylerinin karşılaştırılması (Mann Whitney U testi)
Eksuda örneklerindeki sitokin düzeyleri ile PAl indeks arasında ilişki bulunamadı (p>0.05). Ancak IL-1β ile lezyon boyutu, PAl ile lezyon boyutu arasında pozitif, TNF-α düzeyi ile eksuda hacmi arasında negatif korelasyon saptandı (p<0.05) (Tablo 3).
C.Ü. DİŞHEKiMLiGi FAKÜLTESi DERGiSi 2000
IL-1β - TNF-α IL-1β – Pal IL-1β -lezyon boyutu IL-1β Eksuda miktarı TNF-α - PAl
TNF-α - Lezyon boyutu TNF-α - Eksuda miktarı PAl- lezyon boyutu PAl- Eksuda miktarı
Lezyon boyutu - Eksuda miktarı
r -0.140 0.089 0.387 0.195 0.039 -0.184 -0.342 0.539 0.082 0.222 p 0.423 0.610 0.022* 0.261 0.826 0.289 0.044* 0.001* 0.641 0.199 .*İstatistiksel olarak anlamlı (p<O.05).
Tablo 3: IL-1β, TNF-α , PAl, Lezyon boyutu ve Eksuda miktarı arasında Korelasyon (Basit korelasyon analizi-Pearson Korelasyon)
TARTIŞMA
Periapikal granülomalar çok yaygın lezyonlar olmasına rağmen, gelişmesinden sorumlu patolojik mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Peria-pikal kemik rezorbsiyonu periaPeria-pikal lezyon gelişi-minin en belirgin bulgusudur ve IL-1β, TNF-α ve diğer kemik rezorbe edici sitokinler gibi çeşitli enf-lamatuar mediatörler periapikal lezyon eksudasında tespit edilmiştir.13,15 In vitro çalışmalarda, kemik yıkımında IL-1β 'nın TNF-α 'dan 500 kat daha etkili olduğu ve osteoklast aktive edici faktör'ün büyük bir kısmını oluşturduğu bulunmuştur.18,19 Dolayısıyla bu bulgular IL-1β 'nın kemik rezorbsiyonu açısından daha ön planda olduğunu göstermesine rağmen, periapikal eksuda da TNF-α'nın relatif konsantrasyonu henüz belirlenmemiştir. Bu bilgilerden yola çıkılarak, mevcut çalışmada kanal-lardan elde edilen periapikal eksuda örneklerinin ELlSA yöntemi kullanılarak yapılan analizi ile IL1β ve TNF-α düzeyleri belirlendi.
Her iki sitokin, IL-1β ve TNF- α , temelde mo-nonükleer fagosit sistemine ait hücrelerce üre-tilmektedir ve periapikal granülomalarda söz konusu sitokinler için pozitif boyanan hücreler gösterilmiştir. 12 Bu çalışmada, IL -1β tüm periapikal eksuda örneklerinde saptanırken, TNF-α 35 örneğin 25'inde saptandı. IL-1β örneklerde TNF-α 'dan yaklaşık 12 kat daha fazla miktarda mevcuttu. Dahası, IL-1β düzeyleri büyük radyolusent alanlı dişlerin periapikal eksudalarında anlamlı şekilde daha yüksekti ve lezyon boyutu ile arasında pozitif ilişki saptandı. Dolayısıyla, büyük lezyonların eksudalarında daha fazla miktarda bulunmasının yanı sıra kemik rezorbsiyonu stimulasyonunda daha patent
olmasına dayanarak, bu mediatörlerden IL-1β 'nın periapikal kemik kaybında daha önemli rolü olduğu sonucuna varıldı.
Periapikal eksudalarda tespit edilebilir dü-zeylerde TNF-α Safavi ve Rossomando15
tarafın-CiLT: 3, SAYI: 2 tarafından saptanmıştır. Artese ve ark.12 periapikal granülomalarda TNF-α için pozitif boyanan hücreleri görmüşler ve lezyonun patogenezinde kemik rezorbe edici rolü olabileceğini önermişlerdir. Bilgi-lerimize göre bu çalışma periapikal eksudalardaki TNF-α düzeyleri ile klinik bulgular arasındaki ilişkiyi inceleyen ilk araştırmadır. Çalışmadan elde edilen veriler TNF-α düzeylerinin IL-1β düzeyleri ile kı-yaslandığında oldukça düşük olduğunu ve bu sito-kinlerin aralarında bir ilişki olmadığını ortaya koy-muştur. ilginç bir şekilde TNF-α düzeyleri eksuda volümü ile negatif ilişki göstermiş ve klinik bulguların varlığında daha düşük olma eğilimi saptanmıştır. Bu bulgular periapikal eksudadaki TNF-α düzeylerinin enflamatuar şartları yansıtmadığını ortaya koymaktadır. Doku kültür çalışmasında, Stashenko ve ark.18 IL-1β ve TNF-α 'nın kemik rezorbe etkinliği açısından sinerjik etkili olduklarını göstermişlerdir. Ancak bu çalışmada bu tür bir sinerjik etki saptanamamış ve sonuçlar, en azından, periapikal kemik rezorbsiyonunda rol oynamadığını dü-şündürmektedir.
Lim ve ark.20 semptomatik insan periradiküler lezyonlarının daha fazla IL-1β içerme eğiliminde olduklarını göstermiştir. Matsuo ve ark.1 klinik bulgulara göre eksuda örnekleri iki gruba ayrıldı-ğında IL-1β düzeylerinde anlamlı fark bulamamış-lardır. Kuo ve ark.21 supurasyonlu dişlerden elde ettikleri eksuda örneklerinde daha yüksek IL-1β düzeyleri rapor etmişlerdir. Söz konusu çalışmaların verilerinden IL-1β düzeyleri ve klinik bulgular arasındaki ilişkinin çelişkili olduğu anlaşılmaktadır.
Bu çalışmada periapikal lezyonların şiddetini radyografik olarak değerlendiren Periapikal indeks sistemi kullanılmış ve kanallarından eksuda örnekleri alınan lezyonlu dişler indeks skorlarına göre gruplara ayrılmıştır. Gruplarda PAl skoru arttıkça IL-1β düzeyinin de arttığı, TNF-α düzeyinin ise düştüğü saptanmıştır. Ancak indeks skorlarına göre ayrılan gruplar arasında IL-1β ve TNF-α dü-zeyleri açısından anlamlı farklılık bulunamamıştır. Ayrıca her iki sitokin düzeyi ile PAl skorları arasında korelasyon da saptanamamıştır. Lezyon boyutu ile PAl arasında saptanan pozitif ilişki ise beklenen sonuçtur. Kuo ve ark.21 da PAl skorları 2 veya 3 olan grupla skorları 4 veya 5 olan grup arasında IL-1β düzeyleri açısından fark bulamamıştır. Bu çalışmadan elde edilen veriler göz önünde tutuldu-ğunda eksuda örneklerinde belirlenen IL-1β ve TNF-α düzeylerinin PAl sisteminin belirlediği periapikal lezyon şiddetini yansıtmadığı anlaşılmaktadır. Diğer bir anlamda, önceki çalışmaların verilerine de dayanarak, periapikal eksuda örneklerindeki IL-1β ve TNF-α düzeylerinin gerek klinik bulgular, gerekse radyografik bulguları yansıtabilecek duyarlı bir parametre olamayacağı i- 76
18. Stashenko P, Dewhirst FE, Peros WJ, Kent RL, Ago JM. Synergistic interactions between interleukin 1, tumor necrosis factor and Iymphotoxin in bone resorption. J Immunol1987;
YAZIŞMA ADRESi:
Yrd. Doç. Dr. Hanife Ataoğlu S.S. Dişhekimliği Fakültesi Ağız-Diş-Çene Hast. ve Cer. ABD KONYA C.Ü. DİŞHEKiMLiGi FAKÜLTESi DERGiSi2000
leri sürülebilir.
Periapikal granülomaların gelişmesi çevre kemiğin yıkılma hızıyla birlikte seyretmekte olduğu açıktır. Mevcut çalışma periapikal kemik rezorbsi-yonunda IL-1β 'nın etkinliği için ek delil sağlamak-tadır. Ancak, bu çalışmanın sınırları içerisinde, TNF-α düzeylerinin periapikal granülomaların pa-togenezindeki rolü anlaşılamamıştır.
KAYNAKLAR 1. Stern MH, Dreizen S, Mackler BF, Selbst AG, Levy BM. Quantitative analysis of cellular composition of human peri-apical granulomas. J Endodon 1981; 7:117-122.
2. Torabinejad M, Kettering JD. Identification and relative concentration of B and T Iymphocytes in human chronic pe-riapicallesions. J Endodon 1985; 11: 122-125.
3. Matthews JB, Mason Gl. Immunoglobulin producing cells in human periapical granulomas. Br J Oral Surg 1983; 21:192-197.
4. Torabinejad M, Eby WC, Naidort IJ. Inflammatory and immunological aspects of the pathogenesis of human peri-apicallesions. J Endodon 1985; 11 :479-488.
5. Beutler B, Cerami A. Cachectin and tumor necrosis factor as two sides of the same biological coin. Nature 1986; 320:584-588.
6. Lorenzo JA, Sousa SL, Alender C, Raisz LG, Dinarello CA. Comparison of bone resorbing activity in the supernatan ts from phytohemagglutinin-stimulated human peripheral blood mononuclear ce lls with that of cytokines through the use of an antiserum to IL-1. Endocrinology 1987; 121 :1164-1170.
7. Dewhirst FE, Stashenko P, Mole JE, Tsurumachi T. Purification and partial sequence of human osteoclast activating factor: Identity with interleukin 1 b. J Immunol 1985; 135:2562-2568.
8. Tatakis DN, Schneeberger G, Dziak R. Recombinant interleukin-1 stimulates prostaglandin E2 production by osteob-lastic cells: Synergy with parathyroid hormone. Caleif Tissue Int 1988; 42:358-362.
9. Billingham MEJ. Cytokines as inflammatory media tors. Br Med Bul 1987; 43:350-370.
10. McNicholas S, Torabinejad M, Blankenship J, Bak-lan d L. The concentration of prostagBak-landin E2 io human perira-dicular lesioos. J Endodon 1991; 17:97-100.
11. Shimauchi H, Takayama S, Imai-Tanaka T, Okada H. Balance of interleukin-1 b and interleukin-1 receptor antago-nist in human periapicallesions. J Endodon 1998; 24:116-119.
12. Artese L, Piatelli A, Quaranta M, Colasante A, Mu-sani P. Immunoreactivity for interleukin-1 b and tumor necrosis factor-a and ultrastuctural features of monocytes/macrophages in periapical granulomas. J Endodon 1991; 17:483-487.
13. Matsuo T, Ebisu S, Nakanishi T, Yonemura K, Ha-rada Y, Okada H. Interleukin-1a and interleukin-1b in periapical exudates of infected root canals: correlations with the clinical findings of the involved teeth. J Endodon 1994; 20:432-435.
. 14. Takayama S, Miki Y, Shimauchi H, Okada H.
Relati-onship between prostaglandin E2 concentrations in periapical exudates from root canals and clinical findings of periapical pe
riodontitis. J Endodon 1996; 22:677-680.
15. Safavi KE, Rossomondo EF. Tumor necrosis factor identified in periapical tissue exudates of teeth with apical peri-odontitis. J Endodon 1991; 17:12-14.
16. Shimauchi H, Miki Y, Takayama S, Imai T, Okada H. Development of a quantitative sampling method for periapical exudates from human root canals. J Endodon 1996; 22:612615.
17.0rstavik D, Kerekes K, Eriksen HM. The periapical index: A scoring system for radiographic assessment of periapical periodontitis. Endod Dent Traumatol1986; 2:20-34
CİLT: 3, SAYI: 2 18. Stashenko P, Dewhirst FE, Peros WJ, Kent RL, Ago JM. Synergistic interactions between interleukin 1, tumor necro-sis factor and Iymphotoxin in bone resorption. J Immunol1987; 138:1464-1468.
19.5tashenko P, Obernesser MS, Dewhirst FE. Effect of immun cytokines on bone. Immunol lnvest 1989; 18:239-249.
20. Um GC, Torabinejad M, Kettering J, Unkhardt TA, Finkelman RD. Interleukin 1b in symptomatic and asymptomatic human periradicular lesions. J Endodon 1994; 20:225-227.
21. Kuo M-L, Lamster IB, Hasselgren G. Host mediators in endodontic exudates. I.lndicators of inflammation and humoral
immunity. J Endodon 1998; 24:598-603.
