Böbrek iskemi reperfüzyonunda sildenafilin koruyucu etkisi

T.C.

TRAKYA ÜNİVERSİTESİ

TIP FAKÜLTESİ

ÜROLOJİ ANABİLİM DALI

Doç. Dr. Tevfik AKTOZ

BÖBREK İSKEMİ REPERFÜZYONUNDA

SİLDENAFİLİN KORUYUCU ETKİSİ

Dr. Umut TURAN

(Uzmanlık Tezi)

TEŞEKKÜR

Tezin hazırlanmasında emeği geçen tüm hocalarıma ve çalışma arkadaşlarıma

İÇİNDEKİLER

GİRİŞ VE AMAÇ

GENEL BİLGİLER

BÖBREKLERİN HİSTOLOJİK YAPISI ... 5

İSKEMİK REPERFÜZYON HASARI ... 6

SERBEST RADİKALLER ... 6 ANTİOKSİDANLAR ... 11

GEREÇ VE YÖNTEMLER

BULGULAR

TARTIŞMA

SONUÇ

ÖZET

SUMMARY

KAYNAKLAR

EKLER

SİMGE VE KISALTMALAR

cAMP : Siklik Adenozin Monofosfat CAT : Catalase

cGMP : Siklik Guanozin Monofosfat DNA : Deoksiribonükleik Asit GFR : Glomerül Filtrasyon Hızı GMP : Guanozin Monofosfat GSHPx : Glutatyon peroksidaz GST : Glutatyon S-Transferaz H2O2 : Hidrojen Peroksit İ-R : İskemi Reperfüzyon MDA : Malondialdehit NO : Nitrik Oksit PDE : Fosfodiesteraz

ROS : Reaktif Oksijen Ürünleri SOD : Süperoksid Dismutaz SOR : Serbest Oksijen Radikalleri TBA : Tiyobarbitürik asit

1

GİRİŞ VE AMAÇ

Böbrek iskemisi; kısmi nefrektomi, kardiyopulmoner bypass, sepsis, böbrek transplantasyonu, çeşitli ürolojik girişimler ve hidronefrozis gibi çeşitli klinik durumlarda görülür. İskemiden sonra gelişen akut böbrek yetmezliği, tübüler nekroz ve böbrek damarlarında direnç artışıyla karakterizedir (1).

Böbrek iskemisi ve sonradan oluşan reperfüzyon ile birlikte çeşitli derecelerde doku hasarı oluşturmaktadır. Böbrek iskemi reperfüzyon (İ-R) hasarında, iskemi sonrası böbrek fonksiyon bozukluklarında Serbest Oksijen Radikalleri‟nin (SOR) önemli rolü bulunmaktadır (2).

Özellikle parsiyel nefrektomilerde tümörün çıkarılmasından önce böbrek damarlarının klemplenmesi hem kan kaybını önlemekte, hem de cerrahi işlemi kolaylaştırmaktadır. Ancak damarların klemplenme süresinin uzun olması, böbrek dokusunda geri dönüşümsüz hasara yol açmaktadır. Aynı zamanda renal transplantasyonda ve suprarenal aortik anevrizmalarda da benzer prosedürler kullanılmaktadır. Kansız kalan böbrek dokusunda geri dönüşümsüz hasarı azaltmak, kalan böbrek dokusunun geçici iskemiye rağmen fonksiyonlarını koruyup sürdürmesi için birçok çalışma yapılmaktadır.

Selektif bir fosfodiesteraz tip 5 (PDE5) inhibitörü olan sildenafil sitrat (Viagra®), erektil disfonksiyon ve pulmoner hipertansiyonda kullanılan bir ajandır. Sildenafil, selektif olarak PDE5 enziminin inhibisyonu yoluyla siklik guanozin monofosfat (cGMP) yıkımını önlemektedir (3). Bizim bu çalışmadaki amacımız bir PDE5 inhibitörü olan ve cGMP molekülünün parçalanmasını engelleyerek hücre içi kalsiyumu azaltıp trabeküler düz kas gevşemesi yapan sildenafilin böbrek hasarını önleyip önleyemediğinin ortaya konulmasıdır.

2

GENEL BİLGİLER

ANATOMİ

Böbrekler

Böbrekler, insan organizmasında topografik olarak en iyi korunmuş organlardır. Arkasında kalın sırt kasları, üstte ve yanda 11. ve 12. kostalar ile, önde ve yanda karın duvarı kasları ile çevrilmişlerdir. Bu kas tabakasının altında pararenal yağ dokusu, onunda altında renal fasya (Gerota) bulunur. Bu fasia önde periton ile yapışık olup böbreği destekleyip sarar ve bir çeşit bariyer oluşturur. Karaciğerin konumu nedeni ile sağ böbrek sola oranla daha aşağıda yerleşmiştir (4).

Erişkin erkekte normal böbrek ağırlığı yaklaşık 150 gr'dır. Kadınlarda ağırlık biraz daha düşük olup yaklaşık 135 gr'dır. Uzunluğu 10-12 cm, eni 5-7 cm ve kalınlığı 3 cm'dir.

Renal parankim, korteks ve medulla olmak üzere ikiye ayrılır. Medulla, renal piramid adı verilen multiple konik yapıda segmentler içerir. Her bir piramidin yuvarlak tepesi papilla adını alır ve minör kalikslere açılır.

Renal pelvis, 5-7 ml kapasiteli konik bir yapıdır. Pelvis 2-3 ana majör kalikse bunlarda papillalarda sonlanan bir çok kalikse ayrılırlar.

Böbreğin Vasküler Anotomisi

Böbrek arterleri ve venleri 2. lomber vertebra korpusu düzeyinde, superior mezenterik arterin altından, aort ve vena kava inferior'dan dallanır. Sağ renal arterin çıkışı biraz daha yukarıdandır ve vena kava inferiorun arkasından geçer. Ana renal arter tipik olarak dört ya da daha fazla segmental damarlara ayrılır. İlk ve sabit segmental bölünme posterior daldır.

3

Genellikle ana renal arterden renal hilusa girmeden çıkar ve pelvis renalis arkasından geçerek böbreğin arka tarafını besler. Dört anterior segmental arter dalı tanımlanır. Bunlar anastomoz yapmayan end arterlerdir ve herhangi birinde meydana gelen oklüzyon iskemi ile sonuçlanmaktadır. Segmental arterler renal sinustan sonra lobar arterleri oluşturmaktadır. Bunlarda bölünerek renal parankime girerler ve interlober arterleri oluştururlar. Sonraki seyir Bertini Kolonları ve piramit arasında uzanarak ışınsal tarzdadır. Her bir piramit tabanında interlober arterler arkuat arter olarak devam eder ve kortikomedüller bileşke boyunca böbrek kontürüne paralel seyrederler. Arkuat arterler, dönerek çoklu radial dallar ile interlobüler arterleri oluştururlar. Bu çoklu yan dallar glomerülun afferent arteriollerini yapar. Postglomerüler kapiller sonunda interlobüler venlere drene olurlar ve sırası ile, interlobüler, arkuat, lober ve segmental venler olarak devam ederler. Bazen beş çoğu kez de üç büyük gövde olarak ana renal vende birleşirler. Renal venler parankimde birbirleri ile serbestçe anostomoz yaparlar. Sol renal ven anatomik plandan dolayı sağa nazaran daha uzundur. Böbrek veni daha önde, arter venin arkasındadır (5)( Şekil 1).

Şekil 1. Böbreğin vasküler anotomisi (5)

Renal Papilla, Kaliksler ve Renal Pelvis

Her bir papilla, minör kalikse açılır. Papilla sayıları 4-18 arasında değişebilir. Minör kaliksler, renal toplayıcı sistemin ilk büyük yapısıdır. Renal piramidlerin ve kendilerine uyan minör kalikslerin tipik olarak iki dizilişi vardır. Anterior ve posterior olarak biri diğerine diktir. Minör kaliksler daralarak bir boyun ya da infundibulum oluşturarak diğer minör kalikslerle birleşir, 2 ya da 3 majör kaliks oluşturarak bir renal pelvisle sonuçlanır. Renal pelvis üretere açılarak üreterde devam eder. Anatomik olarak birleşim yeri üreteropelvik

4

bileşkedir. Tüm üst toplayıcı sistem, minör kalikslerden üretere kadar devam eden bir yapıdır (5).

FİZYOLOJİ

Böbrek Fizyolojisi

Böbreğin idrar oluşturma fonksiyonu her biri ayrı bir ünite olan nefronlar tarafından sağlanır. Her bir böbrek, yaklaşık bir milyon nefrondan oluşur. Her nefron, kandan büyük miktarda sıvının filtre olduğu glomerül ve böbrek pelvisi içindeki yolu boyunca, filtre edilen sıvının idrara dönüştüğü uzun bir tübül içerir. Glomerül, diğer kapiller ağlar ile karşılaştırıldığında daha yüksek hidrostatik basınca sahip, dallanan ve anastomoz yapan kapiller bir ağdan oluşmuştur. Glomerül kapillerleri, epitel hücreleri ile örtülmüştür ve tüm glomerül Bowman kapsülü ile sarılmıştır. Glomerül kapillerlerinden filtre olan sıvı, Bowman kapsülü içine ve sonra böbrek korteksinde yer alan proksimal tübül içine akar. Sıvı, proksimal tübülden böbrek medullasına doğru inen Henle kıvrımına akar. İnen kolun ve çıkan kolun alt ucunun duvarları çok incedir, bu nedenle Henle kıvrımının ince kısmı olarak isimlendirilir. Henle kıvrımının inen kolu, kortekse doğru dönüş yaptıktan sonra, tübüler sistemin diğer kısımlarında olduğu gibi duvarı kalınlaşır ve bundan dolayı, çıkan kolun kalın kısmı olarak adlandırılır. Çıkan kalın kolun sonunda, duvarında bir plak içeren kısa bölüme Makula Densa denir. Makula Densa, nefron fonksiyonunun kontrolünde önemli rol oynar. Makula Densadan sonra sıvı proksimal tübül gibi böbreğin korteksinde yerleşmiş olan distal tübüle ulaşır. Distal tübülü, birleştirici tübül ve kortikal toplayıcı tübül izler. Sıvı, buradan kortikal toplayıcı kanala ulaşır. Yaklaşık sekiz ya da on adet kortikal toplayıcı kanalın başlangıç kısımları birleşerek medullada seyreden ve meduller toplayıcı kanal denilen daha geniş bir toplayıcı kanal yaparlar. Toplayıcı kanallar birleşerek giderek daha genişleyen kanalları oluştururlar ve sonunda renal papillanın tepesi aracılığı ile böbrek pelvisine boşalırlar (6).

Normal bir erişkin günde 1000-1500 ml idrar çıkartır. Bu son idrar, glomerüler filtrasyon, tübüler filtrasyon ve sekresyon şeklinde özetlenen ve her bir nefronda ayrı ayrı meydana gelen bir dizi ve oldukça kompleks fonksiyonların sonucudur. Bu son idrarın başlıca özellikleri şunlardır; normal koşullarda 0°C‟de idrar dansitesi 1015-1025 arasındadır. Yani plazmaya göre hipertoniktir. İdrar dansitesi genellikle idrar miktarı ile ters orantılıdır. Böbrekler fizyolojik koşullarda, organizmanın hidrasyon durumuna göre idrarı dilüe (1001-1002'ye kadar) ve konsantre (1035-1036'ya kadar) etme yeteneğine sahiptir. İdrar dansitesi

5

1008-1010 civarında ise izoosmotiktir. İdrar pH'sı sabit olmayıp belirli sınırlar içinde değişir. Böylece asit-baz dengesinin regülasyonunda rol oynar. Normal beslenen bir insanın idrar pH'sı 6.2‟ civarındadır ve 4.8'e inebildiği gibi 8.2'ye kadar da çıkabilir (7).

BÖBREKLERİN HİSTOLOJİK YAPISI

Böbreğin medial kenarı hilum adını alır. Üreterler bu bölgede genişleyerek renal pelvisi oluşturular. Renal pelvis dallanarak kaliksleri oluşturur. Her iki böbrekte de genellikle iki majör kaliks, 10-12 minör kaliks bulunmaktadır. Böbrek dışta korteks ve içte medülla olmak üzere iki bölüme ayrılır. Her böbrek ortalama 2 milyon nefron içerir. Böbreğin yapısal ve fonksiyonel birimi olan nefron birbiri ile bağlantılı bölümlerden oluşur. Nefronun ilk parçası olan Malpighi‟nin renal korpüskülleri korteks dokusu içerisinde yer alır. Her bir nefron renal cisimcik, proksimal kıvrımlı tübül, Henle kıvrımı ve distal kıvrımlı tübülden oluşmaktadır. Her renal cisimcik glomerülden oluşmuştur. Glomerül iki tabakalı epitelyal bir kapsül olan Bowman kapsülü ile sarılmıştır. Kapsülün iç tabakası (visseral tabaka) glomerülün kapillerlerini örter. Dıştaki tabaka pariyetal tabakadır. Bowman kapsülünün pariyetal tabakası ince bir retiküler lif tabakası ve bazal lamina ile desteklenen tek katlı yassı epitelden oluşur.

Glomerülün üzerini saran visseral yaprağın hücreleri ise yıldız şekilli uzantılı hücrelerdir. Bu hücrelere podosit denilmektedir. Glomerül kapillerlerinde, endotel hücreleri ve podositlerin yanı sıra iki ya da daha fazla sayıdaki kapilleri ortak olarak saran bazal laminanın kılıfının bulunduğu bölgelerde kapiller duvarına tutunan mezangiyal hücreler yer alır. Hücreler kendilerini saran ve kapiller duvarına destek olan amorf matriksi sentezler.

Bowman kapsülünün pariyetal yaprağının tek katlı yassı epiteli proksimal kıvrımlı tübüllerde prizmatik epitel şeklinde devam eder. Hücre apeksinde fırçamsı kenarı oluşturan çok sayıda mikrovilluslar bulunur. Hücrelerin büyük olması nedeniyle her enine kesitte, hücrelerin merkezinde yer alan üç ile beş adet küre biçiminde çekirdek bulunur.

Nefronun en uzun ve en geniş parçası olan proksimal tübülün kıvrımlı parçası kortekste seyrederken, düz parçası medullaya doğru inerek henle kulpunun kalın inen parçasını oluşturur.

Henle kulbu kalın inen kol, bir ince inen kol, bir çıkan ince kol ve kalın çıkan koldan oluşan yapıdır. Distal kıvrımlı tübül tek katlı kübik epitelle döşelidir. Distal tübül hücrelerinde fırçamsı kenarlar bulunmaz. Glomerülün afferent arteriolüne yakın konumda bulunan tubülün yoğunlaşmış epitel hücrelerine Macula Densa denilir. Renal cisimciğin hemen bitişiğinde

6

afferent arteriyolün tunika mediyasında modifiye düz kas hücreleri bulunmaktadır. Bu hücrelere jukstaglomerüler hücreler adı verilir (8).

İSKEMİ REPERFÜZYON HASARI

İskemi ve reperfüzyon sırasında, oksidatif fosforilasyonun değişmesi, ATP‟nin azalması, hücre içi kalsiyum artışı ve membran fosfolipitlerinin bozulmasına öncülük eden proteaz ve fosfatazların aktive olması ile aşırı miktarda SOR oluşur, bunlar oksidatif strese neden olur (2). İ-R hasarında, SOR‟nin önemli bir rol oynadıkları bilinmektedir.

Serbest radikaller, canlı organizmaların yapısındaki hemen hemen tüm biyomoleküllerle reaksiyona girerek bunlar üzerinde geriye dönüşlü veya dönüşsüz etkiler meydana getirebilmektedirler. İskemi sırasında küçük oranda serbest radikal oluşmaktaysa da, reperfüzyon döneminde dokunun yeniden oksijenlenmesinin ardından çok daha büyük miktarda serbest radikal oluşmakta ve bunlar da lipit peroksidasyona yol açarak hasarı arttırmaktadırlar (2) .

SERBEST RADİKALLER

Oksidatif stress, reaktif oksijen türleri ya da serbest radikallerin neden olduğu yoğun hücresel oksidasyondur. Ortaklanmamış (eşleşmemiş) elektron içeren atom, atom grubu veya moleküller serbest radikal olarak tanımlanırlar ve ortaklanmamış elektronlarından dolayı oldukça reaktiftirler (9).

Serbest radikallerin hücre içerisinde oluşma şekilleri, radyant enerjinin absorbsiyonu ile normal fizyolojik olaylar sırasında oluşan redüksiyon-oksidasyon reaksiyonları ile eksojen kimyasal maddelerin enzimatik metabolizmaları iledir. Serbest radikaller pozitif yüklü, negatif yüklü veya elektriksel olarak nötral olabilirler.

Serbest radikaller aracılığı ile gelişen hücre zedelenmesinde özellikle üç reaksiyon ilgilidir;

1-Membranların lipit peroksidasyonu 2-Deoksiribonükleik asit lezyonları 3-Proteinlerin çapraz bağlanması (10).

7

Nitrik Oksit

Nitrik Oksit, canlılarda çok önemli biyolojik fonksiyonları yerine getirmek üzere üretilen bir radikaldir. Paylaşılmamış elektron, nitrojen atomuna ait ise de, bu elektronun hem nitrojen hem de oksijen atomu üzerinde lokalize olması nedeniyle tam radikal özelliği taşımaz. Bunun sonucu olarak, bilinen diğer radikallere göre reaktivitesi baskılandığından oldukça uzun ömürlüdür (11).

Oksijen radikallerinin çok sayıdaki enzimatik ve enzimatik olmayan yolları ve çeşitli fiziksel/kimyasal mekanizmalarla oluşmasına rağmen, vücudumuzda NO sentezini gerçekleştiren mekanizmalar son derece kısıtlıdır.

Vücuda giren nitrat içerikli bileşiklerinin metabolize edilmesi sırasında oluşan NO dışında, endojen NO oluşturan tek kaynak nitrik oksit sentaz enzimidir. Bu enzimin üç farklı komponenti vardır. Bunlar nöronal, endotelyal ve indüklenebilir nitrik oksit sentazlardır. Nöronal ve endotelyal nitrik oksit sentaz enzimleri tarafından üretilen çok düşük derişimdeki NO sinir sistemi ve düz kaslarda hücre içi ve hücreler arası haberci molekül olarak kullanılmaktadır. Haberci (messenger) molekül olarak kullanılan NO sitoplazmik guanilat siklazı aktive ederek hücrelerde Siklik Guanozin Monofosfat (cGMP) derişimini arttırır. Ortamdaki cGMP ise çeşitli enzimler aracılığı ile hücre içi kalsiyum derişiminin düzenlenmesini sağlar. Nitrik Oksit sentazların indüklenebilir formu ise başta fagositik lökositler olmak üzere çeşitli hücrelerde bulunur. İndüklenebilir Nitrik Oksit Sentaz enziminin aktivitesi kalsiyumdan bağımsızdır ve yüksek derişimde NO sentezini katalizler (11).

İndüklenebilir Nitrik oksit sentaz ile NO aşırı üretiminin sepsisteki sistemik vazodilatasyondan sorumlu major mekanizma olduğu düşünülmektedir. Endotelde, vasküler kas hücresinde, makrofajda, mezanşimal hücrede indüklenebilir NO sentaz aktivitesi saptanmıştır. İndüklenebilir NO sentaz; E ndotoksin, Tümör Nekrozitan Faktör, İnterlökin-1 ile uyarılır. Ayrıca aktive nötrofillerin kendileri de bir NO kaynağıdır. Lokal NO üretimi renal kan akımı düzenlenmesinde önemli bir medyatördür. Preglomerüler vasküler direnci, efferent arteriol tonusu ve mikrovasküler akımı düzenler. Nötrofil-endotel hücre ilişkilerini bloke ederek trombosit agregasyonunu ve oksidan salınımını engeller. Hayvan modellerinde NO inhibisyonunun proteinüride artışa, böbrek glomerüler süzme hızında azalmaya ve glomerüler tromboza sebep olduğu gösterilmiştir (11).

Nitrik oksit, oksijenin bağlandığı bölgeye yarışmalı olarak bağlanıp sitokrom oksidazın inhibisyonu ile hücresel solunumu düzenlemektedir. Ayrıca NO bazı durumlarda

8

bir antioksidan gibi davranır ve lipid peroksidasyonundan korur. Bununla birlikte süperoksid düzeylerinin arttığı durumlarda süperoksidle reaksiyona girer ve bir prooksidan olan peroksinitrit oluşturur ve radikal tepkimeleri başlatmaya ilave olarak biyomoleküllerin nitrasyonuna neden olur (12,13).

Düşük derişimde üretilen NO esas olarak oksihemoglobin tarafından nitrata (NO3-) oksitlenerek aktivitesi sonlandırılır. Oksijen radikallerinin aksine, nitrik oksiti ortamdan temizleyen herhangi bir özel enzim yoktur. Aerobik ortamda NO stabil değildir. Derişiminin artması ile oksidasyonu hızlanır. Bu nedenle kendi ömrü ile ortamdaki derişimi arasında ters bir orantı vardır.

Serbest Oksijen Radikalleri ve Reaktif Oksijen Türleri

Serbest oksijen radikali biyokimyasında anahtar rolü oynayan maddeler oksijen (O2),

süperoksid (O2.), hidrojen peroksid (H2O2), ve geçiş metallerinin iyonları ve hidroksil

radikalidir.

Oksijenin elektronları o şekilde dağılmışlardır ki bu elektronlardan iki tanesi eşleşmemiştir. Bu yüzden oksijen bazen bir „diradikal‟ olarak da değerlendirilir. Oksijenin bu özelliği onun diğer serbest radikallerle kolayca reaksiyona girmesini sağlar (11).

1- Süperoksit Radikali: Süperoksit radikali moleküler oksijenin indirgenmesinde bir

ara basamaktır ve oluştuğu yerden uzağa yayılamaz. Bu radikal doğal oksijen molekülünün başka bir molekülden elektron almış halidir. Süperoksit radikali, elektron transfer zincirinde redükt nikotinamid adenin dinükleotid (NADH)‟ın okside nikotinamide dinükleotid (NAD)‟e okside olması ile oluşmaktadır. Genel olarak anyon olarak gösterilmesine rağmen, ortamın pH‟sı ile protonlanarak katyon haline dönüşebilir (14).

Canlılarda oluştuğu gösterilen ilk radikal olan süperoksit, başlıca şu mekanizmalarla üretilmektedir:

1. İndirgeyici özellikteki biyomoleküller oksijene tek elektron verirler ve oksitlenirlerken bir süperoksit radikali oluşur. Hidrokinonlar, flavinler, tiyoller, katekolaminler, ferrodoksinler gibi yüzlerce molekül aerobik ortamda oksitlenirken süperoksit yapımına neden olurlar.

2. Çeşitli dehidrogenazlar ve oksidazlar gibi enzimlerin katalitik etkisi sırasında süperoksit radikali ürün olarak oluşabilir.

3. Enerji üretilir iken tüketilen oksijenin %1-5 kadarı süperoksit yapımı ile sonlanır. Buradaki radikal yapımının nedeni NADH dehidrogenaz ve koenzim-Q gibi elektron

9

taşıyıcılardan oksijene elektron kaçağının olmasıdır. Beklenilenin aksine, oksijenin mitokondri solunumu sırasında bağlandığı ve suya indirgendiği sitokrom oksidaz basamağında radikal yapımı gösterilememiştir.

4. Savunma mekanizmasında görevli olan ve aktive edilen fagositik lökositler bol miktarda süperoksit üreterek fagozom içine ve bulundukları ortama verirler. Antibakteriyel etki için gerekli olan bu radikal yapımı, daha reaktif türlerin oluşumunu da başlatabilirler (11).

2- Hidrojen Peroksit: H2O2, oksijenin indirgenmesi ya da süperoksitlerin enzimatik

ya da non enzimatik dismutasyonu tepkimeleri sonucu oluşur. H2O2 net yük taşımaz ve

biyolojik zarları kolayca geçebilir. Yapısında paylaşılmamış elektron içermediğinden radikal özelliği taşımaz, reaktif bir tür değildir. H2O2 özellikle proteinlerdeki hem grubunda bulunan

demir ile tepkimeye girerek yüksek oksidasyon düzeyindeki ferril demir (FeIV) ve perferril demir (FeV) oluşumuna neden olur. Bu formdaki reaktif demir çok güçlü oksitleyici özelliklere sahip olup, lipid peroksidasyonu gibi radikal tepkimeleri başlatabilir. Belirtilen potansiyel oksitleyici özelliği nedeniyle biyolojik sistemlerde oluşan H2O2‟nin derhal

ortamdan uzaklaştırılması gerekir. Bu görevi, hücrelerdeki önemli antioksidan enzimler olan catalase (CAT ) ve peroksidaz enzimleri yerine getirirler (11).

3- Hidroksil Radikali: Hidroksil radikali (●OH), Fenton reaksiyonu ve Haber-Weiss reaksiyonu sonucu hidrojen peroksitten oluşmaktadır. Ayrıca suyun yüksek enerjili iyonize edici radyasyona maruz kalması sonucunda oluşur. Hidroksil radikali son derece reaktif bir oksidan radikaldir, yarılanma ömrü çok kısadır. Hidroksil radikali olasılıkla reaktif oksijen türlerinin en güçlüsüdür. Oluştuğu yerde tiyil radikalleri, karbon merkezli organik radikaller, organik peroksitler gibi yeni radikallerin oluşmasına ve sonuçta büyük hasara neden olur.

H −O− H → H ● + ●OH

4- Singlet Oksijen: Ortaklanmamış elektronu olmadığı için radikal olmayan reaktif

oksijen molekülüdür. Serbest radikal reaksiyonları sonucu meydana geldiği gibi serbest radikal reaksiyonlarının başlamasına da sebep olur Singlet oksijen diğer moleküllerle etkileşime girdiğinde içerdiği enerjiyi ya transfer eder, ya da bağlı tepkimelere girer. Karbon-karbon çift bağları singlet osijenin tepkimeye girdiği bağlardır (11).

10

Serbest Radikallerin Etkileri

Spin kısıtlamasının kalkmış olmasından dolayı reaktivitesi çok yüksektir. Serbest radikaller, hücrelerin lipid, protein, deoksiribonükleik asit (DNA) ve enzim gibi tüm önemli bileşiklerine etki ederler. Sitoplazma, mitokondri, nükleus ve endoplazmik retikulum membranlarında lipid peroksidasyonunu başlatır. Membranlarda lipid peroksidasyonu meydana gelmesi sonucu membran permeabilitesi artar. Proteinlerdeki sistein sülfhidril grupları ve diğer amino asit kalıntıları okside olarak yıkılır, nükleer ve mitokondriyal DNA okside olur. Ayrıca karbonhitratlara da aşağıda bahsedildiği gibi bir takım etkileri söz konusudur.

1-Membran Lipitlerine Etkileri: Serbest radikallerin sebep olduğu lipid peroksidasyonuna "nonenzimatik lipid peroksidasyonu" denir. Hücrede lipid peroksidasyonuna maruz kalan yağ asitleri poliansatüre yağ asitleridir. Yağ asidi ile birleşen radikal, bir dizi tepkimeyi başlatmaktadır. İlk olarak yağ asidi radikalinin oksijen ile birleşmesi sonucu lipit peroksit radikali (ROO● ) meydana gelmektedir.

Lipid hidroperoksidleri bahsedildiği gibi yıkıma uğradığında çoğu aktif olan aldehidler oluşurlar Bu bileşikler ya metabolize edilirler ya da hücrenin diğer bölümlerine hasar verirler. Üç veya daha fazla çift bağ içeren yağ asitlerinin peroksidasyonunda tiobarbitürik asidle ölçülebilen malondialdehit (MDA) meydana gelir. MDA, yağ asidi oksidasyonunun spesifik ya da kantitatif bir indikatörü değildir fakat lipid peroksidasyonunun derecesiyle iyi korelasyon gösterir.

2-Proteinlere Etkileri: Serbest radikallerin çift bağ ve tiyol içeren moleküllerle

reaktivitesinin yüksek olmasından dolayı; triptofan, trozin, fenilalanin, histidin, metionin ve sistein aminoasitleri serbest radikal hasarına duyarlıdır. Serbest radikallerin etkileri neticesinde, immünglobulin G ve albümin gibi proteinlerin yapıları bozulur, fonksiyonlarını yerine getiremezler. Hemoglobin gibi hem proteinleri de serbest radikallerden önemli oranda zarar görürler. Özellikle oksihemoglobinin süperoksit radikali veya H2O2 ile reaksiyonu

methemoglobin oluşumuna neden olur.

3- Nükleik Asitler ve DNA’ya Etkileri: İyonize edici radyasyonla oluşan serbest

11

4- Karbonhidratlara Etkileri: Serbest radikallerin karbonhidratlar üzerine de önemli

etkileri vardır ve diyabetten yaşlanmaya kadar pek çok durumda etkin rol oynadıkları bilinmektedir (9).

Serbest radikallerin hücre ve dokularda neden oldukları zararlar özetlenirse: 1- DNA‟nın tahrip olması,

2- Nükleotid yapılı koenzimlerin yıkımı,

3- Tiollere bağımlı enzimlerin yapı ve fonksiyonlarının bozulması hücre ortamının tiol/ disülfit oranının değişmesi,

4- Protein ve lipidlerle kovalan bağlantılar yapması,

5- Enzim aktivitelerinde ve lipid metabolizmasındaki değişiklikler, 6- Mukopolisakkaritlerin yıkımı,

7- Proteinlerin tahrip olması ve “protein turnover”ının artması, 8- Lipid peroksidasyonu, zar yapısı ve fonksiyonunun değişimi, 9- Zar proteinlerinin tahribi, taşıma sistemlerinin bozulması, 10- Seroid ve yaş pigmenti denilen bazı maddelerin birikimi,

11- Kollajen ve elastin gibi uzun ömürlü proteinlerdeki oksido-redüksiyon olaylarının bozularak kapillerlerde aterofibrotik değişikliklerin oluşması.

ANTİOKSİDANLAR

Serbest radikaller, organizmada normal metabolik yolların işleyişleri sırasında sürekli oluşan ve endojen antioksidanlar adı verilen moleküller tarafından etkisizleştirilen maddelerdir. Ancak belirli düzeyin üzerinde oluştuklarında veya antioksidan sistemin yetersizliğinde serbest radikal molekülleri, organizmanın yapı elemanları olan protein, lipit, karbonhidrat, nükleik asitler ve enzimleri bozarak zararlı etkilere yol açarlar.

Serbest radikaller, organizmada normal metabolik yolların işleyişleri sırasında sürekli oluşan ve endojen antioksidanlar adı verilen moleküller tarafından etkisizleştirilen maddelerdir. Ancak belirli düzeyin üzerinde oluştuklarında veya antioksidan sistemin yetersizliğinde serbest radikal molekülleri, organizmanın yapı elemanları olan protein, lipit, karbonhidrat, nükleik asitler ve enzimleri bozarak zararlı etkilere yol açarlar.

Reaktif oksijen türlerinin oluşumunu ve bunların meydana getirdiği hasarı önlemek için vücutta birçok savunma mekanizmaları geliştirilmiştir. Bunlar antioksidan savunma sistemleri olarak bilinirler.

12

1) SOR‟ni etkileyerek onları tutma veya daha zayıf yeni moleküle çevirme toplayıcı

etkidir.

2) SOR‟yle etkileşip onlara bir hidrojen aktararak aktivitelerini azaltma veya inaktif şekle

dönüştürme bastırıcı etkidir.

3) SOR‟ni bağlayarak zincirlerini kırıp fonksiyonlarını engelleyici etki zincir kırıcı etkidir.

4) Serbest radikallerin oluşturdukları hasarın onarılması onarıcı etkidir (9).

Egzojen ve endojen olmak üzere çeşitli tipte antioksidan maddeler mevcuttur. Bunlardan

Süperoksit dismutaz (SOD), Glutatyon peroksidaz (GSHPx), Glutatyon S-Transferaz (GST), CAT, Mitokondriyal Glutatyon S-Transferaz (GST), Mitokondriyal sitokrom oksidaz sistemi, Hidroperoksidaz enzim olan endojen antioksidanlar iken Melatonin, Seruloplazmin, Transferin, Myoglobin, Hemoglobin, Ferritin, Bilirubin, Sistein, Albumin enzim olmayan antioksidanlardır. Egzojen antioksidanlara ise vitamin C, Askorbik asit, alfa-tokoferol örnek verilebilir (15).

Enzimatik Antioksidanlar

1- Süperoksid Dismutaz: SOD enzimi süperoksidin, hidrojen peroksid ve moleküler

oksijene dönüşümünü katalizler. Selüler bölmelerdeki süperoksid düzeylerini kontrol etmede önemli bir rol oynar.

2 O2 ●‾

+ 2H + → H2O2 + O2

Süperoksit Dizmutazın katalize ettiği reaksiyonun hızı spontan reaksiyonun yaklaşık 4000 katıdır. Enzimin fizyolojik fonksiyonu; oksijeni metabolize eden hücreleri süperoksid serbest radikallerinin zararlı etkilerine karşı korumaktır. Böylece lipid peroksidasyonunu inhibe eder. SOD aktivitesi, yüksek oksijen kullanımı olan dokularda fazladır ve doku pO2

artışı ile artar. Normal metabolizma sırasında hücreler tarafından yüksek oranda süperoksid olmasına rağmen bu enzim sayesinde intraselüler süperoksid düzeyleri düşük tutulur. SOD‟un ekstraselüler aktivitesi çok düşüktür .

2- Katalaz: Her biri bir prostetik grup olan ve yapısında Fe+3 bulunduran 4 hem grubundan oluşmuş bir hemoproteindir (12). CAT‟ın görevi, H2O2‟i oksijen ve suya

parçalamaktır ve 4 tane hem grubu bulunan bir hemoproteindir. Peroksidaz aktivitesine sahip oluşuna ek olarak, bu enzim bir molekül H2O2‟i elektron verici bir substrat olarak, diğerini de

13 2 H2O2 → 2 H2O + O2

Katalazın indirgeyici aktivitesi H2O2‟i ve metil, etil hidroperoksidleri gibi küçük

moleküllere karşıdır. Büyük moleküllü lipid hidroperoksidlerine ise etki etmez (9).

3- Glutatyon Peroksidaz: Özellikle fagositik hücrelerde önemlidirler.

Selenyum-bağımlı ve selenyum-bağımsız iki farklı tipi vardır. Hidroperoksitlerin indirgenmesinden sorumlu enzimdir.

4- Glutatyon Transferaz: Dimerik yapıda olup sitozolde bulunmaktadır. Yabancı

maddelerin biyotransformasyonunda rolleri olan GST‟ler çeşitli endojen ve eksojen bileşiklerin konjugasyonunu katalize eder (15).

Sildenafil Sitrat

Sildenafil, Amerikan Gıda ve İlaç Dairesi tarafından onaylanan ilk oral fosfodiesteraz (PDE) inhibitörüdür. Önceleri antianjinal olarak denenirken ereksiyon yan etkisi nedeniyle dikkat çekmiş ardından da erektil disfonksiyon tedavisinde yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır. Sildenafil sitrat (Viagra®), ereksiyonun hücre içi ikincil habercisi olan siklik guanozin monofosfat (cGMP) yıkımından sorumlu enzim olan PDE5 için seçici bir inhibitördür. Nitrik oksit, vasküler düz kasa girdiğinde siklik guanozin trifosfat‟tan, cGMP oluşumuna yol açan enzim olan guanilat siklazı uyarır. Hücre içi ikincil haberci olan cGMP ise hücre içindeki kalsiyumu ya hücre dışına yada sarkoplazmik retikuluma pompalayarak düz kas gevşemesine yol açar. Prostaglandin E1ise hücre içi kalsiyumu azaltan benzer bir ikinci haberci olan siklik adenozin monofosfat (cAMP) üzerinden etkir. Bu ikincil habercilerin (cAMP, cGMP) yıkımı, bir grup enzim (fosfodiesterazlar) tarafından gerçekleştirilir. Sildenafil, fosfodiesteraz inhibisyonu ile cGMP yıkımını önleyerek, NO‟nın düz kas üzerindeki doğal etkisini arttırır (16). PDE5 aynı zamanda düşük seviyede diğer dokularda da bulunmaktadır. Yaygın kullanıldığı yerlerden biri de vazodilatasyon amacıyla pulmoner hipertansiyondur.

14

GEREÇ VE YÖNTEMLER

Çalışmamızda Wistar Albino türü, ağırlıkları 250 ile 300 gr arasında değişen 4 aylık 36 adet sıçan kullanıldı. İşlemler 1986 Uluslararası Strazburg Hayvan Hakları Evrensel Beyannamesi şartlarına uygun olarak, Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Deney Hayvanları Birimi‟nde Etik Kurulu onayı (Ek-1) ile veteriner hekim kontrolünde gerçekleştirildi. Denekler; Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Deney Hayvanları Birimi‟nin kontrollü ortamdaki standart sıçan kafesleri içinde her kafeste altı sıçan olacak şekilde barındırıldı. Sıçanlar, kemirgenlere özel palet yem ve su ile beslendiler. Hayvan atıklarının uzaklaştırılması, su ve yemlerinin sağlanması, kafeslerin temizlenmesi ve kontrolü merkezin veteriner hekimi ve personelleri tarafından yapıldı. Sıçanlar 6 gruba ayrıldı, deney hayvanı sayıları her grupta 6 sıçan olacak şekilde düzenlendi. Deney hayvanları operasyon öncesi günlük rutinlerini gerçekleştirdiler ve tartı işlemi hemen operasyon öncesi yapıldı.

Grup1‟e kontrol amaçlı sadece laparatomi yapıldı. Grup 2‟ye ise deneyden 1saat önce 1 mg/kg‟dan sildenafil orogastrik tüp ile verildi. Laparatomiyi takiben sol böbrek arteri 30 dk klemplendi. Ardından klemp açılıp 60 dk reperfüzyon sağlandı ve sol nefrektomi uygulanıp cilt kapatıldı. Grup 3‟e deneyden 1 saat önce 1 mg/kg‟dan sildenafil orogastrik tüp ile verildi. Laparatomiyi takiben sol böbrek arteri 45 dk. Klemplenip klemp açılıp 60 dk reperfüzyon sağlandı ardından sol nefrektomi uygulanıp cilt kapatıldı. Grup 4‟e laparatomi yapılıp, sol böbrekte 30 dk iskemi ve 60 dk reperfüzyon yapıldı ardından sol nefrektomi uygulanıp denekler sakrifiye edildi. Grup 5‟e laparatomi yapılıp, sol böbrekte 45 dk iskemi ve 60 dk reperfüzyon yapıldı ve ardından sol nefrektomi uygulandı. Grup 6‟ya oragastrik ile sildenafil

15

verilip laparatomiyi takiben sol nefrektomi uygulandı. Sakrifikasyon cerrahi sırasında ekssanguinasyon metodu ile gerçekleştirildi.

Operasyondan önce sıçanlara, anestezi için %2‟lik ksilazin hidroklorür (Rompun, Bayer) 10 mg/kg ve ketamin hidroklorür (Ketalar, Phizer) 50 mg/kg kombinasyonu intramusküler (im) olarak uygulandı. Sildenafil hazırlığı beher ve havan kullanılarak 100 mg‟lık sildenafil tabletin ezilmesi ve distile su ile 1/1 oranında çözülmesi sureti ile hazırlandı ve kiloya uygun şekilde 0.25-0.35 cc aralığında yeterli olacak şekilde verildi (Şekil 2). Karın bölgeleri tıraş edildikten sonra alttan ısıtmalı ameliyat masasına supin pozisyonunda yatırıldı (Şekil 3). Ardından %10 povidon-iyot ile operasyon alanı silindikten sonra karın üst kısımlarına yapılan 3 cm‟lik median insizyonla cilt, ciltaltı, fasia ve periton açıldı. Sol böbrek bulunarak üreteropelvik bileşke diseke edildi ve renal pediküle ulaşıldı. Ardından dokuyu ezmeyen, arter ve ven ile çalışmaya uygun, 0.4-1.0 mm uzunluğundaki damarlarda kullanılan ve basıncı 5 mm/Hg‟ yi geçmeyen çelik alaşımlı mikrovasküler damar klempleri kullanıldı (Şekil 4-5). Protokol uygulandıktan sonra sıvı kaybı için batın içerisine 2cc sıvı replasmanı gerçekleştirildi ve işlem sonrası sol nefrektomi yapıldı. Çıkarılan böbrekler transvers olarak ikiye ayrıldı, anterior parçalar %10 formol içeren flakonlara alınarak +4o

C‟de saklandı. Posterior parçalar alimünyum folyolara sarılarak -85 o

C‟de saklandı.

Böbrek dokuları bir gece formolde fikse edildi. Dokular daha sonra takip aşamalarından geçirilerek, parafin bloklar hazırlandı. Üç mikrometrelik kesitler alınarak tüm dokular hematoksilen eozin ile boyandı.

Böbreklerde hematoksilen eozin boyasında fokal nekroz, total tübüler nekroz belirlenerek skorlama yapıldı. Skorlama skor 0 hasar yok, skor 1 %50‟den az nekroz ve yapısal hasar mevcut skor 2 %50‟den fazla nekroz ve yapısal hasar var skor 3 ise tamamen nekroz olarak derecelendirildi.

Dokular alındıktan sonra usülüne uygun şekilde kesilip soğuk zincir kurallarına uyularak laboratuvar ortamına taşındı ve çalışma gerçekleştiridi. Lipid peroksidasyonunun son ürünü olan MDA‟nın tiyobarbitürik asit (TBA) ile sıcak ve asit ortamda reaksiyona girmesi sonucu oluşan renk spektrofotometrik olarak ölçüldü. Sonuçlar MDA nmol/g yaş doku olarak ifade edildi. Yöntem olarak Ohkawa ve ark. (17) tarif ettiği yöntem kullanıldı.

İstatistiksel Analiz

İstatistiksel değerlendirme, 10240642 seri numaralı SPSS 19 istatistik programı kullanılarak yapıldı. Ölçülebilen verilerin normal dağılıma uygunlukları tek örnek

16

Kolmogorov Smirnov testi ile bakıldıktan sonra normal dağılım gösterenler için gruplar arası kıyaslamalarda varyans analizi ve post-hoc Dunnett t3 testi normal dağılım göstermeyenler için ise ikili kıyaslamalarda Mann Whitney U testi kullanıldı. Tanımlayıcı istatistikler olarak Median (Min-Max) değerleri verildi. Tüm istatistikler için anlamlılık sınırı p<0.05 olarak seçildi.

Şekil 2. Oragastrik tüp ile hesaplanan dozda sildenafilin verilmesi

17

Sekil 4. Mikrovasküler klemp

18

BULGULAR

Çalışmada İ-R yapılan ve oragastrik ile bir saat önce sildenafil verilen ve verilmeyen gruplar ile kontrol gruplarının böbrekleri alınarak MDA (nmol/g) düzeyleri hesaplanmış ve patolojik bulgular değerlendirilmiştir. MDA‟nın değerleri tablo 1‟de ve gruplara göre istatiksel analizi tablo 2‟de gösterilmiştir.

Patoloji bloklarının istatiksel analizinde ise kontrol grubu olan 1.grup ile sadece sildenafilin verildiği 6. grup arasında anlamlı bir fark saptanmıştır. Ayrıca sildenafil verilip 30dk iskemi 60 dk reperfüzyon yapılan 2.grup ile ilaç verilmeyen ve sadece 30dk iskemi 60 dk reperfüzyon yapılan 4.grup arasında tubüler nekrozun azalması açısından anlamlı bir fark bulunmuş olup nekroz değerleri 4. grup lehine daha yüksek bulunmuştur. Sildenafil verilip 45dk iskemi 60 dk reperfüzyon yapılan 3.grup ile sadece iskemi reperfüzyon yapılan 5.grup arasında anlamlı bir fark saptanmamıştır. Yine aynı şekilde sadece 30 ve 45dk iskemi yapılan gruplar arasında da fark yoktur.1.grup ile diğer tüm gruplar arasında iskemi yönünden anlamlı bir fark gözükmekte olup bu fark iskemi lehinedir. Aşağıdaki tablo 3‟te patolojik inceleme sonucu saptanan tubüler nekroz alanlarının analiz sonuçlarına göre p değerleri verilmiş olup şekil 6, şekil 7, şekil 8, şekil 9, şekil 10 ve şekil 11‟de patoloji preperatlarından kesitler yer almaktadır.

19

Tablo 1. Malondialdehit asitin rat başına bulunan sonuçları

Grup ve Sayılar Doku Ağırlığı Absorbans MDA sonuç

1a 0,163 0,067 0,66 1b 0,130 0,044 0,55 1c 0,123 0,094 1,23 1d 0,123 0,062 0,81 1e 0,148 0,050 0,54 1f 0,188 0,080 0,69 2a 0,172 0,064 0,60 2b 0,151 0,074 0,79 2c 0,196 0,070 0,58 2d 0,157 0,074 0,76 2e 0,169 0,074 0,71 2f 0,160 0,041 0,41 3a 0,115 0,044 0,62 3b 0,150 0,088 0,94 3c 0,156 0,054 0,56 3d 0,146 0,051 0,56 3e 0,124 0,048 0,62 3f 0,116 0,066 0,92 4a 0,171 0,056 0,53 4b 0,184 0,081 0,71 4c 0,183 0,056 0,49 4d 0,200 0,070 0,56 4e 0,177 0,041 0,37 4f 0,177 0,078 0,71 5a 0,119 0,094 1,27 5b 0,136 0,089 1,05 5c 0,187 0,039 0,34 5d 0,166 0,038 0,37 5e 0,147 0,072 0,79 5f 0,171 0,068 0,64 6a 0,162 0,049 0,49 6b 0,138 0,056 0,65 6c 0,159 0,075 0,76 6d 0,180 0,063 0,56 6e 0,168 0,063 0,60 6f 0,196 0,071 0,58

20

Tablo 2. Malondialdehit asitin gruplara göre ortalama değerleri

Gruplar Ortalama Standart Sapma P değeri Grup 1 (6 sıçan) 0,75 nmol/g 0,25 0,608* Grup 2 (6 sıçan) 0,65 nmol/g 0,14 0,608* Grup 3 (6 sıçan) 0,70 nmol/g 0,17 0,608* Grup 4 (6 sıçan) 0,56nmol/g 0,13 0,608* Grup 5 (6 sıçan) 0,74 nmol/g 0,37 0,608* Grup 6 (6 sıçan) 0,60 nmol/g 0,91 0,608*

*MDA düzeyi açısından gruplar arasında istatiksel yönden anlamlı bir fark yoktur. Yapılan ikili kıyaslamalarda da anlamlı bir fark yoktur. (p<0.05 anlamlı)

Tablo 3. Tubüler nekroz bulgularının analiz sonuçları

Grup Median Min-Maks P

1 1 0-2 0,000a 2 1 0-2 0,042b 3 1,5 0-2 0,509c 4 2 0-2 0,000a, b, d 5 1 0-2 0,000a, c, d 6 1 0-2 0,06a

Tablo 3. Tubüler nekroz bulgularının analiz sonuçları. (p<0.05 anlamlı)

a. 1-4.grup, 5 grup ve 6.grup arasında tubüler nekroz yönünden anlamlı bir fark var. b. 2-4.gruplar arasında tubüler nekroz yönünden anlamlı bir fark var.

c. 3-5.gruplar arasında tubüler nekroz yönünden anlamlı bir fark yoktur. d. 4-5. gruplar arasında tubüler nekroz yönünden anlamlı bir fark yoktur

21

Şekil 6. Grup 1, Normal tubül hücreleri HE, X 200

22

Şekil 8. Grup 3, Fokal nekroz alanları HE, X 200

23

Şekil 10. Grup 5, Fokal nekroz alanları HE, X 200

24

TARTIŞMA

Böbrek iskemi reperfüzyon (İ-R) hasarı, böbrek naklinde, parsiyel nefrektomilerde ve suprarenal aortik anevrizmaların cerrahi tedavisi sırasında karşımıza çıkabilmektedir. Son yıllarda böbrek nakli, son dönem böbrek yetmezlikli hastaların tedavisinde geçerli bir tedavi yöntemi olarak kabul edilmektedir. Böbrek naklinde İ-R hasarına bağlı gelişebilecek problemler ise günümüzde hâlâ tam olarak açıklanabilmiş sorunlar olmadığından araştırmalar devam etmektedir.

Böbreklerde deneysel İ-R hasarının etkilerinin ortaya çıkması için belli bir iskemi süresine gerek vardır. Literatürdeki çalışmalar incelendiğinde böbrekte hasar oluşturmaya yönelik olarak karşımıza çeşitli iskemi süreleri çıkmaktadır. Garcia ve ark. (18) böbreğin sıcak iskemi ve reperfüzyona bağlı hemodinamik etkileri inceledikleri çalışmada iskemi süresi 30 dakika tutmuşlardır. Oruç ve ark. (19 ) sildenafilin lökosit infiltrasyonunu azaltarak böbrek İ-R hasarına karşı koruyucu olduğunu gösterdikleri çalışmada iskemi süresi 45 dakika olarak tutmuşlardır. Paller ve ark.(2) iskemiye bağlı akut böbrek yetmezliğinde serbest oksijen radikallerinin etkinliğini gösterdikleri çalışmada 60 dakikalık iskemi süresini tercih etmişlerdir. Bizim çalışmamızda ise 30 dakika ve 45 dakikalık renal iskemi süresi tercih edilmiştir. Altmış dakikalık reperfüzyondan sonra işleme son verilmiştir.

Küçük ve ark. (20) 60 dakika renal iskemi, 90 dakika reperfüzyon uyguladıkları çalışmalarında iskemiden 1 saat önce 1 mg/kg tadalafil ve 1 mg/kg sildenafil kullanmışlar. Hem tadalafilin hem de sildenafilin iskemi reperfüzyon grubu ile karşılaştırdıklarında MDA düzeylerini düşürdüklerini ve ayrıca MDA üzerindeki bu etkinin sildenafil ile daha da belirgin olduğunu göstermişlerdir. Real-time PCR (RT-PCR) ile ölçtükleri iNOS gen ekspresyonunun iskemi reperfüzyon sonucu arttığı ve sildenafil tedavisinin iNOS ve eNOS ekspresyonunu

25

azaltarak MDA üzerindeki azaltıcı etkinliğin muhtemelen bu şekilde oluştuğunu düşünmüşlerdir.

Choi ve ark. (21) böbrek iskemi reperfüzyonunda sildenafil tedavisinin koruyucu etkinliği olduğunu göstermişlerdir. Kandaki üre ve kreatinin düzeylerinin iskemi reperfüzyon öncesi sildenafil verilen grupta azaldığı ayrıca iNOS ve eNOS protein ekspresyonlarının sildenafil ile tedavi edilen iskemi reperfüzyon grubunda, sadece iskemi reperfüzyon yapılan grupla karşılaştırıldığında belirgin olarak arttığını göstermişlerdir. Aynı zamanda bu çalışmada sildenafilin apopitozu engelleyici etkinliği olduğunu ve bunun iNOS, eNOS

üretimini indükleyerek ve Bax/Bcl-2 oranını azaltarak gerçekleştirdiğini düşünmüşlerdir. Garcia ve ark. (18) böbreğin sıcak iskemi reperfüzyondaki hemodinamik değişikliklere karşı sildenafilin etkinliğini araştırmışlardır. Sildenafil 0,7 mg/kg ve 1,4 mg/kg dozunda olmak üzere intravenöz olarak verilmiştir. İskemi süresi 30 dakika ve reperfüzyon süresi 45 dakika olarak uygulanmıştır. Renal vasküler akım ve sistemik arteryel basınç ölçülmüştür. Sildenafilin intra venöz uygulaması kontrol grupları ile karşılaştırıldığında tüm gruplarda sistemik arterial basınç değerlerinde belirgin olarak azalma gösterilmiştir. Bununla birlikte bu değişiklikler özellikle 1,4 mg/kg dozu verildiğinde belirgin olarak ortaya çıkmıştır. Renal vasküler akım 0,7 mg/kg dan verildiğinde daha yüksek olarak saptanmıştır. İlaç iskemiden önce uygulandığında renal vasküler akımın sildenafilin 0,7mg/kg ve 1,4 mg/kg dozlarına göre hafifçe yüksek olduğu saptanmıştır. Böylece bu çalışmanın sonucunda sildenafil sitratın böbreğin iskemi reperfüzyonunda olumlu etkileri olduğu gösterilmiştir.

Bizim çalışmamızda da iskemi- reperfüzyona bağlı gelişen hücresel zedelenmeyi gösterebilmek için lipid peroksidasyonunun bir göstergesi olan MDA düzeylerini ölçmeyi planladık. Diğer çalışmalarda elde edilen sonuçlara göre iskemi-reperfüzyon sonucu MDA değerlerinin artmasını, iskemi reperfüzyon öncesi verilen sildenafilin koruyucu etki göstererek MDA düzeylerindeki artışın bir miktar daha az olmasını bekledik. Ancak bizim çalışmamızda elde ettiğimiz MDA değerleri istatistiksel olarak gruplar arasında bir fark olmadığını gösterdi. Biyokimyasal olarak yeterince destekleyemediğimiz halde histopatolojik değerlendirme sonucu elde ettiğimiz bulgular sildenafilin iskemi reperfüzyon hasarına karşı koruyucu olduğunu gösterdi.

Medeiros ve ark. (22) renal iskemi reperfüzyon öncesi 1 mg/kg dozunda sildenafil gastrik lavaj yolu ile vermiştir. Koruyucu etkinlik histopatolojik değerlendirme ve sintigrafi ile gösterilmiştir. İskemi reperfüzyondan yedi gün sonra belirgin olarak fonksiyonel bozukluk ortaya çıkmıştır. Sintigrafik patern de bulguları destekleyecek şekilde akut tübüler nekroz ile

26

uyumlu olarak saptanmıştır. Sildenafilin tedavisi sonucu reperfüzyonun 24. saatinde kontrol grupları ile karşılaştırıldığında belirgin olarak fonksiyonel düzelme ile uyumludur. Aynı zamanda histopatolojik olarak İ-R‟den 24 saat sonra belirgin olarak ortaya çıkan hücresel nekroz sildenafil ile tedavi edilen ratlarda azalmıştır.

Literatür incelendiğinde sildenafilin iskemi reperfüzyona karşı koruyucu etkinliği başka deneysel modeller kullanılarak ta gösterilmiştir. Bu çalışmaları değerlendirecek olursak Beheshtian ve ark. (23) testiküler iskemi reperfüzyon hasarında sildenafilin koruyucu etkinliğini değerlendirmişlerdir. Bu çalışmada iskemiden 30 dakika önce intraperitoneal olarak sildenafil 0.7 mg/kg dozunda verilmiştir. Reperfüzyonun 4. saatinde alınan testis dokularında MDA değerleri saptanmıştır. Testiküler MDA değerlerinin, sildenafil verilerek iskemi reperfüzyon yapılan grupta sadece iskemi reperfüzyon yapılan gruba göre daha düşük olduğu saptanmış. Ayrıca histolojik inceleme sonucu sildenafilin germ hücrelerindeki apopitozu azaltıcı etkisi olduğu gösterilmiştir.

Yıldız ve ark. (24) düşük doz ve yüksek doz sildenafilin testiküler iskemi reperfüzyon hasarındaki koruyucu etkinliğini değerlendirmişlerdir. Düşük doz sildenafil (0.7 mg/kg) verildikten sonra iskemi reperfüzyon yapılan grupta elde edilen MDA değerleri, sadece iskemi reperfüzyon uygulanan grupla karşılaştırıldığında, belirgin olarak düşük bulunmuştur. Ancak bu çalışmada belirtilen ve dikkati çeken diğer bir nokta; yüksek doz sildenafil (1.4 mg/kg) verildikten sonra iskemi reperfüzyon yapılan grupta elde edilen MDA değerleri ile sadece iskemi reperfüzyon uygulanan grupta elde edilen MDA değerleri arasında bir fark bulunmamış olmasıdır. Patolojik değerlendirme sonucunda da düşük doz sildenafilin koruyucu etkinliği olduğunu ancak yüksek doz sildenafilin histolojik parametreler üzerinde etkisinin olmadığını belirtmişlerdir.

Choi ve ark. (21) yaptıkları çalışmada sildenafil tedavisinin renal iskemi reperfüzyon hasarına karşı renal tübüler hasarı ve apopitozu azalttığını saptamışlardır. Bu çalışmaya benzer olarak Medeiros ve ark. (22) renal iskemi reperfüzyon öncesi verilen sildenafil tedavisinin, iskemi reperfüzyon grubuyla karşılaştırıldığında hücresel nekrozu azalttığını belirtmişlerdir. Küçük ve ark.‟nın (20) çalışmasında ise renal iskemi reperfüzyon hasarı sonrası yapılan histopatolojik inceleme sonucu elde edilen semikantitatif değerlerin hem tadalafil hem de sildenafil tedavisi sonrası azaldığı saptanmıştır. Bizim çalışmamızda da 30 dakika iskemi 60 dakika reperfüzyon uyguladığımız grupla, iskemi reperfüzyon öncesi sildenafil 1 mg/kg verdiğimiz grup karşılaştırıldığında tübüler nekrozun azaldığı saptanmıştır. Bununla beraber 45 dakika iskemi 60 dakika reperfüzyon uyguladığımız grupla, iskemi

27

reperfüzyon öncesi sildenafil 1 mg/kg verdiğimiz grup karşılaştırıldığında tübüler nekroz açısından anlamlı bir fark olmadığı görülmüştür. Ayrıca 30 dakikalık iskemi sonrası 60 dakika reperfüzyon uygulanan grupla, 45 dakikalık iskemi sonrası 60 dakika reperfüzyon uygulanan grup karşılaştırıldığında nekroz açısından fark olmadığı saptanmıştır. Bu sonuçlar değerlendirildiğinde özellikle daha kısa iskemi süresine sahip olan grupta sildenafil tedavisinin etkinliğinin belirgin olarak ortaya çıktığını söyleyebiliriz.

Chintala ve ark. (25) yaptığı çalışmada trombositlerin iskemi reperfüzyon zedelenmesi fizyopatolojisindeki etkinliği değerlendirilmiştir. cGMP miktarını arttıran ajanların kan basıncını düşürücü etkilerinden bağımsız olarak belirgin olarak trombosit birikimini azalttıkları gösterilmiştir. Sonuçta iskemi reperfüzyon hasarına karşı antiplatelet etkinin koruyucu olduğu düşünülmüştür.

28

SONUÇ

Biz çalışmamızda sildenafilin böbrek iskemi reperfüzyonunda koruyucu rolü olup olmadığını araştırdık. Çalışma sonucunda böbrekleri hem histopatolojik açıdan hem de hücre zedelenmesinin bir göstergesi olan MDA düzeyleri açısından değerlendirdik.

Deney sonucunda MDA düzeyleri açısından fark bulunamasa da, histopatolojik açıdan anlamlı bir farka ulaşıldı. Özellikle iskemi süresinin kısa olduğu, iskemiden 1 saat önce sildenafil verilen, 30 dakika iskemi yapılıp 60 dakika reperfüzyon uygulanan 2. grup ile ilaç verilmeyip sadece 30 dakika iskemi sonrası 60 dakika reperfüzyon uygulanan 4. grup arasında histopatolojik açıdan nekrozun sildenafil verilen grupta belirgin olarak azaldığını tespit ettik. İskemi süresinin uzadığı, iskemiden 1 saat önce sildenafil verilip, 45 dakika iskemi ve 60 dakika reperfüzyon uygulanan 3. grup ile ilaç verilmeyip sadece 45 dakika iskemi ve 60 dakika reperfüzyon uygulanan 5. grup arasında ise fark saptanmadı. Sildenafil verilip 6.grupta MDA ve histopatolojik olarak istatistiki açıdan anlamlı olmayan çok seyrek focal nekroz alanları görülmüştür. Ancak bunun bir yorumu yapılamamıştır. Bu bulgular bize sildenafilin iskemi süresinin uzadığı durumlarda koruyucu etkisinin belirgin olarak ortaya çıkmadığını ancak kısa iskemi sürelerinde ise koruyuculuğu olduğunu düşündürmektedir.

29

ÖZET

Bu çalışmada amaç böbrek hasarında yani iskemi reperfüzyonda sildenafilin koruyucu rolü olup olmadığını ortaya koymak ve iskemi süresinin bu mekanizmaya etkisini araştırmak idi. Bu amaçla her biri 6 „„rat‟‟tan oluşan toplam 6 grup kuruldu. Bu gruplar şöyledir. Grup 1 kontrol grubudur. Grup 2, sildenafil verilip 30 dk iskemi 60 dk reperfüzyon yapılan gruptur. Grup 3‟te ise sildenafil verilip 45 dk iskemi 60 dk reperfüzyon yapılırken, Grup 4‟te 30 dk iskemi ardından 60 dk reperfüzyon yapılmıştır. Grup 5‟e 45 dk iskemi 60 dk reperfüzyon uygulanır iken 6. gruba sadece sildenafil verilerek kontrol grubu oluşturulmuştur. Gerekli işlemler yapıldıktan sonra sol böbrekler alınıp ardından malondialdehit asit düzeylerine bakıldı ve dokular histopatolojik yönden incelendi. İstatistiksel analiz sonrası MDA açısından fark görülmez iken histopatolojik olarak sildenafilin 30 dakikalık iskemi grubunda nekrozu azalttığı ve koruyucu rol üstlendiği ancak bu etkisini 45 dakikalık iskemi süresinde göstermediği sonucuna ulaşıldı.

Anahtar kelimeler: Sildenafil, böbrek iskemi reperfüzyon, malondialdehit asit

30

THE PROTECTIVE EFFECT OF SILDENAFIL ON KIDNEY

ISCHEMIA REPERFUSION

SUMMARY

The purpose of this study is to demonstrate that the protective role of sildenafil to kidney damage another words to ischemia-reperfusion and to investigate the effect of duration of ischemia to this mechanism. For this aim 6 groups that each has 6 rats are formed. These groups are; Group 1 is the control group; Group 2 is the group that is made 30min. ischemia, 60min. reperfusion after sildenafil given. İn Group 3, that is made 45min. ischemia 60min. reperfusion after sildenafil given while in Group 4, that is made 60min. reperfusion after 30min. ischemia. Group 5 is applied to 45min. ischemia, 60min reperfusion; and Group 6 is made control group by giving only sildenafil. After the necessary procedures, left kidneys are taken then malondialdehit levels are examined and tissues are investigated histopathologically. After statistical analysis, there was no significant difference in MDA but that is seen that in 30min. ischemia group sildenafil reduced and controlled the necrosis however this effect not be seen in 45min. ischemia duration.

31

KAYNAKLAR

1. Conesa LE, Valero F, Nadal JC. N-acetyl-L-cysteine improves renal medullary hypoperfusion in acute renal failure. Am J Physiol 2001;281:730-7.

2. Paller MS, Hoidal JR, Ferris TF. Oxygen free radicals in ischemicacute renal failure in rat. J Clin invest 1984;74:1156-4.

3. Goldstein I, Lue TF, Padma-Nathan H, Rosen RC, Steers WD, Wicker PA. Oral sildenafil in the treatment of erectile dysfunction. Sildenafil Study Group. N Engl J Med 1998;338(20):1397-404.

4. Anafarta K, Böbrek Anatomisi, Anafarta K, Bedük Y, Arıkan N. (editörler) Temel Üroloji üçüncü baskı, İstanbul: Güneş Tıp Kitapevleri; 2007: s.1-6.

5. Kabalin JN. Retroperiton, böbrek ve üreterlerin cerrahi anatomisi (Çeviri: Dr. M. Sevük) Anafarta MK, Yaman MÖ (Editörler), Campbell Üroloji‟de, Sekizinci baskı, İstanbul: Güneş Kitapevi; 2005: s.3-40.

6. Öner G, Böbreklerde İdrar Oluşumu: I. Glomerüler Filtrasyon, Böbrek Kan Akımı ve Bunların Kontrolü, Arthur C, Guyton MD, John E, Hall PhD, Tıbbi Fizyoloji‟de, Onbirinci basım, İstanbul: Nobel Tıp Kitapevleri, 2007: s.364-79.

7. Müftüoğlu Y, Böbrek Fizyolojisi, Anafarta K, Bedük Y, Arıkan N. (Editörler) Temel

Üroloji Üçüncü baskı İstanbul: Güneş Tıp Kitapevleri, 2007: s. 27-30.

8. Eşrefoğlu M, Özel Histoloji, Üriner Sistem, Birinci baskı, Ankara: Medipres Matbaacılık, 2009: s.157-77.

9. Akkuş İ, Serbest radikaller ve fizyopatolojik etkileri. Konya: Mimoza Yayınları, 1998. 10. Eliaçık M, Turhan G, Hücresel Düzeyde Hipoksi, Kumar Cotran Robbins In Pathology

32

11. Kılınç A. Oksijen Toksisitesinin Aracı Molekülleri Olarak Oksijen. Hacettepe Tıp Dergisi 2002;33(2):110-8.

12. Vincent AM, Russell JW, Low P, Feldman EL. Oxidative Stress in the Pathogenesis of Diabetic Neuropathy. Endocrin. Rev. 2004; 25:612-28.

13. Pratic`o D. Antioxidants and endothelium protection. Atherosclerosis, 2005;181:215-24. 14. Memisogulları R. Diyabet‟te Serbest Radikallerin Rolü ve Antioksidanların Etkisi, Düzce

Tıp Fakültesi Dergisi; 2005;3:30-9.

15. Şener G, Yeğen B. İskemi Reperfüzyon hasarı. Klinik Değişim Dergisi 2008;11:6-13. 16. Gregory A. Broderick, MD, Tom F. Lue, (Çeviri: M. Kendirci, B. Altay, C. Çevik )

Anafarta MK, Yaman MÖ (Editörler), Campbell Üroloji, Sekizinci baskı, İstanbul: Güneş Kitapevi; 2005; s.1619.

17. Ohkawa H, Ohishi N, Yagi K. Assay for lipid peroxides inanimal tissues by thiobar bituric acid reaction. Analt Biochem 1979;95:351-8.

18. Lledo-Garcia E, Subira-Rios D, Ogaya-Pinies G, Tejedor-Jorge A, Cañizo-Lopez JF, Hernandez-Fernandez C. Intravenous Sildenafil as a Preconditioning Drug Against Hemodynamic Consequences of Warm Ischemia Reperfusion on the Kidney. J Urol. 2011; 186:331-3.

19. O.Özgür, Kubilay İ, Tuncay F, Zeybek D, Sevda F, Kamer Kılınç. et al. Sildenafil attenuates renal ischemia reperfusion injury by decreasing leukocyte infiltration. Sildenafilin Acta Histochem 2010; 112 (4):337-44.

20. A.Küçük, M.Yücel, M.Tosun, T. Köken, M.Ozkurt, S.Erkasap. The effects of PDE5 inhibitory drugs on renal ischemia/reperfusion injury in rats. Mol Biol Rep DOI 10.1007/s11033-012-1843-1.

21. Choi DE, Jeong JY, Lim BJ, Chung S, Chang YK, Lee SJ. et al. Pretreatment of sildenafil attenuates ischemia-reperfusion renal injury in rats. Am J Physiol Renal Physiol 2009;297(2):362 -70.

22. Medeiros P, Neto A, Pignataro Lima F, Medeiros Azevedo İ, Sousa Leão R, Cunha Medeiros A, Effect of sildenafil in renal ischemia reperfusion injury in rats. Acta Cir Bras 2010;25(6):490-5.

23. Beheshtioan A, Hassanzadeh Salmasi A, Payabvash S, Kıumehr S, Ghazinezami B, Rahimpour S, et al. Protective effects of sildenafil administration on testicular torsion/detersion damage in rats. World J. Urol 2008;26:197-202.

24. Yıldız H, Durmuş A, Şimşek H, Yaman M, Dose-dependent protective effect of sildenafil citrate on testicular injury after torsiyon/detorsiyon in rats. Androligia 2012;44:300-6. 25. Chintala MS, Bernardino V, Chiu PJ. Cyclic GMP but not cyclic AMP prevents renal

platelet accumulation after ischemia-reperfuzion in anesthetized rats. J Pharmacol Exp Ther. 1994 Dec;271(3):1203-8.

33

EKLER

34