T.C.
GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI
FARKLI DOZLARDAKİ KADMİYUMUN MAYDANOZ (Petroselinum hortense Hoffm) BİTKİSİNDE FOTOSENTETİK PİGMENTLER ve OKSİDATİF ENZİM
AKTİVİTERİNE ETKİSİ
YÜKSEK LİSANS TEZİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI
Hazırlayan: Yakup ULUSU
Danışman: Yrd.Doç.Dr.Lokman ÖZTÜRK
T.C.
GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI
FARKLI DOZLARDAKİ KADMİYUMUN MAYDANOZ (Petroselinum hortense Hoffm) BİTKİSİNDE FOTOSENTETİK PİGMENTLER ve OKSİDATİF ENZİM
AKTİVİTERİNE ETKİSİ
YÜKSEK LİSANS TEZİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI
Hazırlayan: Yakup ULUSU
Danışman: Yrd.Doç.Dr.Lokman ÖZTÜRK
FARKLI DOZLARDAKİ KADMİYUMUN MAYDANOZ (Petroselinum hortense Hoffm) BİTKİSİNDE FOTOSENTETİK PİGMENTLER ve OKSİDATİF ENZİM
AKTİVİTERİNE ETKİSİ
YAKUP ULUSU
YÜKSEK LİSANS TEZİ BİYOLOJİ ANABİLİMDALI
FARKLI DOZLARDAKİ KADMİYUMUN MAYDANOZ (Petroselinum hortense Hoffm) BİTKİSİNDE FOTOSENTETİK PİGMENTLER ve OKSİDATİF ENZİM
AKTİVİTERİNE ETKİSİ
YAKUP ULUSU YÜKSEK LİSANS TEZİ
BİYOLOJİ ANABİLİM DALI
Bu tez 06/09/2007 tarihinde aşağıda belirtilen jüri tarafından oybirliği ile kabul edilmiştir.
Üvanı, Adı Soyadı İmza
Başkan : Doç.Dr.Şaban TEKİN
Üye : Yrd.Doç.Dr.Lokman ÖZTÜRK Üye : Yrd.Doç.Dr.Mahfuz ELMASTAŞ
ONAY
Bu tez, 29/08/2007 tarih ve 31 sayılı Enstitü Yönetim Kurulu tarafından belirlenen jüri üyelerince kabul edilmiştir.
…/…/2007 Enstitü Müdürü
ÖZET
FARKLI DOZLARDAKİ KADMİYUMUN MAYDANOZ (Petroselinum hortense Hoffm) BİTKİSİNDE FOTOSENTETİK PİGMENTLER ve OKSİDATİF ENZİM
AKTİVİTERİNE ETKİSİ
YAKUP ULUSU
Gaziosmanpaşa Üniversitesi
Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı
Yüksek Lisans Tezi 2007, 56 sayfa
Danışman: Yrd.Doç.Dr.Lokman ÖZTÜRK
Jüri : Doç.Dr.Şaban TEKİN
Jüri : Yrd.Doç.Dr.Lokman ÖZTÜRK Jüri : Yrd.Doç.Dr.Mahfuz ELMASTAŞ
Bu çalışmada maydanoz (Petroselinum hortense Hoffm) bitkileri üç ay kontrollü ortamda yetiştirildikten sonra 15 gün süre ile 75, 150 ve 300 µM CdCl2 uygulanmış ve katalaz,
peroksidaz, askorbat peroksidaz enzim aktiviteleri tayin edilmiştir. Bunun yanında çalışmada; total fenolik madde, hidrojen peroksit, total klorofil, karotenoid, prolin ve protein miktarları belirlenmiştir. Kadmiyum katalaz aktivitesini azaltırken, askorbat peroksidaz aktivitesini değiştirmemiştir. Peroksidaz aktivitesi 150 µM CdCl2
konsantrasyonunda önemli oranda artmıştır. Kadmiyum total fenolik madde, hidrojen peroksit, prolin ve protein miktarlarını artırırken, klorofil miktarını azaltmıştır. Kadmiyum maydanoz bitkisinde önemli oranda birikmektedir.
ABSTRACT
THE EFFECT OF VARIOUS CADMIUM CONCANTRATIONS ON
PHOTOSYNTHETIC PIGMENTS CONTENT and ACTIVITIES OF OXIDATIVE ENZYMES IN PARSLEY (Petroselinum hortense Hoffm)
YAKUP ULUSU
Gaziosmanpaşa University
Graduate School of Natural and Applied Science Department of Biology
Master Thesis 2007, 56 pages
Supervisor: Asst. Prof. Dr. Lokman ÖZTÜRK
Jury: Assoc.Prof.Dr. Şaban TEKİN Jury: Asst.Prof.Dr. Lokman ÖZTÜRK Jury: Asst.Prof.Dr. Mahfuz ELMASTAŞ
In the present study, three months old parsley plants grown under controlled conditions that were treated with CdCl2 at 75, 150 ve 300 µM for 15 days. After the 15-day treatment with
CdCl2, enzyme activity rates for catalase, peroxidase, ascorbate peroxidase were
determined. In addition to that, total fenolic material, hydrogen peroxide, total chlorophyll, carotenoid, proline and protein contents were also calculated. Results showed that cadmium treatment was decreased catalase activity, ascorbate peroxidase activity was not effected and peroxidase activity was increased dramatically at 150 µM CdCl2. Total fenolic
material, hydrogen peroxide, proline and protein contents increased by cadmium. On the other hand, chlorophyll content revealed a decrease. Results show that cadmium was accumulated in parsley plants and have been significantly affected by the heavy metal contamination.
TEŞEKKÜR
Tez konumun seçilmesi ve çalışmalarımın yürütülmesi sırasında benden hiçbir desteğini ve ilgisini esirgemeyen değerli danışman hocam Yrd.Doç.Dr. Lokman ÖZTÜRK’e, her zaman maddi manevi anlamda daima yanımda olan sevgili aileme sonsuz şükranlarımı sunarım.
İÇİNDEKİLER ÖZET………...i ABSTRACT……...………ii TEŞEKKÜR………..iii ŞEKİLLER LİSTESİ……….……...vii TABLOLAR LİSTESİ………viii 1.GİRİŞ VE LİTERATÜR ÖZETİ ... 1 1.1. Serbest Radikaller... 7 1.2. Antioksidant Sistem... 8
1.3. Ağır Metallerin Bitkiler Tarafından Alınması ... 9
1.4. Rizosferdeki Metallerin Biyoaktivasyonu ... 10
1.4.1. Proton Salınımı ... 11
1.4.2. Organik Asit Salınımı ... 11
1.4.3. Enzimler ... 12
1.4.4. Fitoşelatinler ... 12
1.4.5. Mikroorganizmalar... 13
1.5. Metal Absorbsiyonu ve Taşıyıcılar... 14
1.6. Metallerin Bitkilerde Dağılım ve Detoksifikasyonları ... 14
1.6.1. Hücre Duvarı ... 15
1.6.2. İntraselular Kompleks Oluşturma... 15
1.6.3. Kofullardaki Metallerin Sekresyonu... 17
1.7. Ağır Metallerin İnsanlar Üzerine Etkileri ... 18
2. MATERYAL VE METOD... 20
2.1. Materyal ... 20
2.1.1. Kullanılan Kimyasal Maddeler... 20
2.1.2. Kullanılan Cihaz ve Aletler ... 20
2.1.3. Kullanılan Çözeltiler ... 21
2.1.3.2. Katalaz Aktivitesinin Ölçülmesi İçin Kullanılan Çözeltiler……….21
2.1.3.3. Peroksidaz Aktivitesinin Ölçülmesi İçin Kullanılan Çözeltiler...…….21
2.1.3.4. Askorbat Peroksidaz Aktivitesinin Ölçülmesi İçin Kullanılan Çözeltiler ………….………..22
2.1.3.5. Total Fenolik Madde İçeriğinin Belirlenmesinde Kullanılan Çözeltiler...22
2.1.3.6. Hidrojen Peroksit İçeriğinin Belirlenmesinde Kullanılan Çözeltiler…....22
2.1.3.7. Fotosentetik Pigment İçeriğinin Belirlenmesinde Kullanılan Çözeltiler..23
2.1.3.8. Prolin Miktarının Belirlenmesinde Kullanılan Çözeltiler……….23
2.1.3.9. Protein Miktarının Belirlenmesinde Kullanılan Çözeltiler………...23
2.1.3.10. Kadmiyum Miktarının Belirlenmesi İçin Kullanılan Çözeltiler ………23
2.1.3.11. Uygulanan Kadmiyum Çözeltileri………..………23
2.2 Metod ... 24
2.2.1. Bitkilerin Yetiştirilmesi ve Kadmiyum Uygulamaları... 24
2.2.2. Enzim Aktivitelerinin ve Protein Mikarının Belirlenebilmesi İçin Homojenat Hazırlanması……….24
2.2.3. Katalaz Aktivitesinin Belirlenmesi... 25
2.2.4. Peroksidaz Aktivitesinin Belirlenmesi... 25
2.2.5. Askorbat Peroksidaz Aktivitesinin Belirlenmesi... 26
2.2.6. Total Fenolik Madde Miktarının Belirlenmesi... 26
2.2.7. Hidrojen Peroksit Miktarının Belirlenmesi ... 27
2.2.8. Fotosentetik Pigment Miktarının Belirlenmesi... 27
2.2.9. Prolin Miktarının Belirlenmesi ... 28
2.2.10. Protein Miktarının Belirlenmesi ... 28
2.2.11. Kadmiyum Miktarının Belirlenmesi……….29
2.2.12. İstatistik Analiz……….30
3. ARAŞTIRMA SONUÇLARI ... 31
3.1. Kadmiyum Klorürün (CdCl2) Katalaz Aktivitesi Üzerine Etkisi... 31
3.2. Kadmiyum Klorürün (CdCl2) Peroksidaz Aktivitesi Üzerine Etkisi... 32
3.3. Kadmiyum Klorürün (CdCl2) Askorbat Peroksidaz Aktivitesi Üzerine Etkisi... 33
3.5. Kadmiyum Klorürün (CdCl2) Total Fenolik Madde Üzerine Etkisi... 34
3.6. Hidrojen Peroksit Miktarının Belirlenmesinde Kullanılan Standart Grafik ... 35
3.7. Kadmiyum Klorürün (CdCl2) Hidrojen PeroksitMiktarı Üzerine Etkisi ... 36
3.8. Kadmiyum Klorürün (CdCl2) Fotosentetik Pigmentler Üzerine Etkisi... 37
3.8.1. Kadmiyum Klorürün (CdCl2) Total Klorofil Miktarı Üzerine Etkisi ... 37
3.8.2. Kadmiyum Klorürün (CdCl2) Karotenoid Miktarı Üzerine Etkisi ... 38
3.9. Prolin Miktarının Belirlenmesinde Kullanılan Standart Grafik……….39
3.10. Kadmiyum Klorürün (CdCl2) Prolin Miktarı Üzerine Etkisi... 40
3.11. Protein Miktarının Belirlenmesinde Kullanılan Standart Grafik... 41
3.12. Kadmiyum Klorürün (CdCl2) Protein Miktarı Üzerine Etkisi ... 41
3.13. Kadmiyum Klorürün (CdCl2) Kadmiyum Miktarı Üzerine Etkisi ………42
4. TARTIŞMA ... 44
5. KAYNAKLAR... 49 ÖZGEÇMİŞ
Ş
EKİLLER LİSTESİ
Şekil Sayfa
1.1. Rizosferdeki Metallerin Biyoaktivasyonu………...10
3.1. Kadmiyumun katalaz aktivitesi üzerine etkisi…………..……….31
3.2. Kadmiyumun peroksidaz aktivitesi üzerine etkisi …………...……….32
3.3. Kadmiyumun askorbat peroksidaz aktivitesi üzerine etkisi ……..…………...………33
3.4. Total fenolik madde miktarının belirlenmesi için kullanılan standart grafik…………34
3.5. Kadmiyumun total fenolik madde miktarı üzerine etkisi ………....……….35
3.6. Hidrojen peroksit miktarının belirlenmesinde kullanılan standart grafik………..……36
3.7. Kadmiyumun hidrojen peroksit miktarı üzerine etkisi...36
3.8. Kadmiyumun total klorofil miktarı üzerine etkisi...37
3.9. Kadmiyumun total karotenoid miktarı üzerine etkisi.………...38
3.10. Prolin miktarının belirlenmesinde kullanılan standart grafik………...………...39
3.11. Kadmiyumun prolin miktarı üzerine etkisi…...40
3.12. Protein miktarının belirlenmesinde kullanılan standart grafik……….41
3.13. Kadmiyumun protein miktarı üzerine etkisi………42
TABLOLAR LİSTESİ
Tablo Sayfa
3.1. Kadmiyumun katalaz aktivitesi üzerine etkisi (EÜ/g yaprak/Protein miktarı)………..31 3.2. Kadmiyumun peroksidaz aktivitesi üzerine etkisi (EÜ/g yaprak/Protein miktarı)……32 3.3. Kadmiyumun askorbat peroksidaz aktivitesi üzerine etkisi (EÜ/g yaprak/Protein miktarı)………33 3.4. Kadmiyumun total fenolik madde miktarı üzerine etkisi (mg/g)………..……….…....35 3.5. Kadmiyumun hidrojen peroksit miktarı üzerine etkisi (µM /g)……..………..…….…37 3.6. Kadmiyumun total klorofil miktarı üzerine etkisi (mg/g)..………..……..38 3.7. Kadmiyumun total karotenoid miktarı üzerine etkisi (mg/g)……….…..……….…….39 3.8. Kadmiyumun prolin miktarı üzerine etkisi (µg/g)….………..………..40 3.9. Kadmiyumun protein miktarı üzerine etkisi (mg/g)…..………..…….…..42 3.10. Kadmiyumun yapaklardaki kadmiyum miktarı üzerine etkisi (ppm/g)………...43
1.GİRİŞ VE LİTERATÜR ÖZETİ
Endüstrileşme ve kentleşmenin doğada meydana getirdiği en önemli sorunlardan birisi çevre kirliliği olarak kabul edilmektedir. Toprak su ve hava kirliliğine ağır metallerin büyük katkısı vardır (Zengin ve Munzuroğlu, 2004). Son dönemlerde madenlerin metal ve kimya fabrikalarının, çok yaygın olarak kullanılan metal içeren mantar ilaçları ile ahşap koruyucularının, büyük sanayi komplekslerinin yaydığı gaz ve tozların toprak ve bitkileri kirlettiği belirtilmektedir. Kirlilik bu gibi alanlardan çok daha fazla uzak bölgelerde dahi görülebilir. Örneğin havaya karışan kadmiyum partikülleri yere ya da suya düşmeden önce çok uzun mesafeler kat edebilir. Zehirli atık depo alanlarında gerçekleşen sızıntı ve taşkınlar sonucunda suya veya toprağa karışabilir. Toprak partiküllerine güçlü bir şekilde bağlanır. Bazı kadmiyum bileşikleri suda çözünebilir ancak doğada parçalanmaz (Çatak ve ark., 2000).
Özellikle yirminci yüzyılın ikinci yarısında endüstri gelişimine bağlı olarak ortaya çıkan ve artarak devam eden hava kirliliği günümüzde bütün canlıları tehdit eder bir duruma gelmiştir. Bu tehdit ekosistemlerin primer üreticileri konumundaki bitkiler üzerinde çok daha fazladır (Munzuroglu, 2000).
Bir Akdeniz ülkesi bitkisi olan maydanoz kök ve yapraklarından yararlanmak amacıyla üretilir. Yeşil yaprakları yemek ve mezelerde garnitür olarak kullanılırken köklerinin de bazı yemek ve çorbalarda kullanıldığı bilinmektedir.
Birçok ülkede olduğu gibi ülkemizde de 12 ay boyunca sofralardan eksik olmayan maydanoz E vitamini bakımından oldukça zengin ve kokulu bir sebzedir. Üreticilere de yıl boyunca sürekli gelir sağlayarak ekonomik gelirde de önemli bir yer tutar.
Maydanoz ticari olarak Akdeniz, Ege ve büyük çaplı olarak Marmara Bölgesi’nde üretilirken, uygun iklim koşullarına sahip bütün bölgelerimizde bahçelerde küçük çaplı olarak yetiştirilir.
Maydanoz Akdeniz ülkelerinin bitkisidir. İspanya, Yunanistan, Fas, Cezayir ve Tunus’da bol miktarda yabani maydanoz bulunduğu bilinmektedir. Yetiştiriciliği M.Ö. 4000 yıllarına kadar dayanır ve 2000 yıldan beri kültürü yapılmaktadır. Eski eserlerde Mısırlıların, Romalıların ve Yunanlıların maydanozu hoş kokusu nedeniyle ürettikleri, tıbbi ve baharat bitkisi olarak kullandıkları bildirilmektedir (Vural ve ark. 2000).
Maydanoz normal olarak iki yıllık bir kültür bitkisidir. Birinci yıl yaprak ve yeşil aksamını, ikinci yıl ise çiçek ve tohumlarını oluşturur. Bunun yanında kökler toprak içerisinde uzun yıllar kalabildiği için çok yılık bitkiler grubunda da görülür. Ülkemizde yılda 32 000 ton maydanoz üretimi yapılmaktadır (Vural ve ark. 2000).
Doğal olarak çevrede bulunan metaller, kayalarda, toprakta, bitkiler ve hayvanlarda mevcutturlar. Metaller suda çözünen iyonlar şeklinde, gaz şeklinde veya kayalar, kum ve topraklarda mineraller veya tuzlar formunda bulunurlar. Metaller organik veya inorganik moleküllere de bağlı olabilirler veya havadaki partiküllere bağlıdırlar. Hem doğal hem de antropojenik prosesler ve kaynaklar su ve hava içerisinde metallerin yayılımına sebep olurlar (Çatak ve ark., 2000).
Özellikle ağır metal kirliliği bu tip topraklar üzerinde yaşayan bitkiler için büyük bir tehlikedir. Bu yüzden de bu tür ağır metal kirliliği görülen topraklar üzerinde farklı ıslah prosedürleri uygulanarak verimlilik restorasyonuna yönelik yoğun çalışmalar yapılmaktadır (Leon et al. 2002).
Ağır metaller inorganik maddelerin büyük bir grubudur ve onlar yeryüzünün büyükçe bir kısmına yayılmışlardır. Bu bölgeler genellikle pis su atık alanları, belediye atıkları, pestisitler, gübreler ve belediye çöp alanlarından çıkan gazlar, araba eksoz gazları, metal madenleri ve koku endüstrisidir (Garbisu and Alkorta, 2003). Bununla beraber metaller şu anda doğal olarak yerkürede de bulunurlar. Örneğin; Cu, Fe,Mn, Ni, Zn gibi pek çok metal hücreler için esansiyeldir (Halim et al., 2003). Bütün metaller yüksek konsantrasyonda toksiktir. Özellikle çoğu metal ve metalloid türleri istenmedikleri yerlerde bulunduklarında birer kirletici olarak sayılabilirler. Bunların yüksek konsantrasyonları
çevre ve insan sağlığına da etkilidir (McIntyre, 2003). Topraktaki metal konsantrasyonu orijini ne olursa olsun aşırı seviyede toprak kalitesinde azalma, ürün veriminde azalma ve düşük kaliteli zirai ürünlerin meydana gelmesine neden olurlar. Bu durum ise insan, hayvan ve ekosistem sağlığı için bir risktir. Bunlar genelde As, Cd, Cr, Cu, Pb, Hg, Ni, Se, Ag ve Zn gibi metal ve metalloidleri içerir. Al, Cs, Co, Mn, Mo, Sr, Ur gibi doğada daha az bulunan bazı metal türleri de birer kirletici olarak sayılabilir (McIntyre, 2003).
Topraklara karışan kadmiyumun (Cd) %54-58’inin fosforlu gübrelerden , % 39–47’ sinin atmosferden ve % 2–5’ nin kanalizasyon atıklarının kullanımından kaynaklandığı bildirilmektedir (Alloway 1990). Kabata-Pendias ve Pendias (1984), topraklar için 0.02–4 ppm Cd değerlerini normal, Cr için 0.1–1 ppm normal, Co için 0.5–6.5 ppm normal, Pb için 2–300 ppm, Ni için 2–750 ppm’in normal olduğunu kabul etmektedirler
Ağır metaller bitki dokularında aşırı biriktiği zaman canlılıkla ilgili çeşitli büyüme fonksiyonlarının değiştirebilir. Bunlara ek olarak mineral beslenme, transpirasyon, fotosentez, enzim aktivitesi, nükleik asit yapısı, klorofil biyosentezi ve çimlenme gibi bitkinin birçok canlılık olaylarının değişmesine sebep olur. Buna ek olarak ağır metaller membranlarda hasara, hormon dengesinin bozulmasına ve bitki-su ilişkisinin değişmesi gibi pek çok fizyolojik olaya olumsuz anlamda etki yapar (Yıldız ve Aksu, 2005).
Katalaz enzimi (CAT), konsantrasyonu yüksek olan hidrojen peroksitin su ve oksijene kadar parçalanmasını sağlar. Bu enzim yapısında prostetik grup olarak porfirin içerir ve molekül ağırlığı yüksek olan bir enzimdir. Katalaz genellikle bitkilerin yaprak, kotiledon ve kök hücrelerinde peroksizom ve glioksizomlarında bulunur. Bundan farklı olarak ise mısırda bulunan CAT III ise hücrelerin mitokondrilerindedir (Öztürk, 2002).
Katalaz enziminin ana fonksiyonu, moleküler oksijen varlığında hücre metabolizmasının bazı basamaklarında sentezlenen, radikal özellikli hidrojen peroksit veya ROOH gibi herhangi bir peroksitin radikal özelliğini gidererek oluşturabilecekleri geri dönüşümsüz hasarların önüne geçmektir. Zira hidrojen peroksit, singlet oksijen ve hidroksil radikalinin (OH-)· potansiyel bir kaynağıdır (Öztürk 2002).
Peroksidaz enzimleri, hidrojen peroksit substratını kullanarak pek çok organik ve inorganik maddenin oksidasyonunu katalizleyen enzim grubudur. Peroksidazların molekül ağırlıkları genellikle 35-100 kDa arasında değişmektedir. Peroksidaz enzimleri, fenoller, hidrokinonlar, hidrokinoidaminler (yalnızca benzidin türevi olanlar) gibi pek çok sayıda aromatik komponentlerin dehidrojenasyonlarınıda katalizlemektedirler. Peroksidazlar, çeşitli aromatik bileşikleri substrat olarak kullanarak metabolizmanın sonucunda meydana gelen hidrojen peroksiti etkisiz hale getirirler (Öztürk, 2002)
Askorbat peroksidaz hücrelerde meydana gelen fizyolojik olaylar sonucunda ortaya çıkan hidrojen peroksitin hasarlarını ortadan kaldırır. Bu enzim baskın olarak sitoplazmada, mitokondrilerde ve kloroplastlarda bulunur. Askorbat peroksidaz, hidrojen peroksiti nötralize etmek için askorbatı bir elektron vericisi olarak kullanır. Bu enzim askorbat-glutatyon döngüsündeki ilk enzimdir. Askorbat peroksidaz hidrojen peroksitin suya redüksiyonunu katalizler ve bir redüktant olarak askorbata karşı yüksek bir afinitesi ve spesifikliği vardır (Asada,1999).
Ham maddelerin işlenmesi ile ürünün saklanması sırasında oluşan lipit oksidasyonu besinlerin acılaşmasına neden olan ve böylelikle bozulmaya yol açan bir süreçtir. Lipit oksidasyon ürünleri besinlerin içerisinde bulunan protein gibi diğer maddelerin de absorbsiyonunu etkileyebilir. Okside olmuş lipitlerin organizma üzerine istenmeyen etkileri nedeniyle besinlerdeki lipit oksidasyon ürünlerini inhibe etmenin önemi daha da artmaktadır. Endüstriyel proseslerde besinlerin saklama süresini uzatmak için esas olarak sentetik antioksidanlar kullanılmaktadır. Ancak pekçok araştırıcı uzun süredir besin proseslemede kullanılan BHA (Büthillenmiş hidroksi anisol) ve BHT (Büthillenmiş hidroksi toluen) gibi bazı sentetik antioksidantların canlı organizmalarda karsinojenik etki gösterdiğine dikkat çekmektedirler. Tüketiciler de genellikle doğal antioksidanları sentetik olanlara tercih etmektedir. Fenolik maddeler doğal antioksidanların en önemli gruplarını oluştururlar. Bunlar bitkilerin tüm kısımlarında görülen polifenolik komponentlerdir, en yaygın bitkisel fenolik antioksidanlar flavonoitler, sinnamik asit türevleri, kumarinler, tokoferoller ve fenolik asitlerdir. Bunların besinlerde bulunan ve kolaylıkla oksitlenebilen maddeleri oksidasyondan korudukları bilinmektedir. Bu nedenle uzun yıllardır besinlerin
koku ve tat gibi özelliklerini arttırmak için katkı olarak kullanılan baharat ve aromatik bitkiler giderek önem kazanmaktadır (Tunalıer ve ark., 2002).
Bitkiler kendi besinlerini kendileri üretebilen canlılardır. Bu işi fotosentez yoluyla ve dolayısıyla da fotosentetik pigmentler aracılığıyla yapmaktadırlar. Fotosentetik pigmentler genel olarak klorofil a, klorofil b ve karotenoidler gibi çeşitli pigmentleri içermektedir. Ağır metallerle karşı karşıya kalan bitkilerde klorozis olayının meydana gelmesi kaçınılmazdır. Yapılan çalışmalarda kadmiyumun fotosistem I üzerine fazla bir etkisi olmazken, fotosistem II’ yi inhibe ettiği kanıtlanmıştır (Jiang and Li, 1989).
Bitki dokularında prolin birikiminin önemi henüz tam olarak anlaşılamamıştır. Prolin birikimi bitki hücrelerinin stresten etkilendiği anlamına gelmektedir. Prolin, organizmada glutamattan glutamat γ-semialdehit üzerinden sentezlenir. Proteinlerin yapısına katılır. Prolin, glisin betain ve çözünür karbonhidratlar gibi osmotik etkiye sahip organik maddeler çoğu bitkilerde yüksek tuzlulukla artar. Prolin için önerilen koruyucu rollerden biri proteinlerin çözünürlüğünü artırmasıdır. Sakkaroz ise kuruma zararlarına karşı kloroplastları korumaktadır. Prolinin koruyucu rolünü bazı bitkilerde glisin betain yada sorbitol gibi başka bileşikler üstlenebilir. Bu nedenle tüm bitkilerde prolin birikimi gözlenmeyebilir. Prolinin uyuma ilişkin rolü büyümenin devamından çok canlılığın sürdürülmesi ile ilişkilidir (Greenway, 1980).
Kadmiyum bitki yaşamında daha çok toksik etkileriyle bilinirken; bitkilerin büyüme ve gelişmesi için gerekli değildir. Bitkilerde fotosentez, solunum ve nitrojen metabolizmalarını etkileyerek bitki gelişmesini yavaşlatır ve biyomas miktarında azalmaya neden olur (Dixit et al. 2001; Lanelli et al. 2002). Kadmiyum serbest radikaller ve aktif oksijen türlerini oluşturarak bitkilerde oksidatif strese neden olur. Oluşan bileşikler; lipidler, proteinler, pigmentler ve nükleik asitlerle etkileşerek lipid peroksidasyonuna, membran hasarına ve enzimlerin inaktivasyonuna neden olurlar. Böylece hücrelerdeki metabolik olayları etkileyerek bitkinin büyüme ve gelişmesini önemli ölçüde inhibe etmekte ya da bitkinin ölümüne neden olabilmektedir. Ortamda bulunan kadmiyum konsantrasyonu ve etki süresi arttıkça hasarın derecesi de artmaktadır. Örneğin, tütün
bitkisinde yapılan bir çalışmada toprak kadmiyum konsantrasyonundaki artış ile birlikte fotosentetik hız ve yaprak klorofil içeriğindeki azalmalar kaydedilmiş, kadmiyum fotosistem II’nin fotokimyasal aktivitesini inhibe etmiş, fakat fotosisitem I üzerinde herhangi bir etkisi belirlenememiştir (Jiang et al. 1989; Vitoria et al. 2003/4).
Quariti et al. (1997) tarafından domates ve fasulye bitkilerinde yapılan bir çalışmada ise 0–50 mM CdCl2 içeren besin çözeltilerinin 7 gün süre ile bitkilere
uygulanması durumunda, kadmiyum uygulamasının sürgün ve kök kuru ağırlıkları üzerinde baskılayıcı etkilerini belirtmiş, ayrıca kadmiyum uygulanan bitkilerin kök ve yapraklarında nitrat redüktaz aktivitesinde azalmalar kaydedilmiştir. Quariti ve arkadaşları (1997) tarafından yapılan diğer bir çalışmada ise 0,5 ya da 50 mM kadmiyum ve bakır içeren besin çözeltilerinde yetiştirilen 17 günlük domates fideciklerinde metal konsantrasyonlarındaki artışlara bağlı olarak kadmiyum ve bakır birikiminde artış olduğu belirtmektedirler. Kadmiyum ve bakırın birikimi primer yapraklarda daha yüksek olarak gözlenmiş, yüksek konsantrasyonlarda köklerde ve primer yapraklarda biyomas üretimini şiddetle baskılamıştır. Dixit ve ark. (2001) tarafından yapılan bir çalışmada 7 gün boyunca 4 ve 40 µM Cd konsantrasyonuna maruz bırakılan bezelyelerde metal dağılımları, biyomas, antioksidant ve antioksidant enzimler üzerine etkileri bitkinin kök ve yapraklarında incelenmiştir ve kadmiyumun bitkide biyomas azalmasına sebep olduğu görülmüştür. Maksimum kadmiyum birikimi daha fazla gövde ve yapraklarda görülmüştür. Yapılan araştırmada bitki dokularında lipid peroksidasyonunun artması, hem kök hem de yaprak dokularında H2O2 artışına neden olmuştur. Lannelli ve ark., (2002) yaptığı bir
çalışmada ise; Phragmites australis bitkileri 21 gün yüksek konsantrasyonda CdSO4 (50
µM)’a maruz bırakılmış ve daha sonra bu bitkilerdeki metal dağılımları, antioksidantlar ve antioksidant enzimler üzerine olan etkileri ile redoks potansiyelleri kök, gövde ve yapraklarda incelenmiştir. Burada Cd2+’ nin daha ziyade köklerde biriktiği görülmüştür. Fakat kontrol grubu ile karşılaştırmalar yapıldığında gövdede de birikimin olduğu anlaşılmıştır. Cd ile muamele edilmiş bitki köklerinde hem yüksek miktarda glutatyon (GSH) hem de buna paralel olarak yüksek miktarda glutatyon-S-transferaz (GST) aktivitesi görülmüştür.
Ağır metaller bitkinin klorofil içeriğini de önemli oranlarda etkiler. Cu-Ni içeren topraklarda yetişen Empetrum nigrum’un klorofil miktarı kontrol bitkilerine göre azalma göstermiştir (Monni et al. 2001). Brassica oleracea bitkisine nikel uygulandığında klorofil a ve b’nin miktarında bir azalmanın olduğu, bunun sonucunda yapraklarda nekrozis ve klorozisin meydana geldiği bildirilmiştir. Ayrıca nikelin hem genç hem de yaşlı yapraklardaki kloroplastların yapısal organizasyonunu değiştirdiği, grana ve stroma tilakoidlerinin sayısının azalttığı, kloroplastların şekil ve boyutunun değişmesine neden olduğu tespit edilmiştir (Molas and Bran, 2004). Cladonia pleurota likeni nikel, bakır, kobalt ve demir maruz bırakıldığında klorofil a ve b miktarının kontrollere göre daha az olduğu bildirilmiştir (Baĉkor and Fahselt, 2004). Bakır, çinko ve kurşun Cladonia convoluta ve Cladonia rangiformis likenlerine uygulandığında klorofil a/b oranını azaldığı, stroma ve grana lamellerinde yapısal bozuklukların meydana geldiği, Brassica oleracea var. botrytis klorofil a ve b miktarının kontrole göre azaldığı rapor edilmiştir (Chatterjee and Chatterjee, 2000; Zengin ve Munzuroğlu, 2005).
Hava kirleticilerinin makroskobik, mikroskobik ve biyokimyasal seviyede vejetatif organları önemli derecelerde etkilediği çok sayıda çalışma ile tespit edilmiştir (Zhelijazkov and Nielsen, 1996). Fakat kirlilik sadece vejetatif organları değil, aynı zamanda generatif organları da etkilemektedir. Polenler hava kirleticilerinden en çok etkilenen yapıların basında gelir. Toksik seviyedeki kirleticilerin polen çimlenmesi ve tüp gelisimi üzerinde önemli etkileri vardır. Kadmiyum, kobalt, bakır, çinko, kursun, demir ve civa gibi agır metal iyonlarının polen çimlenmesi ve tüp büyümesini engellediği, polen tüpünün ince yapısını bozduğu çeşitli araştırıcılar tarafından rapor edilmiştir (Munzuroğlu ve Gür, 2000).
1.1. Serbest Radikaller
Serbest radikaller, hücrelerde endojen veya eksojen kaynaklı olarak oluşurlar. Serbest radikaller bir veya daha fazla eşleşmemiş elektrona sahip, ömürleri kısa olan, kararlı olmayan, molekül ağırlıkları düşük ve çok etkin moleküllerdir. Kadmiyum ve
kurşun gibi bazı çevre kirletici ağır metallere maruz kalma durumları oksidatif strese neden olur ki, bu da biyolojik sistemlerdeki istenmeyen birçok olayın altında yatan bir mekanizma olarak değerlendirilebilir. Oksidatif stres basit olarak, antioksidan savunması ile hücrelerdeki lipid peroksidasyonuna da sebep olan serbest radikal üretimi arasındaki bir dengesizlik olarak tanımlanabilir. Serbest radikaller; hidroksil, süperoksit, nitrik oksit ve lipid peroksit radikalleri gibi farklı kimyasal yapılara sahiptirler. Biyolojik sistemlerdeki en önemli serbest radikaller oksijenden oluşanlardır. Örneğin, son derece aktif ve birçok hücrede hasara yol açan süperoksit radikali, süperoksit dismutaz (SOD) ile hidrojen peroksite (H2O2) çevrilir. Süperoksitten çok daha az etkili olan H2O2 dokularda bulunan
katalaz ve peroksidaz gibi enzimler aracılığıyla su ve oksijene dönüştürülerek zararsız hale getirilir (Dixit et al. 2001; Chaoui et al. 2004; Mercan, 2004).
1.2. Antioksidant Sistem
Antioksidantlar, hem direkt hem de dolaylı olarak ksenobiyotiklerin, ilaçların, karsinojenlerin ve bazı toksik radikal reaksiyonlarının istenmeyen etkilerine karşı hücreleri koruyan maddelerdir. Vitamin C, E, A, beta-karoten, metallotionin, poliaminler, melatonin, NADPH, adenozin, koenzim Q-10, ürat, ubikinol, polifenoller, flavonoidler, fitoöstrojenler, sistein, homosistein, taurin, metiyonin, s-adenozil-L-metiyonin, resveratrol, nitroksidler, GSH, bu gruba giren antioksidantlar arasındadır (Mercan, 2004).
Bitkiler antioksidant sistem sayesinde kendilerini çevrenin zararlı etkilerinden (sıcaklık, radyasyon, ağır metal kirliliği) korurlar. Antioksidant sistem antioksidant enzimler ve antioksidant bileşiklerden oluşmaktadır. Antioksidant enzimler; süperoksit dismutaz (SOD), katalaz (CAT), askorbat peroksidaz (APX) ve glutatyon redüktaz (GR) gibi çok sayıda enzimi içermektedir. Antioksidant bileşikler ise karotenoidler, ksantofiller, askorbik asit, glutatyon ve tokoferoller gibi çok sayıda bileşikten meydana gelir. Ayrıca; bitkilerin kadmiyuma maruz kaldığı sürede hücrelerde aktive olmuş çeşitli detoksifikasyon mekanizmaları da rol oynamaktadır. Bunlar; fitoçelatinlerin metallerle kompleks oluşturması, vakuollerde metallerin biriktirilerek depolanması, hücre duvarının
kalınlaşması, plazma zarının geçirgenliğinin azalması ve çok önemli rolleri olan stres proteinlerinin sentezi gibi olayladır (Jemal et al. 1998). Olumsuz çevre şartları bitkilerde stres metabolitlerinin birikimini artırır. Prolin stres metabolitleri içinde en yaygın olanıdır. Bitkilerin su eksikliği, yüksek tuzluluk, soğuk, sıcaklık ve ağır metallere maruz kaldıklarında prolin içeriğinin arttığı görülmüştür. Prolin birikimi çevresel stres indikatörü olarak değerlendirilmektedir (Sharma et al. 1998; Chen et al. 2003).
1.3. Ağır Metallerin Bitkiler Tarafından Alınması
Bitkilerdeki topraktan bitkiye iz metallerin geçişindeki ana süreçler;
a) Kök-mikrop etkileşimi aracılığıyla rizosferdeki metallerin biyoaktivasyonu
b) Plazma membranlarındaki taşıyıcılarda artış
c) Metallerin detoksifikasyonları ve sitoplazmadaki çeşitli ligandlarla şelatlanması (fitoçelatinler, metallotiyoninler, metal bağlama proteinleri… vb.)
d) Metallerin vakuollerin içine tonoplastdaki taşıyıcılar tarafından taşınması gibi basamaklarından meydana gelir (Yang et al. 2005).
Yüksek bitkilerde ağır metal alınımı kompleks bir işlemdir. Bu işlem birkaç farklı süreci içine alır. Bunlar; metallerin kök hücrelerinin plazma membranları boyunca boyunca taşınması, ksileme yüklenmesi, metallerin bitki ve hücre seviyesinde detoksifikasyonu ve sekresyonudur (Lombi et al. 2002).
1.4. Rizosferdeki Metallerin Biyoaktivasyonu
Ağır metallerin çoğu toprakta hareket edemezler ve bitki köklerinde kolayca absorblanamazlar. Örneğin Thlaspi caerulescens için çinko (Zn) alınımıyla total toprak Zn konsantrasyonunun değil; topraktaki serbest Zn konsantrasyonunun ciddi bir ilişkisi vardır. (Knight et al. 1994). Topraktaki ağır metallerin bitki tarafından alınımı ve biyokullanılabilirliği rizosferin; pH’sına, su miktarına, organik maddelere ve diğer elementlere bağlıdır. Bitki köklerindeki ve topraktaki mikroorganizmalar ve onların etkileşimleri rizosferdeki proton, organik asit, fitoçelatin, amino asit ve enzim salınımını artırır (Yang et al. 2005).
1.4.1. Proton Salınımı
Proton salınımı asitliği sağlar ve rizosferdeki metal çözünürlüğünü artırır (Bernal et al. 1994). Bernal ve ark. (1994) pH’nın metal salınımını artırdığını Ni hiperakümülatörü olan Alyssum murale’de göstermişlerdir. Bakır biriktirici bitkiler için pH çok daha az önemlidir. Plazma membranından proton salınımı hidrojen bağımlı H+-ATPaz’ı ve H+ pompasını uyarır. Bunun membran proteinleri üzerine etkileri ve moleküler temelleri günümüzde araştırma konusudur ve henüz aydınlatılamamıştır (Verret et al. 2004).
P-1-B-ATPaz ve AtHMA4 (Arabidopsis thaliana ağır metal ATPaz’ı) Arabidopsis’te Cd ve Zn taşıyıcısıdır. Verret et al. (2004) AtHMA4’ün plazma membranında lokalize olduğunu ve kök vaskular sisteminin etrafındaki dokularca salındığını göstermiştir. Zn, Cd ve Co’ın toksik konsantrasyonu AtHMA4’ün aşırı salınımını durdurur. AtHMA4’ün aşırı salınımı ise köklerde metal birikimini artırır.
1.4.2. Organik Asit Salınımı
Organik asit sekresyonu ağır metalleri hareketlendirir ve bu da kökteki absorbsiyonu artırır. Pek çok düşük molekül ağırlıklı organik asit Cd alınım ve salınımını etkiler. Cd’un topraktaki çözünürlüğünü Cd-LMWOA (düşük molekül ağırlıklı organik asit) formuna dönüştürerek artırırlar (Krisnamurti et al.,1997).
Cielsinki et al. (1998) pek çok düşük molekül ağırlıklı organik asitler bulmuştur. Ör: Asetik asit-süksinat. Bu asit Cd akümülatör genotipli buğdayda varken akümülatör olmayanda yoktur. Aliminyum, buğday da temel aliminyum tolerans mekanizması olarak maleat’ın oksidasyonunu indükler. Bununla beraber plazma membran yüzey potansiyeli ve H+-ATPaz’ın aktivasyonunu da sağlar. Ancak Thlaspi caerulescens’de metal birikiminde kök salgısı ile alakalı olarak zıt sonuçlarda gösterilmiştir. Bazı araştırıcılar da Thlaspi caerulescens’de metal birikimiyle kök salgıları arasında bir ilişki olmadığını öne sürmektedirler (McGrath et al. 1997; Zhao et al. 2001).
Demir eksikliğinde, topraktaki Fe, Zn, Cu ve Mn hareketliliğini sağlamak için fitosideroforlar salınır. Fitosederoforlar bitki tarafından demir alabilmek için salınan ve topraktaki demiri serbest hale geçiren maddelerdir. Bunların sentez mekanizmalarıyla ilgili pek çok geniş kapsamlı araştırma yapılmış, fakat henüz bir kanıt bulunamamıştır. (Romheld, 1991).
1.4.3. Enzimler
Kök redüktazları, bazı dikotillerde düşük Fe ve Cu kaldığı zaman Fe+3 ve Cu+2’yi azaltırlar. Bu azalma Fe, Cu, Mn, Mg alınımını artırır. Arabidopsis ve mısırdan ferrik redüktaz genleri izole edilmiştir. Ancak bu hiperakümülatördeki kök redüktazının karakterizasyonu ile rizosferdeki metal transformasyonu arasındaki ilişki açıklanamamıştır (Welch et al. 1993).
1.4.4. Fitoşelatinler
Fitoşelatinler peptid familyasındandır. İlk olarak mayalarda tanımlanmışlardır. Bu peptidler hakkında var olan bilgilerin çoğu mayada ve de özellikle son zamanlarda Arabidopsis’de yapılan moleküler genetik çalışmalarından sağlanmıştır. Fitoşelatinlerin sentezi Cd, Ni, Cu, Zn, Ag, Hg ve Pb gibi ağır metallere, anyonlara (arsenat ve selenit gibi) maruz kalan hücrelerde hızlıca indüklenir (Rauser, 1995; Yang et al. 2001). Fitoşelatinler sadece üç amino asit içerir ki bunlar; Glutamin (Glu), Sistein (Cys) ve Glisin (Gly)’dir. Fitoşelatinlerin sentezi tripeptit olan glutatyonla ilişkilidir ve ondan enzimatik olarak sentezlenirler. Fitoşelatinler genel olarak –Glu-Cys dipeptit tekrarını izleyen terminal Gly bağlanması şeklindedir. Yani Gly-(-Glu-Cys)n-Gly şeklindedir. Burada “n” genelde 2-5
arasında iken, en fazla 11 olabilir. Arabidopsin’in glutatyon eksik olan mutantında fitoçelatinlerin de eksik olduğu ve Cd’a karşı duyarlı hale geldikleri bildirilmiştir (Cobbet, 2000).
1.4.5. Mikroorganizmalar
Rizosferde büyük oranda mikroorganizma populasyonları vardır. Onlarda ana olarak bakteri ve mikorizal mantarları içerirler. Bu kök bakteri ve mikoriza kolonileri metal iyonlarının alınımı için biyokullanılabilirliği artırırlar. İlk olarak; bunların biyokullanılabilirlik için redoks transformasyonlarını katalizlediği gösterilmiştir. Örneğin; Xanthomonas maltophyla’nın bir suşu çok hareketli olan Cr+6 ve Cr+3 hareketini hem önleyip hem redükleyebilir. Tabi ki kromun da daha az hareketli olan şekli çevreye daha az zararlıdır (Blake et al. 1993). Bazı diğer suşlar ise diğer toksik metallerin transformasyonlarını indükler. (Pb+2, Hg+2, Au+3, Te+4, Ag+4 ve bazılarını da oksijenler SeO4-) (Lasat, 2002). As hareketliliği farklı bir mekanizma ile olur. Bunu da Shewanella alga yapar (Cummings et al. 1999).
Ek olarak T. caerulescens’de toprak mikroorganizmaları Zn birikimini ciddi derecede artırır. Bu Zn’nin çözünürlüğünü artırarak yapar. Bu sayede de biyokullanılabilirliği artırmış olur. İkinci olarak; toprak mikroorganizmaları organik bileşikler salgılarlar ki bunlarda birçok metal için biyokullanılabilirliği ve kök absorbsiyonunu artırır, (Mn+2 ve Cd+2 gibi) dahası fungal simbiyotik birlikler kök absorbsiyon potansiyelini artırır ve bitki besinlerini de içeren metal iyonlarının alınımını sağlar. Mikorizal birliklerin metal alınımı üzerine etkileri tam net değildir. Metale ya da bitkiye göre değişir. Mikorizaların metal alınımını inhibe ettiklerine dair kanıtlarda vardır. Ancak mikorizalar bitkide metal ve metalloid birikiminde de rol alabilirler. Sedum alfiredi bitkisinin rizosferinde normal toprağa oranla çok daha fazla miktarda erimiş Pb ve Zn bulunmuştur. Sedum alfiredi bitkisinden ilk yıl izole edilen Zn ikinci yıldakinden daha az bulunmuştur. Kısaca kök mikrop etkileşimleri de metal alınımında ciddi rol oynar ve bu da ileriki araştırmaların konusunu oluşturacaktır (Salt et al. 1995).
1.5. Metal Absorbsiyonu ve Taşıyıcılar
Transport proteinleri ve intraselülar yüksek bağlama kapasiteli bölgeler plazma membranı boyunca metal alınımına aracılık eder. Metal transport işleminin anlaşılabilmesi çok ciddi genetik mühendisliği çalışmaları ve özel stratejiler gerektirmektedir. Proteinlerin pek çok sınıfı ağır metal transportu ile ilgilidir. Bu grup ağır metal ATPaz’ını içerir ki bu da bitkinin ağır metal toleransında hemoztazisini sağlar (Williams et al. 2000).
CPx tipi ağır metal ATPaz’ı birçok organizmada tanımlanmıştır. İki farklı amino terminal metal bağlama bölgesi içeren ATPaz’lara CPx tipi ATPaz’lar denir. Bunlar Cu, Zn, Cd, Pb gibi toksik metallerin membran boyunca taşınmalarında rol alırlar (Williams et al. 2000). Bu taşıyıcılar çok çeşitli yüklere sahip maddeleri membrandan pompalamak için ATP kullanırlar. Ağır metal metal taşıyıcıları tip 1B olarak sınıflandırılmıştır ve ismi CPx-ATPaz’dır. Arabidopsis’deki PAA1 ilk tanımlanan CPx-CPx-ATPaz’dır. Bu güne kadar tanımlanan çoğu CPx-ATPaz Cu ve Cd taransportunda belirlenmiştir. Ağır metal ATPaz’ının fizyolojik rolü bilinmemektedir. Arabidopsis’de CPx-ATPaz’nın gösterilmesinin ardından diğer bazı benzerleri de başka bitkilerde ve başka substratlar için tanımlanmıştır (Belouchi et al. 1997).
Kısaca metal alınmındaki artış; a) Alım bölgelerinin artışı
b) Alım proteinlerindeki değişiklikler
c) Topraktan ayırma kapasitesi gibi faktörlere bağlıdır (Yang et al. 2005).
1.6. Metallerin Bitkilerde Dağılım ve Detoksifikasyonları
Bitkilerdeki ağır metal detoksifikasyonu için genel mekanizma apoplastik dokudaki dağılımıdır. Buralar;
b) Ligandlarla şelatlanması
c) Vakuolde metal-ligand kompleksinin ayrılmasıdır (Krämer et al., 2000).
1.6.1. Hücre Duvarı
Hücre duvarı Cd, Zn ve Ni hiperakümlatörü bitki hücrelerinde detoksifikasyonda önemli bir rol oynar. Ni ve Zn nin %60-70’i apoplast hücre duvarında bulunur. Ancak hücre duvarının detoksifikasyonda nasıl bir rol aldığının moleküler temelleri anlaşılamamıştır (Krämer et al., 2000).
1.6.2. İntraselular Kompleks Oluşturma
İntraselular kompleks oluşturma Metallotiyoninler (MTs) ve Fitoçelatinler (PCs) gibi peptidleri içerir. Metallotiyoeninler sisteince zengin proteinlerdir ve ilk olarak memeli dokularında Cd bağlayıcı proteinler olarak tanımlanmışlardır. Bitkilerde de pek çok MTs geni ve proteinleri tanımlanmıştır. MTs gen kodlarıyla sentezlenirken, PCs enzimatik olarak sentezlenirler. Monokotilleri, dikotilleri, gymnospermleri ve algleri içeren çok geniş bir bitki grubunda fitoçelatinler belirlenmiştir (Salt et al., 1995).
Silene cucubalis bitkisinde glutatyon bağımlı fitoçelatin sentaz aktivitesi tanımlanmıştır. Enzim sadece Cd, Cu, Zn, Ag, Hg, gibi metal iyonlarının varlığında aktif olur. Benzer çalışmalar domates, bezelye ve Arabidopsis’de yapılmış ve benzer sonuçlar elde edilmiştir. PCsentaz aktivitesinin Cd toleransında önemli bir rolü olduğu gerçeği Vigna angularis’de gösterilmiştir. Bu bitki Cd’a karşı aşırı hassastır. Bitkinin hücre süspansiyon kültürüne Cd verildiği zaman PCs sentezlememiştir. Bu hücrelerde PCs sentaz aktivitesi de görülememiştir. Bu da Cd toleransında PCs sentezinin ne kadar önemli olduğunu kanıtlamıştır. (Gril et al., 1989).
PC sentaz aktivitesinin yaklaşık 10 yıl kadar önce tanımlanmasına karşın, bunun genlerle olan ilişkisi henüz karanlıktır. PC sentaz genleri iki araştırmacı grubu tarafından
izole edilmiştir. Vatamaniuk et al. (1999) Arabidopsis’de bir cDNA tanımlamışlar ve bunu AtPcS1 olarak adlandırmışlardır. AtPcS1’in protein ekpresyonu Cd birikimindeki artışla ilişkilidir ve bu gende Cd şelatlanmasında rol oynar. Clemens et al. (2002) buğday da bir cDNA tanımlamışlar ve buna da TaPcS1 adını vermişlerdir. Bu genin de yabanıl bir mayaya aktarılması Cd rezistansını artırmıştır. Cd rezistansında TaPcS1’de AtPcS1 gibi Cd birikimindeki artışa glutatyona bağımlıdır (Yang et al. 2005).
Cd toleransında hem AtPcS1, hem de TaPcS1 gulutatyon bağımlıdır. Bunlar sitozölde lökalize olmuşlardır ve mayalarda PC’lerin in vivo biyosentezi ile ilişkilidirler. Hindistan hardal bitkisinde fitoçelatinlerin metal hiperakümülasyonundaki rolleriyle ilgili başka kanıtlar da vardır ve bunlarda bakteriyal glutatyon sentazın aşırı salınımından gelir. Bu glutatyon sentezleyen enzimdir. Transgenik bitkiler yüksek bir glutatyon seviyesine, PC seviyesine ve de fazla miktarda Cd biriktirme ve tolere edebilme yeteneğine sahiptirler. Ayrıca bitki PC sentazının transgenik mayalarda aşırı salınımı Cd toleransını ve akümülasyonunu artırmıştır. Bu çalışmalar glutatyon kullanımının ve PC konsantrasyonunun bitkilerde ağır metal birikiminin artırılmasında önemli bir rolü olduğunu göstermiştir (Zhu et al. 1999).
PCs biyosentez mekanizmasında en önemli regülatör PCs sentaz aktivitesinin düzenlenmesidir. Bu yönde bitki hücre kültürü denemelerinde kanıtlar bulunmuştur. Fitoçelatin biyosentezi, başlangıçta hücrede var olan protein sentezinden bağımsız olarak kadmiyuma maruz kalma durumundan hemen birkaç dakika içinde olur. PCs biyosentezi, farklı bitki türlerinde, transkripsiyonda veya transkripsiyon sonrası aşamada veya her iki aşamada farklılık gösterebilir. Bu da PCs biyosentezinin farklı bitkilerde farklı şekillerde regüle edildiğini destekler (Yang et al. 2005).
PCs biyosentezi glutatyon sentezi ile de düzenlenebilir. Transgenik bir bitki olan Hindistan hardalında (Brassica juncea) glutatyon biyosentez yolundaki enzim ekpresyonunda ki artışlara paralel olarak PCs biyosentezi ve Cd toleransı da artar (Zhu et al. 1999). Yabanil H. hardalında Cd’a maruz kalma -glutamilsistein sentaz (-ECS) transkripsiyonunu artırır. Bu PCs biyosentez yolundaki ilk enzimi kodlayan gendir. Ayrıca
buna ek olarak, (-ECS) transkripsiyonunun post-transkripsiyonal regülasyonda da rolü olduğuna dair kanıtlar vardır (May et al. 1998).
Metal bağlama protein ve peptidleri bitkilerdeki metal toleransını ve birikimini artırır. Bu metal bağlama peptid ya da proteinleri özellikle çok ağır toksik etkileriyle diğerlerinden ayrılan Cd, Hg, Pb gibi ağır metallere spesifik olmalıdır. Ryu et al. (2003) Asya Cezayir menekşesinde (Littorina brevicula) yeni bir bakır bağlama proteini karakterize etmiştir. Bu bitki çok yüksek konsantrasyonlardaki ağır metallere karşı toleranslıdır. Bu bitki Cd ve Zn’yi de içeren birçok metali bağlayıcı proteine sahiptir. Saflaştırılan proteinin molekül ağırlığının 11.38 kDa olduğu belirlenmiştir. Bu bakır bağlama proteini (Cu-BP) yaygın olarak bilinen Mollusk metallotiyonininden farklıdır. MTs çok az miktarda Cys (8 rezidü) ve yüksek miktarda aromatik amino asit içerir (Tyr ve Phe). Cu-BP’in Cu regülasyonunda olduğu kadar Zn regülasyonunda da fonksiyonu vardır. Bu arada Cu hemosiyanin pigmentinin de esansiyal bir bileşenidir (Yang et al. 2005).
1.6.3. Kofullardaki Metallerin Sekresyonu
Kofullar metaller için bitki ve mantarlarda ana depo bölgeleridir. Bölünen mantarlarda (Schizosaccharomyces pombe) PC-metal kopleksinin kofulların içine pompalandıklarına dair kanıtlar vardır (Ortiz et al., 1995).
Ni’in vakuolar birikimi Saccharomyces cerevisiae Ni rezistansını önemli ölçüde artırır. Bu vakuolar birikim vakuol membranı boyunca var olan pH gradienti sayesinde yürütülür. (Gries and Wagner, 1998).
Ayrıca metallerin vakuollerde kompartımanlaşması da bazı metal hiperakümülatörü bitkilerde tolerans mekanizmasının bir parçasıdır. Ni hiperakümülatörü Thlaspi goesingense, intraselular Ni birikiminin çoğunu vakuollerde depolamayla Ni toleransını artırır. T. goesingense’de yüksek seviyede vakuolar metal iyon transporterinin (TgMTP1) salınımı onun kök vakuollerindeki metal iyonu biriktirme yeteneğini açıklayabilir (Persans et al. 2001).
Bazı bitki hücrelerinde PCs-Metal kompleksinin vakuole geçişi ABC tip bir transporter proteini tarafında sağlanır. Bu tonoplasta yerleşik bir proteindir. Glutatyonlarla konjuge olmuş antosiyaninler benzer bir taşıyıcıyla vakuole geçerler. Aslında antosiyaninler de metal bağlama ve sekresyonunda rol alırlar. Diğer bir metal bağlama molekül grubu vakuoldeki organik asitlerdir. Günümüzde metal toleransında en iyi karakterize edilmiş bilinen vakuolar transporter ve kanal YCF1’dir ve S.cerevisiae’den karakterize edilmiştir. Bu kanal As-GS3 ve HgGS2 yi olduğu kadar Cd-GS2’yi de vakuol
içine taşır (Gueldry, 2003).
1.7. Ağır Metallerin İnsanlar Üzerine Etkileri
Bitkilerin yapılarında biriken ağır metaller besin zinciri yoluyla insanların ve hayvanların vücutlarına geçmektedir. Hava, su ya da besinler yoluyla düşük düzeyde kadmiyuma uzun süre maruz kalma sonucunda kadmiyum böbreklerde birikir ve böbrek hastalıklarına neden olabilir. Akciğerde hasar ve kemiklerin kırılganlığının artması diğer etkileridir. Hayvan deneylerinde kadmiyumun tansiyon yükselmesine, kandaki demir düzeyinin düşmesine, karaciğer hastalıklarına, sinir sistemi ve beyinde hastalıklara neden olduğu gösterilmiştir (Satarug et al. 2000).
Metal iyonları, süperoksit anyonları ve H2O2 ile biyolojik sistemlerde hidroksil
serbest radikali ve metal-oksijen kompleksleri gibi çok reaktif türleri üretmek için reaksiyona girmektedirler. Bu reaksiyonları sonucunda ise DNA hasarları meydana gelebilmektedir. Kimyasal karsinojenezis olayında metallerin sebep olduğu oksidatif DNA hasarları önemli rol oynarlar (Mercan 2004).
Kurşunun neden olduğu toksik etkileri, serbest radikal üretimi ve oksidatif stres yoluyla meydana gelmektedir. Radikal oksijen türleri ve radikal üretimi akut kadmiyum toksisitesi için bir mekanizma olarak vurgulanmaktadır. Hepatosit kültürlerinin kadmiyuma maruz kalması, lipid peroksidasyonuna neden olur. Kültür hücrelerinde kadmiyum süperoksit anyonu, nitrik oksit ve H2O2 üretilmesini teşvik eder ve bunlar
değişik yollarla kadmiyuma maruz kalan canlıların plazma, beyin, akciğer, karaciğer ve böbreklerinde oksidatif hasar ve lipid peroksidasyonu meydana getirirler. Bu durumlarda verilen Vit E ve beta-karoten CdCl2’ün zararlı etkilerini azaltır (Mercan 2004).
İnsan ve hayvan sağlığına karşı ağır metal tehtidi onların çevrede kalma süresinin artışıyla beraber şiddetlenir. Örneğin kurşun çok daha fazla kalıcıdır. Yaklaşık olarak toprakta 150–500 yıl arasında kaybolur. Kurşun 150 yıl sonra bile doğada kendini bir tortu şeklinde koruyabilir (NandaKumar et al. 1995). Ayrıca kadmiyumun biyolojik yarılanma ömrü 18 yıldır ve insan vücudunda yaklaşık 10 yıl kadar kalabilir (Forstner 1995). Toksik ağır metaller insan ve hayvan vücuduna besin zinciri yoluyla taşınırlar ve oralarda DNA hasarlarına, karsinojenik etkilere ve mutajenik etkilere sebep olabilirler (Salt et al. 1995). Örneğin Cd, Cr ve Cu’ın bazı türleri insanda deri yangılarına ve çeşitli kanser tiplerine sebep olabilirler (McLaughlin et al. 1999). Buna ek olarak 238U, 137Cs gibi bazı metallerin çevrede radyoaktif izotopları bulunur ki buda gerçekten insan hayvan ve ekosistem sağlığı için ciddi bir risktir (McLaughlin et al. 1999; Das et al. 1997).
Canlı organizmanın serbest radikallerin etkisinden korunması için antioksidatif korunma sistemine sahip olduğu bilinmektedir. Bazı durumlarda antioksidatif koruyucu sistemin iyi çalışmamasından dolayı, serbest radikallerin vücutta fazlalaştığı görülür. Bu vücutta bazı hasarlara neden olur, serbest radikallerin miktarı arttıkça önce yaşlanma hızlanır, hücre ölümü, sonra doku ölümü daha sonra ise beyin damarlarının tahribatına varan hasarlar oluşur (Tunalıer, 2002).
Bu çalışmada, maydanoz (Petroselinum hortense) bitkisinde farklı konsantrasyonlardaki kadmiyum uygulamalarının antioksidant enzim aktiviteleri, total protein, fotosentetik pigment, hidrojen peroksit, prolin ve total fenolik madde miktarları üzerine etkileri araştırıldı. Bölgemizde maydanoz bitkisi kentsel yerleşim alanları içinde, yol kenarlarındaki arazilerde, evlerin bahçelerinde yetiştirilmektedir ve bütün bir yıl boyunca besin olarak tüketilmektedir. Bu nedenle çeşitli toksik etkileri olan kadmiyumun maydanoz bitkisi tarafından ne ölçüde absorbe edildiği araştırıldı.
2. MATERYAL VE METOD
2.1. Materyal
Araştırmada maydanoz (Petroselinum hortense) bitkisi materyal olarak kullanılmıştır. Tohumlar İstanbul Tohumculuk firmasından temin edildi ve laboratuar şartlarında kontrollü olarak yetiştirildi (Bkz 2.2.1).
Maydanoz normal olarak iki yıllıktır ve kültürü yapılır. İlk yılda yapraklarını ve yeşil kısımlarını oluştururken ertesi yıl çiçek ve tohumlarını meydana getirmektedir. Ülkemizde yaklaşık olarak yıllık 32.000 ton maydanoz üretildiği bilinmektedir (Vural ve ark., 2000).
2.1.1. Kullanılan Kimyasal Maddeler
Çalışmada kullanılan kimyasal maddeler; Etanol, folin-ciocalteu, sodyum bi karbonat, triklor asetik asit, potasyum di-hidrojen fosfat, sodyum hidroksit, sülfosalisilik asit, glasiyel asetik asit, ninhidrin, fosforik asit, coomassie brillant blue G-250, hidroklorik asit, sığır serum albumini, hidrojen peroksit, gallik asit, potasyum iyodür, aseton, askorbik asit, guiacol (Merck) toluen prolin (Sigma) ’dir.
2.1.2. Kullanılan Cihaz ve Aletler
Çalışma sürecinde yararlanılan alet ve cihazlar;
Etüv : Nüve (Ankara, Türkiye)
Hassas/Analitik terazi : Shimadzu (Osaka, Japonya) Manyetik karıştırıcı : Heidolph (Almanya)
Rotary evaporatör : İka (Almanya)
UV spektrofotometre : Jasco V- UV/VIS Spectrophotometer (Japonya)
Otomatik pipetler : Ephendorf (Almanya) Soğutmalı mikrosantrifüj : Hettich R22 (Almanya)
Santrifüj : Nüve (Ankara, Türkiye)
pH metre : Hanna (Romanya)
- 80 0C derin dondurucu : Hettich (Almanya)
Buzdolabı : Regal (Türkiye)
Atomik absorbsiyon spektrofotometresi : Perkin-Elmer Analyst 700 (ABD)
2.1.3. Kullanılan Çözeltiler
2.1.3.1. Homojenat Tamponu
1. 50 mM KH2PO4 (pH=7)
2.1.3.2. Katalaz Aktivitesinin Ölçülmesi İçin Kullanılan Çözeltiler
1. 50 mM KH2PO4 (pH=7) (aktivite tamponu)
2. 30 mM H2O2 (substrat çözeltisi)
2.1.3.3. Peroksidaz Aktivitesinin Ölçülmesi İçin Kullanılan Çözeltiler
1. 50 mM KH2PO4 (pH=6,5) (aktivite tamponu)
2. 22,5 mM H2O2 (substrat çözeltisi)
2.1.3.4. Askorbat Peroksidaz Aktivitesinin Ölçülmesi İçin Kullanılan Çözeltiler
1. 100 mM KH2PO4 (pH=6) (aktivite tamponu)
3. 2.5 mM Askorbik Asit (substrat çözeltisi)
4. 10 mM H2O2 : (subsrat çözeltisi)
2.1.3.5. Total Fenolik Madde İçeriğinin Belirlenmesinde Kullanılan Çözeltiler
1. Etil alkol : %99,8’lik etil alkol kullanıldı.
2. Folin-ciocalteu : Merck folin-ciocalteus reagent kullanıldı.
3. %2’lik Sodyum karbonat çözeltisi
2.1.3.6. Hidrojen Peroksit İçeriğinin Belirlenmesinde Kullanılan Çözeltiler
1. % 0,1 (w/v) Triklor asetik asit (TCA)
2. 1M Potasyum İyodür (KI)
2.1.3.7. Fotosentetik Pigment İçeriğinin Belirlenmesinde Kullanılan Çözeltiler
1. % 80 (v/v) Aseton
2.1.3.8 Prolin Miktarının Belirlenmesinde Kullanılan Çözeltiler
1. %3’lük Sülfosalisilik Asit
2. %96’lık Glasiyel Asetik Asit
3. Asit Ninhidrin
4. Toluen: Sigma toluen kullanıldı.
2.1.3.9. Protein Miktarının Belirlenmesinde Kullanılan Çözeltiler
1. Coomassie Brillant Blue G-250
2.1.3.10. Kadmiyum Miktarının Belirlenmesi İçin Kullanılan Çözeltiler
1. Derişik HNO3
2. %30’lık H2O2
2.1.3.11. Uygulanan Kadmiyum Çözeltileri
1. 75 µM CdCl2
2. 150 µM CdCl2
2.2 Metod
2.2.1. Bitkilerin Yetiştirilmesi ve Kadmiyum Uygulamaları
Maydanoz (Petroselinum hortense) tohumları saksıların yüzey alanları dikkate alınarak m2’ye 1-1,5 g tohum gelecek şekilde her bir saksı için ayrı ayrı tartıldı (Vural ve ark., 2000). Tohumlar ekilmeden önce yüzeysel sterilizasyon işlemine tabi tutuldu. Sterilizasyon işlemi tohumların %5’lik sodyum hipoklorit çözeltisi içerisinde 20-30 dk bekletilmesi ile yapıldı. Sterilizasyondan sonra tohumlar destile su banyolarından geçirilmek suretiyle sodyum hipokloritten arındırıldı. Bu işlemin ardından tohumlar içlerinde kurutma kağıtları bulunan petri kaplarında çimlendirilerek saksılara ekim işlemi gerçekleştirildi. Saksılarda toprak olarak %40 torf, %40 elenmiş bahçe toprağı, %20 kum kullanıldı. Kum köklerin daha rahat bir şekilde gelişebilmesi için kullanılmıştır. Saksılar vertikal klinostata konuldu ve yetiştirme sürecinde 12 saat 9000 luks ışık şiddeti uygulandı. Bitkiler düzenli aralıklarla sulandı. Maydanoz fidelerine üç aylık gelişme periyodu sonunda 75 µM, 150 µM, 300 µM CdCl2 çözeltileri uygulandı. Uygulama her bir periyotta
200’er ml olmak üzere üç gün ara ile iki periyotta yapıldı. Uygulama sonunda yine üçer gün ara ile 250 ml su ile sulandı ve on beş gün sonunda bitkilerin yaprakları hasat edildi. Hazırlanan numuneler alüminyum folyo ile paketlenerek -80 0C’de analizler yapılana kadar muhafaza edildi.
2.2.2. Katalaz, Peroksidaz, Askorbat Peroksidaz Aktivitesinin ve Protein Miktarının Belirlenmesi İçin Homojenat Hazırlanması
Enzim aktivitelerinin ve protein miktarının belirlenebilmesi için 0,25 g yaprak dokusu 2,5 ml 50 mM KH2PO4 (pH=7) tamponu içerisinde porselen havanda homojenize
santrifüj edildi. Santrifügasyon sonucunda süpernatantlar buzdolabında muhafaza edildi ve enzim aktivite ölçümlerinde kullanıldı.
2.2.3. Katalaz Aktivitesinin Belirlenmesi
Katalaz hidrojen peroksitin (H2O2) su (H2O) ve oksijen (O2)’e parçalanmasını
katalizler. Aktivite ölçümü ise bu reaksiyon sırasında H2O2’nin su ve oksijene
parçalanması sırasnda meydana gelen renk açılmasının 240 nm’de izlenmesi esasına dayanır. Aktivite ölçümünde 3 ml’lik reaksiyon karşımı 50 mM fosfat tamponu (pH=7), 30 mM H2O2 ve 30 µl homojenattan oluşacak şekilde hazırlandı ve 2 dakika boyunca
absorbansı ölçüldü (Öztürk, 2002).
Ölçümlerde lineer olarak absorbans azalması olan aralıktan dakika başına düşen absorbans hesaplandı. Hesaplamalarda ışık yolu 10 mm, ekstinksiyon katsayısı (Є H2O2)
0,0394 (mmol-1 x mm-2) alınarak A= Є.b.c formülünden 240 nm’de, bir dakika içerisinde 1 µmol H2O2’nin parçalanmasını sağlayan enzim miktarı belirlendi.
2.2.4. Peroksidaz Aktivitesinin Belirlenmesi
Spektrofotometrik olarak peroksidaz aktivitesinin belirlenmesi için aktivite ölçümünde 3 ml’lik reaksiyon karışımı 50 mM fosfat tamponu (pH=7), 22,5 mM H2O2, 30
mM guaiacol ve 20 µl enzim ekstraktından oluşacak şekilde hazırlandı. Reaksiyon aktivite ölçüm ortamına en son olarak enzim çözeltisinin ilave edilmesiyle başladı ve 470 nm’de 2 dakika boyunca optik dansitesi kaydedildi. Bir enzim ünitesi bir dakikada 1 µmol guaiacol’u katalizleyen enzim miktarı olarak hesaplandı (Demir and Öztürk, 2003).
2.2.5. Askorbat Peroksidaz Aktivitesinin Belirlenmesi
Spektrofotometrik olarak askorbat peroksidaz aktivitesinin belirlenmesi için aktivite ölçümünde 3 ml’lik reaksiyon karışımı 100 mM fosfat tamponu (pH=7), 10 mM H2O2, 2.5 mM askorbik asit ve 100 µl enzim ekstraktından oluşacak şekilde hazırlandı.
Reaksiyon aktivite ölçüm ortamına en son olarak hidrojen peroksitin ilave edilmesiyle başladı ve 2 dakika boyunca 290nm’de absorbansı kaydedildi. Enzim aktivitesi askorbatın ekstinksiyon katsayısı kullanılarak hesaplandı (2.8 mM-1 cm-1) (Karabal et al., 2003).
2.2.6. Total Fenolik Madde Miktarının Belirlenmesi
Total fenolik madde miktarı Folin-Ciocaltaeu yöntemine göre yapıldı. Tayin için 1,5 g taze maydanoz yaprağı etüvde 45-50 0C’de kurutuldu. Kurutan yapraklar havanda öğütüldü. Daha sonra her birisinin üzerine 5-10 ml etanol ilave edildi ve iki saat süre ile manyetik karıştırıcıda karıştırıldı. Süpernatant kısmı süzüldü ve bu süzüntü daha önceden daraları alınmış 100 ml’lik balonlarda toplandı. Ekstraktsiyon işleminden sonra çözeltilerin çözücüleri rotary evaporatörde uçuruldu. Bu işlemden sonra balonlar tekrar tartıldı. Net ekstrakt miktarı belirlendi ve bu ekstrakt 2mg/ml olacak şekilde tekrar etanolde çözüldü. Bu işlemin ardından 50 ml’lik balon jojelere 45 ml saf su konuldu. Daha sonra üzerlerine 500’er µl ekstrakt ilave edildi. Her bir jojeye sırasıyla 1 ml folin-ciocaltaeu ve 3 ml (% 2’lik w/v) Na2CO3 ilave edildi ve son hacim saf su ile 50 ml’ye tamamlandı. Her bir
numune için ayrı ayrı hazırlanan balon jojeler 2 saat süre ile karanlık ortamda inkübasyona bırakıldı. Daha sonra spektrofotometrede 760 nm’de absorbanslar kaydedildi. Bu işlemin ardından kontrol ve uygulama gruplarındaki total fenolik bileşik miktarları gallik asitten hazırlanan standart grafik yardımıyla belirlendi. Standart grafik için 1ml’sin 1 mg gallik asit bulunan stok çözelti kullanılarak dilüsyon çözeltileri hazırlandı. Daha sonra aynı yöntemle gallik asit konsantrasyonlarına karşılık gelen absorbanslar belirlendi. (Tunalıer ve ark., 2004).
2.2.7. Hidrojen Peroksit Miktarının Belirlenmesi
0,3 g yaprak dokusu 3 ml %1’lik (w/v) TCA’da homojenize edildi. Elde edilen homojenat 12000 x g de santrifüj edildi. Süpernatanttan 0,5 ml alınarak üzerine 10 mM (pH=7) fosfat tamponu ve 1M KI ilave edildi. Elde edilen karışımın absorbansı 390 nm’de ölçülerek kaydedildi. Daha sonra hidrojen peroksitten hazırlanan standart grafikten yararlanılarak kontrol ve uygulama gruplarında hidrojen peroksit belirlendi.(Velikova et al. 2000).
Standart grafik için 163µM’lık H2O2 stok çözeltisinden sırasıyla tüplere 50, 100,
200, 300, 400, 500 ve 700 µl pipetlendi. Her bir tüpe 1 ml 1 M KI ilavesinden sonra son hacimler 10 mM (pH=7) fosfat tamponu ile 2 ml’ye tamamlandı. Hazırlanan standart seri tüplerinin absorbansları 390 nm’de okunarak kaydedildi (Karataş, 2007).
2.2.8. Fotosentetik Pigment Miktarının Belirlenmesi
Toplam klorofil miktarının belirlenmesinde Arnon denklemi kullanıldı (Arnon, 1949). Karetenoid miktarı ise Jaspars formülüne göre belirlendi (Öztürk and Demir, 2001). Analiz için ayrılan 0,2 g yaprak dokusu % 80’lik 5 ml aseton ile porselen havanda homojenize edildi. Homojenat 15 ml’lik santrifüj tüplerine alındı ve sonra 3000 x g’de 5 dakika süre ile santrifüj edildi. Elde edilen süpernatantın 645, 663 ve 450 nm’deki absorbansları (Optik dansite=OD) köre karşı spektrofotometrede okundu ve bu absorbanslar yardımı ile aşağıda belirtilen formüllerden ‘mg pigment / ml ekstrakt’ miktarı hesaplandı.
Klorofil a = 12,7 x A663 – 2,69 x A645
Klorofil b = 22,9 x A645 – 4,68 x A663
Total Klorofil = 20,2 x A645 + 8,02 x A663
2.2.9. Prolin Miktarının Belirlenmesi
Kontrol ve uygulama gruplarında prolin miktarını belirlemek için 0,4 g yaprak %4’lük sülfosalisilik asitte homojenize edildi. Daha sonra homojenat süzgeç kağıdı aracılığıyla süzüldü. Süzüntüden 0,5 ml alınarak saf su ile 10 kat seyreltme yapıldı. Daha sonra her bir numune için üçer adet tüp alındı. Tüplere 1 ml numune, 1 ml %96’lık glasiyel asetik asit ve 1 ml asit ninhidrin ilave edildi. Bunun ardından bütün tüpler 100 0C’de etüvde 60 dakika inkübasyona bırakıldı. İnkübasyonun ardından tüpler aynı anda buz banyosunda 10 dakika boyunca tutuldu. Daha sonra her bir tüpe 2 ml toluen ilave edilerek vorteks’te karıştırıldı. Bu işlemin ardından beş dakika beklenerek her tüpün üst kısmında oluşan pembe fazın absorbansı ölçülerek kaydedildi. Sonuçlar prolinden (Merck) hazırlanan standart grafik yardımıyla g taze doku başına prolin miktarı hesaplandı. (Öztürk and Demir, 2003).
Standart grafik için 10 mg saf prolin 50 ml destile suda çözüldü. Hazırlanan bu stok çözeltiden tüplere sırasıyla 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ve 100 µl pipetlendi. Tüplerin son hacimleri destile su ile 1 ml’ye tamamlanarak, tüplere 1 ml %96’lık glasiyel asetik asit ve 1 ml asit ninhidrin ilave edildi. Tüpler 1 saat 100 0C’de inkübasyona bırakıldı. İnkübasyonun ardından her tüpe 2 ml toluen ilave edilerek vorteks’te karıştırıldı. Bu işlemin ardından beş dakika beklenerek her bir tüpün üst kısmında oluşan pembe fazın absorbansı 520 nm’de ölçülerek kaydedildi
2.2.10. Protein Miktarının Belirlenmesi
Yapraklardaki protein miktarı Bradford (1976) yöntemine göre belirlenmiştir. Bu yöntemde kullanılan boya (Coomassie brillant blue G-250) negatif yüklüdür ve protein üzerindeki pozitif yüklere bağlanır. Bu boyanın kırmızı (Amax=465 nm) ve mavi (Amax=595
nm) formları mevcuttur. Boya ile proteinin bağlanması kırmızı formun mavi forma dönüşümünü sağlar. Bu yöntem çok geniş bir kullanım alanına sahiptir. Reaksiyon çok
defa tekrarlanabilir ve hızlı bir şekilde cereyan eder. Meydana gelen renk, stabilitesini bir saat kadar koruyabilir.
Protein miktarının belirlenebilmesi için 0,25 g yaprak dokusu 2,5 ml 50 mM KH2PO4 (pH=7) tamponu içerisinde porselen havanda homojenize edildi. Homojenat
eppendorf tüplerine aktarılarak +40C’de 15000 x g’de 20 dakika santrifüj edildi. Santrifügasyon sonucunda süpernatantlar buzdolabında muhafaza edildi ve protein miktarının belirlenmesi için kullanıldı. Süpernatanttan 20 µl alınarak üzerine 2,5 ml Coomassie brillant blue G-250 ilave edildi. Her bir tüp votekslenerek 10 dakika inkübasyona bırakıldı. İnkübasyonun ardından tüplerin 595 nm’deki absorbansları ölçülerek, stantdart grafik yardımıyla yapraklardaki protein miktarı belirlendi (Öztürk, 2002).
Standart grafik için ilk önce 1ml’sinde 1 mg protein çözeltisi ihtiva eden sığır serum albumin çözeltisi hazırlandı. Hazırlanan bu stok çözeltiden tüplere sırasıyla 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 µl pipetlendi ve son hacimler saf su işle 100 µl’ye tamamlandı. Her bir tüpün üzerine 2,5 ml Coomassie brillant blue G-250 ilave edildi ve vortekste karıştırıldı ve 10 dakikalık inkübasyondan sonra 595 nm’de absorbansları ölçüldü ve her bir protein miktarına karşılık gelen absorbanslara standart grafik hazırlandı.
2.2.11. Kadmiyum Miktarının Belirlenmesi
Bitki yapraklarındaki kadmiyum miktarının belirlenebilmesi için 1 g kuru bitki dokusu 6 ml derişik HNO3 ve 2 ml %30’luk (v/v) H2O2 konulmuştur. Daha sonra her bir
numune 150-1700C’de çözücüler buharlaşıncaya kadar kaynatıldı. Tüpün dibindeki kalıntı 1 ml derişik HNO3’de çözüldü. Son hacim deiyonize su ile 5 ml’ye tamamlandı ve yaprak
dokularındaki kadmiyum miktarı atomik absorbsiyon spektrofotometresiyle belirlendi (Jemal et al. 1998).
2.2.12. İstatistik Analiz
Kontrol ve uygulama gruplarındaki farklılıklar Duncan çoklu aralık testine göre P<0,05 önemlilik değerinde yapılmıştır. Çalışmada her bir grup için 5 tekrar yapılmıştır (n=5). İstatistiki analizler SPSS for Windows 11.5.0 Standart Version paket programı ile yapıldı. Kontrol ve uygulama grupları arasındaki farklılıklar tek yönlü varyans analizi (one-way ANOVA) ile analiz edildi (Duncan, 1955).
3. ARAŞTIRMA SONUÇLARI
3.1. Kadmiyum Klorürün (CdCl2) Katalaz Aktivitesi Üzerine Etkisi
CdCl2 konsantrasyonlarına göre katalaz aktivitesinde meydana gelen değişiklikler
Şekil 3.1.’de gösterilmiştir. Ayrıca yine uygulama gruplarına göre değişen enzim ünitesi miktarları da Tablo 3.1.’de belirtilmiştir. Sonuçlar hesaplanırken bulunan enzim ünitesi miktarları belirlenen protein miktarına oranlanmıştır. Aktivite 75 µM CdCl2 uygulanan
grupta kontrole göre önemli ölçüde azalırken (p<0.05), 150 ve 300 µM CdCl2 uygulanan
gruplarda da kontrole göre daha düşüktür.
Şekil 3.1. Kadmiyumun katalaz aktivitesi üzerine etkisi
Tablo 3.1. Kadmiyumun katalaz aktivitesi üzerine etkisi (EÜ/g yaprak/Protein miktarı)
0 20 40 60 80 100 Kontrol 75 µM 150 µM 300 µM Kadmiyum Konsantrasyonu E n zi m Ü n it es i (E U g -1 t az e ağ ır lı k) b a ab ab
Gruplar Enzim Ünitesi (EU g-1 taze ağırlık)
Kontrol 85,483 b ±5.03
75 µM 70,906 a ±3.30
150 µM 79,896 ab ±1.66
