Bombyx mori (Lepidoptera; Bombycidae)’de Besin Stresine Bağlı Gelişim
Meryem AKALİN¹, Ayla ÖBER², Gamze TURGAY İZZETOĞLU³
¹Ege Üniversitesi, Fen Fakültesi, Biyoloji Bölümü, Zooloji Anabilim Dalı, 35100 Bornova-İZMİR ²Ege Üniversitesi, Fen Fakültesi, Biyoloji Bölümü, Zooloji Anabilim Dalı, 35100 Bornova-İZMİR ³Ege Üniversitesi, Fen Fakültesi, Biyoloji Bölümü, Zooloji Anabilim Dalı, 35100 Bornova-İZMİR
Sorumlu Yazar Geliş Tarihi : 15 Eylül 2008
e-posta: meryem.akalin@hotmail.com Kabul Tarihi : 12 Ocak 2009
Özet
Gelişim biyolojisinde genetik ve çevresel faktörler canlı boyutu ile onu oluşturan yapıların büyüklüklerinin düzenlenmesinde önemlidirler. Böceklerde de büyüme moleküler ve fizyolojik mekanizmalar çerçevesinde gerçekleşir. Hücrelerin büyümesi ile besin alınımı arasındaki ilişkide insulin sinyalinin bulunmasının şart olduğu belirtilmektedir. Yapılan çalışmada ipekböceklerinde gelişim, besin miktarına bağlı olarak izlenmiştir. Normal besin miktarı (30g) ile beslenen kontrol grubunun gelişimi göz önünde bulundurularak 1. (20g ile beslenen) ve 2. (10g ile beslenen) gruplardaki gelişim farklılıkları belirlenmeye çalışılmıştır. Alınan besin miktarına göre larval sürecin uzaması, geç koza örme davranışı, 1. grupta belirgin olarak görülür. Gruplar arasındaki farklılıklar besin-hormon ilişkisine bağlanabilmektedir. Besin miktarının azlığında salınan hormon miktarının da azaldığı bilinmektedir. Bombyx mori larvalarının da büyüklükleriyle doğru orantılı olarak koza ördükleri, pupa ve kelebek oldukları görülmüştür. Larvaların gelişimi esnasında, ancak kritik ağırlık denilen ağırlığı geçen larvaların başkalaşım geçirmeleri önemli bir noktadır. Koza boyutundaki farklılıkların ise ipek miktarını etkileyeceği açıktır. Bombyx mori’de gelişim için geçirilen evreler bir zincirin halkaları olarak tanımlanır. Larval evrede görülen gelişim bozukluğu son halkaya kadar uzanmakta ve anomaliler görülmektedir.
Anahtar Kelimeler: Bombyx mori, larva, besin stresi
Development in Bombyx mori (Lepidoptera; Bombycidae) Dependent on Nutrition Stress
Abstract
In the growth biology, it is important that the genetic and environmental factors arrange the size of living and their greatness at suitable structures of its forming. The development in insects carries out in frame of the molecular and physiological mechanisms as well. It was determined that the existed of insulin signal must be condition in relation with between growth of cells and taking a nutrition. In the present work, the development was followed with the nutrition quantity in silkworm as well. The development differences in the first (feeding 20g) and second groups (feeding 10g) were studied by designating the development of control group feeding normal nutrition quantity (30g). According to take the nutrition quantity, it is evident that the second group opposite of first group appears to extend of larval period and to knit the behavior of late cocoon. Difference of among groups can bind up nutrition-hormone relation. The reduced of secreted of hormone quantity is known in the lack of nutrition quantity as well. It was appeared that Bombyx mori larvae knitted the cocoon and were the pupae and moth as directly proportional their greatness. During the larval development, it is an important point that having only the metamorphosis to pass larvae named critical weight. It is clear that the differences of cocoon dimension affect silk quantity. The passed stages for the development are defined as the rings of chain in Bombyx mori. Developmental defect seen at larval stage was reached as the last ring and anomalies were appeared too.
Keywords: Silkworm, larvae, nutrition stress
GİRİŞ
İpekböceği (Bombyx mori L.) için başlıca besin kaynağını dut (Morus alba L.) yaprakları oluşturmak-tadır. Yumurtadan çıkan her larva yaşam devrini sağ-lıklı bir şekilde tamamlamak için toplam 30g yaprağa ihtiyaç duymaktadır. Bu süreç içerisinde belli bir bo-yuta gelen larva koza örmeye başlar. Böceklerin bü-yüklüğünü, larval büyüme periyodu ve böceklerin ge-lişim instarlarındaki yapısal parametrelerin karakteri-ze ettiğini Timmermann ve Briegel [1] belirtmişlerdir. Larval büyüme periyodu uyku ve besin miktarına göre değişebilmektedir.
Hücre veya organ büyümeleri çok farklı sinyal me-kanizmaları ile gerçekleşirken genler, metabolizma, besin ve hormonlarla kompleks bir ilişki içerisinde ol-dukları Nijhout [2,3] tarafından ifade edilmiştir. Hüc-re büyümesi ile alınan besin arasındaki ilişkide,
nor-mal büyümenin gerçekleşmesi için insulin sinyalinin şart olduğu görülmüştür [2,3,4,5,6,7,8,9]. B. mori’de hemolenf içinde bulunan ve beyinden salınan insulin benzeri bombyxin hormonun hücre bölünmesi ile bü
-yümeyi uyardığı Nijhout ve Gunert [10] tarafından belirtilmiştir. Lepidoptera’daki bombyxinlerin karbo
-hidrat metabolizmasını düzenlediklerine; gelişmeyi, vücut büyüklüğünü, üremeyi ve yaşlanmayı sinyal sistemiyle etkilediklerine Nijhout [2,3] işaret etmek
-tedir. Açlığa maruz bırakılan Bombyx mori larvaların
-da hemolenf içindeki bombyxin miktarının düştüğü, beslenmeye başlayan larvalarda ise arttığı gösteril
-miştir [11,12]. Ayrıca larvaların hemolenfinde bomb
-yxin miktarı attığında karbohidrat miktarında azalma olduğu da saptanmıştır [11].
Manduca sexta beşinci instar larvalarında juvenil hormon-esteraz aktivitesinin, larva ağırlığı ile doğru orantılı olarak arttığına ve kritik ağırlık geçildikten
Çizelge 1. 50 larva için öğünlere göre yaprak miktarı sonra juvenil hormon salınımının durduğuna Brow-der ve ark. [13] tarafından işaret edilmektedir. M. sexta larvaları beşinci instar başında aç bırakılırlarsa, juvenil hormon esteraz aktivitesinin düştüğü ve lar-vaların koza örme davranışına girmelerinde gecikme meydana geldiği belirtilmiştir [14,15]. Cymbrowski ve arkadaşlarının [14] gözlemlerine göre, larva kritik ağırlığına (6.0-6.5g) ulaşmadan aç bırakılırsa juvenil hormon salgılanması engellenmekte böylelikle instarın uzamasına neden olunmaktadır.
Nijhout ve Williams [16,17] tarafından da juvenil hormon salgılanmasının ne zaman duracağını kritik ağırlığın belirlediği, daha önce bildirilmiştir. M. sexta larvaları kritik ağırlığa ulaşmadan aç bırakıldıkların-da juvenil ile protorasikotropik hormonların anormal denile bilecek uzun bir süre salgılanmasından dolayı larvaların koza örmesi gecikmiştir. Buna karşılık, lar-valar kritik ağırlığı geçtikten sonra aç bırakıldıkların-da koza örme bırakıldıkların-davranışınbırakıldıkların-da ve metamorfoz süresinde bir gecikme gözlenmediği de Nijhout ve Williams [16,17] tarafından belirtilmektedir.
Metamofoz geçirecek olan M. sexta larvalarının büyümesini beş faktörün kontrol ettiği ortaya konmuştur [18,19]. Bunlar; (a) juvenil hormonun kaybol -masını başlatan kritik ağırlık, (b) juvenil hormon sa-lınımının durması ve protorasikotropik hormonunun salınımının başlaması, (c) protorasikotropik hormo-nunun salınımı için fotoperiyodik düzene gereksinim duyulması, (d) son larval instarın gelişim hızı ve (e) son instara geçen larvaların büyüklüğüdür .
Sudo ve Tanaka [20] dut yapraklarına yüksek sı-caklık uygulayıp besin kalitesini değiştirerek, yap-rakları B. mori larvalarına verdiklerinde 5. instar lar-vaların davranışlarının değiştiğini belirtmişlerdir . B. mori larvalarını beslerken Vassarmidaki ve ark. [21] dut yapraklarına buprofezin uygulaması yapmışlar ve buprofezinin larvaların gelişimine etki ettiğine işaret etmişlerdir .
B. mori larvalarına besin kısıtlaması yapıldığında 5. instar larvalarının öldüğü, koza, deri ve pupa
lıklarında beslenmeye bağlı düşüşler olduğuna işaret edilmiştir [22]. Drosophila melanogaster’le yapılan
çalışmalarda ise sınırlı besin verilen larvalarında gin bireyler meydana getirdiği Britton ve Edgar [4]
tarafından gözlenmiştir. MATERYAL VE YÖNTEM
İpekböceğinin yetiştirilmesi
Bombyx mori hibrid yumurtaları Bursa Koza Birlik’ten temin edilmiştir. Yumurtadan çıkan larvalar normal geliş-meleri için gerekli olan optimum 25±1°C sıcaklık, hava sirkülasyonu ve yaklaşık %75-90 nemde uzun gün peri-yoduna (16 saat aydınlık 8 saat karanlık) uygun olarak Ege Üniversitesi Kampüsü’ndeki dut ağaçlarının yaprak-ları ile beslenmişlerdir [23,24,25].
Beslenme
İpekböcekleri üzerinde besin miktarına bağlı gelişim iz-leneceği için laboratuvarda kontrol grubu ile birlikte üç ayrı grup oluşturulmuş ve her gün gözlemler yapılmıştır.
Kontrol grubuna günde üç kez besleme (sabah-öğle-akşam) yapılıp, 1. instardan 5. instar sonuna kadar her larvaya 30g yaprak düşecek şekilde besin verilmiştir. Birinci gruba günde bir kez (öğle) besleme ve her larvaya 10g yaprak, ikin-ci gruba günde iki kez (sabah-akşam) besleme ve her larvaya 20g yaprak düşecek şekilde besin verilmesi gerçekleştirilmiş-tir.
Kontrol grubunda her böcek 30g yaprağın %2’ni 1., 2. ve 3. instarlarda, %10’luk kısmını 4. instarda, %88’lik kıs-mını ise 5. instarda tüketerek yaşam devirlerini tamamlamış-lardır. Kontrol grubuna öğünlere göre verilen yaprak miktarı Çizelge-1’de verilmiştir (50 larva için). Birinci grup kontrol grubunun 1/3 kadar, ikinci grup ise 2/3 kadar besin tüketmiş-tir [26].
Ağırlık ve Boy Ölçümleri Yapılması
İpekböceği larva, pupa ve kelebeklerinin ağırlıkları hassas terazide, larvaların boy, pupaların boy ve çapları mm’lik kağıt ile, kozaların boy ve çapları ise kumpas ile ölçülmüştür.
Şekil 1. Kontrol grubu larva
Şekil 2. 2. grup larva
Şekil 3. 1. grup larva BULGULAR
İpekböceklerinin larval dönemine bakıldığında kontrol gurubunun larval evre süresi 27, birinci grubun 42 ve ikinci grubun ise 28 gün sürmüştür.
İpekböceklerinin larval dönemde ağırlık ve boy, pupal evrede ağırlık, boy ve çap, ayrıca kozanın ağırlık, boy ve çapı ve ergin dönemde ise sadece ağırlık ölçümleri yapıldıktan sonra gruplar arasında farklanma olup olmadığına bakılmak amacıyla elde edilen değerler one way analysis of variance (ANOVA) testine tabii tutulmuştur. ANOVA testi gözleme ya da deneye dayanan bir çalışmada üç ya da daha fazla or-talamanın eşitliğini varyans analizi ile ortaya koymaktadır. Değerler %5 hata payı (p) verilerek teste tabii tutulmuştur (p<0.05).
Larval dönemde 2., 3., 4., 5. instar başları ve 5. instar so-nunda ağırlık ölçümleri teste tabi tutulduğunda 2. instar başı p<0.0, 3. instar başı p<0,008, 4. instar başı p<0.0, 5. instar başı p<0.0 ve 5. instar sonu p<0.0 sonuçlarına ulaşılmıştır. p değerlerinin 0’dan küçük olması gruplar arasında larval dönem ağırlıkların önemli derecede farklı olduğunu göster-mektedir (Şekil 1,2,3).
Larval dönemde 2., 3., 4., 5. instar başları ve 5. instar sonunda boy ölçümleri teste tabi tutulduğunda 2. instar başı p<0.0, 3. instar başı p<0,003, 4. instar başı p<0.0, 5. instar başı p<0.0 ve 5. instar sonu p<0.0 sonuçlarına ulaşılmıştır. p değerlerinin 0’dan küçük olması gruplar arasında larval dönemde larvaların boylarının da önemli derecede farklılık gösterdiğini işaret etmektedir (Şekil 1,2,3).
Pupal dönemde alınan pupa boyu ölçümleri teste tabi tu-tulduğunda p<0.002, pupa ağırlığı p<0.0, pupa çapı p<0.047, koza boyu p<0.0, koza ağırlığı p<0.0, larval dönemden pu-paya geçişte atılan deri p<0.555 sonuçlarını vermiştir. p de-ğerlerinin 0’dan küçük olması gruplar arasında pupal dönem ağırlık, boy ve çap değerlerinde dikkate alınması gereken bir farklılık olduğunu göstermektedir (Şekil 4,5,6).
Ergin dönemde kelebeklerin ağırlıkları teste tabi tutul-duğunda p<0.0 değerini vermektedir. p değerlerinin 0’dan küçük olması kelebek ağırlıklarında da bir farklanmayı işaret etmektedir (Şekil 7,8,9).
TARTIŞMA
Bu çalışmada, B. mori larvaları üzerinde 1. instardan baş-layarak beslenme stresinin sebep olduğu gelişim farklılıkla-rını ortaya koymak amaçlanmış ve daha önce yapılan birçok çalışmadan yararlanılmıştır.
Çalışmada 30g besin ile beslenen kontrol grubunun ge-lişimi göz önünde bulundurularak diğer gruplardaki gelişim farklılıkları belirlenmeye çalışılmıştır. Larval sürecin uzama-sı, koza örme davranışının gecikmesi alınan besin miktarına
bağlı olarak 2. grupta çok belirgin bir farklılık göstermeme-sine karşın, 1. grupta anormal denilebilecek bir farklılık bu-lunması alınan besin miktarının, hormon salınımını yüksek oranda etkilediğini düşündürmektedir. Kaynaklarda B. mori larvalarında beslenmeye bağlı olarak hormon değişiklikle-ri meydana geldiğinde 5. instarın uzayabileceği ve larvanın koza örmeden ölebileceği belirtilmektedir [20]. Gruplar
ara-Şekil 4. Kontrol grubu koza Şekil 7. Kontrol grubu kelebek
Şekil 5. 1. grup koza Şekil 8. 1. grup kelebek
Şekil 6. 2. grup koza Şekil 9. 2. grup kelebek
sında son larval evredeki ağırlık ve boy farklılıklarının göz-lenmesi besin ve hormon ilişkisine bağlanabilir. Beslenme stresinin daha yoğun olduğu 1. grupta ağırlık ve boy ölçümle-ri, kontrol grubunun ölçümlerinin altında kalmıştır.
B. mori larvalarının, büyüklükleriyle doğru orantılı olarak koza ördükleri Sudo ve Tanaka [20] tarafından
gösterilmiş-tir. Araştırıcılar larva ile ipek bezi boyutunun doğru orantılı olarak büyümesinden, bu doğrultuda kozanın da daha büyük olacağını bildirmişlerdir. Bu çalışmada da larvaların büyük-lüğü koza, pupa ve kelebek boyutlarını etkilemiştir. İkinci ve üçüncü grubun larva boyutları kontrol grubunun larva boyutlarından daha küçük olduğu için koza ağırlığı, boyu ve
çapının da kontrol grubundan daha küçük olması beklenen bir sonuçtur ve birçok araştırma bulgusu ile benzerlik gös-termektedir [20,21,22]. İkinci ve birinci grubun koza ağır-lığı, boyu ve çapı ile doğru orantılı olarak pupa ağırlığı ve boyutu da kontrol gurubuna göre daha küçük olmaktadır. D. melanogaster’le yapılan çalışmada araştırmacılar sınırlı besin verilmesi ile larvalardan daha küçük boyutlarda, fakat üreyebilen ergin formlar elde etmişler, kritik ağırlığı geçmiş olan larvaların daha küçük boyutta ergin bireyler meydana getirebildiklerini bildirmişlerdir [4]. Bu çalışmada da 2. ve 1. grubun kelebek ağırlığı ve boyutunun daha küçük olduğu tarafımızdan gözlenmiştir.
Sonuç olarak holometabol gelişim gösteren B. mori’de yumurtadan çıkıştan itibaren kelebek oluncaya kadar geçi-rilen tüm evreleri bir zincirin halkaları olarak kabul edilirse, zincirin ilk halkası olan larval evrede meydana gelen bes-lenmeye bağlı gelişim bozukluklarının son halkaya kadar yansıdığı ve büyümede besinin önemli bir parametre olduğu düşünülmelidir.
KAYNAKLAR
[1] Timmermann S.E., Briegel H. 1998. Molting and metamorphosis in mosquito larvae: a morphometric analysis. Mitteilungen Der Schweizerischen Entomologischen Gesellschaft Bulletin De La Societe Entomologique Suisse, 71:373-387.
[2] Nijhout H.F. 2003. The control of growth, Development, 130:5863-5867.
[3] Nijhout H.F. 2003. The control of body size in insects. Developmental Biology 261:1-9.
[4] Britton J.S., Edgar B.A. 1998. Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms. Development 125:2149-2158.
[5] Edgar B.A. 1999. From small flies come big discoveries about size control, Naturel Cell Biology, 1:E191-E193.
[6] Weinkove D., Neufeld T., Twardzik T., Waterfield M., Leevers S. 1999. Regulation of imaginal disc cell size, cell number and organ size by Drosophila class IA phosphoinositide 3-kinase and its adaptor. Curr. Biol. 9:1019-1029.
[7] Edgar B. A., Britton J., de la Cruz A.F.A., Johnston L.A., Lehman D., Castellanos C.M., Prober D. 2001. Pattern- and growth-linked cell cycles in Drosophila development, Novartis Foundation Symposium, 237:3-18.
[8] Britton J.S., Lockwood W.K., Cohen S.M., Edgar B.A. 2002. Drosophila’s insulin/P13-kinase pathway coordinates cellular metabolism with nutritional conditions. Dev. Cell 2:239-249. [9] Ikeya T., Galic M., Belawat P., Nairz K., Hafen E. 2002.
Nutrient-dependent expression of insulin-like peptides from neuroendocrine cells in the CNS contributes to growth regulation in Drosophila. Curr. Biol. 12:1293-1300.
[10] Nijhout H.F., Grunert L.W. 2002. Bombyxin is a growth factor for wing imaginal discs in Lepidoptera. Proc. Natl. Acad. Sci USA 99:15446-15450.
[11] Satake S., Masumura M., Ishizaki H., Nagata K., Kataoka H., Suzuki A., Mizoguchi A. 1997. Bombyxin, an insulinrelated peptide of insects, reduces the major storage carbohydrates in the silkworm Bombyx mori. Comp. Biochem. Physiol. 118:349-357.
[12] Masumura M., Satake S., Saegusa H., Mizoguchi A. 2000. Glucose stimulates the release of bombyxin, an insulin-related peptide of the silkworm Bombyx mori. Gen. Comp. Endocrinol. 118:393-399.
[13] Browder M.H., D’Amico L.J., Nijhout H.F. 2001. The role of low levels of juvenile hormone esterase in the metamorphosis of Manduca sexta. J. Insect Sci. 11:1-5.
[14] Cymborowski B., Bogus M., Beckage N.E., Williams C.M., Riddiford LM. 1982. Juvenile hormone titres and metabolism during starvation-induced supernumerary larval moulting of the tobacco hornworm, Manduca sexta Journal of Insect Physiology 28:129-135.
[15] Sparks T.C., Hammock B.D., Riddiford L.M. 1983. The haemolymph juvenile hormone esterase of Manduca sexta-inhibition and regulation. Insect Biochemistry 13:529-541. [16] Nijhout H.F., Williams C.M. 1974. Control of moulting and
metamorphosis in the tobacco hornworm, Manduca sexta (L.): growth of the last-instar larva and the decision to pupae. J. Exp. Biol. 61:481-491.
[17] Nijhout H.F., Williams C.M. 1974. Control of moulting and metamorphosis in the tobacco hornworm, Manduca sexta (L.): cessation of juvenile hormone secretion as a trigger for pupation. J. Exp. Biol. 61:493-501.
[18] D’Amico L.J., Davidowitz G., Nijhout H.F. 2001. The developmental and physiological basis of body size evolution in an insect. Proc. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 268:1589-1593. [19] Davidowitz G., D’Amico L.J., Nijhout H.F. 2003. Critical
weight in the development of insect body size. Evol. Dev. 5:188-197.
[20] Sudo M., Tanaka S. 1989. A factor in heat-treated mulberry leaves that inhibits metamorphosis in Bombyx mori: effects on development of last instar larvae and pupae. Appl. Ent. Zool. 24:441-449.
[21] Şahan Ü., Gülseren C., Özeler A. 1999. Ebeveyn generasyonun kısıntılı beslenmesinin birinci generasyon ipekböceklerinde (Bombyx mori) larva ve koza karakterleri üzerine etkisi. Tr. J. Of Veterinary and Animal Sciences 23(3):495-499.
[22] Vassarmidaki M.E., Harizanis P.C., Katsikis S. 2000. Effect of applaud on the growth of silkworm. J. Econ. Entomol. 93(2):290-292.
[23] Ryu K.S. 1978. İpekböceği bakım beslenme ve hastalıkları. İpekböcekçiliği Araştırma Enstitüsü Yayınları No:70. [24] Parlak O. 2001. İpekböceği Biyolojisi yardımcı ders kitabı.
Ege Üniversitesi Basımevi, Fen Fakültesi Yayınları No:171, Bornova-İzmir.
[25] Turgay İzzetoğlu G., Falakalı Mutaf B. 2008. İpekböceği (Bombycidae: Bombyx mori)’nin Farklı Genomik İçerikli Yumurtalarında Vitellin Proteini Özelliklerinin Araştırılması. Biyoloji Bilimleri Araştırma Dergisi 1(1): 23-29.
[26] Shimizu M., Tajima Y. 1972. Handbook of Silkworm Rearing, Agricultural Technique Manual 1, Fuji Publishing Co., LTD., Tokyo, Japan.
