POLYGONUM COGNATUM MEISSN.
(MADIMAK) TOHUMLARININ ÇİMLENME BİYOLOJİSİ ve KLONLARI ARASINDAKİ GENETİK
ÇEŞİTLİLİĞİN BELİRLENMESİ Mesut ÖZKURT
Y.Lisans Tezi
Bitki Koruma Anabilim Dalı Doç. Dr. Hüseyin ÖNEN
T.C.
GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİTKİ KORUMA ANABİLİM DALI
Y.LİSANS TEZİ
POLYGONUM COGNATUM MEISSN. (MADIMAK) TOHUMLARININ ÇİMLENME BİYOLOJİSİ ve KLONLARI ARASINDAKİ GENETİK
ÇEŞİTLİLİĞİN BELİRLENMESİ
Mesut ÖZKURT
TOKAT 2008
kurallarına uyulduğunu, başkalarının eserlerinden yararlanılması durumunda bilimsel normlara uygun olarak atıfta bulunulduğunu, tezin içerdiği yenilik ve sonuçların başka bir yerden alınmadığını, kullanılan verilerde herhangi bir tahrifat yapılmadığını, tezin herhangi bir kısmının bu üniversite veya başka bir üniversitedeki başka bir tez çalışması olarak sunulmadığını beyan ederim.
07/04/2008 tarihinde aşağıdaki jüri tarafından oy birliği/oy çokluğu ile Bitki Koruma Anabilim Dalı’nda Yüksek Lisans tezi olarak kabul edilmiştir.
Başkan : Prof. Dr. İzzet KADIOĞLU İmza :
Üye : Doç. Dr. Hüseyin ÖNEN İmza :
Üye : Yrd. Doç. Dr. İskender PARMAKSIZ İmza :
Yukarıdaki sonucu onaylarım
Prof. Dr. Metin YILDIRIM
i
Y. Lisans Tezi
POLYGONUM COGNATUM MEISSN. (MADIMAK) TOHUMLARININ ÇİMLENME BİYOLOJİSİ ve KLONLARI ARASINDAKİ GENETİK ÇEŞİTLİLİĞİN
BELİRLENMESİ
Mesut ÖZKURT Gaziosmanpaşa Üniversitesi
Fen Bilimleri Enstitüsü Bitki Koruma Anabilim Dalı
Danışman: Doç. Dr. Hüseyin ÖNEN
Türkçede, madımak olarak isimlendirilen Polygonum cognatum Meissn. tarım alanlarında veya tarla sınırları, karayolları kenarları, hava alanları ve endüstriyel bölgeler gibi tarım yapılmayan alanlarda yabancı ot olarak bulunmaktadır. Ancak, Orta Anadolu Bölgesinde (özellikle Tokat, Sivas ve Çorum Amasya illerinde) insanlar tarafından besin olarak yoğun bir şekilde tüketildiğinden, bu yörelerimizde halk kültüründe önemli yer işgal eden bir bitkidir. Bununla birlikte, madımak üzerinde çok az sayıda araştırma yapılmış olup, mevcut araştırmalar da genellikle madımağın ana vatanı, yayılış alanları ile bazı biyolojik özelliklerinin saptanması ve halk tababetinde kullanımı üzerinde yoğunlaşmıştır. Bu çalışmada; i) İç Anadolu’nun farklı ekolojik koşullara sahip bölgelerinden (Tokat, Sivas, Çorum ve Amasya illerinde) toplanan P. cognatum klonları arasındaki genetik varyasyonun RAPD-PCR çalışmaları ile ortaya konması, ii) madımak tohumlarının genel özelliklerinin belirlenmesi ve iii) madımak tohumlarında görülen dormansinin ortadan kaldırılması için uygun yöntemlerin belirlenmesi amaçlanmıştır. RAPD-PCR çalışmasında toplam 45 primer denenmiştir. Daha önce öngörülmeyen problemler nedeniyle bunlardan sadece 4 primerle çalışılmıştır. Tohumların genel özellikleri mikroskop altında belirlenmiş ve tohumların bin dane ağırlığı saptanmıştır. Tohumlarda görülen dormansinin ortadan kaldırılması amacıyla sülfürik asit, gibberellik asit ve potasyum nitrat uygulamaları yapılmış, tohumlar ön üşütme veya ön ısıtmaya tabi tutulmuş ve tohumlara akan suyun altında yıkanma ile mekanik kazıma işlemleri uygulanmıştır. RAPD-PCR çalışmasında kullanılan primerlerdan 80 bant elde edilmiş, bu bantlardaki polimorfizmin % 100 olduğu saptanmıştır. Elde edilen bantlara göre çalışmada kullanılan 68 klon 3 farklı gruba ayrılmıştır. Madımak tohumları üzerinde yapılan çalışmalarda, tohumların achene formunda, üzerinde perinat kalıntıları olan üç
ii
gibberellik asit uygulamaları beraberce yapıldığında ise en yüksek çimlenme oranı saptanmış ve tohumların % 57’ye varan oranda çimlenebildiği belirlenmiştir
2008,65 Sayfa
Anahtar Kelimeler: Polygonum cognatum, Madımak, Genetik varyasyon, RAPD, PCR, Dormansi, Tohum çimlenme biyolojisi
iii Ms Thesis
DETERMINATION OF GERMINATION BIOLOGY OF MADIMAK (POLYGONUM COGNATUM MEISSN.) SEEDS AND GENETIC VARIATION AMONG CLONES
Mesut OZKURT
Gaziosmanpaşa University
Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Plant Protection
Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Huseyin ONEN
Polygonum cognatum Meissn, known as ‘madimak’ in Turkish, is a weed found in both agricultural and non-agricultural areas such as field edges and roadsides, airfield and industrial areas. Since the weed is consumed as vegetable, especially in Central Anatolian Region, it is also an important folkloric plant. Literature review shows that number of researches on madimak is very limited. The researches generally focused on the origin and distribution of madimak, and determined some of biological characteristic and the process of consuming as a vegetable and folk medicine plant. The aims of this research are to; i) investigate genetic variation among P. cognatum clones adapted to different ecological conditions of Central Anatolian (Tokat, Sivas, Corum and Amasya provinces) Region using RAPD-PCR analyses, ii) determine seed properties of P. cognatum, and iii) determine suitable processes to overcome seed dormancy. Forty-five primers were tested for the RAPD-PCR analyses. Due to unexpected problems occurred during the experiment, only four primers were selected to identify the genetic distances among madimak clones. Sulfuric acid, hot water and mechanical seed scarifications, potassium nitrate, gibberellik acid, chilling applications, and washing under running water treatments were used to promote seed germination. Totally 80 bands were obtained from the RAPD-PCR studies. The polymorphic rate of the bands was 100 %. Depending on pattern of bands, total 68 clones collected from different habitats were divided into three groups. The fruit of madiamak (a triangular achene surrounded by remains of perianth, dark brown or black in color, smooth and shiny) was measured as 1.64 mm x 2.94 mm in
iv 2008, 65 Pages
Keywords: Polygonum cognatum Meissn., Madimak, Genetic variation, RAPD, PCR, Dormansi, Seed germination biology.
v
Çalışmamın her aşamasında bilgi, öneri, yardım ve desteğini esirgemeyen ayrıca engin fikirleriyle akademik anlamda yetişme ve gelişmeme katkıda bulunan danışman hocam Sayın Doç. Dr. Hüseyin ÖNEN’e, ayrıca çalışmalarımın her aşamasında yardımlarını esirgemeyen ve bana maddi manevi destek olan Sayın Yrd. Doç. Dr. İskender PARMAKSIZ’a, bilimsel yaklaşımları ve engin bilgileri ile gerek çalışmalarımda gerekse yetişmemde yardımı olan bölüm başkanımız Sayın Prof. Dr. İzzet KADIOĞLU ve diğer bölüm hocalarıma, çalışmalarımın başından sonuna kadar benden yardımlarını esirgemeyen arkadaşlarım Zir. Yük. Müh. Melih YILAR, Zir. Yük. M. Yaşar ÖZDEMİR, Zir. Yük. Fatih ALAY, Yüksek Lisan Öğrencisi Murat AYDEMİR, Yüksek Lisan Öğrencisi İsmail BENLİ’ye teşekkürü bir borç bilirim.
Ayrıca tüm hayatım boyunca attığım her adımda benden hiçbir fedakârlığı esirgemeyen aileme ve çalışmalarımın her aşamasında manen desteğini esirgemeyen, benim stres ve yorgunluğuma katlanan arkadaşlarıma tüm yakınlarıma bütün samimi duygularımla teşekkür ederim.
Bu tez; TÜBİTAK TOVAG (Tarım Ormancılık Veterinerlik Araştırma Gurubu) tarafından desteklen “Orta Anadolu Orijinli Madımak (Polygonum cognatum Meissn.) Genotiplerinin Moleküler ve Agronomik Özellikleri ile Allelopatik Potansiyellerinin Belirlenmesi” adlı ve 105 O 502 nolu proje kapsamında yürütülen çalışmaların bir kısmını içermektedir.
Mesut ÖZKURT Mayıs 2008
vi Sayfa ÖZET ……...I ABSTRACT...III ÖNSÖZ ………...…...V İÇİNDEKİLER……….VI RESİMLER DİZİNİ...IX ÇİZELGELER DİZİNİ………X SİMGE ve KISALTMALAR DİZİNİ...XI
1.GİRİŞ………..1
2. LİTERATÜR ÖZETLERİ………..3
2.1. Polygonaceae Familyasının Genel Özellikleri……….3
2.2 Polygonaceae Cinsinin Genel Özelikleri……….……….3
2.3 Polygonaceae Cinsinin Sistematiği………..………4
2.4. Polygonum cognatum (Meissn.)’ in Genel Özellikleri..………..4
2.4.1. Çevre İstekleri………...5 2.4.2. Bitkinin İçeriği………..5 2.4.3. Kullanılma Şekiller………...5 2.5. Çimlenme Çalışmaları……….5 2.6. DNA Markörleri………..8 3. MATERYAL ve YÖNTEM……….17 3.1. Materyal……….17 3.2. Yöntem………..22
3.2.1. Madımak Tohumlarının Bazı Morfolojik Özelliklerinin Belirlenmesi…………..22
3.2.1.1. Tohum büyüklüğü, Tohum şekli ve Bin Dane Ağırlığı………...22
3.2.2. Çimlenme ve Dormansi Kırma Çalışmalarında Kullanılan Yöntemler…………..22
vii
3.2.2.5. Ön üşütme Çalışmaları...……….24
3.2.2.6. Ön Isıtma Çalışmaları………...………...24
3.2.2.7. Suda Yıkama Çalışmaları…..………..24
3.2.2.8. Mekanik Kazıma………..25
3.2.3. Madımak Tohumlarının Çimlenme Biyolojisine İlişkin Verilerin Değerlendirilmesi……….25
3.2.3. Moleküler Çalışmalar……….26
3.2.4.1. DNA İzolasyonu……….27
3.2.4.2. DNA Konsantrasyonunun Ayarlanması…..………27
3.2.4.3. MgCl2 Konsantrasyonu ve Optimizasyonu….………...27
3.2.4.4. Primer seçimi, Konsantrasyonu ve Optimizasyonları………..……...….28
3.2.4.5. dNTP Konsantrasyonu ve Optimizasyonu………..………...29
3.2.4.6. Taq DNA Polimeraz Konsantrasyonu…..………..29
3.2.4.7. DNA Polimeraz Tamponu…..………29
3.2.4.8. PCR Koşullarının Optimizasyonu……..……….30
3.2.4.9. Agaroz Jel Elektroforezi ve Fotoğraflama………..………30
3.2.4.10. RAPD Polimorfizmi ve Genetik Mesafenin Hesaplanması…….………31
4. BULGULAR ve TARTIŞMA………..32
4.1. Çimlenme Çalışmaları ile İlgili Çalışmalar..……….32
4.1.1. Tohum büyüklüğü, Tohum Şekli ve Bin Dane Ağırlığı………...32
4.1.2. Mekanik Kazıma……….33
4.1.3. Sülfürik Asit Uygulaması…..……….33
viii
4.1.8. Ön Yıkama Çalışmaları..………39
4.2. Moleküler Çalışmalar ve Optimizasyonu………..40
4.2.1. DNA İzolasyonu Optimizasyonu ve Miktar Tayini………..………..40
4.2.2. PCR Koşullarının Optimizasyonu ve RAPD Tekniği………41
4.2.3. MgCl2 Konsantrasyonun Ayarlanması…..……….43
4.2.4. Primer Seçimi ve Optimizasyonu………...44
4.2.5. dNTP Konsantrasyonu..………..44
4.2.6. Taq DNA Polimeraz Konsantrasyonun Optimizasyonu…….………....45
4.2.7. Agaroz Jel Elektroforezi ve Fotoğraflama………….………45
4.2.8. RAPD Polimorfizmi ve Genetik Mesafenin Tesbiti………...47
5. SONUÇ……….52
KAYNAKLAR………54
EKLER……….60
EK 1 DNA Extraksiyon Protokolü………..60
EK 2. Kullanılan Kimyasallar ve Çözeltiler……….61
EK 3. Polimorfizim Mesafeleri……… 64
ix
Resim 2. Moleküler düzeydeki çalışmalarda kullanılmak üzere madımak klonlarından yaprak örneklerinin alınma dönemi……….27
Resim 3. Madımak yaprakların fiziksel olarak sıvı nitrojenle öğütülmesi……….28 Resim 4. MgCl
2 optimizasyonu sırasında alınan bir görüntü………..29 Resim 5. 45 RAPD primerlerinin denenmesi esnasında elde edilen bantlar…………...29
Resim 6. dNTPs optimizasyonu esnasında alınan bir görüntü………30 Resim 7. PCR çalışmalarında kullanılan APOLLO ATC 401 marka cihaz…………..31 Resim 8. Tohumların genel görünümü………...33 Resim 9. RAPD pirimerlerinin verdiği polimorfik agaroz jel görüntüleri……….48 Resim 9. Madımak klonlarında RAPD analizi sonucu oluşan dendogram………51
x
Çizelge 3.1. İllere göre toplanan madımak klonlarının ve kullanılan klon sayısı……...18 Çizelge 3.2. Tokat-Kazova’nın İklim Verileri….………..19 Çizelge 3.3. Klonların toplandığı iller, bu illere bağlı ilçe ve köy isimleri ile klonların toplandığı yerler (habitatları) ve bunların parsellerdeki gelişme durumu (skala değeri olarak) verilmiştir………...20
Çizelge 4.1. Tohum en boy ve ortamla büyüklükleri………33 Çizelge 4.2. Mekanik kazıma çalışmasının madımak tohumlarının çimlenmesi üzerine
olan etkileri………34
Çizelge 4.3. Sülfürik asit uygulamasının madımak tohumlarının çimlenmesi üzerine olan etkileri………35
Çizelge 4.4. Sülfürik-Gibberellik asit uygulamasının madımak tohumlarının çimlenmesi üzerine olan etkileri………..36
Çizelge 4.5. Potasyum nitrat uygulamasının madımak tohumlarının çimlenmesi üzerine olan etkileri………38
Çizelge 4.6. Ön ısıtma çalışmasının madımak tohumlarının çimlenmesi üzerine olan etkileri………39
Çizelge 4.7. Ön üşütme çalışmasının madımak tohumlarının çimlenmesi üzerine olan etkileri………40
Çizelge 4.8. Suda yıkamanın madımak tohumlarının çimlenmesi üzerine olan etkileri...40 Çizelge 4.9. Optimize edilen reaksiyon karışımları ve PCR koşulları……….44 Çizelge 4.10. Çalışmada kullanılan primerler ve optimize edilen sıcaklıkları………….45
xi
AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism (çoğaltılmış fragmentlerin uzunluk polimorfizmi)
CTAB Cetyhrimethhylamoninmbromide dATP deoksi adenozin trifosfat
dCTP deoksi sitozin trifosfat dGTP deoksi guanozin trifosfat dTTP deoksi timidin trifosfat DNA deoksiribonükleik asid EDTA Ethilendiamintetraasetik asid mM milimolar
ng nanogram
PCR Polymerase Chain Reaction (polimeraz zincir reaksiyonu) POPGENE Population Genetic Analysis (Populasyun Genetik Analizi)
RAPD Randomly Amplified Polymorfic DNA (rastgele çoğaltılmış polimorfik DNA)
MEGA Molecular Evolutionary Genetics Analysis
RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (kesilmiş parçaların uzunluk polimorfizmi)
SSR Simple Sequence Repeat (basit dizi tekrarı) STS Sequence target site (dizisi etiketlenmiş bölge) Taq Thermus aguaticus
TBE Tris/borat/EDTA (Buffer) TE Tris/EDTA (Buffer)
Tris Tris(hidroksimetil) aminometan Tris-HCl Tris hidroklorid
xii µM mikromolar
1.GİRİŞ
Giderek artmakta olan dünya nüfusuna paralel olarak tarım alanlarının yerleşim yeri veya sanayi tesislerinin kurulması amacıyla kullanımının bir sonucu olarak ekilebilecek tarım alanları her gecen gün azalmaktadır. Ayrıca, insan nufusundaki artış yanında sanayideki gelişmenin bir sonucu olarak tarım alanlarında kirlilik her gecen gün artmakta ve doğal denge bozulmaktadır. Dolayısıyla tarım alanlarının arttırılması mümkün olmadığına göre artan nüfusu beslemek için var olan kaynakların en uygun şekilde kullanılması gerekmektedir. Bu amaçla günümüzde kullanılan modern tarım teknikleri ve klasik bitki ıslah yöntemleri ile büyük verim artışları sağlanmıştır. Sağlanan bu verim artışına rağmen, büyük bir hızla artan insan nüfusuna paralel olarak verimin daha fazla arttırılması gerekmektedir.
İnsanoğlunun beslenmesinin garanti altına alınabilmesi ancak birim alanda mümkün olan en yüksek verimin alınması ile mümkün olduğundan sulama, gübreleme ile tarım sistemlerinin geliştirilmesi yanında gereken bitki koruma önlemlerinin alınmasına dıkkat edilmektedir. Klasik ıslah yöntemleri ile bitkilerin genetik yapıları değiştirilerek başarılı sonuçlar alınmaktadır. Fakat klasik yöntemlerle yeni çeşit ıslahı için uzun yıllara ihtiyaç duyulmaktadır. Moleküler biyoloji ve buna bağlı olarak biyoteknolojide meydana gelen büyük gelişmeler klasik ıslahta karşılaşılan sorunların çözümü için yeni alternatifler sunmuştur. Bu yöntemlerinin hızlı bir şekilde benimsenmesi ve bitkilere uygulanması ile bitkisel üretimde bilinen klasik yöntemlerle çözülemeyen veya çözümü zor olan sorunlara çözüm bulunmuş ve kalite ve verim bakımından daha üstün özelliklere sahip çeşitler elde edilmiştir. Bunun bir sonucu olarak bitkisel üretimde diğer kültürel tedbirlere de riayet edilerek üretim patlaması yaşanmıştır. Ancak biyoteknolojik yöntemlerin, yalnızca bilinen bitkisel üretim ve klasik ıslah yöntemlerini bütünleyici nitelikte olduğu unutulmamalıdır.
Tüm bu çalışmalara kaynaklık eden gen kaynaklarının korunması büyük önem taşımaktadır. Zira tüm tahribatlara rağmen insanoğlunun geleceği halen doğada var olan yeni besin kaynakları veya gen kaynaklarında gizli olabilir. Bu bağlamda yabancı otlar
sahip oldukları yüksek uyum yetenekleri nedeniyle üzerinde durulması gereken bitkiler arasında yer almaktadır.
Polygonum cognatum (Mesinn.) (madımak) orta Anadolu’da (Tokat, Sivas, Amasya illerinde) insanlar tarafından yoğun olarak tüketilen ve halk tababetinde kullanılmaktadır. Şimdiye kadar geleneksel olarak tarım veya tarım dışı alanlardan toplanarak evlerde tüketilen madımak artan şehirleşmeye paralel olarak ticari bir ürün olarak pazarlarda satılmaya başlanmıştır. Bu nedenle de artan talebi daha kolay bir şekilde karşılamak ve pazara ürünü zamanında sunabilmek amacıyla, günümüzde madımak tarımı yapılmaya çalışılmaktadır.
Bitkinin tohumlarında bulunan dormansi nedeniyle, çiftçiler farklı bölgelerden topladıkları ve özelliklerini bilmedikleri klonlara ait vejetatif üreme materyali (rizomlar) ile tarlada yetiştiricilik yapmaktadırlar. Karışık halde toplanıp tarlaya dikilen bu üretim materyalinden de istenen kalitede ürün alınamamaktadır. Bu sebeple giderek artan talep nedeniyle ileride daha büyük alanlarda tarımı yapılması öngörülen bu bitkinin klonları arasındaki genetik ve morfolojik farklılıkların ortaya konması ve buna göre seleksiyona gidilmesi büyük önem taşımaktadır. Üstün agronomik özlliklere ve yabancı otları baskı altına alması yönüyle yüksek allelopatik potansiyele sahip çeşitlerin seleksiyonu ile madımak tarımının çok daha hızlı bir şekilde yayğınlaşmasına katkı sağlanacaktır. Ayrıca, tarım alanlarında yabancı ot veya doğal ekosistemlerde yabani bitki olarak bulunması nedeniyle, madımak klonları arasındaki genetik farklılıkların ortaya konması çok yıllık yabancı otlarda görülen klonal varyasyonun düzeyi ve bu bitkilerin adaptasyon yeteneklerinin anlaşılmasına teorik ve pratik katkılar sağlayacaktır. Elde edilecek bu sonuçlardan özellikle çok yıllık yabancı otların idaresinde yararlanmak mümkün olacaktır.
Tohumdan üretimin için öncelikle madımak tohumlarında var olan dormansinin ortadan kadırılması gerekmektedir. Ancak, madımak tohumları üzerinde de daha önce herhanği bir çalışma yapılmamış olması bitkinin çimlenme biyolojisi üzerinde çalışmaların yapılasını da zorunlu kılmaktadır. İşte multi disipliner bir projenin bir kısmı olarak (TÜBİTAK-TOVAG 105 O 502 nolu proje) bu tezde, İç Anadoluda yaygın olarak tüketilen ve allelopatik potansiyeli ile antioksidant ve antimikrobial etkisi nedeniyle
değerli bir bitki olan madımağın klonları arsındaki genetik çeşitliliğin belirlenmesi ve tohumdan üretim önündeki sorunların ortadan kaldırılması amacıyla tohum dormansinin kırılması için uygun yöntemlerin saptanması hedeflenmiştir.
Çalışma ile orta Anadolu’nun farklı bölgelerinden (Tokat, Sivas ve Amasya İllerinde) toplanacak madımak genotiplerinde bulunan genetik varyasyonun RAPD (Rastgele Çoğaltılmış Polimorfik DNA’lar) teknikleri ile ortaya konmuş ve farklı dormansi kırıcı tekniklerin medımak tohumlarının çimlenmesine etkisi belirlenmiştir. Daha önce literatürde dünyada madımağın genetik çeşitliliği ve tohumların çimlenme biyolojisi üzerinde herhangi bir çalışmanın olmaması sonuçların önemini biraz daha güçlendirmektedir. Ancak proje aşamasında karşılaşılan bazı sorunlar nedeniyle çalışmanın özlelikle genetik varyasyonun kısmını daha sonra detaylı bir şekilde tekrarlama zorunluluğunu ortaya çıkarmıştır.
2. LİTERATÜR ÖZETLERİ
2.1. Polygonaceae Familyasının Genel Özellikleri
Başta Kuzey Yarımkürede olmak üzere tüm dünyada yayılış gösteren Polygonaceae familyası 38 cins ve 800 tür içermektedir. Türkiye’de ise bu familyaya ait 8 cins ve 68 kadar tür bulunmaktadır. Tek veya çok yıllık otsu, çalı veya nadiren ağaç formunda bitkilerdir (Özer ve ark., 1999).
Ülkemizde Polygonaceae familyasında yer alan bitkiler çayır mera alanlarında sıkça rastlandığı ve hayvanlarda duyarlılığı artırdığı (Töngel ve ark., 2005); halk arasında ise tedavi amaçlı (Şimşek ve ark., 2002) ve gıda olarak (Turan ve ark., 2003; Şimşek ve ark., 2002) tüketilmektedir.
Genellikle tek veya çok yıllık otsu, çalı veya nadiren ağaç formunda bitkilerdir. Bir veya iki evcikli olabilirler. Yapraklar basit, mızrak ucu şekilli, eliptik, üç köşeli veya böbrek şeklinde olabilirler. Çiçekler tek veya iki eşeyli, ışınsal simetrili ve sipika, panikula veya demetler halinde bulunur. Çanak yaprakları 3-6 adet, tabanda birleşmiş ve iki daire şeklinde dizilmişlerdir. Taç yaprak yok. Erkek organ 6-9 adet ve 2 dairede dizili, dişi organ 1, ovaryum üst durumlu, 2-4 karpelli ve tek gözlüdür. Meyve köşeli veya kanatlı bir akendir (Özer ve ark., 1999).
2.2 Polygonaceae cinsinin genel özelikleri
Polygonum cinsi Polygonaceae familyasına dahildir. Polygonum cinsi adını Adını Yunanca çok anlamına gelen “Poly” ve boğum anlamına gelen “gonu” kelimelerinden almaktadır. Özellikle kuzey yarım kürenin ılıman bölgelerinde gelişmektedir. 5 cm kadar boylanabilen tek yıllık otsu bitkileri, 3-4 m kadar boylanabilen çok yıllık otsu bitkileri ve 20-30 m kadar boylanabilen çok yıllık odunsu bitkileri içeren geniş bir cinstir. Her bir sürgün veya yaprak boğumlarında yoğun kümeler halinde, pembe, beyaz veya yeşilimsi renkte yazın açan küçük çiçekleri vardır (Anonymous, 2007a).
2.3 Polygonaceae cinsinin sistematiği
Polygonum cinsinin sistematiği önemli görülen 9 Polygonum türü verilmektedir (Anonymous, 2007c).
Alem: Plantae
Bölüm: Magnoliophyta (kapalı tohumlar) Sınıf: Magnoliopsida (İki çenekliler) Takım: Caryophyllales
Familya: Polygonaceae Cins: Polygonum
Tür: Polygonum cognatum Meissn. Polygonum aviculare L. Polygonum hydropiper L.
Polygonum multiflorum Thunb.
Polygonum cuspidatum Siebold & Zucc.
Polygonum sachalinense F. Schmidt ex Maxim. Polygonum convolvulus L. ve diğerleri
2.4. Polygonum cognatum (Meissn.)’ in genel özellikleri
Türkiye’de Polygonum cinsine bağlı 27 bitki türü teşhis edilmiş olup bunlardan 2 tanesi Anadolu’da gıda olarak tüketilmektedir. Bunlar sürgünleri pişirilip yenilebilen Polygonum cognatum Meissn. ve daha ziyade ilaç olarak değerlendirilebilen P. aviculare L.‘dir (Aker, 1989). Yabancı ot olarak tarım alanlarında sorun oluşturan P. aviculare tek yıllık olup kara madımak olarak adlandırılmaktadır.
Madımak veya hakiki madımak olarak adlandırılan P. cognatum ise genellikle çok yıllık, sürünücü gövdeli, kazık köklü, 50 cm'ye kadar boylanabilen otsu bir bitkidir. Gövdesi sert ve silindiriktir. Gövde ilk önce toprak yüzeyine dik olarak gelişir. Daha sonra toprak yüzeyine yayılmaktadır. Gövde sürgünleri yeşil renktedir. Yapraklar basit, mızrak, ok, böbrek veya elips şeklindedir. Yapraklar sürgün üzerinde alternat veya
nadiren karşılıklı kulakçık tüp şeklini alarak boğum kınını oluşturur. Yaprak sapı kısa ve sürgünler şeffaf zarımsı bir kın içinde bağlanır. Yaprakların altı ve üstü tüysüz olup koyu yeşil renklidir. Çiçekler yaprak koltuklarında oluşur ve her yaprak koltuğunda 2-5 adet çiçek bulunur. Çiçekler 4-5 cm uzunluğunda, pembe renkli, hermafrodit olup basit veya iki kat 3-6 parçalı çanak yaprağa sahiptir. Tohum siyah renkte ve köşeli veya tek kanatlı bir akendir (Davis 1967; Yazgan ve Sağlam, 1992).
2.4.1. Çevre İstekleri:
Ülkemizde Bursa Uludağ ile Erzurum arasında kalan bölgede, özelliklede Orta Anadolu’da, 300 – 3000 m rakıma sahip yörelerde yol ve tarla kenarlarında, meyilli arazilerde ve tarım alanlarında yabani bitki veya yabancı ot olarak bulunmaktadır (Davis, 1966).
2.4.2. Bitkinin İçeriği:
Bitki içeriğinde organik asitler nedeniyle hafif ekşi bir lezzete sahip olan bitkinin 100 gr yenebilir kısımda 0,4 gr yağ, 1,4 gr protein, 65 mg C vitamini, 55 mg kalsiyum, 25 mg sodyum, 6 mg fosfor bulunmaktadır (Aker, 1990).
2.4.3. Kullanılma Şekilleri:
İdrar arttırıcı, böbrek taşlarına ve şeker hastalığına karşı kullanılmaktadır. Böbrek taşlarına karşı bitkinin kökleri kaynatılır ve suyu içilir. Yapraklarının haşlandığı su bebeklerin yüz ve vücutlarında oluşan isiliğe karşı da kullanılmaktadır (Baytop, 1984, Üçer, 1973).
2.5. Çimlenme Çalışmaları
Daha önce madımağın çimlenme biyolojisine yönelik olarak yapılmış herhanği bir çalışma bulunmamaktadır. Ancak literatürde madımağın yakın akraba türleri de dahil
olmak üzere farklı yabancı ot tohumlarında dormansinin varlığı ve dormansinin kırılmasına ilişkin çok sayıda çalışma bulunmaktadır. Örneğin yapılan bir çalışmada 20 farklı yabancı ot türüne ait tohumlar üzerinde, dormasi ve dormansinin kırılmasında etkili olan yöntemler araştırılmıştır. Bunun için bu türlerin tohum uçlarının kesildikten, tohumların 300C’de 1 hafta süreyle nemsiz ortamda ön ısıtmada 1 saat bekletildikten, 40C’de 1 hafta süreyle nemsiz ortamda ön üşütmede bırakıldıktan, 24 saat saf su da bekletildikten, %0,2’lik KNO3’de 24 saat muamele edildikten ve oda sıcaklığında 1 hafta süreyle havasız ortamda bekletildikten, 28 gün nemli ortamda karanlıkta bırakıldıktan sonra çimlenme testi 28 gün süreyle uygulanmıştır. Denemede 3., 5., 7., 14., 21. ve 28. günün sonunda ölçüm yapılmış olup, alınan sonuç % çimlenme olarak değerlendirilmiştir (İskenderoğlu ve ark., 1993).
Kokar ot (Bifora radians Bieb.) tohumlarının canlılık oranı ve bazı dormansi kırıcıların çimlenmeye etkileri üzerine araştırmalar yapılmıştır. Yapılan bu çalışmada 1986-87 yıllarında orta Anadolu buğday ekim alanlarının en yaygın ve yoğun yabancı otu durumunda olan kokarot (Bifora radians Bieb.)’un tohumlarının canlılık oranı ve bazı dormansi kırıcıların çimlenmeye etkileri araştırılmıştır. Oda sıcaklığında 12 ay bekletilen tohumlarda 10, 15 0C’lerde %53-54 çimlenme gerçekleşmiş, 40C ve 250C de ise çimlenme olmamıştır. 4-6 ay yaşlı tohumlarda 150C’de %2’lik KNO3 uygulamasında, %30, 500ppm GA3 ‘ta ise %38,5 çimlenme görülürken kontrolde bu oran %5-8 düzeyinde kalmıştır. Tohum kabuğunun mekanik yolla çıkarılması ile %24, H2SO4 ile yakılmasından %25, H2SO4 ile yakıldıktan sonra 500ppm GA3 uygulamasında ise %71 çimlenme görülmüştür. Tohumları damlama şeklindeki musluk suyunda belli süreler yıkama 24 saate kadar çimlenmeyi arttırıcı daha uzun sürelerde ise azaltıcı etkide bulunmuştur. Suda bekletme ve ışık çimlenmeyi olumsuz yönde etkilemiştir (Taştan ve Gürcan, 1993).
Kekere (Acroptilon repens L.) hem tohumla hem de kökleri ile çoğalıp yayılan bir bitkidir. Her ne kadar tohumla yayılma oranı köklere göre daha düşük oranda da olsa bir kekre bitkisinin yılda bazı araştırıcılara göre 25000 tohum oluşturduğu düşünülürse ve yine bir kekre bitkisinin iki yılda 12 m2’lik bir alanı kapladığı da göz önünde
bulundurulursa bu yabancı otun tohumla yayılmasının nedenli önemli olduğu gözler önüne serilmektedir. Kekre tohumlarında sekonder dormansinin olması bizi dormansi kırma çalışmalarına yöneltmiştir. Bu çalışmalarda Gibberellik asittin farklı dozları tohum çimlenmesini farklı oranlarda arttırmıştır. Tohumlara ışık uygulandığında, çimlenme karanlık ortama göre oldukça engellenmiştir. Tohumlara ön üşütme uygulaması ile sıcak-soğuk-sıcak ve soğuk-sıcak- soğuk kombinasyonları çimlenmeyi arttırıcı yönde etkilemiştir. Su içerisinde 2,5 ay bekletilen tohumların %77,5 oranında çimlendikleri görülmüştür. Tohum kabuğunun çimlenmeyi önemli ölçüde azalttığı saptanmıştır. Tohumların hasattan itibaren farklı süreler depo koşullarında bekletilmesinin çimlenmeye etkisi araştırılmış ve bunun sonucunda 22 ay oda sıcaklığında depolanan tohumların %78 oranında çimlendiği belirlenmiştir (Sözeri ve Erdiler 1993).
Lupinus arboreus tohumları faklı çizme ve sıcaklık uygulamasına maruz bırakılmıştır. Çizme olmaksızın bir hafta içinde %5 ten daha az çimlenme gözlemlenmiştir. 60 dakikalık sülfürik asit uygulamasına kadar muamele zamanının artmasıyla çimlenme düzenli bir şekilde artmış, 60 dakika dan sonra önemli bir artış olmuştur. Bunun yanında tohum yüzeyinin bıçakla çizilmesiyle %97 çimlenme olmuştur. En yüksek çimlenme 21-240C arasında meydana gelmiştir. Toplam çimlenme 320C’ye yakın olan durumlarda %2 azalırken 350C de çimlenme meydana gelmemiştir. Lupinus arboreus tohumlarında yüksek çimlenme çizme, 24-290C arasında tutma ise tohumlardaki çimlenme hızını arttırdığı belirtilmiştir (Mackay at. al., 2001).
Madımak ile aynı cinste yer alan Polygonum aviculare bitkisine ait tohumlar üzerinde yürütülen bir çalışmada ise; tohumlar 350 şerli guruplar halinde ağ şeklindeki naylon çantalara yerleştirilip önceden 700C 3 gün fırında kurutulan toprak ile doldurulmuş 5cm derinlikte ve 12cm çapındaki siyah plastik kaplara gömülmüştür. Kaplar doyuncaya kadar sulanmış ve üstü siyah naylon ile örtülmüştür. Farklı soğuk sıcaklıklarda (1,6, 7 ve 12oC) depolanan kapların ağırlıkları alınmış ve depolama periyodu boyunca kaplar düzenli aralıklarla tekrar tartılıp orijinal ağırlığına kadar su ilave edilmiştir. 1,60C de 12
gün depolamadan sonra çimlenme yüzdesinin düştüğü gözlemlenmiştir. (Batlla and Benech-Arnold 2005).
Trema micronfha L. tohumlarında dormansiyi kırmak için 25 dakika (%95-98) sülfürik asit konsantrasyonuna daldırılmış, daha sonra asidi yıkamak için 20 dakika musluk suyu ile yıkanmıştır. Tohumlar 12 saat damıtılmış suya daldırıldıktan sonra gölgede kurutulmuş ve thiram etkili maddeli bir fungusitle muamele edilmiştir. Daha sonra tohumlar 3 sabit (20oC, 30oC ve 40oC) ve 3 alternatif (20-30, 30-40, 20-40oC) sıcaklıklarda 15 hafta içinde çimlenmeye bırakılmıştır. Tohumların düşük yoğunluktaki sıcaklıklarda dahi çimlenme gösterdiği belirtilmiştir (Costellani and Aquior 2001).
Ferula gummosa Boiss.(Apiaceae) ve Teucrium polium L. (Labiatae) tohumlarının dormansi ve çimlenme gereksinimlerinin belirlenmesi amacıyla yürütülen bir çalışmada, her iki türün tohumları da farklı muamelelere (GA3, HNO3, H2SO4) maruz bırakılmıştır. T. polium tohumlarının en yüksek çimlenme oranı ve çimlenme yüzdesi 500-2500 ppm GA3 konsantrasyonlarında sağlanmıştır. T. polium’ un tohumlarının %75’i 5 ve 10 dk. H2SO4 ile çizme uygulamalarında çimlenirken, GA3 (1500ppm, 48h) uygulamasın da ise %31,9 oranında çimlenme belirlenmiştir. Suda ıslatma yönteminde F. gummosa tohumlarının T. polium’a nazaran daha az çimlenme gösterdiği belirtilmiştir (Nadjafi et. al., 2006).
2.6. DNA Markörleri
DNA’nın sarmal yapısının Watson ve Crick tarafından 1953 yılında keşfiyle biyolojik sistemler ve moleküler teknikler olmuştur. Beraberinde rekombinant DNA teknolojisiyle biyoteknoloji alanında hızlı adımlar atılmaya başlanmıştır. DNA markörleri farklı genotiplere ait DNA nükleik asit diziliş farklılığını çeşitli şekillerde ortaya koyan markörler geliştirilmiştir. Bu markörler DNA melezleme markörleri ve PCR (Polimeraz zincir reaksiyonu) kullanımına dayalı markörlerledir (Küfrevioğlu ve ark., 2000).
Polimeraz Zincirleme Reaksiyonu (Polymerase Chain Reaction - PCR), DNA içerisinde yer alan, dizisi bilinen iki segment arasındaki özgün bir bölgeyi enzimatik olarak çoğaltmak için uygulanan tepkimelere verilen ortak bir isimdir. Metot basitçe tüp içerisinde nükleik asitlerin uygun koşullarda çoğaltılması esasına dayanır. PCR; 94°C-98°C aralığında gerçekleştirilen denatürasyon, 30°C-65°C aralığında gerçekleştirilen primer yapışması ve 72°C’de gerçekleştirilen zincir uzaması aşamalarından oluşur ve bu parametrelerin belirli sayıda tekrarlanmasına dayanır.
PCR yöntemine dayalı olarak birçok primer olarak adlandırılan başlatıcı DNA teknikleri geliştirilmiştir. Bu başlatıcı DNA'lar belli dizilere sahip ve sentetik olarak üretilebilen moleküllerdir. PCR'a dayalı başlıca teknikler RAPD (Rasgele çoğaltılmış polimorfik DNA), AFLP(Çoğaltılmış parça uzunlukları polimorfizmi), SSR (Basit dizin tekrarı) gibi markör teknikleridir. Bu teknikler birçok bitki ve hayvanda genetik akrabalığın teşhisinde tür içi ve türler arasında kullanılmaktadır (Yıldırım ve Kandemir, 2005).
Tesadüfî olarak bazı primerlerin kullanılmasıyla elde edilen markörler, Rasgele Çoğaltılmış Polimorfik DNA’lar (RAPD’s) olarak adlandırılırlar. Bu markörde reaksiyon şartlarının spesifik olmaması DNA’nın rastgele çoğaltımına izin verir. Yaygın olarak PCR uygulamalarının aksine iki değil bir primer kullanılır. Ancak bu primer her iki yöndeki DNA üretimi içinde kullanıla bilir (Yıldırım ve Kandemir, 2002).
DNA markörleri birçok farklı mutasyon sınıflarının bir sonucu olarak ortaya çıkarlar. Tek bir bazın yer değiştirerek bir enzimin kesim noktasını değiştirmesi, DNA parçasının uzunluğunu değiştirerek ilgili gözlem metodunda direkt olarak bir bireyin genotipini temsil eden farklı bir markör ortaya çıkarır. PCR metodunu temel alan gözlemlerde PCR primerinin (başlatıcı DNA) bağlanacağı bölgedeki bir bazdaki değişiklik de aynı şekilde bir etkiye sahiptir. Alternatif olarak iki kesim bölgesi arasındaki veya iki primer bölgesi aralığındaki yeni düzenlenmeler DNA markörlerini meydana getirirler. Bu gibi yeni düzenlenmeler hareketli DNA elementlerinin (transposable elementler) katılmasını, çıkarılmasını veya ardışık olarak tekrarlanan sıraların kopyalanmasındaki hataları içerebilmektedir. Yeniden düzenlenmeler birçok farklı enzimler veya aynı bölgenin karşılıklı kıyılarında bulunan farklı PCR primerleri tarafından ortaya çıkarılabilen DNA markörlerini meydana
getirme eğilimindedirler. Öte yandan, taban yer değiştirmeleri sadece belirli kesici enzimler veya PCR primerlerine özeldir. Bir kesici enzim tarafından belirlenen DNA markörlerinin diğer kesici enzimler tarafından da belirlenebildiğinin bulunması, birçok bitki türlerindeki DNA markörlerinin çoğunun DNA'nın bölgesel reorganizasyonunun sonucu olduğunu göstermektedir (Özcan ve ark.,2004).
DNA markörleri farklı genotiplere ait DNA nükleik asit diziliş farklılığını çeşitli şekillerde ortaya koyan markörlerdir. Bunlar DNA melezleme markörleri ve polimeraz zincir reaksiyonu kullanımına dayalı DNA coğaltım markörleridir. DNA melezleme markörleri çeşitli şekillerde etkilenmiş bir DNA parçasının araştırılan bir DNA örneğindeki benzer veya aynı dizilişteki DNA’ya melezlenebilmesini temel almaktadır (Özcan ve ark., 2004).
Polimeraz zincir reaksiyonu DNA polimeraz enziminin kullanılmasıyla suni şartlarda DNA üretilmesini ifade etmektedir. Bu üretim için 6-25 nükleotid uzunluğunda başlatıcı DNA'lar (primerler) gerekir. Reaksiyon ortamında ayrıca pH'yı ve tuz konsantrasyonunu optimum hale getiren tampon çözelti, polimeraz enziminin ihtiyaç duyduğuMgCl2 ve DNA üretiminde kullanılacak A, T, G, C nükleotidlerinden her biri bulunur. Polimeraz enzimi, bu başlatıcı DNA'nın bir kalıp DNA üzerine bağlanmasından sonra, onu bir uçtan uzatmaya başlar ve kalıp DNA'nın aynısını üretir. DNA üretim işlemi birbirini izleyen bir seri çok spesifik sıcaklık devrelerinde yapılır. Önce 95 °C civarında bir sıcaklık kullanımıyla kalıp DNA'nın çift sarmal yapısı açılır ve DNA tek iplik haline getirilir. Sonra 30-60 °C arasında bir sıcaklıkta başlatıcı DNA'nın kalıp DNA'ya yapışması sağlanır. Son olarak da 72 C°'de DNA üretimi yapılır. Bu devrelerin sıcaklık koşullarının her birinde sadece 1-2 dakika kullanılır. Bu üç farklı sıcaklık koşulu isteğe bağlı olarak defalarca tekrarlana bilir (Yıldırım ve ark., 2005).
Son yıllarda polimeraz zincir reaksiyonunun kullanımı esasına dayalı geliştirilen DNA dizinindeki polimorfizmin belirlenebilmesi için RFLP (kesilmiş parça uzunlukları polimorfizmi), AFLP (çoğaltılmış parça uzunluğu polimorfizmi), SSR (basit dizin tekrarları) ve RAPD (rastgele çoğaltılmış polimorfik DNA) gibi moleküler markör
teknikleri geliştirilmiştir. Böylece farklı bir lokusu temsil eden her bir PCR ürünü ile DNA düzeyindeki farklılık tahmin edilebilmektedir (Reiter ve ark. 1993).
Çoğaltılan parça uzunluğu farklılığı-AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) tekniği RAPD tekniğinin dezavantajını gidermek üzere geliştirilmiştir. Bu teknikte genomik DNA önce birisi 6, diğeri 4 taban tanıyan iki kesim enzimi tarafından kesilir. Kesilen parçaların uçlarına nükleotid dizilişi sentetik olan DNA’lar eklenir. Eklenen sentetik DNA’nın nükleotid dizilişinde tanıyan başlatıcı DNA’lar kullanımıyla nispeten spesifik DNA çoğaltımı yapılır. Bu çoğatma iki aşamada gerçekleşir. İlk aşamada her iki uçtan DNA kesim enzimlerinin tanındığı diziden sonraki ilk nükleotide göre seçici çoğaltımın yapıldığı ön üretim; ikinci aşamada ise ön üretimde elde edilen parçaların kullanımıyla kesim enzimi tanıma yerinden sonraki ikinci ve üçüncü nükleotidler için seçici üretimin yapıldığı asıl üretimin yapıldığı bildirilmiştir (Özcan ve ark, 2004; Yıldırım ve ark., 2005).
STS tekniği RFLP güvenirliliği ve PCR kolaylığını bir araya getiren bir tekniktir. Nükleotid dizilişi bilinen az kopyalı yeterli uzunlukta (16-24 nükleotid) başlatıcı DNA laf geliştirilmekte ve bu başlatıcılar genomik DNA üzerinde çok spesifik şartlarda DNA üretimi yapılmaktadır (Yıldırım ve ark., 2004).
SSR veya mikrosatelitler ökaryotik genomlar boyunca dağılmış bulunan ve ardışık olarak tekrarlanmakta olan 2-6 nükleotid guruplarından oluşan PCR reaksiyonu temelli markör tipidir (Yıldırım ve ark., 2004).
Projede kullanılacak moleküler teknik olan Ko-dominant (heterozigot) RAPD markörleri; aynı lokusdan çoğalmış farklı büyüklükte DNA segmentleri olup, çok az sayıda belirlenebilmektedir (Williams ve ark. 1990).
Dominant markörler, kendilenmiş homozigot ebeveynlerin kullanılması durumunda genetik haritalama için uygundur. RAPD markörleri genetik haritalamada, bitki ve hayvan ıslahı uygulamalarında, popülâsyon genetiği çalışmalarında ve genetik farklılığı belirlemede kullanılmaktadır. Ayrıca DNA
parmak izi analizlerinde, kromozom-spesifik DNA parçacıklarının hızlı belirlenmesi ve polimorfizm bakımından etkili bir yöntemdir (Newbury ve Ford-Lloyd 1993).
RAPD tekniği, basit olmasının yanında çok sayıda bitki türünde uygulanabilmesi nedeni ile yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır. Örneğin; buğday (Dweikat ve ark. 1997, Akar 2002, Dilbirliği 2003), soya (Maughan ve ark. 1996, Doldi ve ark. 1997), mısır, pamuk, kırmızı üçgül (McDonald ve ark. 1994), patates (Demede ve ark. 1996), kiraz (Stockinger ve ark. 1996) ve susam (Şençiçek 2000), Oxytona seksiyonuna giren yabani haşhaş türleri (Parmaksız, 2004) RAPD tekniğinin başarı ile kullanıldığı bazı bitki türleridir.
Buchloe dactyloides (manda çimi) biyotipleri arasındaki farklılıklar 30 farklı primer kullanarak SSR, ISSR, SRAP ve RAPD yöntemi ile araştırılmıştır. Buna göre; ortalama genetik benzerlik SSR’ da 0,52, ISSR’de 0,51, SRAP’ de 0,62 ve RAPD’ de 0,57 olarak tespit edilmiştir. Ayrıca bu (ISSRs, SSRs, RAPDs ve SRAPs) 4 farklı markör tekniğide kendi aralarında karşılaştırılırken RAPD ve SRAP indekslerinde yüksek korelâsyon r: 0,73, RAPD ve SSR arasında r: 0,24 ve ISSR ve SSR arasında r: 0,63 olarak bulunduğunu belirtmişlerdir. Bu verilerin ışığında yakın akraba çeşitlerde genetik benzerliği ifade etmede RAPD’in güvenle kullanılabileceği anlaşılmaktadır (Budak ve ark. 2004). Ancak, başka bir çalışmada Orabanche cumana Wallr. üzerinde genetik çeşitliliği ortaya koymak amacıyla AFLP ve RAPD teknikleri karşılaştırılmış, AFLP markörünün RAPD’e göre daha güvenilir sonuçlar verdiği sonucuna varılmıştır (Ganne et al.2000).
Bir başka çalışmada ise RAPD markör analizi yardımıyla yirmiye yakın Orabanche ssp. arasındaki genetik farklılığı açıklamak için kullanılmıştır. O. alba, O. amethystea, O. arenaria, O. balotae, O. cernua, O. clausonis, O. cumana, O. crenata, O. densiflora, O. latisquanna, O. foetidavabroteri, O. gracilis, O. haenseleri, O. hederae, O. latisguanna, O. muteli, O. nan, O. ramosa, O. rapumgenistae, O. santolinae toplam 20 tür için 5 RAPD primeri kullanılarak 202 polimorfik sonuç sağlanmıştır. O.ramosa populasyonları benzer amplifikasyonlar gösterdiği halde O.cerenata popülasyonlarının gelişimi üzerindeki birçok farklılık bulunmuştur. O. foetida ile O. densiflora beraber
guruplanmıştır. Ayrıca tercih edilen diğer birçok tür morfolojik ve sitolojik benzerlikleri desteklediğini bildirmiştir (Roman et.al. 2003).
Asma çeşitleri üzerinde yapılan araştırmada gerçekleştirilen RAPD reaksiyonlarında toplam 300 adet primer test edilmiştir. Amplifikasyon ürünleri negatif filmden "var" ya da "yok" diye değerlendirildikten sonra yapılan χ2 testleri sonucunda 1:1 ve 3:1 dağılım gösteren polimorfik lokuslar belirlenmiştir. Italia çeşidinde 59, Mercan çeşidinde ise sadece 55 adet lokus bağlantı analizlerinde kullanılabilmiştir. Haritanın çıkartılması amacıyla Mapmaker/Exp 3.0 paket programında farklı LOD değerleri kullanılmıştır. Genom haritalaması için çift yönlü-yalancı melezleme tekniği kullanılmıştır (Yaşa, 2005).
Hyacinthella türleri arasındaki genetik uzaklığı belirlemek için yapılan bir çalışmada Rastgele Çoğaltılmış Polimorfik DNA - Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RAPD-PCR) kullanılmıştır. Kullanılan primerler, Hyacinthella türleri arasındaki genetik uzaklıkları belirlemede faydalı olduğu tespit edilmiştir. O-3 ve O-11 primerlerine göre H. heldreichii bireyleri genetik bakımdan birbirinin aynı bulunurken, O-3, O-11 ve O-4 primerlerine göre hem türler hem de bazı türün bireyleri arasında polimorfizm olduğu belirlenmiştir. H. hispida, H. lineata ve H. glabrescens bireyleri arasında oldukça yüksek polimorfizm görülmüştür (Arslan, 2004).
Akdeniz Bölgesinde Yetiştirilen P-3165, P-3394, Vero, Luce, OSKK-596 ticari mısır (Zea mays) çeşitlerinin genetik karakterizasyonunu RAPD PCR tekniği ile belirlendi. Kullanılan 9 farklı RAPD primerinden toplam 75 markör bant elde edildi. Bant profilleri Jaccard eşitliği ile değerlendirilerek aralarındaki benzerlik değerleri hesaplandı. Çeşitler arasındaki genetik benzerlik değerleri 0.383 ile 0.561 arasında bulundu. Kümeleme analizli yapılarak dendrogram çizilmiştir. Dendogramda 2 ana küme ve iki alt küme oluşmuştur. Sonuçlar aynı tohum firmasında üretilen tohum çeşitlerinin aynı grupta yer aldığını göstermiştir. Ayrıca bu çalışma ile çeşitler arasındaki polimorfizmin belirlenmesini sağlayan ve çeşide özgü olan tanımlayıcı primerler belirlenmiştir. Sonuç olarak farklı isimler altında satılan bu 5 ticari mısır çeşidinin genetik olarak da farklı oldukları gösterilmiştir (Salkın, 2005).
Değişik muz klonları arasındaki genetik farklılıklar Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) markörleri ile belirlenmiştir. Araştırma bulguları primer basına düsen toplam bant sayısının 1-10 adet arasında, bantların uzunluğunun ise 400-2140 bp arasında değiştiğini göstermiştir. Klonlar arasında en yüksek polimorfizm, Grand Nain ile Basrai muz klonları arasında belirlenmiştir. Petit Nain ile Dwarf Cavendish ve Williams ile Basrai muz klonları ise bir birbirlerine en yakın klonlar olarak saptanmıştır. Ayrıca denenen klonlardan Poyo, diğer klonların hepsinden farklı bir grup içerisinde yer almıştır (Gübbük ve Pekmezci, 2001).
Türkiye’de yetişen ve nikel metalini yaprakta biriktirme özelliği nedeni ile ekolojik değeri olan bazı Alyssum L. (Brassicaceae) türleri arasındaki genetik uzaklıklar RAPD-PCR ve SDS-PAGE yöntemleri ile belirlenmiştir. RAPD-RAPD-PCR çalışmasında toplam 42 primer denenmiştir. Bunlardan beş primer polimorfik bantlar vermiş ve OPI18 primeri genetik uzaklığın tanımlanması için seçilmiştir. Genetik uzaklıklar hem RAPD-PCR hem de SDS-PAGE yöntemlerinde çalışılan türler için hesaplanmış ve SPSS bilgisayar programı ile dendrogramlar çıkartılmıştır. Alyssum cinsine ait türlerden SDS-PAGE yöntemi ile incelenenlerde türler arası polimorfizm, RAPD-PCR yöntemi ile incelenenlerde ise tür içi polimorfizm varlığı tespit edilmiştir (Babaoğlu ve ark., 2004)
Antalya bölgesindeki 7 dişi ve 7 erkek Kıl keçisi için toplam 20 farklı primer kullanılarak RAPD-PCR yöntemi ile çalışılmıştır. Bütün RAPD primerleri 100-600 bp aralığında belirlenmiştir. Tüm primerlerin kullanılmasıyla toplam 1363 bant değerlendirilmiştir. Toplam 153 bandın 142’si polimorfik bulunmuştur. Genetik benzerlik (bant paylaşım frekansı, Fxy) oranı ve genetik uzaklık sırasıyla 0,6464 ve 0,3536 olarak bulunmuştur. Ortalama heterozigotluk oranı 0,3691±0,1472 olarak tahmin edilmiştir (Şahin ve ark., 2006)
Sekiz çam türü (Pinus sylvestris, P. strobus, P. rigida, P. resinosa, P. nigra, P. contorta, P. monticolo ve P. banksiana) arasındaki akrabalığı belirlemek amacıyla RAPD markörleri kullanılarak türler arsındaki genetik akrabalık ve polimorfizim belirlenip, bazı cam türleri için spesifik RAPD markörleri sekanslanmış ve klonlanmıştır. (Nkongolo et. al., 2002).
Çok nemli göl setlerinde 11 Peromyscus maniculatus popülasyonundaki genetik çeşitliliği üzerinde uzun dönemde habitatın etkileri RAPD markörleri kullanılarak değerlendirilmiştir. Bölgesel skalalarda ada popülasyonunun temel popülâsyonlardan farklı olduğu belirlenmiştir. Sonuçta genetik çeşitliliğin ciddi şekilde izolasyona bağlı olduğu fakat ada alanlarında beklenmedik negatif ilişki olduğu saptanmıştır (Vucetich et.al., 2000)
Brassica türlerinde Leptosphaeria maculans a karşı dayanıklılık RAPD markörleri kullanılarak belirlenmiştir. Sonuçta 24 genotipin % 46 sı dayanıklı bulunmuştur. Tüm genotipler 13 RAPD ve 8 SSR markörüyle üretilen 169 ayrıntılı sonuç sergilenmiş ve 6 RAPD markörü (OPB01, OPE03, OPE16, OPF10, OPE12 ve OPI01) polimorfik bulunmuştur (Ananga et.al., 2006)
Üç farklı moleküler markör olan RAPD, AFLP ve SSR, Saccharomyces cerevisiae’ nin genetik analizinde kullanılmıştır. Karakterize edilen 27 tane şarap mayası türünde çok zayıf karşılıklı ilişkilerin olduğu belirlenmiş. AFLP ve SSR’ın RAPD e göre benzer bir belirleyici sonuç verdiği bildirilmiştir (Gallego et,al., 2004).
Türkiye kökenli yabani arpa hatları (Hordeum murinum, Hordeum bulbosum ve Hordeum vulgare spontaneum) arasındaki çeşitlilik moleküler düzeyde Rastgele Çoğaltılmış Polimorfik DNA (RAPD) tekniği kullanılarak karsılaştırmıştır. Farklı arpa hatlarından ekstre edilen yaprak DNA’ları Polimeraz Zincir Reaksiyonu’nda (PCR) rastgele seçilmiş primerler ile çoğaltılmıştır. 23 hat arasındaki polimorfizm oranı çiftler halinde karsılaştırmalı olarak tayin edilmiştir. Elde edilen sonuçlar, yabani arpa hatlarında mevcut olan ekonomik öneme sahip karakterlerin (hastalıklara, kuraklığa dirençlilik vb.) seçilmesinde kullanılabileceği bildirilmiştir (Albayrak ve Gözükırmızı 1998). Güney Amerika da doğal olarak yetişen Digitaria exilis ve Digitaria iburua türlerinde var olan genetik çeşitlilik boyutu ve kökenini araştırmak maksadıyla da RAPD markörleri kullanılmıştır (Kuta et.al., 2005).
Genetik mühendisliği ve biyoteknoloji alanında izoenzimler, RFLP, RAPD, AFLP, SSR, STS gibi moleküler markörleri kullanarak bitki ıslahı için yeni olanaklar sunduğu
ve bu markörlerin hızlı sonuç vermeleri, çevre şartlarından etkilenmemeleri, seleksiyon aşamasındaki doğrulukları, agronomik açıdan önemli karakterlerin seçiminde, markörler yardımıyla seleksiyonu en güvenilir uygulama haline getirmiş oldukları bildirilmiştir (Budak ve ark., 2004).
Cinsler arası kamaşık (C. grandis (L.) Osb. x [C. paradisi Macf. x Poncirus trifoliata (L.) Raf.]) x [( C. paradisi Macf. x P. trifoliata (L.) Raf.) x C. reticulata Blanco] x [( C. paradisi Macf. x Poncirus trifoliata (L.) Raf.) x C. sinensis (L.) Osb.] çaprazlanmasından elde edilen bitki popülasyonu içinden 30 ağaç rastgele seçilmiş ve 38 RAPD primeri kullanılarak toplam 111 rastgele çoğaltılmış polimorfik DNA belirlenmiştir. Bu markörlerle seçilen bitki popülasyonunun bağlantı haritası oluşturulmuştur. Bu genetik harita dokuz farklı bağ grubuna dağılmış 63 RAPD markör içermekte olup, bu bağ grupları büyük olasılıkla turunçgillerin dokuz olan haploit kromozom sayısına denk geldiği bildirilmektedir (Çevik ve Moore, 2005).
3. MATERYAL ve YÖNTEM
3.1. Materyal
Çimlendirme denemelerinde kullanılan madımak tohumları Tokat ili Merkez ilçeye bağlı Beşören köyünde bulunan bir üretim sahasından toplanmıştır. Denemeler Tokat Gaziosmanpaşa Üniversitesi Ziraat Fakültesi deneme alanında ve Bitki Koruma Bölümü Herboloji Laboratuarında yürütülmüştür.
Ayrıca çalışmanın ikinci aşamasında kullanılan madımak klonlarına ait rizom parçaları 2007 yılı Mart-Nisan aylarında Tokat, Sivas, Amasya ve Çorum illerinden toplanmıştır. Çizelge 3.1.’de illere göre toplanan madımak klonlarının ve kullanılan klon sayısı verilmiştir.
Çizelge 3.1. İllere göre toplanan madımak klonlarının ve kullanılan klon sayısı
Klon toplanan İller Toplanan klon sayısı Kullanılan klon sayısı
Tokat 42 27
Sivas 36 16
Amasya 20 8
Çorum 28 17
Genel toplam 126 68
Klonların alındıkları lokasyonların coğrafik konumları GPS ile tespit edilmiş ve klonların alındıkları habitatların özelikleri kaydedilmiştir. Toplanan klonlar Tokat Gaziosmanpaşa Üniversitesi Ziraat Fakültesi deneme alanında tarlaya şaşırtılmıştır. Deneme alanının denizden yüksekliği 640m, 40° 18' Kuzey enlemi ile 36° 34' Doğu boylamı arasında yer almaktadır. Ayrıca klonların şaşırtıldığı Gaziosmanpaşa Üniversitesi Ziraat Fakültesi deneme alanın bulunduğu bölge Kazova adıyla anılan sınırlar içerisindedir. Bu ovada Karadeniz ikliminin etkisi olmakla birlikte yarı-kurak
iklim özellikleri görülmektedir. Çizelge 3.2.’de Kazova’ da aylar ve aynı ayların uzun yıllar iklim verileri verilmiştir.
Çizelge 3.2. Tokat-Kazova’nın İklim Verileri*
AYLAR Ortalama Sıcaklık (°C) Yağış (mm) Ortalama Nisbi Nem (%)
2006/07 Uzun Yıllar (1965-2007) 2006/07 Uzun Yıllar (1965-2007) 2006/07 Uzun Yıllar (1965-2007) Kasım 5,9 6,9 35,4 43,8 69,7 70,9 Aralık 0,3 3,1 14,2 43,4 69,9 72,6 Ocak 3,5 1,4 33,7 39,0 61,5 69,7 Şubat 2,9 2,8 20,4 33,9 64,1 64,9 Mart 7,9 7,0 39,6 40,5 58,5 60,7 Nisan 9,4 12,4 43,2 60,9 54,7 60,1 Mayıs 20,3 16,2 31,7 59,7 50,9 61,4 Haziran 21,7 19,6 33,8 37,9 53,5 58,5 Temmuz 24,1 22,1 0,2 10,2 50,7 55,7 Top/Ort 10,7 10,2 252,2 369,3 59,3 63,8
* Köy Hizmetleri Araştırma Enstitüsü Verileri, Tokat, 2007.
Bu doğrultuda madımak klonlarının sıcaklıkla ve yağışla orantılı olarak su isteğini karşılamak için damlama sulama sistemi döşenmiş olup, hava sıcaklığına bağlı olarak gerektiğinde parseller sulanmıştır. Parsellerde çıkan yabancı otlar düzenli olarak elle temizkenmiştir.
Çizelge 3.3. Klonların toplandığı iller, bu illere bağlı ilçe ve köy isimleri ile klonların toplandığı yerlerlere (habitatları) ilişkin kordinatlar ve yükseklik değerleri verilmiştir.
Yolyanı Harman yeri 6 40o 35.386 - 35o 32.349 709
Keşlik Harman yeri 7 40o 34.356 - 36o 00.012 628
Aydınlık Harman yeri 8 40o 43.976 - 35o 49.684 865
Merkez
Çiğdemlik Yol kenarı 17 40o 46.587 - 35o 40.718 460
Suluova Saraydüzü Okul-Cami 9 40o 50.194 - 35o 39.911 587
A
m
asya
Merzifon Ortaova Yol kenarı 10 40o 48.843 - 35o 31.644 517
Klon top. İller Klon toplanan İlçeler Klon toplanan Köyler Klonun toplandığı habitat* Klon no Koordinatlar Kuzey - Doğu Klon. top. rakım
Şenköy Harman yeri 12 40o 24.047 - 36o 39.437 814
Tekneli Harman yeri 19 40o 10.040 - 36 o30.464 1372
Efeköy Harman yeri 14 40o 31.580 - 36o 40.591 904
Çöreğibüyük Harman yeri 15 40o 23.071 - 36o 43.534 744
Batmantaş Harman yeri 18 40o 10.596 - 36o 40.599 1536
Tahtaoba Okul-Cami 20 40o 12.588 - 36o 27.598 1104
Merkez
Ortaören Harman yeri 40 40o01.195 - 36o 28.713 1215
Çamlıca Çayır-Mera 1 40o 24.599 - 36o 13.751 914
Yenisu Yol kenarı 2 40o 27.413 - 36o 20.133 969
Ulutepe Mezarlık 3 40o 25.397 - 35o 53.088 1088
Turhal
Çivril Mezarlık 4 40o 23.298 - 36o 00.089 687
Kireçli Harman yeri 5 40o 20.233 - 35o 57.556 820
Kepez Tarla-Bahçe 6 40o 18.598 - 35o 49.004 976
Hasanağa Harman yeri 7 40o 14.505 - 36o 56.614 710
Hatippınarı Harman yeri 8 40o 10.053 - 36o 49.730 863
Reşadiye Yol kenarı 9 40o 12.465 - 35o 40.957 780
Zile
Ütük Yol kenarı 10 40o 16.008 - 36o 00.489 633
Pazar Ballıca Yol kenarı 11 40o 14.236 - 36o 17.768 988
Kartosman Harman yeri 13 40o 34.597 - 36o 33.004 1167
Tepekışla Tarla-Bahçe 29 40o 40.444 - 36o 40.134 218
Bağpınarı Yol kenarı 38 40o 42.564 - 36o 40.416 220
Erbaa
Çamdibi Yol kenarı 28 40o 41.367 - 36o 45.420 502
Gözpınar Yol kenarı 30 40o 36.492 - 36o 43.351 593
Sulugöl Tarla-Bahçe 32 40o 33.045 - 36o 59.226 1107
Niksar
Ardıçlı Yol kenarı 31 40o 37.047 - 37o 00.087 1111
Hatipli Harman yeri 34 40o 32.568 - 37o 14.036 1277
Başçiftlik Hanyeri Yol kenarı 33 40o 31.598 - 37o 05.001 755
Hasanşeyh Harman yeri 35 40o 28.402 - 37o 27.081 1322
Baydarlı Yol kenarı 36 40o 29.589 - 37o 29.608 1336
Reşadiye
Çambalı Okul-Cami 37 40o 24.205 - 37o 24.358 1096
Bakımlı Harman yeri 16 40o 22.301 - 36o 48.015 1112
Almus Ormandibi Harman yeri 17 40o 17.858 - 36o 48.612 914
Taşpınar Yol kenarı 39 40o 07.352 - 36o 20.097 1239
Merkez Harman yeri 42 40o 06.585 - 36o 18.452 1188
Sağlıca Yol kenarı 21 40o 05.551 - 36o 15.111 1289
Artova
Ağmusa Harman yeri 22 40o 08.247 - 36o 10.486 1477
Arpacıkkaraçay Harman yeri 23 40o 04.583 - 36o 02.599 1385
Ballıkaya Kültür 24 40o 03.019 - 35o 59.033 1335
Sulusaray
Sulusaray Yol kenarı 25 40o 00.013 - 36o 05.588 1029
Çırdak Yol kenarı 41 40o 00.452 - 36o 11.158 1069
Yeşilyurt Yol kenarı 26 40o 00.273 - 36o 12.424 1069
To
kat Yeşilyurt
Çizelge 3.3. ün Devamı
Karamağara Yol kenarı 12 40o 52.241 - 35o 23.045 756
Merzifon
Uzunyazı Yol kenarı 11 40o 47.413 - 35o 26.757 551
Eslemez Harman yeri 13 40o 50.560 - 35o 16.181 719
Beden Yol kenarı 14 40o 56.310 - 35o 10.724 980
Gümüşhacıköy
Gümüş Yol kenarı 15 40o 50.711 - 35o 10.630 842
Hamamözü Çayköy Harman yeri 16 40o 46.434 - 35o 04.115 826
Kutu Yol kenarı 1 40o 17.857- 36o 48.614 914
Tuzsuz Yol kenarı 2 40o 29.510 - 35o 38.506 501
Karayakup Harman yeri 3 40o 22.996 - 35o 28.630 672
Göynücek
Kervansaray Harman yeri 4 40o 21.062 - 35o 29.187 527
Baraklı Mezarlık 18 40o 42.917 - 36o 11.237 384
Mercimek Yol kenarı 19 40o 46.586 - 36o 15.331 481
Arpaderesi Yol kenarı 20 40o 47.517 - 36o 19.249 524
A
m
asya Taşova
Hacıbeyköyü Yol kenarı 21 40o 42.730 - 36o 20.485 566
Elicek Yol kenarı 11 40o 18.502 - 34o 46.978 868
Saraylı Yol kenarı 13 40o 16.978 - 34o 48.793 1147
Osmaniye Yol kenarı 22 40o 40.556 - 34o 54.975 1058
Karaağaç Çayır-Mera 23 40o 40.561 - 34o 54.972 1059
Merkez
Konaklı Harman yeri 24 40o 33.102 - 35o 13.117 971
Soğucak Harman yeri 3 40o 14.342 - 35o 03.824 1149
Çatak Harman yeri 4 40o 12.348 - 34o 59.867 981
Örükaya Yol kenarı 5 40o 06.700 - 34o 54.241 981
Eskiyapar Harman yeri 6 40o 09.656 - 34o 46.412 933
Alaca
Küre Okul-Cami 12 40o 16.979 - 34o 48.796 1152
Ekmekçi Yol kenarı 7 40o 09.627 - 34o 38.376 1055
Çiftlik Harman yeri 9 40o 09.166 - 34o 16.883 860
Sungurlu
Boztepe Yol kenarı 10 40o 12.768 - 34o 17.503 837
Bağazkale Yanıcak Mezarlık 8 40o 09.629 - 34o 38.376 920
Kavakalan Yol kenarı 1 40o 17.733 - 35o 12.730 975
Ortaköy
Fındıklı Yol kenarı 2 40o 16.941 - 35o 08.024 1247
Güngörmez Yol kenarı 25 40o 32.269 - 35o 10.088 1047
Boyacı Okul-Cami 26 40o 27.235 - 35o 17.571 1145
Kayı Yol kenarı 27 40o 30.861 - 35o 24.805 1141
Mecitözü
Figani Mezarlık 28 40o 35.419 - 35o 24.780 801
Bayat Akseki Yol kenarı 14 40o 39.603 - 34o 15.352 767
Kayaağızı Harman yeri 15 40o 39.759 - 34o 23.166 709
Kavak Harman yeri 16 40o 46.725 - 34o 25.419 1215
İskilip
Asarcık Harman yeri 17 40o 46.432 - 34o 35.133 1145
Dodurga Yeniköy Çayır-Mera 18 40o 48.467 - 34o 40.570 1091
Girinoğlan Okul-Cami 19 40o 55.819 - 34o 51.707 444
Osmancık
Sarpınkavak Harman yeri 20 40o 55.946 - 34o 51.932 441
Çor
u
m
Lacin Kavaklıçiftlik Yol kenarı 21 40o 56.974 - 34o 41.653 642
Bedirli Harman yeri 2 39o 42.524 - 36o 39.059 1276
Gözmen Harman yeri 3 39o 34.924 - 36o 39.837 1302
Güllüce Harman yeri 32 39o 39.977 - 37o 00.089 1289
Merkez
Bingöl Harman yeri 33 39o 43.853 - 37o 07.975 1361
Elmalı Harman yeri 4 39o 24.691 - 36o 26.490 1380
Şarkışla
Kızılcakışla Harman yeri 5 39o 17.507 - 36o 19.943 1287
Suşehri Kekeç Harman yeri 18 40o 03.900 - 38o 03.704 1469
Merkez Harman yeri 6 39o 16.477 - 36o 45.134 1441
Si
vas Altınyayla
Çizelge 3.3. ün devamı
Budaklı Harman yeri 28 39o 35.584 - 37o 02.501 1338
Karacalar Harman yeri 29 39o 27.166 - 36o 58.721 1406
Eskikarahisar Harman yeri 30 39o 24.919 - 37o 13.722 1514
Ulaş
Tecer Harman yeri 31 39o 24.537 - 37o 05.242 1412
Havuz Harman yeri 8 39o 12.253 - 37o 06.423 1540
Akpınar Harman yeri 9 39o 06.758 - 37o 07.913 1583
Kuşkayası Harman yeri 10 39o 03.689 - 37o 04.775 1585
Deligazi Harman yeri 13 39o 08.841 - 37o 23.268 1569
Alaçahan Harman yeri 14 39o 06.454 - 37o 36.073 1570
Taşgeçit Harman yeri 15 39o 14.485 - 37o 39.372 1585
Temur Harman yeri 16 39o 16.320 - 37o 31.546 1461
Kangal
Tahtalı Harman yeri 17 39o 15.620 - 37o 10.155 1525
Kızılören Harman yeri 11 38o 47.168 - 37o 12.451 1640
Gürün
Dürmepınar Harman yeri 12 38o 57.460 - 37o 22.583 1600
Baharşeyh Harman yeri 19- 20 39o 57.360 - 37o 56.177 1666
İmranlı
Doğançal Harman yeri 22 39o 52.901 - 38o 03.981 1579
Merkez Harman yeri 23 39o 52.462 - 37o 41.257 1317
Zara
Kevenli Harman yeri 21 39o 46.372 - 37o 45.206 1382
Yarhisar Harman yeri 24 39o 51.456 - 37o 29.600 1308
Özen Harman yeri 25 39o 59.124 - 37o 22.712 1383
Merkez Harman yeri 26 39o 51.643 - 37o 24.261 1288
Hafik
Çukurbelen Harman yeri 27 39o 50.842 - 37o 10.791 1319
Kızıl Harman yeri 34 39o 54.030 - 36o 30.448 1537
Karakaya Harman yeri 35 39o 48.833 - 36o 16.551 1239
M. Sarıkaya Harman yeri 36 39o 47.500 - 36o 22.767 1474
Yeniköy Harman yeri 37 39o 53.251 - 36o 42.596 1452
Sivas
Yıldızeli
Direkli Harman yeri 1 39o 42.524 - 36o 39.059 1276 *Harman yeri: Köylerde evlere yakın eskiden harman yapılan ve hayvanların toplandığı yerlerde bulunduğu anlamına gelir; Yol kenarı: Ana yol, tali yollar yada tarla yolları üzerinde veya kenarında bulunduğu anlamına gelir; Mezarlık: betonarme olmayan veya eski köy mezarlıklarında bulunduğu anlamına gelir; Okul-Cami: Köylerde bulunan çocukların toplandığı okul bahçesi veya yetişkinlerin bir araya geldiği cami avlusu daha çokta avlunun yeşillendirilmiş kısımlarında bulunduğu anlamına gelir; Tarla-Bahçe: Tarım yapılan alanlarda bulunduğu anlamına gelir; Kültür: Kendi ihtiyacını karşılamak için ev önlerinde veya ticari amaçla tarlada yetiştirilen bölgelerden toplandığı anlamına gelir; Çayır-Mera: Hayvanların otlatıldığı veya ot biçilen alanlardan toplandığı anlamına gelir.
Resim 1. Tarla parsellerinin hazırlanması ve
Resim 1. Klonların şaşırtıldığı alandan genel görünümü.
3.2. Yöntem
3.2.1. Madımak tohumlarının bazı morfolojik özelliklerinin belirlenmesi
3.2.1.1. Tohum büyüklüğü, tohum şekli, bin dane ağırlığı
100 adet madımak tohumunun uzunluğu ve kalınlığı binoküler altında ölçülmüş ve tohumların renk, şekil gibi genel özellikleri kaydedilmiştir. Ayrıca tohumlar fotoğraflanmıştır.
Yüzlük guruplar halinde 10 adet tohum tartılmış ve bunların 1000 tane ağırlığı belirlenmiştir. Daha sonra bu verilerin ortalamaları alınarak madımak tohumlarının ortalama 1000 dane ağırlıkları saptanmıştır.
3.2.2.Çimlenme ve Dormansi Kırma Çalışmalarında Kullanılan Yöntemler
Çalışmalarında kullanılan bütün tohumlar Tokat Beşören köyünden toplanmıştır. Tohumlarla beklemeden çalışmalara başlanmıştır. Dormansinin ortadan kaldırılması ile ilgili tüm denemeler ISTA (Anonim 2002) kurallarına bağlı kalarak petri kaplarında 4 tekerrürlü olarak tesadüf parselleri deneme desenine göre kurulmuştur. Denemeler
24oC sıcaklığa (12 saat aydınlık, 12 saat karanlık) ayarlanmış çimlendirme dolabında 30 gün süreyle sürdürülmüştür. Denemeler Tokat Gaziosmanpaşa Üniversitesi Ziraat Fakültesi deneme alanında ve Bitki Koruma Bölümü Herboloji Laboratuarında yürütülmüştür.
Ön denemelerle çimlenme problemleri saptanan madımak tohumlarında bulunan dormansinin kırılması ve çimlenmenin teşvik edilmesi amacıyla, tohumlara farklı fizyolojik dormansi kırma yöntemleri ile sert tohumluluğu giderici veya engelleyici maddeleri ortadan kaldırıcı işlemler uygulanmıştır. Dormansinin kırılması ile ilgili çalışmalarda tohumlar çimlendirme dolabına alınmadan aşağıdaki muamelelere tabi tutulmuştur.
3.2.2.1. Sülfürik asit uygulaması
Sert bir kabuk yapısına sahip olan madımak tohumlarının kabuklarını aşındırarak çimlenmelerini teşvik etmek amacıyla yürütülen denemede, tohumlar % 99 konsantre sülfürik asit ile 0, 5, 10, 15, 30, 45 ve 60 dakika süreyle muamele edikten sonra akan suda iyice yıkanmıştır. Daha sonra sülfürik asitten geçirilen tohumlar petri kaplarında çimlendirmeye alınmıştır. Çimlenmeler günlük olarak takip edilmiştir. Sayımlar esnasında çimlenen tohumlar ortamdan uzaklaştırılırmış ve petri kaplarının nemini muhafaza etmesi gayesiyle gerektiğinde yeniden nemlendirilmiştir.
3.2.2.2. Gibberellik asit uygulaması
Pek çok bitkinin çimlenmesini teşvik eden ve tohumlardaki dormansiyi kırıcı olarak kullanılan Gibberellik asittin farklı konsantrasyonları (%0, % 0,02, % 0,04 ve % 0,08 oranlarda) hazırlamıştır (Duke 1985). Hazırlanan Gibberellik asit çözeltileri ile petri kapları nemlendirilmiştir. Daha sonra madımak tohumları petri kaplarında çimlendirmeye alınmıştır.
