GİRİŞ
Günümüzde biyolojik mücadeleye dayalı entegre mücadele yöntemlerinin kullanılması önerilmekte ve desteklenmektedir. Özellikle parazitoit arıların bu amaçla biyolojik mücadele etme-ni olarak kullanılmaları ve bunun için laboratuvar koşullarında üretimleri yapılarak yetiştirilmeleri giderek yaygınlaşmaktadır. Bunlar içerisinde en yaygın olarak kullanılan grup Trichogram-matidae familyasına ait Trichogramma türleridir. Trichogramma cinsi Trichogrammatidae familyası içinde yer alan 80 cinsten bi-risidir. Bu familyanın bütün üyeleri çeşitli böcek yumurtalarının parazitoitidirler. Trichogramma içinde yer alan türlerin yaklaşık 145 tanesi tanımlanmıştır [1]. Bu mikroskobik arılar biyolojik mücadeledeki öneminden dolayı oldukça dikkat çekmiştir. Bo-yutlarının oldukça küçük oluşu ve genel olarak sabit ve değişmez morfolojik karakterlere sahip olmamalarından dolayı teşhisleri oldukça zordur.
Vücut rengi, vücut kıllarının uzunluğu ve sayısı gibi genel fiziksel karakterleri vücut boyutuna, mevsime, yetiştirilme sıcak-lığına ve yetiştirildikleri konukçuya göre çeşitlilik göstermek-tedir. Bu nedenle Trichogramma türlerinin sınıflandırılmasının aydınlatılması için önceleri erkek üreme sisteminin morfolojik karşılaştırılması, daha sonra ise enzimatik analizi içeren metotlar
kullanılmıştır. Öncelikli olarak bugün teşhiste vücut rengi, kanat damarlanması ve antenle ilgili özellikler destekleyici karakteris-tikler olarak hizmet etmekle birlikte, yeterli görülmemektedir. Dişiler bu özelliklere dayanarak aynı güvenilirlikte teşhis edi-lememektedir. Dolayısıyla teşhis için koleksiyonların erkek bi-reyleri içermesi zorunludur [2]. Taksonomik destek, doğal ya da laboratuvarda yetiştirilen türlerin teşhis edilmesi ve istenmeyen türlerle karışmaması için oldukça önemli ve gereklidir [3]. Bir çok Trichogramma türü ve ırkı mevcut olup, farklı çevresel koşullara uyumları ve kontrol ettikleri farklı böceklere göre büyük ölçüde çeşitlilik göstermektedirler. Biyolojik mücadele için en uygun tür ya da ırkın seçimi, oldukça zor olmakla beraber, mücadele prog-ramının başarısı için çok önemlidir. Bu nedenle Trichogramma türlerinin doğru teşhisi önem taşımaktadır. Hedef zararlıya karşı bu arıların çok daha etkili kullanımları için Trichogramma türle-rinin seçiminde daha iyi metotların gelişimine ihtiyaç vardır [4]. Enzimatik analiz, özellikle esteraz elektroforezi Trichogramma cinsi içindeki farklılıkların belirlenmesinde oldukça kullanışlı bir tekniktir. Bu çalışmada farklı Trichogramma kültürlerine ait es-teraz zimogramları arasındaki farklılık elektroforez yöntemiyle belirlenmiştir.
Trichogramma (Hymenoptera: Trichogrammatidae) Popülasyonları Arasındaki Esteraz
Varyasyonunun Elektroforez İle Belirlenmesi
Fahriye SÜMER* Servet ÖZCAN1 Sevcan ÖZTEMİZ2 Aydın TUNÇBİLEK1
1Erciyes Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi, Biyoloji Bölümü, Kayseri 2 Zirai Mücadele Araştırma Enstitüsü, Adana
ÖZET
Bu çalışma yumurta parazitoiti Trichogramma popülasyonları arasındaki esteraz varyasyonlarının belirlenmesi için yapılmıştır. Günümüzde elektroforez, popülasyonlar arası enzim varyasyonlarını ölçmek için kullanılan yöntemlerden biridir. Enzim analizleri, özellikle esteraz Trichogramma türlerinin belirlenmesine katkıda bulunmaktadır. Çalışmada farklı lokasyonlardan toplanıp laboratuvarda yetiştirilen örneklerden 9 farklı Trichogramma popülasyonu oluşturulmuş ve bunların esteraz izozimleri poliakrilamid jel elektroforez (PAGE) yöntemi ile belirlenmiştir. Esteraz zimogramları için her popülasyona ait 20 ergin homojenize edilmiş ve -20ºC de tutulmuştur. Esteraz bantlarını görüntülemek için Fast Blue RR ve substrat olarak α-Naphtyl asetat kullanılmıştır. Aktivite boyaması sonucunda popülasyonların iki farklı esteraz izozimine (yavaş: EST1 ve hızlı: EST2) sahip oldukları belirlenmiştir. Popülasyonlar, elektroforez bantları esas alınarak üç gruba ayrılmıştır.
Anahtar Kelimeler: Parazitoit, Trichogramma, esteraz, elektroforez.
Determination of Esterase Variation among the Trichogramma
(Hymenoptera: Trichogrammatidae) Populations By Electrophoresis
Abstract
This study was carried out to determine the esterase variation between egg parasitoid, Trichogramma populations. Recently, electrophoresis is one of the techniques used to measure the enzymatic variations among populations. Enzymatic analyses, especially esterase contribute the identifi cation of Trichogramma species. In the study, nine Trichogramma populations were collected from different locations, reared in laboratory and defi ned their esterase isozymes by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Twenty adults were homogenized for esterase zymograms and exposed to the -20 ºC. Fast Blue RR and α-Naphtyl acetate as a substrat were used for monitoring esterase bands. Two different isozymes in populations (slow: EST1 and fast: EST2) were determined after activity dying. Populations were separated in three groups according to their esterase bands.
Key words: Parasitoid, Trichogramma, esterase, electrophoresis.
*Sorumlu Yazar Geliş Tarihi: 02 Haziran 2008
e-posta: [email protected] Kabul Tarihi: 17 Temmuz 2008
Biyoloji Bilimleri Araştırma Dergisi 1 (1): 49-51, 2008
F. Sümer ve ark. / Bibad, 1 (1): 49-51, 2008
50
MATERYAL VE YÖNTEM
Örneklerin Hazırlanması: Çalışmada kullanılan Trichogramma erginleri 25°C sıcaklık, %70 nisbi nem ve 16 saat aydınlık, 8 saat karanlık koşullara ayarlı ye-tiştirme odalarında Ephestia kuehniella Zeller (Lepidop-tera: Pyralidae) yumurtaları üzerinde yetiştirilmiştir. Pa-razitoit arılar konukçu yumurtasından çıktıkları ilk gün bulundukları tüp içerisinde önce hareketsizleşmeleri için 4°C’ye konulmuştur. Buradan denemelerde kullanılacak sayıda ergin ependorf tüplerine aktarılarak -20°C’ye yer-leştirilmiştir. Homojenizasyon pH:7 olan Borat tamponu (%10 sükroz içeren) içerisinde gerçekleştirilmiştir.
Elektroforez: Jellerin hazırlanmasında Laemmli’
nin yöntemi kullanılmıştır [5]. Bu yönteme göre %4’lük yükleme ve %12’lik yürütme jelleri hazırlanmıştır. Koş-turma tamponu olarak pH:8.3 olan Tris-Glisin tamponu kullanılmıştır. Borat tamponu içinde homojenize edilmiş olan örnekler santrifüj edilmiş ve her örneğe ait superna-tant elektroforez tankına yerleştirilen jele istenilen sıraya göre hamilton şırıngası yardımıyla yüklenmiştir. Yükle-me işlemi bittikten sonra jel 20mA sabit akımda koştu-rulmuştur. Koşturma işlemi soğuk odada (4°C) gerçek-leştirilmiştir. İşlem bittikten sonra esteraz izozimlerinin görüntülenmesi için önce pH:7 olan 0.1M fosfat tamponu hazırlanmış, aktivite boyaması için Fast Blue RR ve α-Naphtyl asetat kullanılmıştır [6]. Jel koşturulup çıkarıl-dıktan sonra önce 100 ml fosfat tamponu içinde birkaç dakika yıkanmış ve daha sonra fosfat tamponu süzülüp, jel içerisinde Fast Blue RR ve α-Naphtyl asetat bulunan 100 ml fosfat tamponuna aktarılmıştır. Bantlar belirgin hale gelinceye kadar 37 °C’ lik inkübatörde bekletilmiş, bantlar tamamen açığa çıktıktan sonra boyama işlemi durdurulmuş ve jel %5’lik asetik asit (fiksatif olarak) içi-ne alınarak görüntülenmiştir.
BULGULAR
Laboratuvarda yetiştirilen farklı Trichogramma kül-türlerine ait esteraz bantları Şekil 1’de gösterilmiştir.
Şekil 1’de görüldüğü gibi; 1, 2, 3 ve 8 numaralı kül-türler ile 6, 7 ve 9 numaralı külkül-türlerin birbiriyle aynı bantlara sahip olduğu belirlenmiştir. 4 ve 5 numaralı kültürlerin esteraz bantları ise birbirleriyle aynı ve diğer kültürlerden farklıdır. 1, 2, 3 ve 8 numaralı kültürler Grup I, 6, 7 ve 9 numaralı kültürler Grup II ve 4 ve 5 numaralı kültürler Grup III olarak değerlendirilecek olursa her gru-bun kendi içinde aynı, gruplar arasında ise farklı bantlaş-ma özelliğine sahip olduğu görülmektedir. Bantlar hem mobilite hem kalınlık açısından farklılık göstermektedir. Mobilitedeki farklılık farklı esteraz izozimlerinin varlığı-na işaret etmektedir.
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Şekil 1. Farklı Trichogramma kültürlerine ait Esteraz zimogramları.
TARTIŞMA
Bazı böcek taksonları için morfolojik karakterler esas alınarak yapılan tanımlamalar yeterli olmamaktadır. Dolayısıyla teşhis ve sınıflandırma çalışmalarında mor-folojik karakterler yanında moleküler yöntemlerden de yararlanılması gerekmektedir. Trichogramma türlerinde fiziksel karakteristikler yani vücut rengi, vücut kıllarının sayısı ve uzunluğu, vücut büyüklüğüne, mevsime, maruz kaldıkları sıcaklığa ve yetiştirildikleri konukçuya göre değişiklik göstermektedir. Böyle durumlarda türler mo-leküler yöntemler kullanılarak ayırt edilebilmektedir.
Bu araştırmada uygulandığı gibi elektroforetik yön-temler, amaca uygun olarak çok çeşitli organizmalar için kullanılabilen etkili yöntemlerdir. Nitekim, bu konu ile ilgili çok sayıda araştırma bulgusu mevcuttur. Örneğin, Helicoverpa armigera Hübner (Lepidoptera: Noctuidae)’nın mücadelesinde kullanılan
Trichogram-ma türlerinin seçiminde moleküler biyoloji teknikleri
bu türlerin sistematiği için bir araç olarak kullanmıştır [7]. Ayrıca, Mısır kökkurtlarında (Coleoptera: Chryso-melidae) dirençli bireyleri teşhis etmek (8), Aphidius (Hymenoptera: Braconidae) cinsine ait parazitoit afit türlerinin arazi popülasyonlarında üreme izolasyonunu ve konukçu adaptasyonu / spesifitesini içeren genetik ilişkiyi araştırmak [9], Simulium equinum (L.) (Diptera: Simuliidae)’un organofosfatlı insektisitlere maruz kalmış kirli bölgelerdeki arazi popülasyonlarındaki esteraz akti-vitesindeki farklılıkları göstermek [10], H. armigera’nın değişik popülasyonlarının bazı insektisitlere karşı duyar-lılık düzeylerini belirlemek [11] ve Plutella xylostella (L.) (Lepidoptera: Plutellidae)’nın esteraz zimogramla-rını belirlemek için elektroforez tekniklerinden yararla-nılmıştır [12]. Ayrıca, Akdeniz Bölgesi’nde pamukta ana zararlılar durumundaki H. armigera, Bemisia tabaci Genn. (Homoptera: Aleyrodidae), Aphis gossypii Glover (Hemiptera: Aphididae) ve Tetranychus urticae Koch (Acari: Tetranychidae) popülasyonlarının bazı ilaçlara
F. Sümer ve ark. / Bibad, 1 (1): 49-51, 2008 51 karşı göstermiş oldukları duyarlılıklar ve biyokimyasal
temellerini belirlemek [13] ve Leptinotarsa
decemlinea-ta (Say) (Coleoptera: Chrysomelidae)’da juvenil hormon
esteraz aktivitesindeki değişiklikleri göstermek için elek-troforetik yöntemler kullanılmıştır [14].
Mıura ve ark. (15) esteraz izozimlerini belirlemek için yaptıkları çalışmada, Trichogramma chilonis Is-hii (Hymenoptera: Trichogrammatidae)’in dört,
Tric-hogramma ostriniae (Peng & Chen) (Hymenoptera:
Trichogrammatidae)’nın ise üç farklı aktivite bandına sahip olduğunu belirlemişlerdir. Benzer şekilde bu ça-lışmada da aynı konukçu kullanılmış, izozimlerin bant-laşma özelliğine göre mevcut 9 kültür üç farklı gruba ayrılmıştır.
Trichogramma türlerine ait kültürlerin
zimogramla-rının araştırıldığı çalışmalarda, kullanılan konukçu ve yetiştirme koşulları bu araştırmadakinden farklı olmakla beraber, araştırma sonuçları; konukçu, sıcaklık, ekolojik koşullar ya da cinsiyet gibi faktörlerin Trichogramma’nın izoenzimogramını etkilemediğini göstermiştir [16, 17].
SONUÇ
Farklı lokasyonlardan toplanan Trichogramma kül-türleri arasındaki esteraz varyasyonunu belirlemek için yapılan bu çalışmada PAGE yöntemi kullanılmıştır. Koş-turma tamponu olarak pH:8.3 olan Tris-Glisin ve aktivite boyaması için α-Naphtyl asetat tercih edilmiştir. Kültür-ler arasındaki esteraz varyasyonu aktivite boyaması so-nucunda belirlenmiştir. Bu farklılık tür içi ve türler arası varyasyonu tanımlaması açısından önemlidir. Çalışma, diğer moleküler yöntemlerle desteklenerek filogenetik çalışmalara zemin oluşturması açısından önemlidir. Böy-lece, Trichogramma türlerinin moleküler yöntemlerle teşhisi yapılarak biyolojik mücadelede daha etkili türle-rin tespiti ve kullanılması mümkün olacaktır.
Lawrence ML, Cooper RK, Thune RL., 1997. Atte-nuation, persistence, and vaccine potential of an Edward-siella ictaluri purA mutant. Infection and Immunity, 65:4642-4651.
KAYNAKLAR
[1] Olkowski W and Zhang A., 1990, Trichogramma modern day
frontier in biological control, The IPM Practitioner. 12:1-15. [2] Pinto JD et. al., 1978, Clarifi cation of the identify of
several common species of North American Trichogramma (Hymenoptera: Trichogrammatidae), Entomol. Soc. America. 71:169-178.
[3] Nagaraja H and Nagarkatti S., 1973. A key to some New World species of Trichogramma (Hymenoptera: Trichogrammatidae) with descriptions of four new species, Proc. Ent. Soc. Wash. 75:288-297.
[4] Silva I., 1999, Identifi cation and evaluation of Trichogramma
parasitoids for biological control, WAU dissertation no. 2660.
[5] Laemmli UK., 1970, Laemmli Sample Buffer, Catalog Number, 161-0737, Nature, 227, 680.
[6] Wool D and Front L., 2003, Esterase variation in Tribolium
confusum (Coleoptera: Tenebrionidae): genetic analysis of
interstrain crosses in relation to malathion resistance, J. of Stor. Pro. Res. 39, 237-249.
[7] Silva IMMS et. al., 1999, Selection of Trichogramma spp. (Hym: Trichogrammatidae) for control of Helicoverpa
armigera (Lep,. Noctuidae), Wageningen, The Netherlands.
[8] Zhou X et. al., 2002, Diagnostic Assays Based on Esterase-Mediated Resistance Mechanism in Western Corn Rootworms (Coleoptera: Chrysomelidae), J. of Econ. Entomol., Vol. 95, No.6, pp. 1267-1274.
[9] Atanassova P et. al., 1998, Electrophoretic study of fi ve aphid
parasitoid species of the genus Aphidius (Hymenoptera: Braconidae) including evidence for reproductively isolated sympatric populations and a cryptic species, Bulletin of Entomological Research, 88, 3-13.
[10] Judy P et. al., 1997, Esterase Activity and Allele Frequency in Field Populations of Simulium equinum (L.) (Diptera: Simuliidae) exposed to organophosphate population, Environmental Toxicology, pp, 2550-2555.
[11] Uğurlu S., 1998, Heliothis armigera (Hubn.) (Lepidoptera: Noctuidae)’nın değişik popülasyonlarının bazı insektisitlere karşı duyarlılık düzeylerinin belirlenmesi üzerine araştırmalar, Ankara Zirai Mücadele Merkez Araştırma Enstitüsü. [12] Murai T., 1993, Esterase Isozyme of Diamondback Moth,
Economic Entomology, 363-367.
[13] Gürkan MO et. al., 1998, B., Akdeniz Bölgesi Pamuk Ekiliş Alanlarında Çoklu Direnç Yöntemi, Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bitki Koruma Bölümü, Zirai Mücadele Merkez Araştırma Enstitüsü, S.D.Ü.Z.F. Bitki Koruma Bölümü-Isparta.
[14] Vermunt AMW et. al., 1997, Purifi cation and Characterization of Juvenile Hormone Esterase from Hemolymph of the Colorado Potato Betle, Archives of Insect Biochemistry and Physiology, 35:261-277.
[15] Mıura K et. al., 1990, Esterase zymograms of Trichogramma
chilonis Ishii and T. ostriniae Pang et Chen (Hymenoptera,
Trichogrammatidae), Jpn. J. Ent., 58 (4): 689-692.
[16] Ram P et. al., 1995, Studies on strains of Trichogramma
evanescens Westwood from different regions of Eurasia,
Biocontrol Science and Technology, 5, 329-338.
[17] Basso C et. al., 1999, Taxonomic study of two Trichogramma species from Uruguay (Hym.: Trichogrammatidae), Bol. San. Veg. Plagas, 25 (3): 373-382.
