İn Vivo Çalışmalar

5.8.1. Sıçanlarda İn Vivo İlaç Doku Dağılımı Çalışmaları

Hazırlanan formülasyonların ve riboflavin-5-fosfat sodyum içeren piyasa preparatlarının (D:MedioCross Dekstroz, TE:MedioCross Transepitelyal) in vivo çalışmalarda göze uygulanması sonucu korneaya geçen etken madde miktarlarının (korneada tutulma/korneada birikme) tespit edilmesi amacıyla, sıçan gözlerine topikal olarak formülasyonların uygulanmasından 30 dk. sonra korneada bulunan etken madde miktarları tespit edilmiş ve elde edilen bulgular Şekil 4.39. ve Şekil 4.40.’

da sunulmuştur. Genel olarak, etken maddeler temel alınarak karşılaştırma yapıldığında Şekil 4.39 ve 4.40’ta riboflavin içeren formülasyonlarda riboflavin-5-fosfat sodyum içeren formülasyonlara göre daha yüksek kornea ilaç miktarı tespit edilmiştir. Bu durumun nedeni, riboflavinin daha hidrofobik yapıya sahip olmasından dolayı lipofilik ilaçların yüksek oranda geçişine izin veren kornea epitelinden daha kolay permeasyon sağlaması ve korneada daha yüksek oranda birikmesi olarak düşünülmektedir.

Riboflavin içeren gruplar kendi aralarında içlerinde kıyaslandığında (Şekil 4.39) en yüksek korneal ilaç tutulumun RB+ kodlu (stearilamin içeren) NLT formülasyonu ile sağlandığı tespit edilmiştir. Bunun nedeni pozitif yüklü formülasyonların negatif yüzey yüküne sahip kornea ile etkileşime girmesi ile açıklanabilir. Transcutol P içeren NLT’ler ise ikinci en fazla korneal ilaç tutulumu sağlayan grup olmuştur ve bu durum Transcutol P’nin kornea epiteldeki sıkı kavşakları açarak riboflavinin geçişini artırması ile açıklanabilir. Riboflavin içeren formülasyonların sıçanlara uygulanması sonrası kornea dokusunda tespit edilen en düşük ilaç miktarı ko-kristal formülasyonlarının

uygulama sonrası elde edilmiştir. Bu durum en düşük viskoziteye sahip olan ko-kristal formülasyonlarının gözden çabuk uzaklaştırılması ile açıklanabilir.

Riboflavin-5-fosfat sodyum içeren preparatlar kendi aralarında incelendiğinde (Şekil 4.40.) riboflavin içeren gruplarına paralel olarak, en yüksek korneal ilaç tutulumun RT+ kodlu (stearilamin içeren) NLT formülasyonu ile sağlandığı tespit edilmiştir. “Epi-on” uygulamalar için geliştirilmiş olan MedioCROSS TE®, MedioCROSS D®’ye kıyasla istatistiksel olarak anlamlı şekilde daha fazla kornea ilaç miktarı sağlamıştır. “Epi-on” (epitel kazınmadan) uygulamalar için geliştirilmiş olan MedioCROSS TE®’nin formülasyonunda % 0.25 riboflavine eşdeğer riboflavin-5-fosfat sodyum , % 1.2 HPMC ve % 0.01 benzalkonyum klorür bulunmaktadır. “Epi-off”

(epitel kazınarak) uygulamalar için geliştirilmiş olan MedioCROSS D®’nin formülasyon bileşenleri % 0.1 riboflavine eşdeğer riboflavin-5-fosfat sodyum ve %20 dekstran’dan oluşmaktadır. İki piyasa preparatı kendi arasında karşılaştırıldığında MedioCROSS TE®

ile daha yüksek kornea riboflavin -5-fosfat sodyum miktarının elde edilmesinin nedeni formülasyonun içerdiği benzalkonyum klorürün penetrasyon artırıcı bir yardımcı madde olması ile açıklanabilir.

Hidrofilik jel formülasyonları dışında tüm formülasyonlar (ticari preparatlar dahil) ticari preparatların klinikte kullanımlarında olduğu gibi her iki dakikada bir damla olarak uygulanmıştır. Yüksek viskozitesi ve jel özelliği nedeniyle hidrofilik jel formülasyonları 15 dk da bir damla olarak uygulanmıştır. Aradaki bu büyük uygulama farkına rağmen jel formülasyonları da önemli ölçüde etkin bulunmuştur. Bu durum jel formülasyonları ile ilacın artmış korneal temas süresi ile açıklanabilir.

5.8.2. Tavşan İn-Vivo Çalışmalar

İn vivo çalışmaların ikinci bölümünü tavşan gözlerine formülasyonların uygulanmasını takiben elde edilen kornea dokusunun biyomekanik cevabının ölçülmesi oluşturmaktadır. Biyomekanik cevabın ölçülmesi için, elde edilen korneaların Texture-analyzer XT-Plus cihazı ile uygulanan farklı strain (uygulanan germe) değerlerine karşı gösterdiği direnç ölçülmüştür.

Kornea dokularında riboflavin ve Riboflavin-5-fosfat sodyum miktarının belirlenmesinin yanında biyomekanik cevabın ölçülmesinin nedeni, ilaç miktarının kornea sertliğini artırmada tek başına etkili bir parametre olmamasıdır. Burada önemli nokta riboflavinin dışarıdan UV ışığı ile aktive olması ve bu aktivasyonun etkinliğidir. Riboflavin her ne kadar tekli oksijen molekülü oluşmasına yardımcı olsa da ortamda fazla miktardaki tekli oksijenin yıkımında rol oynayarak dengenin korunmasını da sağlamaktadır (280). Bir başka deyişle, gözdeki riboflavin konsantrasyonunun artırılması ile fazladan tekli oksijen reaktifinin oluşturulamayacağı sonucuna ulaşılabilir.

Şekil 4.44., 4.45., 4.46., 4.47. ve 4.48’de verilen farklı gerilim oranlardaki stres seviyeleri incelendiğinde, yalnızca UV uygulanan gruba kıyasla, RT+ hariç tüm formülasyonlarda (piyasa preparatları dahil) %4, 6, 8 veya 10 gerilim düzeyinde istatistiksel olarak anlamlı bir fark gözlenmiştir. Benzer şekilde, ticari formülasyonlar kendi aralarında karşılaştırıldığında kornea ilaç miktarlarında olduğu gibi Epi-on”

(epitel kazınmadan) uygulamalar için geliştirilmiş olan MedioCROSS TE®’nin, “epi-off”

(epitel kazınarak) uygulamalar için geliştirilmiş olan MedioCROSS D®’ den daha yüksek etkinlik gösterdiği bulunmuştur.

Şekil 4.47.’de verilen %10 gerilimdeki sonuçlar incelendiğinde; riboflavin içeren NLT formülasyonları arasında en etkili preparatın pozitif yüklü, stearilamin içeren NLT formülasyonları olduğu görülmektedir. Bu durum ex vivo ve in-vivo çalışmalarda elde edilen bulguları desteklemektedir. Formülasyonun sahip olduğu pozitif yük nedeniyle negatif yüklü korneaya daha iyi tutunma sağladığından bu etkinin oluştuğu düşünülmektedir. Trancutol P içeren RBTP formülasyonun RBN formülasyonuna kıyasla üstün olmadığı tespit edilmiştir. Riboflavin, riboflavin-5-fosfat sodyuma göre daha hidrofobik bir yapıda olduğu için epitelden kolayca geçebilmektedir. Bu nedenle Transcutol P bu formülasyonlarda penetrasyon artırıcı etkinliğini tam olarak göstermemiştir.

Riboflavin-5-fosfat sodyum içeren NLT formülasyonları kendi aralarında değerlendirildiğinde ex vivo ve in vivo doku ilaç miktarı çalışmalarından farklı olarak en etkili formülasyonun Transcutol P içeren NLT formülasyonu olduğu görülmüştür.

(ex vivo ve in vivo yapılan çalışmalarda pozitif yüklü riboflavin-5-fosfat sodyum içeren NLT formülasyonlarının daha yüksek tutulum gösterdiği bulunmuştu). Bu durumun nedeni pozitif yüklü NLT formülasyonlarının korneanın epitel tabakasına tutunma gösterdiği, ancak stroma tabakasına Tanscutol P (penetrasyon artırıcı) içeren formülasyonlar kadar geçemediği ve bunun sonucu olarak stromada bulunan kolajenler arası çapraz bağ oluşumuna yeteri kadar etki edemediği düşünülmektedir.

Buna ilaveten, riboflavin-5-fosfat sodyum hidrofilik bir madde olduğundan kornea epitelinden geçmesi oldukça zordur. Bu nedenle epitelden geçişi artıran Transcutol P, bu maddenin etkinliğini anlamlı şekilde artırmıştır.

Termosensitif jel formülasyonları kendi aralarında incelendiğinde en etkin formülasyonun riboflavin 5-fosfat sodyum ve Transcutol P içeren (THJ-TP) olduğu bulunmuştur. Bu durum, riboflavin-5-fosfat sodyumun sahip olduğu yüksek çözünürlük nedeniyle riboflavin içeren hidrofilik jellere kıyasla daha etkili olduğunu göstermektedir. İçerdiği Transcutol P sayesinde geçişi kolaylaşan riboflavin-5-fosfat sodyumun, hidrofilik yapıda bulunan stromaya daha kolay penetre olduğu düşünülmektedir. Hidrofilik jeller, ex vivo ve in vivo rat çalışmalarının aksine fizyolojik cevap açısından oldukça etkili bulunmuştur. Bu durumun sebebi olarak göz yüzeyini tamamen kaplayan hidrofilik jeldeki riboflavin ve riboflavin-5-fosfat sodyum’un UV ışığı ile yüksek miktarda etkileşime girdiği, bunun sonucunda oluşan radikallerin stromadaki kolajenler arasındaki çapraz bağları indüklemiş olabileceği düşünülmektedir.

Ko-kristal formülasyonları arasından en etkin olanın ise 1R-1N formülasyonu olduğu görülmüştür.

İn vivo biyomekanik cevabın ölçülmesi çalışmaları genel olarak değerlendirildiğinde, geliştirilen formülasyonlardan en ümit verici olanın riboflavin 5-fosfat sodyum ve Transcutol P içeren (THJ-TP) termosensitif jel formülasyonu olduğu tespit edilmiştir. Bu formülasyonun 15 dakikada bir uygulanmasına rağmen, her iki dakikada bir uygulanan ve “epi-on” (epitel kazınmadan) yönteme uygun olarak geliştirilmiş ticari preparat olan MedioCROSS TE’den istatistiksel olarak anlamlı bir üstünlük gösterdiği tespit edilmiştir.