Uygulamaya Yönelik Öneriler

As células foram imobilizadas pelo método do aprisionamento em gel de alginato de cálcio. Esferas de gel foram produzidas pelo gotejamento de solução de alginato de sódio e suspensão celular em solução de cloreto de cálcio (concentrações conforme ítem 4.5.1) mantida sobre agitação, conforme apresentado no esquema da Figura 17.

Figura 17 - Esquema de imobilização de células de

S.shehatae UFMG-HM 52.2 em matriz de alginato de cálcio.

As esferas formadas, contendo as células imobilizadas foram mantidas na solução de cloreto de cálcio a 4ºC por um determinado período de cura (tempo conforme ítem 4.5.1). Após este tempo, as esferas foram lavadas em água destilada estéril e utilizadas nos ensaios fermentativos.

4.5.1 Determinação de condições de imobilização celular: Avaliação da influência das variáveis concentração de alginato de sódio, de cloreto de cálcio e tempo de cura nas condições de imobilização celular

Para determinação de condições de imobilização da levedura S. shehatae UFMG- HM 52.2, foram avaliadas como variáveis independentes a concentração de alginato de sódio, concentração da solução de cloreto de cálcio e o tempo de cura.

A suspensão celular obtida conforme o ítem 4.3, foi adicionada a diferentes soluções de alginato de sódio (Alginic acid Sodium salt from Brown algae; for immobilization of microorganisms – Fluka analytical) (previamente autoclavada à 0,5 atm por 20 min), de modo a obter-se uma solução final contendo uma concentração de alginato de sódio de 1%, 1,5% ou 2%, e concentração celular de 3,0 g/l, de acordo com as condições experimentais estudadas em cada ensaio (Tabela 8). Esferas de gel foram produzidas pelo gotejamento desta suspensão em soluções 0,1 M, 0,15 M ou 0,2 M de cloreto de cálcio (previamente autoclavada à 0,5 atm por 20 min) sobre agitação, e posteriormente armazenadas nesta solução a 4ºC (sem agitação) por um período de cura de 12, 18 ou 24 h, de acordo com condições do planejamento fatorial (Tabela 8). Após o período de cura, as esferas foram lavadas em água destilada estéril e utilizadas nos ensaios fermentativos. Conduziu-se as fermentações em frascos Erlenmeyer de 125 ml contendo 40 ml de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-açúcar destoxificado suplementado (5 g/l de sulfato de amônia, 3 g/l de extrato de levedura e 3 g/l de extrato de malte) e 10 ml de suporte com células imobilizadas. Os ensaios foram conduzidos em incubadora de movimento rotatório (Innova 4000 ,Incubator Shaker, New Brunswick Scientific, Enfield, CT, USA) à 30°C e 200 rpm, por 48 h. Amostras foram coletadas periodicamente para as determinações da concentração de açúcares, etanol e produção de biomassa.

A determinação dos efeitos das variáveis independentes foi realizada por planejamento fatorial completo do tipo 23 com três ensaios no ponto central. Foram consideradas como variáveis respostas o fator de rendimento e a produtividade volumétrica

em etanol durante os ensaios fermentativos. Os níveis das variáveis estudadas encontram- se apresentados na Tabela 8.

Tabela 8 - Níveis codificados e valores reais do planejamento de experimentos 23 para variáveis independentes concentração de alginato de sódio (% m/v), concentração de cloreto de cálcio (M) e tempo de cura (h), no processo imobilização de células de S. shehatae UFMG-HM 52.2, visando a produção de etanol a partir de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar em frascos Erlenmeyer.

Fonte: Arquivo pessoal

A análise das varáveis respostas YP/S e QP foi realizada utilizando-se o programa STATISTICA for Windows (StatSoft, Inc. V.5 Tulsa, OK, USA). Os resultados foram expressos em gráficos de Pareto, tabelas de análise de variância e nível de significativa (p) e gráficos de contorno e superfície de resposta.

4.5.2 Teste com elevada concentração celular interna nas esferas de alginato de cálcio no processo de produção de etanol a partir de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar utilizado células imobilizadas de S. shehatae UFMG-HM 52.2

Avaliou-se a influência da elevada concentração celular no interior das esferas (definida pela concentração celular em solução de alginato de sódio) no processo de imobilização celular, visando a produção de etanol a partir de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar utilizado células imobilizadas de S. shehatae UFMG-HM 52.2.

Determinada suspensão celular, obtida conforme o ítem 4.3, foi adicionada a solução de alginato de sódio (Alginic acid Sodium salt from Brown algae; for immobilization of microorganisms – Fluka analytical) (previamente autoclavada à 0,5 atm por 20 min), de modo a obter-se uma solução final contendo uma concentração de alginato de 1%, e concentração celular de 6 g/l. Esferas de gel foram produzidas pelo gotejamento desta suspensão em uma solução 0,2 M de cloreto de cálcio (previamente autoclavada à 0,5 atm por 20 min) mantida sobre agitação, e posteriormente armazenadas nesta solução a 4ºC (sem agitação) por um período de cura de 12h. Após o período de cura as esferas

Variáveis independentes (+1) 0 (-1)

(A) Concentração de alginato de sódio (% m/v) 1,0 1,5 2,0 (B) Concentração de cloreto de cálcio (M) 0,1 0,15 0,2

foram lavadas em água destilada estéril e utilizadas nos ensaios fermentativos. Conduziu- se as fermentações, em duplicatas, em frascos Erlenmeyer de 125 ml contendo 40 ml de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-açúcar destoxificado suplementado (5 g/l de sulfato de amônio, 3 g/l de extrato de levedura e 3 g/l de extrato de malte) e 10 ml de suporte com células imobilizadas. Os ensaios foram conduzidos em incubadora de movimento rotatório (Innova 4000 ,Incubator Shaker, New Brunswick Scientific, Enfield, CT, USA) à 30°C e 200 rpm, por 48 h,. Amostras foram coletadas periodicamente para a determinação das concentrações de açúcares, etanol e produção de biomassa.

4.5.3 Avaliação do desempenho do sistema de bateladas repetidas em frascos Erlenmeyer

Foram realizadas operações em bateladas consecutivas com reutilização das células imobilizadas.

Conduziu-se as fermentações em frascos Erleymeyer de 125 ml contendo 40 ml de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-açúcar destoxificado suplementado (5 g/l de sulfato de amônio, 3 g/l de extrato de levedura e 3 g/l de extrato de malte) e 10 ml de suporte com células imobilizadas (Condições de imobilização: concentração de alginato de sódio: 1 %, cloreto de cálcio: 0,2 M, tempo de cura: 12 h e concentração celular em solução de alginato de sódio: 3 g/l). Cada batelada, em duplicata, foi conduzida em agitador rotatório (Innova 4000, Incubator Shaker, New Brunswick Scientific, Enfield, CT, USA) à 30°C e 200 rpm, por 72h. Ao final de cada ciclo de batelada, o meio fermentado foi descarregado, as células imobilizadas lavadas e utilizadas como inóculo da batelada seguinte em novo meio de fermentação. Amostras foram coletadas periodicamente para determinação das concentrações de açúcares, etanol e produção de biomassa.