UV 1. Türev UV 2. Türev UV
4. TARTIŞMA
Atipik antipsikotik ilaçlar sınıfında yer alan ve benzizoksazol türevi etken maddelerden olan risperidon, çeşitli psikotik hastalıkların tedavisinde kullanılmaktadır. Bu tez kapsamında risperidon içeren preparatlarda etken madde tayinine imkan sağlayan spektrofotometrik yöntemler geliştirilmiştir. Çalışmalara başladığımızda yaptığımız kaynak taramasında etken maddenin miktar tayini için herhangi bir spektrofotometrik yönteme rastlanmamıştır. Bu nedenle önerilen tüm yöntemlerin orijinal bir çalışma olduğu düşünülmektedir.
Risperidon etken maddesinin saflığının araştırılması amacıyla Fako İlaçları A.Ş. firmasından temin ettiğimiz etken madde için UV ve IR spektrumları alınmış ve erime noktası tayin edilmiştir. Elde edilen spektrumlar ve bulunan erime noktası, etken maddenin yeterli saflıkta olduğunu göstermiştir. Analiz çalışmalarına başlamadan önce, etken maddenin en iyi çözündüğü ortamı belirlemek amacıyla çeşitli çözücü ortamları (su, 0.1 N HCl, metanol) denenmiş; en iyi çözücü ortamı metanol olarak belirlenmiştir.
Tez kapsamında risperidon etken madde tayini için önerilen ilk yöntem
“doğrudan UV spektrofotometri”dir. Etken maddenin 200.0-325.0 nm’ler arasında doğrudan UV spektrumu alınmıştır (Şekil 3.2.1.1.). Elde edilen spektrumlarda etken maddenin maksimum absorbans verdiği dalga boylarının 237.5 ve 278.0 nm olduğu tespit edilmiştir. Bu dalga boylarında okunan absorbans değerleri, konsantrasyonlara karşı grafiğe geçirilerek Çizelge 3.2.1.1.’de verilen kalibrasyon verilerine
ulaşılmıştır. Çizelge 3.2.1.1.’de görüldüğü gibi, yöntemde çalışma aralığı 7.0-35.0 µg.mL-1 olarak belirlenmiştir. Korelasyon katsayılarının önemli bir değer
olup olmadığı araştırılmış ve her iki dalga boyu için hesaplanan tH değerleri, tT değerlerinden büyük olduğu için (tH>tT) korelasyon katsayısının önemli bir değer olduğuna karar verilmiştir. 237.5 ve 278.0 nm’ler için hesaplanan yakalama sınırları ve tayin alt sınırlarının küçük olması, önerilen yöntemin duyarlı olduğunu göstermektedir. Belirlenen dalga boylarında korelasyon katsayılarının 1’e çok yakın
olması, önerilen yöntemin duyarlı olduğunun ispatıdır. Laboratuarda etken maddeye ait üç paralel çözelti hazırlanmış, belirlenen şartlarda yöntem uygulanmış (oda
sıcaklığı, karanlık ve soğukta bekletilen çözeltilerin 5 gün boyunca 200.0-325.0 nm’ler arasında spektrumları alınmıştır); 237.5 ve 278.0 nm’ler için SS
ve % BSS değerleri hesaplanarak Çizelge 3.2.1.3.’te gösterilmiştir. Hesaplanan bu değerler, yöntemin kesinlik açısından uygun olduğunu göstermektedir. Çalışmamızda farmasötik preparatlar içerisindeki katkı maddelerinin girişim yapıp yapmadığını tespit etmek amacıyla “% geri kazanım” deneyleri yapılmıştır. Bu deneyler sonucunda elde edilen ortalama % geri kazanım değerleri 237.5 ve 278.0 nm’ler için sırasıyla %100.0 ve 100.1; % BSS değerleri ise 237.5 ve 278.0 nm’ler için sırasıyla
%2.05 ve 1.92 olarak bulunmuştur.
Tez kapsamında risperidon etken madde tayini için önerilen ikinci yöntem
“birinci türev UV spektrofotometri”dir. Etken maddenin 200.0-325.0 nm’ler arasında alınan doğrudan UV spektrumlarının birinci türevleri alınmıştır (Şekil 3.2.2.1.). Elde edilen spektrumlarda etken maddenin absorbans verdiği dalga boylarının 247.9 ve 286.2 nm olduğu tespit edilmiştir. Bu dalga boylarında okunan dA/dλ değerleri, konsantrasyonlara karşı grafiğe geçirilerek Çizelge 3.2.2.1.’de verilen kalibrasyon verilerine ulaşılmıştır. Çizelge 3.2.2.1.’de görüldüğü gibi, yöntemde çalışma aralığı 7.0-35.0 µg.mL-1 olarak belirlenmiştir. Korelasyon katsayılarının önemli bir değer olup olmadığı araştırılmış ve her iki dalga boyu için hesaplanan tH değerleri, tT
değerlerinden büyük olduğu için (tH>tT) korelasyon katsayısının önemli bir değer olduğuna karar verilmiştir. 247.9 ve 286.2 nm’ler için hesaplanan yakalama sınırları ve tayin alt sınırlarının küçük olması, önerilen yöntemin duyarlı olduğunu göstermektedir. Belirlenen dalga boylarında korelasyon katsayılarının 1’e çok yakın olması, önerilen yöntemin duyarlı olduğunun ispatıdır. Yöntemin kesinliğinin belirlenmesi için alınan doğrudan UV spektrumlarına birinci türev yöntemi uygulanmış; 247.9 ve 286.2 nm’ler için SS ve % BSS değerleri hesaplanarak Çizelge 3.2.2.3.’te gösterilmiştir. Hesaplanan bu değerler yöntemin kesinlik açısından uygun olduğunu göstermektedir. “% geri kazanım” deneyleri için alınan doğrudan UV spektrumlarına birinci türev yöntemi uygulanmıştır. Bu deneyler sonucunda elde edilen ortalama % geri kazanım değerleri 247.9 ve 286.2 nm’ler için
sırasıyla %99.8 ve 100.0; % BSS değerleri ise 247.9 ve 286.2 nm’ler için sırasıyla
%2.21 ve 1.67 olarak bulunmuştur.
Tez kapsamında risperidon etken madde tayini için önerilen üçüncü yöntem
“ikinci türev UV spektrofotometri”dir. Etken maddenin 200.0-325.0 nm’ler arasında alınan doğrudan UV spektrumlarının ikinci türevleri alınmıştır (Şekil 3.2.3.1.). Elde edilen spektrumlarda etken maddenin absorbans verdiği dalga boylarının 246.5 ve 284.4 nm olduğu tespit edilmiştir. Bu dalga boylarında okunan d2A/dλ2 değerleri, konsantrasyonlara karşı grafiğe geçirilerek Çizelge 3.2.3.1.’de verilen kalibrasyon verilerine ulaşılmıştır. Çizelge 3.2.3.1.’de görüldüğü gibi, yöntemde çalışma aralığı 7.0-35.0 µg.mL-1 olarak belirlenmiştir. Korelasyon katsayılarının önemli bir değer olup olmadığı araştırılmış ve her iki dalga boyu için hesaplanan tH değerleri, tT değerlerinden büyük olduğu için (tH>tT) korelasyon katsayısının önemli bir değer olduğuna karar verilmiştir. 246.5 ve 284.4 nm’ler için hesaplanan yakalama sınırları ve tayin alt sınırlarının küçük olması, önerilen yöntemin duyarlı olduğunu göstermektedir. Belirlenen dalga boylarında korelasyon katsayılarının 1’e çok yakın olması, önerilen yöntemin duyarlı olduğunun ispatıdır. “% geri kazanım” deneyleri için alınan doğrudan UV spektrumlarına ikinci türev yöntemi uygulanmıştır. Bu deneyler sonucunda elde edilen ortalama % geri kazanım değerleri 246.5 ve 284.4 nm’ler için sırasıyla %100.2 ve 100.1; % BSS değerleri ise 247.9 ve 286.2 nm’ler için sırasıyla %1.59 ve 1.40 olarak bulunmuştur.
Tez kapsamında risperidon etken madde tayini için önerilen dördüncü yöntem
“üçüncü türev UV spektrofotometri”dir. Etken maddenin 200.0-325.0 nm’ler arasında alınan doğrudan UV spektrumlarının üçüncü türevleri alınmıştır (Şekil 3.2.4.1.). Elde edilen spektrumlarda etken maddenin absorbans verdiği dalga boylunun 283.1 nm olduğu tespit edilmiştir. Bu dalga boyunda okunan d3A/dλ3 değerleri, konsantrasyonlara karşı grafiğe geçirilerek Çizelge 3.2.4.1.’de verilen kalibrasyon verilerine ulaşılmıştır. Çizelge 3.2.4.1.’de görüldüğü gibi, yöntemde çalışma aralığı 7.0-35.0 µg.mL-1 olarak belirlenmiştir. Korelasyon katsayılarının önemli bir değer olup olmadığı araştırılmış ve her iki dalga boyu için hesaplanan tH değerleri, tT değerlerinden büyük olduğu için (tH>tT) korelasyon katsayısının önemli
bir değer olduğuna karar verilmiştir. 283.1 nm için hesaplanan yakalama sınırı ve alt tayin sınırının küçük olması, önerilen yöntemin duyarlı olduğunu göstermektedir.
Belirlenen dalga boyunda korelasyon katsayısının 1’e çok yakın olması, önerilen yöntemin duyarlı olduğunun ispatıdır. “% geri kazanım” deneyleri için alınan doğrudan UV spektrumlarına üçüncü türev yöntemi uygulanmıştır. Bu deneyler sonucunda elde edilen ortalama % geri kazanım ve % BSS değerleri 283.1 nm için sırasıyla %99.5 ve 2.16 olarak bulunmuştur.
Tez kapsamında risperidon için önerilen beşinci yöntem YPSK yöntemidir.
Risperidonun belirtilen şartlarda sisteme verilmesiyle Şekil 3.2.5.2.’de görülen kromatogramlar elde edilmiştir. Elde edilen kromatogramlarda risperidonun alıkonma zamanının yaklaşık 7 dakika olduğu; analiz süresinin ise yaklaşık 15 dakika olduğu görülmüştür. Elde edilen kromatogramların hepsine aynı integrasyon parametreleri uygulanmış; risperidon pik alanı/iç standart pik alanı konsantrasyonlara karşı grafiğe geçirilmiş; en küçük kareler yöntemi kullanılarak Çizelge 3.2.5.1.’de verilen kalibrasyon denklemine ulaşılmıştır. YPSK yönteminde risperidon için 50.0-500.0 µg.mL-1 analitik çalışma aralığında doğrusallık tespit edilmiştir. Yöntem için yakalama sınırı 0.051 µg.mL-1; tayin alt sınırı ise 0.017 µg.mL-1’dir. Gerek yakalama sınırı, gerek tayin alt sınırı değerlerinin küçük olması; önerdiğimiz yöntemin duyarlı olduğunu göstermektedir. Yöntemde elde edilen korelasyon katsayısının 1’e çok yakın olması önerdiğimiz yöntemin hassasiyetinin çok yüksek olduğunu göstermektedir. Korelasyon katsayısının önemli bir değer olup olmadığı araştırılmış ve yöntem için hesaplanan tH değerleri tT değerlerinden büyük bulunduğu için (tH>tT) korelasyon katsayısının önemli bir değer olduğuna karar verilmiştir. Yöntemin kesinliğinin tespiti için yapılan gün içi ve günler arası deneylerinin sonuçları Çizelge 3.2.5.3. ve 3.2.5.4.’te verilmiştir. Önerilen YPSK yönteminin doğruluğunun tespiti için laboratuar şartlarında standart ilave yöntemi ile hazırlanan numunelere yöntem uygulanmış; elde edilen ortalama % geri kazanım değeri %99.6; % BSS değeri ise %1.39 olarak hesaplanmıştır. Bu değerler yöntemin doğruluğunun yüksek olduğunu göstermektedir.
Önerilen tüm yöntemlerde yapılan geri kazanım deneylerinin sonuçlarının tatmin edici olması, tablet içeriside bulunan yardımcı maddelerin (laktoz, nişasta, magnezyum stearat, titanyum dioksit, vb.) yöntemleri etkilemediğini göstermektedir.
Önerilen spektrofotometrik yöntemler Yunanistan’dan temin edilen, değişik miktarda (1, 4 ve 8 mg) risperidon içeren üç adet farmasötik preparata başarıyla uygulanmıştır. Önerilen YPSK yöntemi ise; 1 ve 8 mg risperidon içeren farmasötik preparatlar analizler sırasında bittiğinden, sadece 4 mg risperidon içeren Rispefar®
adlı preparata başarı ile uygulanmıştır.
Çizelge 4.1. Önerilen yöntemlerin validasyon verileri
Doğrudan UV Spektrofotometri
Birinci Türev UV Spektrofotometri
İkinci Türev UV Spektrofotometri
Üçüncü Türev UV Spektrofotometri
Yüksek Performanslı
Sıvı Kromatografi
Dalga boyu (nm) 237.5 278.0 247.9 286.2 246.5 284.4 283.1 275.0
Eğim 0.0309 0.0278 -0.0028 -0.0025 -0.0011 -0.0015 -0.0014 0.0283
Kesim 0.0360 0.0265 -0.0014 -0.0017 -1.0×10-5 -1.1×10-3 -0.0007 0.2238
Çalışma aralığı
(µg.mL-1) 7.0-35.0 7.0-35.0 7.0-35.0 7.0-35.0 7.0-35.0 7.0-35.0 7.0-35.0 50.0-500.0
Korelasyon katsayısı (r) 0.9997 0.9997 0.9998 0.9997 0.9988 0.9996 0.9958 0.9994
Tayin katsayısı (r2) 0.9994 0.9994 0.9996 0.9993 0.9976 0.9991 0.9917 0.9988
Yakalama sınırı
(µg.mL-1) 0.033 0.034 0.027 0.035 0.065 0.041 0.119 0.051
Tayin alt sınırı
(µg.mL-1) 0.110 0.112 0.090 0.118 0.217 0.138 0.396 0.170
% Geri kazanım 100.0 100.1 99.8 100.0 100.2 100.1 99.5 99.6
% Bağıl standart sapma 2.05 1.92 2.21 1.67 1.59 1.40 2.16 1.39