RPLC ve HILIC şartlarında yürütülen analizler 55

EC-HA-APS’nin RPLC ve HILIC şartlarındaki sabit faz özelliklerinin belirlenmesi amacıyla yürütülen çalışmalar; 4,6x100 mm ölçülerinde bir kromatografik kolon üzerinde yürütülmüştür. Deneysel parametrelerin etkisini incelemek için önce tek bileşenli numunelerle bazı analizler yürütülmüş ve kaydedilen piklerden, kromatografik kapasite faktörleri (k’) hesaplanmıştır. k’ değerlerindeki farklılaşmalar, incelenen deneysel parametrelerin etkisiyle ilişkilendirilmiştir. Etkisi incelenen deneysel parametreleri şu şekilde sıralamak mümkündür:

− Akış hızı

− Hareketli fazın bileşimi (hareketli fazdaki organik çözücü ve Su oranı) − Hareketli fazdaki farklı pH değerlerine sahip amonyak çözeltisi

− Sıcaklık

Tek bileşenli numunelerle yürütülen analizlerden elde edilen sonuçların ışığında, çalışılan nükleosit ve nükleobazlar için kromatografik ayırmaların mümkün olduğu şartlarda çok bileşenli numuneler kullanılarak analizler yürütülmüştür. Bazı türlerin kromatografik ayırmaları, iki seviyeli ve iki değişkenli tam bir faktöriyel dizayn (22) temelinde optimize edilmiştir. Nükleositler için kaydedilen optimum ayırmalara karşılık gelen şartlarda 0,1 F NH3, 0,1 F H3PO4 ve 0,1 F CH3COOH çözeltileri kullanılarak

kaydedilen kromatogramlar karşılaştırılmış ve NH3 çözeltisinin etkisi

değerlendirilmiştir. Çeşitli şartlarda kaydedilen kromatografik ayırmalar, aynı şartlarda APS sabit fazı ile doldurulmuş aynı ebattaki kolon üzerinde elde edilen kromatografik ayırmalarla karşılaştırılmış ve böylece immobilizasyon işleminin etkisi vurgulanmıştır. Belirtilen analizlerden önce, sabit faz üzerinde elde edilen sonuçların tekrarlanabilirliği, farklı zaman dilimlerinde, kolonun MeOH-Su hareketli faz sistemiyle etkileştirilme derecesine bağlı olarak incelenmiştir. Elde edilen veriler, sabit fazın şartlanma derecesiyle ilişkilendirilmiştir.

3.6.1.1. Şartlandırma işleminin etkisi

Kolonun ilk kullanılmaya başlandığı zamandan itibaren, hareketli fazdaki MeOH oranına bağlı olarak nükleositlerin k’ değerlerindeki değişimler periyodik olarak takip edilmiştir. Bu amaçla; zaman içerisinde çeşitli tekrar analizleri yürütülmüş ve k' değerlerindeki tekrarlanabilirlik değerlendirilmiştir. Günler-arası tekrar analizlerinden elde edilen k’ değerlerindeki standart sapma düzeyi ≤0,03 olduğunda, kolonun uygun şartlanma seviyesine ulaştığı kabul edilmiş ve uygun şartlanma seviyesine ulaşan kolon üzerinde diğer analizler yürütülmeye başlanmıştır. Yani, daha sonraki işlemlerin tamamı, yeterli düzeyde şartlandırılmış kolon üzerinde yürütülmüştür.

3.6.1.2. Akış hızının etkisi

Teorik tabaka yüksekliği ile hareketli fazın akış hızı arasındaki ilişkiyi değerlendirmek amacıyla, EC-HA-APS sabit fazı üzerinde, 0,15–1,50 mL/dak aralığında değişen farklı akış hızlarında bazı denemeler yapılmıştır. Denemeler; RPLC şartlarında 0,1 F NH3 (pH=7)-MeOH hareketli faz sistemi kullanılarak yürütülmüş ve

verilerden, tek bileşenli numunelerle yürütülecek analizlerin hangi akış hızında yürütüleceği belirlenmiştir. Analizler süresince, kolon fırını sıcaklığı 25 oC’a ve deteksiyon dalga boyu 254 nm’ye ayarlanmıştır.

3.6.1.3. Hareketli fazdaki organik çözücü türünün ve yüzdesinin etkisi

Nükleosit ve nükleobazlar için k’ değerleri, farklı oranlarda organik çözücü içeren Su-MeOH ve Su-MeCN hareketli faz sistemleri kullanılarak türetilmiştir. Hareketli fazdaki organik çözücü oranına (%1-90; v/v) bağlı olarak k’ değerlerindeki değişimler irdelenmiştir. Böylece; RPLC ve HILIC şartlarına karşılık gelen şartlardaki kromatografik davranışlar kapsamlı bir değerlendirmeye tabi tutulabilmiştir.

Belirtilen tüm analizler süresince; hareketli faz akış hızı 0,50 mL/dak, kolon fırınının sıcaklığı 25 oC ve detektörün dalga boyu 254 nm olacak şekilde ayarlanmıştır.

3.6.1.4. Hareketli fazdaki amonyak çözeltisi ve sıcaklığın etkisi

Yapılan bazı ön denemeler, hareketli fazda kullanılan NH3 çözeltisinin, çalışılan

türlerin elüsyon derecelerinin ayarlanmasında çok faydalı olduğunu göstermiş ve bu nedenle farklı pH değerlerine sahip 0,1 F’lik NH3 çözeltileri kullanılarak RPLC ve

HILIC şartlarında sırasıyla NH3-MeOH ve NH3-MeCN hareketli faz sistemleriyle bazı

analizler yürütülmüştür. Bu analizlerle, türlerin k’ değerlerinin NH3 çözeltisinin pH’sına

(3-7) ve sıcaklığa (25-45 oC) bağlı olarak değişimi incelenmiştir. Yani; NH3/NH4+

türlerinin sabit faza karşı yarışmalı türler olarak etkisini değerlendirmek amacıyla hareketli fazda, farklı pH değerlerine sahip 0,1 F NH3 çözeltileri kullanılmıştır.

Analizlerden hemen önce, NH3 çözeltileri taze olarak hazırlanmış ve pH’ları 0,1 M HCl

çözeltisiyle istenen seviyeye ayarlanmıştır. NH3 çözeltisinin etkisi, RPLC ve HILIC

şartlarına karşılık gelen hareketli faz bileşimlerinde ayrı ayrı incelenmiştir. RPLC şartlarında nükleositler ve nükleobazlar için yürütülen denemelerde, hareketli faz olarak sırasıyla 0,1 F NH3 (pH=3,5–7,0)-MeOH (99:1; v/v) ve 0,1 F NH3 (pH=3,5–7,0)-MeOH

(9:1; v/v) karışımları; HILIC şartlarında ise her iki bileşik grubu için de 0,1 F NH3

(pH=3,5–7,0)-MeCN (1:9; v/v) karışımı kullanılmıştır. Analizler, her bir pH değerinde üç farklı sıcaklıkta (25; 35 ve 45 oC) olmak üzere, farklı pH değerlerinde yürütülmüştür.

Böylece; her bir pH değerinde, incelenen bileşiklerin her biri için van’t Hoff grafikleri çizilmiş ve türlerin kromatografik davranışlarının şekillenmesinde rol alan mekanizmalarda sıcaklığın ne tür bir etkiye sahip olduğu incelenmiştir. Farklı sıcaklıklarda yürütülen analizlerde, kolondan çıkan hareketli faz kısımları, sıcaklığı 25

o_{C’a ayarlanmış kolon fırınına yönlendirildikten sonra detektöre gönderilmiştir.}

Böylece; tüm analizler süresince deteksiyon sıcaklığı da sabitlenmiştir.

3.6.1.5. Kolon ön-şartlandırma işleminin etkisi

Kolonun ön-şartlandırılmasında kullanılan hareketli faz bileşiminin etkisi, RPLC şartlarında (Su-MeOH karışımı ile) denenmiştir. Bu denemelerde, analit olarak Ura, Thy ve Cyt içeren bir numune kullanılmış ve hareketli faz bileşimi (analiz başlatıldığı andan itibaren) Su-MeOH (9:1; v/v) olacak şekilde ayarlanmıştır. Her analizden önce kolon, %0–35 (v/v) aralığında değişen MeOH içeriğine sahip hareketli faz bileşimleri kullanılarak şartlandırılmıştır. Sabit fazın her bir durum için incelenen maddelere karşı sergilediği ayırma gücündeki (RS) farklılaşmalar, kolon ön-şartlandırma işleminde

kullanılan hareketli faz bileşiminin etkisiyle ilişkilendirilmiştir.