— ROBERT LOUIS STEVENSON Virginibus Puerisoue (1881)

Os ITRNNs agem inibindo a transcriptase reversa por possuírem grande afinidade pelo bolso hidrofóbico próximo ao domínio catalítico da transcriptase reversa. A ligação dos inibidores na enzima altera sua flexibilidade e consequentemente bloqueia a síntese de DNA viral. Portanto, as mutações relacionadas a resistência a esta classe (exemplifique-se a Y181C associada à nevirapina, K103N associada a EFZ, e também Y188C, K103N, G190A e V106A) ocorrem por alteração na afinidade enzimática ao seu sítio ligador.

O HIV-1 subtipo O e HIV-2 são intrinsecamente resistentes a este grupo de drogas.

A K103N é a mutação que ocorre mais comumente no grupo e confere resistência aos ITRNNs de primeira geração (EFZ e NVP). A K103R ocorre em 2 a 3% dos pacientes não tratados com ITRNN e também causa resistência.

A98G, K101E, e V108I causam baixa resistência aos ITRNN isoladamente. A G190A/S causa alta resistência à Nevirapina e Efavirenz.

A Y181C/I é principalmente selecionada apos utilização de Nevirapina e apresenta forte impacto na sensibilidade ao ITRNN de 2a geração atualmente disponível (Etravirina). Sendo consideradas também importantes para esta a 100I , 101P e 230L (JOHNSON et al., 2004). A V106M confere alta resistência in vitro a nevirapina e efavirenz (BRENNER et al., 2003). Esta mutação tem sido observada apenas em

isolados clínicos de HIV classe C, embora mutagênese direcionada ao sítio indique que V106M confere resistência aos ITRNN de 1a geração em vírus HIV classe B. A V106I tem impacto na resistência à Etravirina.

1.10.1.3 Resistência aos Inibidores de Protease

A enzima protease possui dois homodímeros simétricos com um centro onde fica a cavidade de ligação ao substrato. Os inibidores de protease têm estrutura química que mimetiza os peptídeos virais normalmente reconhecidos pela protease. Assim, estes compostos com alta afinidade se ligam à enzima competindo com o substrato natural e inibindo sua atividade catalítica. A Resistência aos IP surge por mutações que levam a alterações dentro do domínio de ligação do substrato da enzima ou próximo a este. Diretamente ou indiretamente, estas mudanças de aminoácidos modificam o número e a natureza de pontos de contato entre os inibidores e a protease, diminuindo, por conseguinte, sua afinidade (CLAVEL et al., 2004).

As mutações principais são inicialmente selecionadas na presença de droga, ou demonstradas a nível bioquímico ou virológico, gerando uma alteração na ligação da droga ou uma inibição da atividade ou replicação viral.

As mutações acessórias aparecem tardiamente em relação às principais, e isoladas não têm efeito no fenótipo. Em alguns casos, seus efeitos consistem na melhora do fitness viral, quando existem mutações principais. Embora, o acúmulo destas mutações em conjunto levem a resistência múltipla na classe de IP (PALMER et al., 1999).

As mutações V82A/T/F/S, G48V foram isoladas inicialmente após falhas aos primeiros IP utilizados como Indinavir, Saquinavi e Ritonavir.

Em geral, as mutações chamadas de “assinatura” são identificadas após a utilização de uma determinada droga desta classe e causam

resistência plena a esta, embora com baixa resistência cruzada isoladamente aos demais IP. A D30N foi identificada para o Nelfinavir, I50V para Amprenavir e I50L para Atazanavir (COLONNO et al., 2002). Recentemente I47A foi correlacionada in vitro a resistência ao Lopinavir (MASSE et al., 2007).

As mutações nas posições 46, 47, 53 e 54 são importantes para resistência a esta classe por se localizarem na região do “flap” (posições 45 a 56), responsável pela flexibilidade da enzima para se ajustar ao substrato.

A L90M tem sido isolada de pacientes em uso de Saquinavir, Nelfinavir, Indinavir ou Ritonavir. Esta mutação confere ou contribui diretamente para resistência a todos os IP e está relacionada a resistência cruzada nesta classe de drogas (VASUDEVACHARI et al., 1996).

O códon 63 é o mais polimórfico da protease. Em pacientes não tratados 45% dos isolados no subtipo B apresentam 63L, 45% 63P e 10% outras mutações neste códon. Além disso, a prevalência de aminoácidos outros fora o L aumentam 90% em pacientes tratados pesadamente. Mutações nos códons 77 e 93 dobram a prevalência de 15 a 20% em pacientes não tratados para 30 a 40% naqueles fortemente experimentados (SHAFER et al., 2002). A L63P também é comum em vírus que nunca foram expostos a IP (KOZAL et al., 1996) e podem ser mais prevalentes em vírus de pacientes, em que regimes contendo IP tenham falhado. Porém, isolada não causa nenhum aumento no IC50 para qualquer IP.

As mutações 82L/T, 84V ou 90M são chamadas UPAMs (Universal Protease Inhibitor Associated Mutations). O acrônimo PRAM (Protease Inhibitor-resistance Associated Mutations) tem sido usado para descrever um conjunto de mutações responsáveis pela resistência cruzada entre IP, que consistem de 33W/F, 82A/F/L/T, 84V e 90M. Na maioria dos casos, a presença de uma ou duas PRAMs está associada

com reduzida sensibilidade aos IP atualmente disponíveis (SQUIRES et al., 2003).

1.10.1.4 Resistência aos Inibidores de Integrase

A droga pertencente a esta classe, que foi introduzida ao arsenal terapêutico recentemente, é denominada Raltegravir. Estudos clínicos revelaram duas vias que conferem resistência a este inibidor. O primeiro envolve a aquisição da N155H, algumas vezes associada com L74M, E92Q, T97A, G136R ou V151I. A outra via tem como principal mutação a Q148K/R/H, usualmente associada com E138K ou com G140A/S. Uma terceira possível via de resistência inclui mutações Y143R/C, junto com L74A/I, E92Q, T97A, I203M e S230R (MALET et al., 2008; COOPER et al., 2008). Clones resistentes contendo G140S/Q148H permanecem estáveis ao longo do tempo, enquanto populações virais com N155H geralmente mudam para G140S/Q148H (MILLER et al., 2008). G140S confere baixos níveis de resistência comparado a Q148H, mas aumenta a capacidade replicativa viral na presença de Q148H (DELELIS et al., 2009). A E92Q aparece associada a resistência ao Raltegravir, a qual aumenta os efeitos da N155H na susceptibilidade ao Raltegravir, quando ambas aparecem juntas no mesmo clone (FRANSEN et al., 2008).

No HIV-2 a resistência ao Raltegravir surge associada com o desenvolvimento da N155H ou Q148R, (GARRET et al., 2008; ROQUEBERT et al., 2008).

1.10.1.5 Resistência aos Inibidores de Fusão

O processo de fusão entre a membrana celular e viral ocorre, efetivamente, após interação entre as regiões hidrofóbicas distal de HR2 e proximal de HR1, finalizando no encurtando da molécula.

O primeiro peptídeo inibidor de fusão foi estudado em 1992, mostrando inibição da infecção pelo HIV-1, em culturas celulares, denominado Enfuvirtida (WILD et al., 1992). Desde então, vários peptídeos inibidores de fusão, que mimetizam partes das regiões HR1 (aminoácido 27 ao 66) ou HR2 (aminoácidos 127 a 162) da gp41, têm sido testados como inibidores (GREENBERG et al., 2004; WILD et al., 1993; WILD et al., 1994). Partes miméticas peptídicas da região HR2 são mais potentes e efetivas, em concentrações nanomolares, comparadas aos peptídeos miméticos de partes da região HR1, que requerem concentrações micromolares para serem efetivas (JIANG et al., 1993; LU et al., 1995; WILD et al., 1993; WILD et al., 1994).

A Enfuvirtida é um aminoácido peptídico de 36 Kb, derivado do HR2, que ligando-se ao HR1 bloqueia o processo de integração (CHAN et al., 1998; KILBY et al., 1998) (Figura 11). A resistência viral a esta droga, resulta de mutações localizadas principalmente num perímetro de 10 aminoácidos do HR1. Mudanças na gp41 ou gp120 parecem associadas com diferenças na susceptibilidade viral a esta droga (G36D/S, I37V, V38A/M, Q39R, N42T, N43D), (CLAVEL et al., 2004; ECKERT et al., 2001). Embora inibidores de fusão sejam uma nova classe de drogas para tratamento do HIV, vírus resistentes começaram a emergir. Quase todos os estudos desenvolvidos para definir resistência aos Inibidores de Fusão se focaram nas mudanças na gp41 que conferem resistência (BALDWIN et al., 2004; DERDEYN et al., 2000; DERDEYN et al., 2001; ERON et al., 2004; GREENBERG et al., 2004; HEIL et al., 2004; KINOMOTO et al., 2005; LU et al., 2004; MENZO et al., 2004; POVEDA et al., 2002; REEVES et al., 2005; RIMSY et al., 1998; WEI et al., 2002).

Figura 11 - Mecanismo de Fusão da gp41/gp120

Expressão das regiões hidrofóbicas HR1 e HR2. Representação do mecanismo de ação da Enfuvirtida (T20), que mimetizando HR2 bloqueia o processo de encurtamento da molécula para que ocorra a fusão das membranas viral e celular (Fonte: Nameki, D., Kodama, E., Ikeuchi, M., et.

al. Journal of Virology, 2005).

Além da Enfuvirtida, o T-1249 está em estudo clínico, sendo peptídeo de 39 aminoácidos composto de sequências derivadas do HIV-1, HIV-2 e vírus da imunodeficiência símea (SVI), (ERON et al., 2004). A sequência T-1249 é homóloga a parte da região conservada HR2 da gp41 (aminoácidos 125 a 163), e age ligando-se à região HR1 da gp41. Os inibidores de fusão T-20 e T-1249 são peptídeos sobrepostos, compartilhando partes das suas sequências de aminoácidos e apresentando resistência cruzada.

Em um estudo, desenvolvimento de resistência ao inibidor de fusão C34 foi avaliado, explorando a restrição de manter um elemento RRE funcionante na gp41 para conferir resistência aos inibidores de fusão. Neste estudo, C34 (aminoácidos 117 a 150 da gp41), um peptídeo inibidor de fusão cuja sequência de aminoácidos sobrepõe-se ao inibidor de fusão T-20 (aminoácidos 127 a 162 da gp41) foi selecionado.

A mutação I37K conferiu resistência ao C34. Em adição a I37K, que foi predeterminada como desestabilizadora da estrutura secundária RRE, uma mutação secundária A30V foi encontrada, sugerindo uma recuperação da estrutura secundária RRE. Assim, este elemento poderia ligar-se à proteína Rev para se tornar funcional (Figura 12). Portanto, o estudo propôs que mutações na gp41 que conferem resistência ao C34 são restritas, devido à necessidade de manter um elemento RRE funcional (NAMEKI et al., 2005).

Figura 12 - Estrutura secundária do RRE e posição das mutaçãos relacionadas

A figura demonstra a posição da mutação I37K que conferiu resistência ao 34, e a mutação A30V que restabelecou a establidade do RRE (Fonte: Nameki, D., Kodama, E., Ikeuchi, M., et. al., Journal of Virology, 2005).

Rimsky et al. identificaram uma sequência de resíduo do HR1, contendo três aminoácidos (GIV nas posições 36 a 38), que é critica para inibição da entrada do HIV-1 HXB3 pelo T20, e pela associação eficiente entre HR1 e peptídeo T20 (RIMSKY et al., 1998). Vírus gerados por resistência ao T20 in vitro foram associadas com substituições em duas posições da sequência GIV (G→S ou D e V→M). Embora a sequência GIV seja altamente conservada entre isolados do HIV-1 (MYERS et al., 1995), uma cepa comumente estudada e laboratorialmente adaptada X4, pNL4-3, contem uma substituição G→D na posição 36 do HR1. Apesar desta substituição, este vírus apresenta-se sensível a altas doses de T20 (RIMSKY et al., 1998).

Variantes derivadas da cepa de HIV-1 pNL4-3, resistentes à Enfuvirtida in vitro, demonstram mutações importantes nos códons 36 a 38 da gp41, que estão localizadas no epítopo da região de repetição do HR1. A sequência de aminoácidos nestes três resíduos é DIV no pNL4-3, e SIV, GIV ou GIM em vírus sensíveis a droga, e SIM, DIM ou DTV em clones resistentes à droga (RIMSKY et al., 1998). Embora, outros determinantes fora da sequência tripeptídica GIV, e provavelmente localizados em Env, são críticos para o desenvolvimento de resistência (LABROSSE et al., 2003; SU et al., 2006). Mutações primárias nos códons 36-38 foram raramente encontrados in vivo em pacientes infectados de longo tempo e potencialmente tratados previamente com inibidores PR e TR (ZOLLNER et al., 2001). Mutações L33S e V38E também têm sido encontradas após seleção in vitro na presença do inibidor estando localizadas na alça do braço IIB e no meio do braço IIB do RRE do HIV-1, respectivamente. Mutações sinônimas nos resíduos da gp41 Gln41 (CAG a CAA) e Leu44 (UUG a CUG), que afetam a alça do braço III do RRE, agem como mutações secundárias, aumentando a replicação do HIV-1 associadas a mutações de resistência primária à enfuvirtida (UENO et al., 2009).

A primeira evidência da emergência de resistência clínica ao T20 foi reportada há 9 anos (WEI et al., 2002). Mutações de resistência encontradas neste estudo foram G36D no GIV, e Q32H, Q32R, I37V, V38A, V38M e Q39R. Na fase II de estudos clínicos, as substituições mais comumente encontradas foram na posição 36 (G36D, G36S), 38 (V38A, V38M), 40 (Q40H), 42 (N42T) e 43 (N43D, N43K, N43S) (SISTA et al., 2004; MARCELIN et al., 2004). Outras mutações encontradas in vivo foram V38G, V38W, V38E, S42G, N42Q/H e N43Q (SISTA et al., 2004; MARCELIN et al., 2004; COVENS et al., 2009). Mutações nas posições 36 e 38 tendem a desaparecer, enquanto N43D torna-se predominante após tratamento de longo tempo com enfuvirtida (CABRERA et al., 2006). Em estudos fenotípicos, mutações únicas como I37K ou V38E e, várias combinações de duas mutações como

G36D/N42T, G36V/N42D, Q41R/N43D, parecem estar relacionadas a alta resistência ao inibidor (tabela 6).

Tabela 6 - Susceptibilidade da Enfuvirtida obtida em isolados clínicos e recombinantes de isolados de HIV-1

Substituições de Aminoácidos Fold change-aumento da IC50a

G36D/N42T >1000 (4) G36V/N42D >1000 (4) V38E >1000 (7,8); 192 (8) b Q41R/N43D >1000 (4) I37M/N43D 600 (4) V38E/N42S 513 (1,8); >40 (12,14) V38A/L44M 283 (4) V38A/L44M/L45P 248 (4) I37K 212 (2) ΔFNSTW/G36D/I37K/N126K/L204I c 163 (13) V38A/N42T 149 (1,8); >40 (12,14) V38A/N42D 140 (1,8), 49 (8) b ; >40 (12,14) I37K/N126K 134 (2) G36D/I37V 82 (7) b Q40H/L45M 67 (8); >48 (15); 327 (8) b ΔFNSTW c /D36G/I37K/N126K/L204I 64 (2) N42T/N43S 61 (1,8); 339 (6) b ; 3(8) b N43D/S138A 47 (3) G36E 39,3 (8) G36D/N43D/S138A 35 (13) N42T/N43K 32 (1,8);252 (6) b ;>55 (12) N43D/E137K 5,9-55,5 (10) V38M 26 (2); 800 (4) b ; 8 (5) b D36G/I37K/N126K 23 (2) G36D/N43D 20 (13) Q40H 10-28,4 (1,6,8,15) A30V/I37K/N126K 17 (2) V38A 16-17,8 (1,8);255-1000 (4) b ; 35-45 (5,7) b ; >55 (12,15) N43D d 15-28 (1,3,8,10);>48 (15); 122-249 (6) b ; 1000 (4) b G36S/L44M 15 (1,8); 632 (6) b I37T/N126K 14 (2) N42T/L45M 14 (8); 30 (8) b I37T 13 (2) N43K (aaa) 13 (15) I37V/N43S 11 (6) b G36D/N43K (aaa,aag) 10-13 (15) D36G/I37K/N126K/L204I 10 (2) G36D/V38A 9,6 (13) G36S 7-7,3 (1,8);12-29 (6) b Q32R/V38A 6,3(5) L33S >5 (9) N43S 5,6-6 (1,8) Q32R/G36D 5,4 (5); 1 (5) b D36S/V38M 5,1 (2) N43K (aag) 5-5,3 (1,8,15) L33V 5 (9) G36D 4-8 (1,5,8,13); 4,3-450 (5-7) b

L34M/L54M/Q56R 4,8 (9) L54M/Q56K 4,3 (9) N42T 3,8-4 (1,8) I37V 3,2 (5) b S138A 3 (3) L54M 2 (9) L54M/Q56R 2 (9) L44M 1,8-2 (1,8) N126K 1,9 (2) L34M 1,7 (9) ΔFNSTW C 1,5 (2) G36D/N126K 1,4 (13) E137K 0,6-3,2 (10,11) L204I 1,1 (2) L45M 1-1,4 (1,8); 13 (15) Q32H/G36D 1 (5) b N42E 1 (1) N42S 0,5-1 (1,8,12,14) Q56K 0,9 (9) Q32L <1 (8) S35F 0,6 (9) D36S 0,6 (2) A30V 0,5 (2) Q56R 0,5 (9) Q39R 0,4 (9) Q39H 0,13-0,2 (2,4); 1,2 (8) b D36G 0,1 (2,15) a

Indicam valores correspondentes a razão entre 50% da concentração inbitoria (IC50) obtida com

vírus recombinantes e a referencia de vírus selvagem.

b

Isolado clinico de paciente

c

ΔFNSTW é uma deleção de 5 aminoacidos nas posições 364-368 na região V4 da gp120 da cepa NL4-3 do HIV-1.

d

In vitro, esta mutação confere 1,6 – 51 vezes diminuição da susceptibilidade em diferentes sistemas de métodos e passado genético, devido a diminuição da estabilidade de ligação, mas seu efeito pode ser compensado em parte com E137K (Bai et al, 2006; Tolstrup et al, 2007; Bai et al, 2008).

Greenberg et al. 2004; Mink et al, 2002 e Wei et al, 2002. 2. Nameki et al.,2005. 3. Xu et al., 2005. 4. Menzo et al.,2004. 5. Wei et al. 2002. 6. Sista et al ,2004. 7. Huang et al ,2005. 8. Mink

et al. 9. Chinnadurai et al, 2005. 10. Tolstrup et al, 2007. 11. Bai et al, 2008. 12. He et al, 2008.

13. Naito et al, 2009. 14. Wang et al, 2009. 15. Ueno et al, 2009.

O impacto negativo na capacidade replicativa viral das mutações de resistência, na gp41, pode levar ao aparecimento de mutações secundárias no epítopo de repetição HR2, para compensar tais defeitos deletérios à replicação viral. S138A apareceu em 6 de 17 pacientes, após 8 semanas de tratamento com enfuvirtida, e após desenvolvimento de mutações no HR1 (XU et al., 2005). Esta mutação

aumenta o nível de resistência em aproximadamente 3 vezes àquela conferida pela mutação no HR1 N43D, compensada pelo aumento da capacidade fusogênica de variantes do HIV-1 carreando mutações primárias, que abrigam ligação à enfuvirtida (IZUMI et al., 2009; RAY et al., 2009). S138A aumenta a estabilidade da ligação da sexta hélice determinada pela espectroscopia de dicroísmo circular. Um mecanismo similar de ação foi observado para N125D, uma mutação que compensa perda de capacidade replicativa produzida por mutações de resistência à enfuvirtida Q40H e Q56R (RAY et al., 2009). Um polimorfismo de base natural no HR2, N137K, foi encontrado em associações com mutações na posição 43, durante os estudos do TORO (MELBY et al., 2007), sendo capaz de resgatar completamente a competência fusogênica de HIV-1 resistente à enfuvirtida contendo N43D (TOLSTRUP et al., 2007; BAI et al, 2006).

Outro exemplo de efeito compensatório envolve a N126K, uma mutação HR2 que em conjunto com V36A predominaram na população viral, após 32 semanas de terapia, em pacientes em falha com enfuvirtida (BALDWIN et al., 2004). A V36A emergiu primeiro e reduziu a ligação à enfuvirtida, mas com custo na capacidade replicativa. Quando surgiu a dupla mutação (V36A/N126K) houve aumento nesta capacidade replicativa, embora tornando este vírus incapaz de infectar células na ausência de droga, devido à pressão seletiva desta para manter ambas as mutações. Estudos de mecanismo, sugerem que estas mutações tornam o HIV-1 hiperfusogênico pela aceleração na formação da ligação da sexta hélice, um evento que parece estar atrasado na presença de enfuvirtida (BALDWIN et al., 2008).

O HIV-1 do grupo O parece ser tão susceptível à enfuvirtida quanto os vírus do grupo M (CHINNADURAI et al., 2005). Em adição, CRF01_AE, CRF02_AG, e cepas de subtipo C do HIV-1 são efetivamente inibidas pela enfuvirtida, embora tenham de 10 a 16 substituições de aminoácidos na região de ligação à droga (CILLIERS et al., 2004; FLEURY et al., 2006). Mutações G36S/E/D, I37T, V38M/A/L/E, N43K,

L45R/M e A50T/V foram selecionadas in vitro após exposição à enfuvirtida de vírus subtipo C (CILLIERS et al, 2005).

Portanto, as mutações importantes de vírus resistentes a fusão, parecem estar entre os aminoácidos 32 e 56 da gp41, local essencial para síntese de RRE e portanto, com possível impacto na sua função. Tornando-o assim, um possível alvo terapêutico por sua necessidade de estabilidade para manutenção da replicação viral.

A inibição pela enfuvirtida é altamente influenciada pela especificidade da ligação do inibidor e do correceptor viral CXCR4 (DERDEYN et al., 2000). Portanto, o IC50 para T20 em isolados usando CCR5 foi

reportado como sendo em torno de 8 vezes maior que isolados usando CXCR4. Usando vírus quiméricos derivados do clone pNL4-3 foi evidenciado que determinantes da especificidade do correceptor estão localizados na alça V3 da gp120, e são responsáveis pelas diferenças na sensibilidade ao inibidor observados com isolados R5 e X4. Nestes estudos, a alça V3 de vírus X4 e a sequência GIV na posição 36-38 da gp41 o tornaram 60 vezes mais sensível que aqueles R5 na alça V3 e sequência DIV nos resíduos 36-38 da gp41 (DERDEYN et al., 2000). Mais evidências sobre o efeito da gp120/afinidade de correceptor na sensibilidade de T20 foi demonstrada usando quimeras contendo diferentes tipos de sequências de alça V3. A substituição K412D, na região ponte da gp120 na cepa de vírus primário YU2, reduziu a afinidade para CCR5 e aumentou sensibilidade ao T20 em 30 vezes (REEVES et al., 2002). Outros têm reportado que independentemente, as mutações na gp120 como T202G, K421D, I423S, P437A ou G441V podem reduzir a ligação do CCR5 enquanto conferem resistência ao T20 e T1249 (REEVES et al., 2004).

O inibidor de correceptor CCR5 atualmente em uso no Brasil é denominado Maraviroque. Este se liga ao bolso formado pelas hélices transmembrana ligado à proteína G, enquanto a gp120 interage com a porção N terminal e a segunda alça extracelular do CCR5. A resistência ao Maraviroque pode se desenvolver através da aquisição de mutações no gene Env, que permitem ao HIV-1 usar correceptores CXCR4, gerando mudança no tropismo (WESTBY et al., 2006). Resistência a esta droga in vitro ocorre nos aminoácidos T163K, A316V, S405A e no domínio C3 (N355Y). Resíduos importantes para resistência encontrados foram Ala316 e Ile323 na alça V3 da gp120 (WESTBY et al., 2007).

Embora estudos, inclusive nacionais, apontem os testes de genotipagem como formas de detecção de resistência a drogas desta classe por determinação do tropismo viral, o teste comprovadamente eficaz e aceito mundialmente é o Trofile (Monogram Biosciences). Este analisa fenotipicamente o tropismo viral em culturas de vírus com receptores marcados por luminescência (WHITCOMB et al., 2007).

2 JUSTIFICATIVA

Novas drogas são estudadas e formuladas repetidamente na tentativa de construir um esquema terapêutico eficaz, potente e com boa adesão. Mas apesar dos esforços e das novas tecnologias, para cada nova medicação que surge já existem mutações de resistência bem determinadas antes mesmo da sua comercialização. Portanto, a busca de novos alvos terapêuticos se faz necessária a fim de superar os mecanismos de defesa viral existentes.

A pesquisa de novas drogas terapêuticas pode seguir atualmente dois processos. O mais largamente utilizado até hoje é a pesquisa em bancos de bibliotecas de substâncias químicas para detectar possíveis drogas terapêuticas ou modificações destas, promovendo melhor afinidade com o substrato. Alternativa é utilizar a técnica de modelagem computacional conhecida como docking molecular, que permite um estudo detalhado dos sistemas biológicos através da análise das interações em escala microscópica. Nesta, através da afinidade entre o complexo receptor-ligante, é gerado um resultado final de cálculo para projeção e estudo de novos compostos. Ambas as técnicas necessitam de uma análise precisa do substrato a ser utilizado.

Para que uma droga seja sintetizada ou que uma vacina alcance eficácia preventiva, é imprecindível encontrar regiões virais específicas, que sejam conservadas tanto em relação a cepas virais quanto à regionalização das mesmas. O RRE é, portanto, uma molécula de grande perspectiva terapêutica. Primeiro por sua capacidade em se manter conservado a despeito da grande atividade mutagênica da transcriptase reversa. Como demonstrado na introdução, para realizar sua atividade específica esta molécula não pode sofrer variações significantes no seu códon e portanto, tende a estabilização durante as infecções agudas e crônicas pelo vírus HIV. Em seguida, ressaltamos a sua atividade de transporte de mRNA nuclear para o citoplasma,

essencial para manter o ciclo viral. Como esta molécula age tanto no núcleo quanto no citoplasma, agentes não necessariamente intranucleares podem alcançar eficácia adequada.

Sendo assim, sabendo que a despeito da conservação desta região viral, mutações são geradas diariamente pelo HIV em todo seu genoma, fazendo-se necessário o estudo particularizado de mutações nessa região, particularmente em isolados clínicos sob pressão seletiva de antirretrovirais, bem como o impacto destas na replicação e citopatogenicidade viral (BALDWIN et al., 2004; DERDEYN et al., 2000; DERDEYN et al., 2001; ERON et al., 2004; GREENBERG et al., 2004; HEIL et al., 2004; KINOMOTO, 2005; LU et al., 2004; MENZO et al., 2004; POVEDA et al., 2002; REEVES et al., 2005; RIMSY et al., 1998; WEI et al., 2002).

Diante do exposto, como trabalho preliminar para uma possível molécula inibidora em terapêuticas futuras, iniciamos um estudo mais complexo da molécula do RRE. Diante da possibilidade de ser um alvo conservado do vírus HIV, propusemos a hipótese de que o estudo do RRE em diferentes populações com exposição a drogas antirretrovirais disponíveis no mercado poderiam gerar a resposta sobre a capacidade mutacional ou de estabilização desta. Assim como, definir as possíveis mutações principais a serem encontradas em populações expostas a antirretrovirais, incluindo inibidores de fusão, que têm seu foco mutacional nesta região como determinado previamente.

A caracterização de mutações na região responsável pela formação do envelope viral proverá informações a cerca dos mecanismos de ação da replicação do HIV-1, em especial na fusão com a célula hospedeira. O códon 36 é importante para a replicação viral por sua localização tanto na região do envelope quanto da codificadora do RRE