RIP1 gen ifadesinin değerlendirilmesi

Nekroptoz, iskemi dahil olmak üzere çeşitli hastalıkların önemli bir düzenleyicisi olarak kabul edilen programlanmış bir hücre ölüm sürecidir. RIPK1, RIPK3 ve MLKL nekroptozda rol oynayan ana moleküllerdir. TNF-a tarafından uyarılan hücrelerde RIPK1’in aktivasyonu, nekroptoz veya apoptoz yoluyla düzenlenmiş hücre ölümlerinin teşvik edilmesinde önemli bir rol oynar. Aktive

100

edilmiş RIPK1, apoptoza aracılık etmek üzere kompleks IIa oluşturmak için FADD ve kaspaz 8 ile etkileşime girerken nekroptozun oluşması için gerekli olan kompleks IIb oluşumu için RIPK3 ile etkileşime girer. Hücrelerin bu süreçlerden hangisine gireceği esas olarak kaspaz 8 ve cIAP1, cIAP2, XIAP gibi apoptoz inhibitör proteinlerine bağlıdır. Apoptoz inhibitör proteinleri RIPK1’in ubikitinasyonuna neden olurken kaspaz 8 proteinin aktivasyonu RIPK1’in proteolitik olarak kesimine aracılık eder. Kaspaz 8 aktivitesinin inhibisyonu RIPK1 kesimini engelleyerek nekroptozu tetikler (Choi, Price, Ryter, & Choi, 2019;

Grootjans, Berghe, & Vandenabeele, 2017; X. Li et al., 2019; Y. Liu et al., 2019;

Shan, Pan, Najafov, & Yuan, 2018; Yuan, Amin, & Ofengeim, 2019; Zhu, Zhang, Yang, & He, 2019).

Yapılan çeşitli çalışmalarda beyinde iskemik hasar sonucunda hücrelerde hem apoptotik hem de nekroptoz hücre ölüm yolaklarının aktive olduğu bildirilmiştir (Degterev et al., 2005; Deng, Li, & Sun, 2019; Fakharnia, Khodagholi, Dargahi, & Ahmadiani, 2017; Galluzzi et al., 2018; Hribljan, Lisjak, Petrović, &

Mitrečić, 2019; H. Shen et al., 2017; Yin et al., 2015; W. Zhou & Yuan, 2014; Y.

Zhou et al., 2017). Vieiera ve ark. larının in vitro olarak hippokampal nöronlar üzerinde oksijen-glikoz mahrumiyeti (OGD) modeli ile oluşturdukları global iskemide nekroptoz yolağını incelemişler ve model oluşumundan 24 saat sonra RIP1 gen ifadesinin arttığını belirlemişlerdir (Vieira et al., 2014). -karyofilenin nekroptoz ve inflamasyon üzerine etkilerinin incelendiği bir çalışmada, beyin dokusunda RIP1, RIP3 ve MLKL mRNA düzeylerinin fokal iskemiden 48 saat sonra belirgin bir şekilde artmış olduğu bildirilmiştir (M. Yang et al., 2017).

Deneysel intraserebral kanama modeli oluşturularak RIP1'in nekroptozdaki rolünün araştırıldığı bir başka çalışmada, sham grubu ile yapılan karşılaştırma sonucunda RIP1 ifadesinin 24 saatte aşamalı olarak artarak en yüksek düzeye ulaştığı belirlenmiştir (H. Shen et al., 2017).

101

Kaspaz 8 proteini RIPK1’in proteolitik olarak kesimini sağlayarak hücrelerin nekroptozdan kaçmasını sağlar. Yapılan çeşitli çalışmalarda kaspaz 8 inhibisyonunun hücrelerde RIPK1 yıkımının engellenmesi ile nekroptoz yolaklarının aktive olduğu bildirilmiştir (Berghe et al., 2014; Lin et al., 1999;

Linkermann et al., 2012; Martinet et al., 2006; Vandenabeele et al., 2006). Primer kortikal nöronlarda OGD reperfüzyon modeli ile oluşturulan İ/R hasarında geldanamisinin etkilerinin araştırıldığı bir çalışmada, Z-VAD-fmk kullanımının RIP1 gen ifadesini artırdığı gösterilmiştir (W. W. Chen et al., 2012). Nekroptozun OGD modeli ile in vitro olarak incelenmesi sonucunda Z-VAD-fmk kullanımının RIP1, RIP3 gen ifadelerini artırdığı ve bu artışın RIP1-RIP3-MLKL etkileşimlerini düzenlediği bildirilmiştir (Qu et al., 2016).

Çalışmamızda elde ettiğimiz bulgular literatür bilgilerinde de ifade edildiği gibi iskemi ve reperfüzyon sonucunda beyin dokusunda RIP1 gen ifadesinin arttığı yönündedir. Ayrıca çalışmamızda apoptoz inhibitörü olan Z-VAD-fmk’nın intraperitoneal olarak kullanımının İ/R sonucunda artan kaspaz 8 gen ifadesini azaltarak RIP1 gen ifadesinin daha fazla yükselmesine neden olduğu ve hücrelerin nekroptoza daha duyarlı hale geldiği kanaatine varıldı.

Beyin İ/R sürecinde mikrogliaların ve astrositlerin aktivasyonu nöroinflamasyonu uyarır ve bu süreçte diğer hücrelerde ikincil İ/R hasarına neden olarak nöronal ölümü şiddetlendirir. Yapılan çeşitli çalışmalarda apoptotik hücrelerin bir enflamatuvar reaksiyon ortaya çıkarmadan fagositoz ile hızlı bir şekilde ortamdan uzaklaştırıldığı belirlenmiştir. Fakat nekroptotik hücreler, hücre içi içeriklerinin salımını engelleyemezler. Özellikle nekroptozda MLKL proteininin aktivasyonu hücre zarı geçirgenliğinin artmasına ve Pan1 kanalarının aktivasyonuna sebep olarak çeşitli proenflamatuvar moleküllerin ve DAMP’ların nekroptotik hücrelerden salınımını arttırır (Heckmann, Tummers, & Green, 2019).

Pan1 kanalları beyin İ/R sürecinde NMDAR'lar tarafından aktive edilerek kontrolsüz glutamat salınımına ve lezyon bölgesinde Ca⁺²'nın aşırı artmasına

102

neden olarak eksitotoksisite oluşumunu destekler. Aktif Pan1 kanalları DAMP’ların / PAMP'ların hücre içine girmesini sağlayarak, hücre içi TLR'lerin aktive olmasını sağlayabilir. Bu nedenlerden dolayı Pan1 kanalları inflamasyon başlatıcı hem de ikincil hücre ölümü ile ilişkili yolaklar için düzenleyici olarak tanımlanmaktadır (Kim et al., 2017; S. Li et al., 2018; Maes et al., 2013; Penuela et al., 2013). Wei ve ark. ları sıçanlarda oluşturdukları beyin İ/R hasarı çalışmalarında, Pan1 kanal inhibitörü olan probenecidin lizozomal ve enflamatuvar hasarı azalttığını bildirmişlerdir (R. Wei et al., 2015). Farelerde karragenanın intraventriküler olarak uygulanması ile oluşturulan beyin inflamasyon modeli ile yapılan bir çalışmada probenecid uygulamasının oluşan beyin iltihabını tamamen inhibe etti belirlenmiştir (Gamache & Ellis, 1986). Pan1 kanallarından hücre içine giren DAMP’lar nekroptozu tetikleyebilir. Yapılan çeşitli çalışmalarda nekroptozun yalnızca ölüm reseptörlerinin ligandları ile değil aynı zamanda toll benzeri reseptörler (TLR'ler) ve interferon (IFN) reseptörleri ligandları tarafından da başlatılabileceği bildirilmiştir (Shestopalov & Slepak, 2014).

Çalışmamızda Pan1 inhibitörü olan probenecidin tek başına kullanımının RIP1 gen ifadesinin azalmasına neden olduğu gözlendi. Yapılan literatür taraması sonucunda Pan1 kanallarının RIP1 gen ifadesi üzerine etkilerinin araştırıldığı bir çalışmaya ulaşılamamıştır. Çalışmamızda probenecid kullanımı sonucunda Pan1 kanallarının kapatılması, dokunun ikincil hasara maruz kalarak TLR artışını engellemiş, böylece nekroptozu engelleyerek RIP1 gen ifadesini azaltmış olabilir.

Çalışmamızda Z-VAD-fmk ve probenecidin birlikte kullanılması İ/R sürecinde artan RIP1 gen ifadesini önemli ölçüde azalttığı belirlendi. Her iki inhibitörün birlikte kullanımı ile probenecidin tek başına uygulaması arasında istatistiksel olarak fark bulunamadı. Yapılan literatür araştırmalarında iki inhibitörün birlikte

103

kullanılmasının RIP1 gen ifadesi üzerine etkileri ile ilişkili çalışmalara ulaşılamamıştır.